Abstract
Diferenças na atividade de neurotransmissores e neuromoduladores e, consequentemente, diferentes respostas neurais, podem ser encontrados entre os animais anestesiados e acordado. Assim, os métodos que permitem a manipulação de sistemas sinápticas em animais acordados são necessários a fim de determinar a contribuição de entradas sinápticas neuronais de processamento afectada pelos anestésicos. Aqui, nós apresentamos metodologia para a construção de eléctrodos para gravar, simultaneamente, actividade neuronal extracelular e libertar várias substâncias neuroactivos na vizinhança dos locais de gravação em ratos despertos. Ao combinar estes procedimentos, foram realizadas injeções microiontophoretic de gabazine para bloquear seletivamente receptores GABA A em neurônios do colículo inferior de ratos conteve-cabeça. Gabazine modificado com sucesso as propriedades da resposta neural, tais como a área de resposta a frequência e adaptação específica do estímulo. Assim, demonstra-se que os nossos métodos são adequados para recording atividade de unidade única e para dissecar o papel dos receptores de neurotransmissores específicos no processamento auditivo.
A principal limitação do processo descrito é o tempo de gravação relativamente curto (~ 3 h), o qual é determinado pelo nível de habituação do animal para as sessões de gravação. Por outro lado, várias sessões de gravação pode ser realizada no mesmo animal. A vantagem desta técnica em relação a outros procedimentos experimentais utilizados para manipular o nível da neurotransmissão ou neuromodulação (tais como injecções sistémicas ou a utilização de modelos optogenetic), é que o efeito do fármaco está confinada às entradas sinápticas locais para o neurónio alvo. Além disso, o costume-fabricação de eléctrodos permite o ajuste dos parâmetros específicos de acordo com a estrutura neural e tipo de neurónio de interesse (tais como a resistência de ponta para melhorar a relação sinal-ruído dos registos).
Introduction
A interacção da excitação neural e inibição é fundamental para o processamento da informação sensorial 1. Sabe-se também que a anestesia tem um forte impacto sobre a dinâmica de activação cortical e do padrão temporal de entradas sinápticas 2,3. Por exemplo, tem-se observado que os anestésicos alterar a duração das respostas visuais evocados nos neurónios corticais 3,4. Além disso, a relação entre as entradas excitatórios e inibidores sinápticas é diferente em animais anestesiados e desperto 4,5, alterando ambos evocados e as taxas de actividade espontânea 6,7. Ao medir as condutâncias sinápticas, Haider e colegas 4 descobriu que a inibição de excitação combinado em amplitude sob anestesia que, durante a vigília, a inibição foi mais forte do que a excitação. Estas descobertas solicitar o desenvolvimento de procedimentos experimentais para estudar o impacto de entradas sinápticas específicas no processamento sensorial em animais acordados.
<p class = "jove_content"> A ejeção controlada de substâncias neuroativos cobradas pela aplicação de pequenas injeções atuais (da ordem de nA) tem sido amplamente utilizada para estudar a contribuição de entradas sinápticas eo papel dos receptores celulares putativos no processamento sensorial 8-13 . Esta técnica, conhecida como microiontophoresis, permite a aplicação de medicamentos na vizinhança do neurónio gravada, a qual contribui para um efeito rápido e confinado. Este procedimento é mais apropriado para estudar os efeitos locais de substâncias neuroactivos, em comparação com o efeito generalizado provocado por outras manipulações experimentais, tais como injecções sistémicas, microdiálise ou a utilização de técnicas de optogenetic. Normalmente, uma configuração de eletrodo piggy-back 14,15 é usado para gravar simultaneamente o neurônio alvo e entregar as substâncias neuroativos de interesse. É constituída por um eléctrodo de registo ligada a uma pipeta multibarrel que transporta as substâncias neuroactivos. Modificações do oprocedimento riginal descrito por Havey e Caspary 14 foram implementadas. Por exemplo, um eléctrodo de tungsténio, em vez de um vidro, pode ser utilizado para registar a actividade neuronal 16. Métodos publicados anteriormente para o fabrico de eléctrodos de tungsténio 17,18 envolve três etapas gerais: ataque eletrolítico de pontas de fio de tungstênio, isolamento de vidro, e o ajuste da exposição ponta para satisfazer as necessidades de gravação.Um campo interessante e emergentes em neurociência auditiva é o estudo de adaptação específicas de estímulo (SSA 19). SSA é uma diminuição específica na resposta neural para sons repetitivos que não generaliza para outros sons, raramente apresentados. A importância da SSA reside no seu papel potencial como um mecanismo de detecção de desvio neural subjacente no cérebro auditivo, bem como uma possível correlação neuronal para o componente incompatibilidade negatividade tardia do potencial evocado auditivo 20,21. SSA occurs do IC, até o córtex auditivo 19,22-24. A inibição mediada por GABA tem sido demonstrada para actuar como um mecanismo de controlo de ganho no SSA 7,16,25, que também tem sido mostrado a ser afectado por anestesia 26. Aqui apresenta-se um protocolo que combina métodos anteriormente descritos para gravação a actividade de uma única unidade do neurónios IC antes e durante a aplicação de um antagonista selectivo dos receptores de GABAA em ratos despertos. Em primeiro lugar, descrevemos a fabricação de eletrodos piggy-back e no próximo, os métodos cirúrgicos e de gravação. Para testar a eficácia da libertação do fármaco, foi comparado o campo receptivo, bem como o nível de SSA de neurónios IC antes e durante a ejecção de microiontophoretic gabazine.
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Protocol
Todos os procedimentos experimentais foram realizados na Universidade de Salamanca com a aprovação, e usando métodos em conformidade com as normas de uma Universidade do Comitê Animal Care Salamanca, bem como as normas da União Europeia (Directiva 2010/63 / UE) para o uso de animais em pesquisas de neurociência.
1. eléctrodos de tungsténio
Nota: O fabrico de eléctrodos de tungsténio baseia-se na técnica original descrita na Merrill e Ainsworth 27 e Ainsworth et al 28 e realizada usando a configuração de estação de trabalho descrita no Bullock et al, 17...
- Para gravar a atividade extracelular unidade única de neurônios IC, usar eletrodos com uma impedância ponta 1,5-2,5 mohms. Aqui, os passos envolvidos no fabrico do eléctrodo de tungsténio são descritas apenas por pouco tempo, uma vez que uma descrição detalhada é encontrada nas referências acima mencionadas.
- Coloque fios de tungstênio num alinhamento custom-builtferramenta (Figura 1A) para auxiliar cortando-os para o comprimento desejado. A ferramenta de alinhamento é constituído por 30 agulhas (25 g) coladas em paralelo em intervalos de 2 mm, com uma paragem numa extremidade de limitar o comprimento dos cabos a ~ 40 mm. Cuidadosamente anexar as pontas soltas dos fios com fita adesiva, e cortar o resto do fio com uma tesoura forte.
- Puxar suavemente a partir da fita, a fim de remover os fios de tungsténio a partir de a ferramenta de alinhamento, certificando-se de que todos os fios permanecem ligados à fita. Rolar a fita em um eixo de latão polido (Figura 1B, C), segurando os fios firmemente contra o eixo para que haja uma boa conexão elétrica.
- Ligue o eixo de um motor 5 rpm na estação de trabalho, e mergulhar as pontas de fio salientes em uma solução de ataque químico (KNO 2, 90 g por 80 ml). Ângulo do eixo do fuso de 45 ° em relação à superfície da solução de gravação. Mergulhar as pontas do fio de modo que ~ 1/3 dos fios de contacto a solução.
- immerse um eléctrodo de vareta de carbono para o banho de decapagem para fechar o circuito. Utilize uma mola escova trança de cobre para aplicar o fornecimento de gravação para o eixo do fuso, enquanto o veio está a rodar. Ajustar a corrente que passa através dos eléctrodos e a solução de ataque químico a 250 mA. Pare o condicionamento ponta quando a corrente cai para 200 mA. As pontas de arame será gravado em pontos muito finos.
- Passe um fio afiada através de uma chama para remover qualquer resíduo de graxa e adesivo. Coloque o fio (extremidade embotada em primeiro lugar) para um capilar de vidro de borossilicato (1,5 mm de diâmetro externo, 0,86 mm de DI) com a sua extremidade inferior bloqueada com massa de modelar. Fixe a pipeta verticalmente na parte superior e inferior. Puxar a pipeta usando uma serpentina de aquecimento (5 mm de diâmetro, 5 mm de profundidade) e um êmbolo suspenso. À medida que o fio é puxado para baixo pelo peso do êmbolo, o vidro fundido forma uma camada muito fina em torno dele.
- Remover o vidro que cobre a ponta afiada na extremidade do eléctrodo com a ajuda de um cordão de fundido de sódiotetraborate. Para formar o grânulo, misturar o tetraborato de sódio (~ 0,25 g) com uma pequena quantidade de água (~ 0,5 ml) e, lentamente, colocá-lo sobre um elemento de aquecimento, até que se funde com um talão de ~ 2 mm de diâmetro. A temperatura do elemento de aquecimento é controlado por um potenciómetro. Coloque o cordão e elemento de aquecimento em um braço manipulador fixado à mesa, e movê-lo até que o cordão está focada sob o microscópio em baixa ampliação.
- Prenda o fio com cobertura de vidro para um slide e colocá-lo sob o microscópio. Mova o controle deslizante com os botões de palco até que a ponta e talão tetraborate estão em foco. Aqueça o talão até que derreta um pouco, e insira a ponta do fio ~ 10 - 15 mm. Girar o potenciômetro aquecimento desligado. Como o rebordo arrefece, ela contrai-se e irá remover o vidro a partir da ponta do eléctrodo, expondo o tungsténio subjacente. O eletrodo de tungstênio está pronto para usar.
2. Multibarrel vidro Pipeta Manufacturing
- Proteger as extremidades do multicapilares barril de vidro (cinco barris em H-configuration) com tubos de calor encolhe, para permitir uma melhor aderência aos grampos extrator e evitar a ruptura, e coloque um no puxador vertical.
- Para obter comprimentos de ponta de ~ 15 mm, definir o extrator com os seguintes parâmetros: Calor: 84, Sub força de ímã: 49, força magneto principal: Fine-tune 38. esses parâmetros de acordo com a configuração específica, bem como depois de mudar o elemento de aquecimento.
- Puxe o capilar para obter duas pipetas com as pontas ocluído. Montar uma pipeta sobre uma lâmina utilizando argila de modelagem e quebrar a ponta da pipeta sob o microscópio até que o diâmetro externo é de ~ 20 - 30 um, utilizando uma tesoura fina ou fórceps, ou o lado liso de um bisturi. Se a borda quebrada é muito áspero, refiná-lo usando a técnica tetraborate talão descrito na etapa 1.7.
- Coloque um eléctrodo de tungsténio (de secção 1) num suporte feito com uma agulha G 20, no final de um microposicionador miniatura de 3 eixos montado no microscópio veadoe. Usando fórceps, dobrar a extremidade do eléctrodo de 5 - 10 °, ~ 30 mm da ponta.
- Sob o microscópio, alinhe cuidadosamente o eletrodo de tungstênio sobre a ponta multibarrel. Uma vez alinhados, abaixe o eletrodo até que ele contata o multibarrel, encaixando no sulco entre os dois barris superiores. Deslize a ponta do eléctrodo, até que se projecta ~ 15 - 20 pM de distância a partir da ponta da multibarrel. Adicione o ângulo entre o eléctrodo e o multibarrel tão pequena quanto possível para se obter uma melhor ligação e um conjunto mais fino.
- Aplique uma pequena gota de luz curável adesiva ~ 5 mm de distância das pontas. Tenha cuidado para que a cola não alcança a ponta para evitar o bloqueio dos canais multibarrel.
- Curar a cola usando uma lâmpada de luz LED azul. Repita a cola application / cura, se necessário, para melhor aderência.
- Mover a platina do microscópio suavemente até que a extremidade do eléctrodo de tungsténio é libertado do seu suporte. Retirar o conjunto piggy-back do slide.
- enrole the secção intermédia do eléctrodo piggy-back em um curto período de calor encolher tubo e aplicar rápida apropriada de cura epóxi para o vidro para proteger ainda mais o eletrodo de tungstênio ao multibarrel.
3. Medicamentos para Microiontophoresis
Nota: As drogas utilizadas para microiontophoresis deve ter uma carga eléctrica, quando dissolvido em água. Verifique a literatura para ver se o fármaco de interesse é adequada para este procedimento. Aqui, o processo para gabazine, um antagonista do receptor de GABA A, é descrita.
- Filtrar a água destilada utilizando um filtro de seringa de 0,2 mm para esterilizar a água e garantir que não contém solutos. Prepare ~ 1.000 ul de 20 mM gabazine usando essa água destilada.
- Ajustar o pH da diluição a 4 com 0,2 fim de NaOH filtrada utilizando um eléctrodo de pH de ponta fina.
- Armazenar 100 - 200 mL alíquotas a -20 ºC. Descongelar no dia da gravação. Naquele dia, antes de o animal é contêEd, preencher os tambores (3-5 ul) de o eléctrodo multibarrel com as drogas, utilizando uma micro-seringa de 100 ul ajustada com uma agulha de plástico flexível.
4. Cirurgia e Headpost Implantação
- Realizar experimentos em dois ratinhos CBA / J machos (Mus musculus), com pesos de 27 e 30 g. Siga os procedimentos cirúrgicos e de gravação de Bryant e seus colegas 29, Portfors e colaboradores 30-32, e Duque e Malmierca 26.
- Nos dias antes da cirurgia, os animais manusear e habituar-las para a câmara de gravação, permitindo-lhes a explorar livremente. Faça 3 sessões por dia, cada uma com duração de pelo menos 30 min. Desta forma, os animais vão ser mais calmo e confortável durante as gravações.
- Anestesiar o rato utilizando uma mistura de cetamina (50 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) injectada por via intramuscular. Com esta dose, o animal é anestesiado profundamente por cerca de 1 h. Dê doses suplementares de um third da dose inicial, conforme necessário.
- Colocar o animal em um cobertor de aquecimento ajustado para manter uma temperatura de 38 ± 1 ºC e estabilizar a cabeça do animal em um quadro estereotáxico, usando duas barras de ouvido e um bar mordida. Tenha cuidado para não perfurar a membrana timpânica com as barras de ouvido.
- Proteger os olhos por aplicação de uma gota de gel oftálmico.
- Raspar o couro cabeludo com uma tesoura e aplicar iodopovidona para desinfectar a pele.
- Usando um bisturi, fazer uma incisão ao longo da linha média para expor o crânio e retrair o periósteo cobrindo o parietal e a parte mais rostral dos ossos occipitais.
- Cole um headpost leve duralumínio (peso ~ 0,65 g, 30 mm de comprimento, Figura 2A) com uma base plana e redondo (5 mm de diâmetro) no crânio. Cole um fio de prata para o meio da headpost deixando suas extremidades livres. O fio de prata será utilizado como o eléctrodo de referência para o registo electrofisiológico.
- Aplicar uma fina camada de ligHT-adesiva curável no crânio e a base do headpost. Esperar 10 seg e colocar o headpost sobre a área rostral dos ossos parietais, ao longo da linha média.
- Para uma força de ligação eficaz, luz curar o adesivo usando uma fonte de luz azul por 20 s.
- Perfurar três buracos ao redor e atrás da base do headpost usando uma furadeira elétrica e uma pequena broca.
- Coloque dois parafusos relógio (~ comprimento 2 mm) nos orifícios perfurados para servir como pontos de contacto adicionais entre o crânio e o headstage. Os parafusos requerem 1½ volta-se para obter um ajuste confortável. Testar os parafusos com uma pinça para se certificar que não estão soltos.
- Insira a ponta do fio terra de prata no terceiro buraco certificando-se que os contactos da dura-máter. Aplique uma pequena gota de água cianoacrilato resistentes cola para ligar o fio ao crânio.
- Aplique composto de cura de luz para reforçar o vínculo da headpost com o crânio. Cobrir a base do headpost, a parte baixa do fio de prata,e os parafusos, tomando cuidado para não estender por trás lambda, para permitir o acesso durante a gravação. Curar usando uma fonte de luz azul.
- Retrair o músculo na parte de trás do pescoço próximo a sua inserção no crânio. Usando um pequeno trephine (2,35 mm de diâmetro), fure uma janela redonda logo abaixo sutura lambda e lateral à linha média, para expor o colículo inferior (CI). Quando as fronteiras estão soltos, puxe o osso cobrindo com uma pinça fina. Se ocorrer sangramento, lavar com solução salina estéril frio para pará-lo.
- Adicione uma parede pequena (~ 1 mm de largura e ~ 1 mm de altura) em torno da janela com composto e de luz que cura.
- Cobrir o crânio exposto e muscular com pomada antibiótica. Em seguida, molhar a superfície exposta do IC com solução salina estéril e cobri-lo com geleia de petróleo, o enchimento do poço gerado depois de fazer a parede em torno da janela de gravação.
- Injectar subcutaneamente buprenorfina (0,03 mg / kg, diluída 1:10 em solução salina estéril) como um analgésico.
- Manter o animal em tele aquecimento cobertor até que ele acorda e devolvê-lo à sua gaiola de habitação para recuperar da cirurgia durante três dias antes das sessões de gravação. Casa animais na gaiola de habitação rat's indivíduo para evitar companheiros de gaiola limpando a geléia eo headpost toque na tampa de metal da grade. Colocar um pouco de enriquecimento na gaiola quando o animal é único alojados. Além disso, mudar diariamente a serragem para prevenir a infecção e verifique cuidadosamente que o animal recupera adequadamente e não mostra quaisquer sinais de desconforto. Além disso, verifique se vaselina é sobre a proteger o cérebro exposto janela de gravação.
5. eletrofisiológica Gravação e Microiontophoresis
- Após a recuperação, dar tempo ao animal para se aclimatar ao ambiente de gravação e com a cabeça contido. Aclimatar o animal através da fixação da headpost ao titular enquanto o mouse está sentado em um limitador de espuma almofadado feito por encomenda esculpida ao seu tamanho corporal (Figura 2B). Este lim vontadeque os movimentos do mouse, irá contribuir para a sua calma.
- Comece com 10 mínimo de sessões e aumentar progressivamente a duração de até 120 min. Durante a sessão, premiar os animais com líquidos doces (leite condensado, diluída 30:70 em água) em determinados intervalos de 33. Mais tarde, durante a sessão de gravação, dar a mesma recompensa no início e no fim da sessão ou quando não é isolado neurónio.
- Se o animal está muito animado antes da gravação, injetar o acepromazina leve sedativo (2 mg / kg, intraperitoneal). De acordo com o sistema neural de interesse, o sedativo pode afetar seus resultados.
- Deixe o animal explorar livremente a câmara de gravação para 5 - 10 min.
- Coloque o corpo do animal para o limitador almofadada de espuma feitos sob medida (Figura 2B).
- Fixar o headpost a um suporte fixado à armação estereotáxica (Figura 2C). Este é um bom momento para dar ao animal uma recompensa líquido.
- coVer o corpo do animal com uma manta de algodão e frouxamente fixá-la utilizando um meio-cilindro de plástico e fita adesiva.
- Remova a geléia de petróleo a partir da janela de gravação e enxaguar com soro fisiológico morno estéril.
- atividade neural registro e aplicação iontoforética de gabazine.
- Colocar o eléctrodo multibarrel ao seu titular, controlado por um Microdrive e ligada a um micromanipulador.
- Ligue os fios para a gravação, usando pequenos clipes de crocodilo. Ligar o terminal positivo para o fim do eléctrodo de tungsténio, e o terminal de terra ao fio de prata que contacta com a dura-máter.
- Coloque um fio de prata não revestidos no interior de cada barril, para que se contactos finais da solução e a outra extremidade está acessível. Conectar essas extremidades para o dispositivo microiontophoresis, seguindo as instruções do fabricante.
- Mova o eletrodo multibarrel até que os contatos ponta da superfície do cérebro. Aplicar soro fisiológico estéril quente para impedir a dessecação de the tecido cerebral. Nesse ponto aplicar uma corrente de retenção (-10 nA para gabazine, vá literatura para a droga particular) para evitar a fuga do fármaco a partir da ponta do tambor, enquanto procura actividade de unidade única.
- Utilize as técnicas padrão para isolar a atividade extracelular único neurônio. Obter a área de resposta de frequência (FRA) do neurónio, ou seja, a combinação de frequências e intensidades capaz de evocar uma resposta, porque o neurónio é sensível a estes sons 34-36.
- Escolha duas frequências (F1 e F2) que evocam uma taxa de disparo semelhante e padrão. Apresentar cada uma dessas freqüências de estímulo tão raro e repetitivo sob o paradigma oddball.
Nota: Resumidamente, no paradigma excêntrico, uma frequência (F1) é apresentado como o estímulo repetitivo com uma alta probabilidade de ocorrência, enquanto que a segunda (F2) é o estímulo desviante ocorrendo raramente, intercalado aleatoriamente entre os repetitivos. Em uma segunda sequência de aves raras, o parenteprobabilidades de os dois estímulos são invertidos. Detalhes do paradigma de estimulação foram descritos anteriormente 22,37. - Solte o gabazine deslocando a corrente para valores positivos (10-20 NA). Obter novamente a FRA e repita o paradigma oddball sob a aplicação gabazine. Manter a ejecção até que um efeito visível na taxa de disparo é observado; que normalmente leva 5-20 minutos, dependendo da droga em particular, a sua concentração, e a magnitude da corrente de ejecção. Repetir o protocolo de gravação para obter os valores sob o efeito da droga.
- Pare a injecção, retornando a corrente para os valores de retenção. Espere até que o efeito da droga para lavar através da monitorização que o FRA ou resposta ao paradigma excêntrico retorna aos valores de controlo.
Nota: As sessões de gravação pode durar 2-3 horas por dia, e deve ser encerrado mais cedo, se o animal apresentar qualquer sinal de desconforto ou lutando. Dê líquido recompensa e cobrir o ch gravaçãoâmbar com vaselina.
Análise 6. Os dados
- Medir a FRA antes e durante a injecção gabazine, bem como o nível de SSA.
- Quantificar a força da resposta SSA pelo índice common-SSA (CSI) eo índice de SSA específicas de frequência (SI), como descrito anteriormente 19,22,23,38,39. A CSI e SI refletir a diferença normalizada entre a resposta neuronal ao estímulo raro e a resposta ao repetitivo. Positivos valores CSI e SI indicar a resposta neural (espigas por estímulo) foi maior para raros do que a tons repetitivas.
- Comparar os dados da condição de controle e de ejeção de drogas.
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Representative Results
Registramos a atividade-única unidade de 4 neurônios bem isoladas do IC. As relações típicas de sinal-para-ruído obtidos durante gravações extracelulares em ratos despertos são mostrados na Figura 3B. A Figura 4A mostra a área da resposta de frequência (FRA) de cada neurónio, antes e durante o bloqueio do receptor GABA A receptores com gabazine. Observou-se um aumento na força da resposta (picos / estímulo), bem como um alargamento do espectro de sintonização. O incremento na resposta evocada também foi evidente nos histogramas de tempo peri-estímulo acumulados obtidos a partir da resposta neural para todas as frequências e intensidades apresentada (Figura 4B).
Um ou dois pares de frequências dentro (cruzes na figura 4a) do neurônio FRA foram escolhidos para ser apresentado como sons repetitivos ou raros num paradigma oddball, para sTUDY o nível de SSA nas suas respostas. Para dois exemplos de neurônios, as respostas evocadas-som para cada frequência (F1 e F2), antes e durante a injeção gabazine são mostrados como rasters ponto na Figura 5A, B. Para os dois exemplos de neurônios, houve uma clara mudança na resposta evocada-som como se observa na raster ponto e PSTHs.
Do mesmo modo, o bloqueio dos locais receptores GABA A aumentou a resposta neuronal para a grande maioria dos tons raras e repetitivos (Figura 5C) de acordo com o nosso estudo anterior 16. Foram observados diferentes níveis de SSA nas respostas neurais para f1 e f2, que se refletiu em CSI positivo (intervalo de CSI: -0,26 a 0,43, 0,25 ± 0,23) e os valores de SI (intervalo de SIs: -0,41 a 0,83, 0,25 ± 0,23) . Para a maioria dos casos, o aumento da resposta ao tom repetitivo causou uma queda nos índices como observado na Figura 5D
Figura 1. prima para a fabricação de eletrodos de tungstênio. Ferramenta de alinhamento (A) do eletrodo, com alguns fios de tungstênio no lugar. A peça mais leve à esquerda é uma parada para os fios. A ponta tesoura indica o lado usado como um guia para cortar os fios no comprimento desejado. (B) do fuso vazio. (C) Fuso com um lote de eletrodos ligados, e que descansa em um suporte. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Acessórios para Recordings Ratos acordado. (A) Headpost. (B) Custom-made restrainer espuma amortecido. lugar tele rato entre ambas as peças, deixando a cabeça para fora. (C) Modificações no quadro estereotáxico. O titular headpost (barra superior) auxilia durante headpost implantação e restringe a cabeça durante as gravações. A peça de morder (inferior bar) é usado somente durante a implantação headpost. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Exemplo de Gravação no mouse Awake. (A) área de resposta de frequência de um neurônio a partir do IC mouse. (B) formas de onda dos picos registrados a partir deste neurônio. (C, D) Dot raster e histograma em tempo peristumulus gravada a partir deste neurônio usando um paradigma oddball nas frequências indicadas por os pontos em (a). Redesenhada a partir dos dadospublicado em Duque e Malmierca 26. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Efeito do bloqueio do GABA A receptores na espectral e propriedades de resposta temporal. Área de resposta (A) Frequência das quatro IC registrou neurônios antes e durante a injecção microiontophoretic de gabazine. As cruzes pretas em (A) indicam as frequências escolhido para ser apresentado como sons raras e repetitivas. (B) acumulados peri-estímulo histogramas de tempo da resposta neural para todas as frequências e intensidades apresentados para construir a área da resposta antes e durante a injecção de gabazine. As barras pretas indicam a duração do som.Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Efeito do bloqueio dos receptores GABA A receptores na resposta a sons repetitivos e raro. (A, B) rasterizações Dot da resposta de adição a um par de frequências apresentadas como rara (vermelho, 10%) e estímulos repetitivos (azul, 90%), antes e durante a aplicação de gabazine. Cada frequência é jogado em duas sequências de tal modo que cada uma foi apresentada como rara- e repetitivo. O fundo sombreado indica a duração do estímulo. (C). Respostas de neurônios único a sete pares de frequências apresentado como o raro e como o som repetitivo antes e durante a aplicação de gabazine (D). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O microiontophoresis de substâncias neuroativos em animais acordados é uma técnica poderosa para sondar e dissecar o papel de entradas sinápticas específicas sobre a atividade de neurônios individuais 40,41. Mais importante ainda, este procedimento permite a determinação do impacto dos neurotransmissores e neuromoduladores nos circuitos neurais sem o potencial de interferência de anestésicos. Aqui, demonstramos que a aplicação de gabazine no IC de ratos acordados robustamente mudou a sintonia de frequência (Figura 4A), os padrões de resposta temporais (Figura 4B) e a SSA (Figura 5).
A principal limitação do processo descrito é o tempo de gravação relativamente curto (~ 3 h), o qual é determinado pelo nível de habituação do animal para as sessões de gravação. Por outro lado, várias sessões de gravação pode ser realizada no mesmo animal. Usando microiontophoresis Não está claro o quão longeas substâncias aplicadas neuroactivos difundem-se para o tecido circundante. Portanto, um possível efeito sobre a atividade da rede neuronal pode ser provocada por afetar não só o neurônio gravado, mas também o glial ao redor e células neuronais. Por exemplo, doces e colegas 42 demonstraram que certas moléculas entregues por iontoforese, que não são removidos rapidamente, pode difundir-se a 600 um. Nos ratinhos IC desta gama cobrir a maior parte da extensão dos mandris dendríticas mas também afectar a resposta neuronal de células adjacentes. Não Em resumo, a droga liberada por iontoforese é como espacialmente restrito como a diálise droga intracelular, o que permite que a dissecção em detalhe mais fino das entradas sinápticas para o neurônio alvo e teste da rede de processos locais de 16,43, é mais específico do que outra experimental os procedimentos usados para manipular o nível da neurotransmissão ou neuromodulação, tais como injecções sistémicas, a utilização de técnicas de optogenetic, ou empurrar-Pull diálise.
O diâmetro da ponta das pipetas de vidro e a magnitude das correntes de retenção e de injecção são factores-chave para monitorar a fim de evitar a fuga de drogas não específica para o tecido. As correntes de injecção baixas (da ordem das dezenas de Na) limitar a propagação da droga que permite a gravação de neurónios perto um do outro. Por exemplo, três das quatro neurónios utilizadas como exemplos os neurónios (1 - 3) foram registadas ao longo da mesma pista, com distâncias de 16 e 800 um entre eles. Apesar da curta distância de 16 uM neurónio entre 1 e 2, uma resposta claramente diferente da Neuron 2 foi observado (Figura 4).
Algumas alternativas para a configuração piggy-back proposta ter sido usado anteriormente. Um deles consiste na utilização de uma das pipetas multibarrel de gravação, em vez de um eléctrodo separado. Embora a construção dos conjuntos é menos complicado, neste caso, há inconvenientes. FirsT, todos os canais irá ter o mesmo diâmetro de abertura na ponta, o que pode não ser óptimo para gravação e de entrega de drogas. Além disso, a ponta do eléctrodo saliente na configuração piggy-back evita danos para a célula alvo provavelmente causado pela ponta mais larga do multibarrel. A segunda alternativa comum é o uso de pipetas de vidro de barril único para gravar 15,44 em vez de eléctrodos de tungsténio. eléctrodos de vidro são fáceis de fabricar com as dimensões necessárias, mas tendem a entupir durante longos gravações ou quando se viaja profundamente no cérebro, de modo que nos eléctrodos de tungsténio experiência proporcionar gravações mais fiáveis. Além disso, utilizando eléctrodos de tungsténio é possível produzir lesão electrolítica para localizar os locais de gravação, sem os procedimentos histológicos mais elaboradas, necessárias quando uma injecção marcador neural é utilizado 45. A utilização de pipetas de vidro multibarrel permite a libertação de vários agonistas e / ou antagonistas de muito perto a gravaçãolocal, que é uma enorme vantagem quando a interação entre sistemas de neurotransmissores no processamento sensorial está em estudo.
Os procedimentos descritos no presente protocolo para a fabricação dos eletrodos piggy-back torná-lo possível produzir eléctrodos de registo de acordo com os requisitos específicos da experiência e das características da área de alvo de interesse de forma sistemática, ainda forma personalizada. Além disso, os materiais para a fixação headpost são convencionalmente utilizados em odontologia, de forma que são facilmente disponíveis. Assim, as etapas críticas no protocolo são a habituação dos animais e o condicionamento dos eléctrodos de tungsténio, que são os principais fatores que contribuem para os neurônios bem isoladas e registros eletrofisiológicos estáveis. No geral, esta técnica é relativamente simples, econômico e muito fiável como um meio para estudar o papel de múltiplas substâncias neuroativos sobre a atividade neuronal única ou multi-unidade no acordado, cabeça-camundongos contido.
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Acknowledgments
Este projecto foi financiado pela MINECO concede BFU201343608-P e PSI2013-49348-EXP, eo SA343U14 concessão JCYL ao financiamento HSH e MRC núcleo para ARP. YAA realizou uma CONACyT (216.106) e uma bolsa de setembro
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tungsten wire | Harvard Apparatus LTD | 33-0099 | 0.005 inches x 3 inches |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus LTD | 30-0053 | Borosilicate standard wall without filament, 1.5 mm OD, 0.86 mm ID, 100 mm long |
| Multibarrel glass capillaries | World Precision Instruments | 5B120F-4 | 5-barrel capillary, 4 inches long, 1.2 mm OD, with filament |
| Diaplus | DiaDent | 2001-2101 | Light-curing adhesive, used to attach the tungsten electrode to the glas multibarrel pipette |
| G-Bond | GC Corporation | 2277 | Light-curing adhesive, used to attach the headpost to the animal's skull |
| Charisma | Heraeus Kulzer | 66000087 | Light-curing composite, used to reinforce the bond of the headpost with the skull |
| Araldit Cristal | Ceys | 2-component expoxy, used to further secure the attachment of the tungsten electrode to the glass multibarrel pipette | |
| Heating blanket | Cibertec | RTC1 | |
| Stereotactic frame | Narishige | SR-6N | Modified for mice |
| Microiontophoretic device | Harvard Apparatus LTD | Neurophore BH-2 | Including IP-2 iontophoresis pumps (one for each drug delivery channel) and a balance module |
| Multibarrel glass pipette puller | Narishige | Model PE-21 | |
| LED lamp | Technoflux | CV-215 | 5 W, 430-485 nm |
| MicroFil | World Precision Instruments | MF34G-5 | Flexible plastic needle, 34 AWG |
| Imalgene | Merial | Ketamine, 100 mg/mL | |
| Rompun | Bayer | Xylazine, 20 mg/mL | |
| Gabazine / SR-95531 | Sigma | S106 | Prepare ~ 1000µl of 20 mM gabazine in distilled water and adjust the pH to 4 |
References
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