Introduction
En transcripcional estudios realizados a nivel tisular, la transcriptomes de tipos de células altamente especializadas, pero raras son a menudo enmascarados por las células circundantes más abundantes. Un ejemplo de tales tipos de células altamente especializadas son las células del linaje reproductivo femenino (línea germinal) en las plantas. La línea germinal femenina se especifica dentro de óvulos en desarrollo, los precursores de las semillas en el interior del gineceo del 1,2 flor. La célula madre megaspora (MMC) es la primera célula de la línea germinal femenina. Se somete a la meiosis para formar una tétrada de megaesporas reducidos. Típicamente, sólo uno de estos megasporas sobrevive y divide mitóticamente sin citocinesis, es decir, en un sincitio. Estos son seguidos por mitosis cellularization para formar el gametofito maduro, que normalmente consiste en cuatro tipos de células: tres antípodas, dos células synergid, el huevo, y la célula central. Los óvulos y centrales son los gametos femeninos que consiguen fertilizados por dos espermatozoides durante Doula fertilización ble para dar lugar al embrión y el endospermo de la semilla en desarrollo 1,2. En el sistema modelo Arabidopsis thaliana sexual, sólo ~ 50 semillas se desarrollan por flor, mientras que alrededor de 50 - 80 semillas por flor se desarrollan en el género estrechamente relacionado Boechera. Por lo tanto, la línea germinal femenina consta de sólo unos pocos tipos de células altamente especializadas, por lo que es un excelente modelo para estudiar los procesos de desarrollo, tales como la especificación y diferenciación celular.
Por otra parte, una visión de los procesos de regulación de genes que regulan la reproducción de plantas pueden ser de valor aplicada. En las plantas, puede ocurrir tanto en la reproducción sexual y asexual a través de semillas (apomixis). Mientras que la reproducción sexual genera diversidad genética en una población, la apomixis conduce a la formación de la progenie clonal que es genéticamente idéntico a la planta madre. Por lo tanto, la apomixis tiene un gran potencial para aplicaciones en la agricultura y la producción de semillas, como los genotipos maternos incluso complejos puedenmantenerse inalterada durante varias generaciones 3,4,5. Debido a que la apomixis no se produce de forma natural en cualquier especie vegetal importante, la ingeniería de la apomixis en los cultivos es de gran interés 3,4,5. Sin embargo, este objetivo a largo plazo es difícil de lograr debido a que la base genética y molecular subyacente de la apomixis no se entiende con el suficiente detalle 6.
Para hacerse una idea de la base de la transcripción que regulan la reproducción apomictic, específica del tipo celular transcripcional de perfiles mediante microdisección asistida por láser (LAM) y la secuenciación de próxima generación (NGS) representa un enfoque muy potente 7,8. LAM primera se ha establecido para los animales y la investigación biomédica. En los últimos años LAM también se ha aplicado a la biología vegetal 6,9,10. En contraste con otros métodos que permiten perfiles de tipos de células y tejidos individuales, LAM no requiere la generación de líneas de marcador 6,9,10. Por lo tanto, puede ser la aplicaciónmentido a cualquier tipo de célula o tejido sin conocimiento previo molecular. Otra ventaja de LAM es que se puede aplicar a cualquier tipo de célula, siempre que la célula se puede reconocer en las secciones secas basada en la posición y / o características estructurales. LAM tiene la ventaja adicional de que se utilizan tejidos fijados, lo que impide cambios del perfil transcripcional durante el procesamiento.
El tejido de interés, por ejemplo, tejido floral, se fija en un fijador no reticulante antes de la incrustación en cera de parafina. Incrustación en cera de parafina se puede hacer manualmente, siguiendo los protocolos establecidos 9,11. Sin embargo, el uso de un procesador de tejido automatizado para la deshidratación y la infiltración con la cera generalmente da como resultado una mayor reproducibilidad en términos de la conservación de la calidad del ARN y la morfología del tejido. La estrategia alternativa de la incrustación de tejidos en resina también se ha utilizado con éxito para el análisis de tipos específicos de células por LAM 8. Sin embargo, el uso de un automprocesador de tejidos ado para incrustar en cera es muy eficiente en el tiempo, ya que muchas muestras se pueden procesar a la vez que requiere un mínimo de manos a tiempo. Aunque normalmente no hay pérdida significativa de la calidad del ARN se produce durante la fijación y la incrustación, la preparación de secciones delgadas con el microtomo y, en particular, el montaje en los frameslides utilizados para LAM sigue siendo un paso crítico para la conservación de la calidad del ARN. Esta ha sido previamente señalado y el uso de un sistema de transferencia de la cinta se ha descrito para dar lugar a una mejor calidad de RNA en este paso 12. Sin embargo, esto añade una etapa que consume tiempo adicional durante la preparación de los portaobjetos y también requiere un equipo especial. El protocolo optimizado se describe a continuación de forma reproducible produce ARN que es de calidad suficiente para el perfil transcripcional con GeneChips y Next Generation Sequencing (NGS) se acerca 7,11,13,14. Además, con el microscopio de microdisección láser utilizado, una alta pureza de los tipos de células aisladas es goleadainely produjo 7,11,13,14.
El género Boechera es un excelente sistema modelo para el estudio de los pasos clave de la reproducción apomictic. En Boechera, una variedad de diferentes adhesiones sexuales y apomícticas han sido identificados y se puede utilizar para los análisis comparativos 15,16,17. En una comparación de transcriptomes tipo de células específicas de las células de la línea germinal femenina de Arabidopsis sexual y apomictic Boechera, hemos identificado los genes y las vías que son expresados diferencialmente, identificando de este modo nuevos aspectos de los procesos de regulación que rige la apomixis 7. Además, este estudio verificó la idoneidad de LAM para la célula de la transcripción de tipo análisis específicos de tipos de células pequeñas y raras. Ya hemos utilizado este protocolo para el análisis de los diferentes tipos de células en una variedad de especies de plantas, pero en las especies y las modificaciones específicas de tejido en el protocolo pueden ser necesarios en algunos casos.
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Protocol
Nota: Este protocolo describe la preparación del tejido, asistida por láser microdisección, y la extracción de ARN para el perfil transcripcional. Siempre use guantes durante todas las etapas del protocolo. Estudiar y tener en cuenta las instrucciones de seguridad para cada producto químico utilizado. En particular, tener en cuenta que el xilol es nocivo y puede penetrar los guantes y que el metanol es tóxico. Para todos los instrumentos que se utilizan, por favor refiérase a los manuales de usuario en consecuencia.
1. La eliminación de RNAsa Actividad de cristalería y otros equipos
- Antes de usarla, ponga cualquier material de vidrio con papel de aluminio antes de la cocción durante ~ 8 horas a 180 ° C para asegurar la calidad de ARNasa libre.
- Tratar ninguna superficie de metal (por ejemplo, par de pinzas), así como el banco de trabajo y la placa de calentamiento con una solución de descontaminación ARNasa apropiado. Posteriormente, lavar las superficies con agua libre de ARNasa para eliminar la solución de descontaminación. Posteriormente, limpiar las superficies con más del 70% de EtOH.
- Utilizar todos los plasconsumibles de tics (por ejemplo, tubos) nuevo sin ningún tratamiento previo. Si está disponible, utilice consumibles de plástico que están certificadas para ser libre de RNasa.
2. Fijación de tejidos
- Preparar 10 ml de solución fijadora del agricultor (3: 1; v / v de etanol: ácido acético) en un nuevo tubo de 15 ml en hielo. (Siempre prepare fijador del granjero fresco antes de su uso). Como alternativa, el etanol no reticulante fijador: ácido acético (5: 1; v / v) se puede utilizar 18.
- Use un buen par de pinzas para recoger los brotes en la etapa de desarrollo de interés. Inmediatamente sumerja brotes en el fijador enfriado con hielo. Usar 10 ml de fijador para la fijación de ~ 20 yemas o flores de Arabidopsis o Boechera Nota:. Cuando se utilizan especies de plantas con flores más grandes se recomienda para diseccionar las flores con una hoja de afeitar para generar piezas más pequeñas antes de la fijación.
- Con el fin de obtener gametofitos maduros, castrar a los 2 - 3 capullos de las flores más grandes del inflorEscence 2 días antes de la cosecha.
- Llene el fondo de un desecador con hielo. Abrir los tubos que contienen las muestras, por ejemplo, las flores, y colocarlos en hielo, ya sea directamente, poniendo ellos en el hielo de una forma que no puedan caer sobre o mediante el uso de un soporte apropiado. Vacuum infiltrarse por 15 min antes de la liberación del vacío.
- Repetir la infiltración al vacío de una vez por 15 min.
- Liberar el vacío y la tienda durante la noche (~ 12 h) en hielo. Cubrir el cubo de hielo con una tapa o papel de aluminio y almacenar el cubo en una habitación C 4 ° o en el refrigerador, a fin de evitar que el hielo de descongelación. Nota: No se recomienda prolongar el tiempo de fijación.
3. Tejido incrustación, Thin seccionamiento y montaje de las diapositivas para LAM
- incrustación de tejidos.
- Intercambiar el fijador a 70% de etanol elaborado con etanol puro y RNasa libre de agua. Deje las muestras en hielo hasta su posterior procesamiento. Comience embedding de las muestras el mismo día. En caso de que ninguna máquina de procesamiento de tejido está disponible, continúe con incrustación manual como se describe en otro lugar 9,11 y continúe con el paso 3.1.11.
- transferir suavemente las muestras para cassettes de tejido incrustación con un par de pinzas. Firmemente cerrar los casetes. Paso crítico: Evitar el secado, incluso parcial de la muestra durante este paso. Evitar apretar las muestras con las pinzas.
Nota: Para etiquetar las cintas de un lápiz se debe utilizar, a ser posible por escrito sobre la superficie inclinada de la casete. - Almacenar el casete cargado con la incorporación de los capullos o flores en etanol al 70% hasta que todo el material se transfiere a los cassettes y la máquina de la incrustación se puede cargar. Para este fin, utilizar una cubeta de tinción de vidrio lleno de 70% de etanol.
- Retire la cesta del procesador de tejido de la réplica de la máquina y la transferencia de los casetes de incrustación a la cesta con las superficies inclinadas que se enfrenta la parte superior y en la misma dirección. CRIPASO TICAL: Realice esto de manera rápida para evitar la desecación de los tejidos. Si el procesamiento de muchos cassettes de inclusión a la vez, coloque la cesta en un contenedor libre de ARNasa adecuada llena de etanol al 70% antes de cargar las muestras.
- Ponga la tapa en la canasta y poner de nuevo en la cesta de la retorta. Cierre la retorta.
Nota: El procesador de tejidos deshidrata de forma automática las muestras, cambia el disolvente a xilol, y hace la infiltración con parafina derretida. Típicamente, esto se realiza durante la noche. - Iniciar el programa del procesador de tejidos. ajustes estándar recomendados son 1 hr 70% de EtOH, tres veces 1 hr 90% de EtOH, tres veces 1 hr 100% EtOH, dos veces 1 hr 100% Xilol, una vez 1 hr 15 min 100% Xylol a temperatura ambiente, seguido de la infiltración con cera de parafina dos veces durante 1 hr y una vez durante 3 horas a 56 ° C 11.
Nota: Para asegurarse de que la estación de bloqueo está listo con la cera derretida, encender el aparato varias horas antes de empezar outilizar la función de temporizador para seleccionar la hora de inicio aproximada.
Nota: En caso de que el tejido no puede ser procesada inmediatamente después, los tiempos de incubación más largos en la cera de parafina a 56 ° C son posibles en lugar de la 3 horas a 56 ° C. Consulte el manual de usuario del instrumento. Por lo general, los casetes con tejidos se mantendrán automáticamente en cera derretida hasta que se aprobó el comando "retorta de vacío". Si la cera no se funde cuando se arranca el procesador de tejidos, la retorta se llena con 70% de etanol y el programa sigue en espera hasta que esté listo para comenzar. - Vaciar la retorta y transferir inmediatamente las muestras a un baño de cera de parafina a 56 ° C en una estación de bloqueo. Retire la tapa de la cesta y cubrir el baño de parafina de la estación de bloqueo con su tapa.
- Pila tantas bandejas de equilibrio frescas en la superficie de la estación de bloqueo calentaron a 56 ° C, ya que hay cassettes en la cesta.
Nota: Un marcador permanente etanol resistente se puede utilizard para etiquetar la parte inferior de las bandejas de equilibrio. No se recomiendan marcadores permanentes Acetona-resistente. - El uso de la estación de bloqueo, llenar una bandeja de plástico de equilibrado fresco precalentado con cera de parafina fundida a 56 ° C. Levante la tapa del baño de parafina, recoger un casete única a la vez y transferir las muestras a partir de los cassettes a la cera de parafina líquida a 56 ° C en la bandeja de equilibrio usando un par de pinzas.
Paso crítico: Evitar cualquier endurecimiento de la cera que rodea la muestra durante la manipulación de la casete mediante el trabajo rápidamente.- Posición Todas las muestras de acuerdo con las necesidades usando una aguja de preparación antes del endurecimiento de la cera. Típicamente, varias flores se disponen en una bandeja de equilibrio espaciados individualmente alrededor de 1 cm en cada dirección.
- Repita el paso 3.1.9 hasta que todas las muestras se transfieren.
- Coloque la cesta de nuevo al procesador de tejidos y limpiar la retorta usando un programa adecuado (consulte el manual de usuario).
- Apagar procesador de tejidos y la estación de bloqueo. Continúe con el paso 3.1.13.
- En caso de que ninguna máquina de infiltración de tejidos, así como ninguna incrustación está disponible, utilizar un horno de calentamiento para derretir la cera de parafina a 56 ° C. En el banco, llenar la cera derretida en bandejas de plástico de equilibrio, transferir las muestras a la cera, y el uso de agujas de preparación para colocar las muestras.
- Dejar que la cera de parafina se endurezca a temperatura ambiente durante ~ 1-3 hr antes de almacenar las muestras a 4 ° C. Las muestras pueden ser procesadas posteriormente recién o almacenarse hasta por varios meses.
- Preparación de secciones delgadas y toboganes para LAM.
- En una mesa de luz que ilumina el bloque de cera desde abajo, quitar la cera de parafina con las muestras de las bandejas de plástico que rodean. Diseccionar un bloque de cera cuadrado que contiene el tejido, por ejemplo., Un capullo o una flor, usando una cuchilla de afeitar libre de ARNasa. Para este objetivo, siempre orientar las muestras hacia la parte superior del bloque de cera (ver también
- Preparar bloques de cera de todas las muestras que se deben utilizar para LAM a la vez.
- En una mesa de luz que ilumina el bloque de cera desde abajo, quitar la cera de parafina con las muestras de las bandejas de plástico que rodean. Diseccionar un bloque de cera cuadrado que contiene el tejido, por ejemplo., Un capullo o una flor, usando una cuchilla de afeitar libre de ARNasa. Para este objetivo, siempre orientar las muestras hacia la parte superior del bloque de cera (ver también
- Montar los bloques para procesar la incorporación de casetes llenas de cera de parafina endurecida: fundir una pequeña pieza o gota de cera de parafina en la punta de una espátula apropiada usando una lámpara de etanol y el uso de la cera caliente para fijar el bloque en el soporte (con los tejidos embebidos en la parte superior).
- Dejar que la cera se endurezca por lo menos durante 20 min a 4 ° C.
- Quitar la cera sobrante que rodea la muestra con una cuchilla de afeitar en la mesa de luz. Asegúrese de mantener una superficie cuadrada con bordes paralelos (ver Figura 1).
- Ajuste la placa de calentamiento a 42 ° C.
- montar con seguridad las muestras al microtomo y preparar 6 - 10 micras de grosor. Consulte las instrucciones del fabricante para el uso del microtomo. Nota: Mientras que las secciones más delgadas a menudo darán una mejor resolución estructural, mayor cantidad de ARN de higheCalidad I se puede obtener con secciones más gruesas. Para las células de Boechera maduran gametofitos utilizamos 7 micras como predeterminado. Mover bastante lentamente con las muestras sobre el cuchillo microtomo a menudo resulta en una mejor histología.
- Siempre transferir las cintas de parafina en una longitud de aproximadamente 10 a 15 cm en una caja de plástico con un cartón negro en la parte inferior antes de colocar en diapositivas LAM.
- Si es posible, antes de seleccionar las partes de las tiras de parafina que contienen las célula o tejido tipos de interés, por ejemplo, óvulos, bajo una disección alcance y desechar el resto.
- Colocar la cantidad necesaria de diapositivas enmarcadas de metal (típicamente 5 a 10) con la superficie plana en la parte superior en la placa de calentamiento.
- Pipeta ~ 1 - 2 ml de RNasa libre de agua en la parte de plástico de la diapositiva. El uso de una cuchilla de afeitar, cortar las cintas de parafina en trozos cortos de aproximadamente 4 - 5 cm de largo suficiente para atravesar las ventanas de plástico. Tse una par de pinzas y una aguja de preparación para colocar idealmente las tiras de parafina paralelas entre sí en las ventanas de plástico de las diapositivas. Con cuidado, levante la corredera en un extremo para eliminar el agua y colocar los portaobjetos de nuevo.
- Como alternativa, coloque la placa de calentamiento bajo una campana química. Aplicar un pequeño volumen de metanol para la parte de plástico de la corredera apenas suficiente para mojar la superficie (esto puede causar una ligera ondulación de las diapositivas). Colocar las tiras de parafina en las diapositivas.
Nota: Por razones de toxicidad, evitar el uso de metanol, si es posible. Sin embargo, el uso de metanol en este paso hace mejorar la calidad del ARN en el caso de la calidad alcanzada por el montaje en agua no es suficiente. Vale la pena probar estas alternativas en el inicio de un nuevo proyecto, ya que la calidad del ARN obtenido varía con el tipo celular y especies bajo investigación.
- Como alternativa, coloque la placa de calentamiento bajo una campana química. Aplicar un pequeño volumen de metanol para la parte de plástico de la corredera apenas suficiente para mojar la superficie (esto puede causar una ligera ondulación de las diapositivas). Colocar las tiras de parafina en las diapositivas.
- Se secan los portaobjetos durante la noche en la placa de calentamiento a 42 ° C durante ~ 12 h. Cubrir la placa con calefacciónuna tapa de plástico que no toca las diapositivas. Asegúrese de que la tapa de plástico no impide el intercambio de aire. Para este objetivo, la tapa se puede colocar en las cajas de pipeta o similares a elevar.
- Alternativamente, reducir el tiempo de secado a un mínimo de dos horas o hasta que el tejido parece totalmente seco. La reducción del tiempo de cortar a la colección puede mejorar la calidad del ARN.
- Bajo una campana química, de-cera las diapositivas 2 veces durante 10 minutos en xilol utilizando tenedores de deslizamiento adecuados. Asegúrese de sumergir completamente la parte de plástico de cada portaobjetos solamente pero para permitir la retirada de la corredera al tocar el extremo más ancho de la estructura de metal que se mantiene seco.
- Deje que los portaobjetos se sequen durante ~ 10 min bajo el capó química antes de la LAM.
Nota: Las diapositivas no procesadas de inmediato se pueden colocar de nuevo en la placa de calentamiento a 42 ° C con el tejido hacia arriba hasta por un par de horas. Esto evitará cualquier humedad de comprometer la calidad de RNA hasta su posterior procesamiento.
4. La microdisección asistida por láser (LAM)
Nota: El procedimiento para LAM variará con el instrumento utilizado. Ciertos detalles de este protocolo se adaptan a un instrumento específico y la tecnología de la recogida de las muestras en un casquillo que hace uso de las fuerzas electrostáticas. Además, los detalles pueden variar incluso entre diferentes versiones del software. Por favor, consulte las instrucciones del fabricante y manuales de usuario para obtener una descripción detallada e instrucciones específicas sobre instrumentos y software.
- Encienda los dispositivos para LAM (computadora, un microscopio láser caja de control).
- Iniciar el programa de dirección y el microscopio láser.
- Encienda el láser pulsando el botón correspondiente en la caja de control.
- Colocar un tapón (0,5 ml, sin difusor) en el soporte de la tapa y posicionarla en el instrumento.
- Apoyar la diapositiva LAM con un portaobjetos de vidrio para microscopía. Asegúrese de que la superficie plana de la diapositiva con latejido adjunto se enfrenta a la lámina de vidrio.
- Colocar la placa en el instrumento con el portaobjetos de vidrio por debajo.
- Seleccione el Objetivo 4X. En el programa, seleccione para mover la tapa en la posición "arriba" y proceder a realizar una exploración de la diapositiva.
- Buscar a través de la corredera y de identificar las estructuras de interés. Localizar y salvar sus posiciones en la diapositiva para poder moverse de nuevo a la posición exacta de la etapa de corte.
- Seleccione el objetivo apropiado (por ejemplo, 40X o 60X).
- Si es necesario, ajustar la velocidad del láser, el enfoque y la potencia del láser, y también calibrar el movimiento en el escenario haciendo referencia al manual de usuario del instrumento. Una vez que una cuenta está configurada para el tejido específico de interés, los ajustes pueden ser reutilizados.
- Verificar la posición del láser por un solo disparo pulsando el botón de "disparo de láser" del programa, a ser posible en una parte de la membrana sin tejido.
- Si es necesario, calibrar la posición del láser siguiendo THe instrucciones del fabricante para el instrumento.
- Verificar la calibración del objetivo moviendo una estructura obvia a las cuatro esquinas de la ventana del software en el monitor, manteniendo el botón derecho del ratón pulsado. Compruebe que la posición de la mano con respecto a la estructura obvia es el mismo en las cuatro esquinas. De lo contrario calibrar los objetivos siguientes el manual del software.
- Con la tapa en la posición "abajo", utilice la herramienta "mano-pen" para marcar las fronteras del tipo de célula o tejido de interés, por ejemplo, la célula huevo. Diseccionar la célula de interés con el láser pulsando "corte". Nota: A menudo, las necesidades de seccionamiento a repetirse si el borde alrededor de la célula no se disecó en un pago único. En este caso, se recomienda configurar el software para hacerlo automáticamente dos repeticiones de la sección como un estándar.
- Levantar la tapa y pasar a la posición guardada junto con la estructura de interés. Repita el paso 4.13del procedimiento para diseccionar las secciones siguientes de células hasta que se recogen todas las células de interés a partir de una diapositiva. Asegúrese de que la tapa está situada de manera que la nueva sección se pega a una posición vacía de la tapa.
Nota: Se recomienda aislar las piezas más grandes de los tejidos (por ejemplo, secciones de flores enteras o partes de él) de cada portaobjetos después de que el aislamiento de secciones de células individuales en un casquillo fresco. Estos pueden ser usados para el control de la calidad del ARN. - Retire la diapositiva y continuar con la siguiente diapositiva, repitiendo los pasos 4.4 a 4.9 y 04.13 a 04.14.
- Repita el paso 4.15 y pasos relacionados hasta que los tipos de células de interés por parte de todas las diapositivas han sido aislados. Nota: No se recomienda para cosechar durante más de ~ 4 - 5 horas en la misma tapa.
- Visualmente inspeccione la superficie de la tapa después del MELA para excluir contaminaciones no específicos de la muestra. Mientras que los tejidos no están protegidos diseccionado con el papel de aluminio, el polvo puede pegarse a la superficie debido a la adherencia electrostática.
- To una inspección visual de la tapa, retirar el portaobjetos del instrumento. Coloque el soporte de la tapa en la posición "abajo" e inspeccionar la superficie con el objetivo 4X.
- En el caso de las pequeñas partículas de polvo son visibles, eliminarlos con un pequeño (2 l) punta de la pipeta. Como alternativa, montar la corredera hacia atrás en el instrumento, coloque la tapa en una parte libre de la corredera (no tejidos), y destruir por completo la contaminación utilizando el láser.
- Cerrar las tapas y se congelan las secciones secas a -80 ° C hasta su uso posterior. Si es necesario, las muestras pueden almacenarse durante hasta varias semanas. Sin embargo, procediendo rápidamente en este paso se recomienda.
5. Aislamiento de ARN y Control de Calidad
Nota: el ARN se puede aislar por cualquier método adecuado para pequeñas cantidades de ARN. En este protocolo se describe el uso de un kit de aislamiento de ARN especificado para pequeñas cantidades de ARN. Siga las instrucciones del fabricante.
- Usa los tubos con la muestra unida ala tapa, ya sea directamente o después de la eliminación de -80 ° C.
- Abrir los tubos y pipetear cuidadosamente 11 l de tampón de extracción a la pared de cada tubo usando puntas con filtro. Cambiar las puntas entre las muestras.
- Cierre la tapa y agitar el tampón de extracción hasta el tapón del tubo.
- Colocar los tubos con el tapón hacia abajo en un horno de calefacción precalentado a 42 ° C. Incubar durante 30 minutos siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Siga las instrucciones del fabricante para la preparación de la columna y recoger el extracto en el fondo de los tubos.
- Si el material de más de un casquillo tiene que ser combinada en una sola muestra, continúe con los pasos 5.1.1 - 5.1.2 de forma individual para cada tubo / tapón.
- Después, en común los extractos de una muestra en un tubo y medir la cantidad de extracto combinado con una pipeta antes de la adición de una cantidad equivalente de EtOH (ver instrucciones del fabricante).
- Asegúrese de que la cantidad de EtOH añadió antes de cargar la columna es igual al volumen del extracto combinado.
- Después de la precipitación de ARN con EtOH, proceder rápidamente a la carga de las columnas siguientes instrucciones del fabricante. Continuar con el protocolo de la etapa de centrifugación 100 x g.
- Después de que los contenidos de cada tubo colector se han pasado a través de la columna, lleve a cabo una etapa de centrifugación 16.000 xg durante 30 segundos para eliminar las instrucciones del paso de flujo siguiente del fabricante.
- Continuar con la extracción de RNA y la purificación siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Después de la carga del tampón de elución a la columna permite la columna de incubar durante 1 min. Continuar para cargar los tubos en la centrífuga siguiendo las instrucciones en las instrucciones del fabricante. Nota: Un paso de centrifugación adicional durante 1 min a 100 xg antes de la elución como se indica en el protocolo puede aumentar la eficiencia de la elución.
- Extracto de ARN de la contROLS (secciones de tejido más grandes) para el control de la calidad del ARN siguientes pasos 5.1 a 5.2.7 de este protocolo.
- Para el control de calidad de carga de ARN total de 1 l de ARN sin diluir de cada muestra de control en el Bioanalyzer utilizando un chip de ARN Pico siguiendo las instrucciones del fabricante.
Nota: El ARN extraído se puede utilizar para la amplificación lineal y el análisis del transcriptoma utilizando microarrays o RNA-Seq 7,11,13,14. Idealmente, el control de calidad debe indicar un número de integridad del ARN (RIN) de al menos 7. Un número de proveedores proporcionar kits adecuados para la amplificación, los ejemplos adecuados se dan en 9.
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Representative Results
Preparación de la muestra y LAM se realizan en pasos consecutivos
Es necesaria una serie de pasos consecutivos para preparar ARN para el análisis de la transcripción de determinados tipos de células por LAM (Figura 1). Esto comienza con la recolección de las flores y fijación inmediata para asegurar que la población de ARN se mantiene sin cambios después de la cosecha. El tejido está incrustado, se seccionaron y se montaron en portaobjetos. Esto permite el aislamiento de las células por LAM y la puesta en común de las secciones específicas del tipo de células en una o varias tapas (Figura 1). El material se puede congelar después o directamente procesada por la extracción de RNA. Aparte de la ventaja de LAM sea aplicable para tipo de células específicas análisis en ambas especies modelo y no modelo, el método sigue siendo bastante tiempo. Por lo menos una semana de tiempo de trabajo, a veces más, es necesario para los pasos de tiN ú mero de la cosecha para la extracción de RNA (Figura 1). Hay que tener en cuenta que a menudo secciones cosechadas durante varios días de LAM se agrupan en una extracción de la muestra y el ARN biológica. Para las células de huevo Boechera, el uso de al menos ~ 200 secciones por muestra es muy recomendable, con hasta ~ 100 secciones aisladas por día.
El aislamiento de la celda Tipos de interés depende de su visibilidad en las secciones secas
El aislamiento de las secciones específicas del tipo de células es el paso más lento del protocolo. Hasta el momento, no incluye la automatización de este paso se ha desarrollado debido a la naturaleza compleja de las muestras. La identificación de las células de interés utilizando una herramienta de software no es factible debido a que las secciones secas tienen bajo contraste y el plano de sección varía entre las muestras debido al hecho de que los óvulos están orientados en diferentes ángulos wentro del tejido (Figura 2). Sin embargo, la morfología única del gametofito hembra madura con las sinérgidas, óvulo y la célula central (células antípodas degeneran antes de la fertilización) permite la identificación inequívoca de los óvulos por el investigador (Figura 2 B, C, Figura 3). De hecho, en Boechera divaricarpa, la célula huevo a menudo se reduce un poco durante la preparación y por lo tanto se separa de los tejidos circundantes, una característica ventajosa para el aislamiento de poblaciones de células huevo a alta pureza (Figura 2B, C; Figura 3).
Inspección visual de la PAC después LAM es Recomendaciones
La inspección visual de la superficie de la tapa después de LAM permite la identificación de cualquier posible contaminación de la muestra, por ejemplo, por el polvo. Además, es útil para asegurar que el secciones se adhieren a la tapa, ya que ocasionalmente secciones se pierden durante el procedimiento. Por lo general, muchas secciones seleccionadas, por ejemplo, células de huevo, se pueden ver en una tapa después de varias horas de LAM.
El flujo de trabajo de la empresa de forma reproducible redundará en la buena calidad del ARN
De tipo de células específicas de aislamientos LAM gametofitos femeninos, las cantidades totales de ARN son sólo en el orden de ng baja. Esta cantidad limitante de RNA hace que sea necesario el uso de un control representativa aislada de tejidos más grandes de cada diapositiva como una aproximación para el control de la calidad del ARN después de LAM. Esto se demuestra por una comparación de ARN tipo de células específicas de B. células divaricarpa huevo como comparación con los controles de las áreas de tejido más grandes aisladas a partir de los mismos se desliza, lo que indica la calidad del ARN similares (Figura 4A, B). Usando este método, un buen a la alta calidad de ARN con números Rin & #8805; 7 se obtiene de forma reproducible. La calidad del ARN obtenido era adecuado para tipo de células específicas de ARN-Seq, lo que lleva a la identificación de 236 genes expresados en la célula huevo apomictic pero no en la célula apomictic central, célula synergid, o célula inicial apomíctica, ni en las células o la gametofito sexual madura de Arabidopsis thaliana (Figura 5) 7.
Figura 1:. Esquema de las etapas del protocolo, indicando el tiempo requiere un mínimo por cada etapa de fijación de las flores o los tejidos de interés se realiza durante la noche. Al día siguiente, se inicia la incrustación, que se ejecuta durante la noche, lo que resulta en el material incrustado en el día 3 del protocolo. En el día se pueden generar 3 secciones de micrótomo a partir de muestras incluidas en bloques de cera. Las cintas de las secciones de parafina finos se montan en portaobjetos y se dejan secar durante la noche. EnSe requerirá de correo a varios días de mecanismos de palanca para obtener material suficiente para una biológica replicar. Después del aislamiento de ARN y control de calidad, la preparación de la biblioteca de ARN-Seq puede llevar a cabo para preparar el análisis del transcriptoma. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Los óvulos son claramente identificables en las secciones delgadas, debido a la morfología característica del gametofito femenino (A) Dibujo esquemático del gametofito femenino maduro (tipo Polygonum) (B - C) Las secciones finas a través de óvulos que albergan gametofitos femeninos en.. divaricarpa Boechera. Los óvulos son claramente visibles. Debido a la morfología del gametofito femenino a menudo no todos los tipos de células (células de huevo: E, sinérgidas: s, Célula central: cc) son visibles en una sola sección. Las barras de escala = 50 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. LAM de óvulos de Boechera divaricarpa. A y C. En la sección del gametofito madura de B. divaricarpa a 7 micras antes y, B y D, después de microdisección con el dispositivo de láser (óvulo: e, sinérgidas: s, célula central: cc). Las barras de escala = 50 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
<strong> Figura 4. ARN de calidad de óvulos láser disecado y secciones de control. (A) la calidad del ARN como se analiza a partir de secciones de óvulos en comparación con (B) las áreas de tejido más grandes cosechadas a partir de las mismas diapositivas como controles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Identificación de genes expresados Sólo en la célula huevo apomícticos en comparación con las células de apomícticos y sexuales gametofitos maduros o la célula inicial apomícticos. Mapa de calor de 236 genes expresados en el óvulo apomictic pero ni en la célula central apomictic, célula synergid o célula inicial de apomictic B. gunnisoniana ni las células del gametofito sexual madura de A. thaliana 7 jerárquicaagrupamiento de las muestras y los genes se basa en la distancia euclídea y la agrupación de aglomeración jerárquica. El rojo denota una expresión elevada y baja expresión negro. Los colores son escaladas por fila. apo:. apomictic Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El Protocolo es adecuado para diferentes tipos de células y de tejidos
LAM combinado con análisis del transcriptoma mediante microarrays o ARN-Sec es una valiosa herramienta para obtener información sobre los patrones específicos de actividad de los genes que regulan los procesos de desarrollo o fisiológicas 7-11,13,14. Sin embargo, la idoneidad de este método para cualquier tipo de célula dada depende críticamente de las cuestiones estructurales. La célula tiene que ser claramente visible e inequívoca en secciones secas utilizadas para LAM. En Boechera divaricarpa, la morfología del gametofito permite una fácil identificación de la célula huevo (Figura 2, Figura 3). Al final, la velocidad de aislamiento de una población celular específica también depende de la frecuencia a la que el tipo de célula se puede encontrar en una diapositiva, como el intercambio de diapositivas y la exploración de nuevas diapositivas son pasos que consumen tiempo. Teniendo en cuenta que depende del tipo de célula, por lo menos 200 a 250 secta célulaiones deben agruparse por muestra, la idoneidad del método para un cierto diseño del estudio depende en gran medida de los requisitos de tiempo para la etapa de LAM.
Además, dependiendo de la morfología del tejido, puede ser ventajoso en términos de estructura para reducir el espesor de las secciones a 6 micras. Del mismo modo, las secciones más gruesas de lo ideal ≥ 8 micras típicamente resultan en una mayor cantidad de ARN y ARN de ligeramente más alta calidad a partir de la misma cantidad de secciones de tejido. Además, las células de interés deben tener al menos un diámetro de 8-10 micras para hacer el aislamiento por LAM factible.
En principio, el protocolo descrito aquí se puede ajustar para diferentes tipos de células y de tejidos de especies alejadas. Sin embargo, la calidad del ARN puede variar incluso entre diferentes tipos de células de la misma especie 7,10,13. Este protocolo ha sido ajustada en base a los tipos de células pequeñas y críticos. Por lo tanto, ahora se puede aplicar a un broader gama de muestras sin más ajustes. Ligeras modificaciones del protocolo podrían no obstante ser necesario, dependiendo del tipo de célula y de las especies bajo investigación. Se recomienda utilizar primero ambos fijadores alternativos (véase el protocolo 1.1) al configurar el método para una nueva especie o tipo de célula para una comparación de la morfología y la calidad del ARN.
En principio, el protocolo se puede adaptar a y se realizó con diferentes instrumentos adecuados para microdisección láser 9. Sin embargo, hay que señalar que los instrumentos varían tanto en la potencia del láser y el ancho mínimo del haz de láser que se puede aplicar, así como en la tecnología de muestreo. En particular, para el aislamiento de células pequeñas y zonas de tejido, los láseres que resulta en un camino estrecho de láser se adaptan mejor. El rayo láser del instrumento que usamos es bastante fino (~ 1 m ancho) y permite la disección de las células pequeñas. La tecnología de muestreo de recoger el cells en una superficie pegajosa tapa por adhesión electrostática es particularmente ventajoso para los tipos de células pequeñas y el aislamiento de secciones de células individuales. Esto minimiza el riesgo de pérdida de la muestra por efectos electrostáticos.
La calidad del ARN obtenido es importante para una mayor análisis de la transcripción
Uno de los puntos más críticos para el éxito de la preparación de la biblioteca de ARN-Sec es la calidad del ARN. Mientras que varios proveedores de kits de amplificación optimizan su tecnología para el ARN de la integridad incluso más baja, la calidad de los datos obtenidos tras el análisis del transcriptoma por cualquiera de microarrays o RNA-Seq aumenta típicamente con la calidad del ARN de entrada. El uso de este protocolo establecido, se obtuvieron buenos y altamente reproducible ARN de calidad para diferentes etapas de desarrollo de los tejidos reproductivos femeninos y de la línea germinal en Arabidopsis y Boechera (por ejemplo, la Figura 4). Mientras que el método es aplicabletambién para las especies más alejadas (por ejemplo, tomate, no publicado), que debe ser tenido en cuenta que las pequeñas optimizaciones o modificaciones pueden ser requeridos dependiendo de la especie, tipo de tejido, e incluso el ambiente de laboratorio como, por ejemplo, una elevada humedad pudiera comprometer la integridad del ARN durante la preparación de diapositivas y LAM.
Un paso crítico durante el protocolo es el montaje de las tiras de cera que contienen las muestras seccionadas a las diapositivas. Aquí, en particular, el contacto con el agua es un paso crítico. Mientras que la sustitución de agua por EtOH no da como resultado ninguna mejora significativa de la integridad del ARN después del aislamiento (no publicado), la sustitución de agua por metanol hace. Sin embargo, el metanol solo debe ser manejado bajo el capó química y con gran cuidado. Dependiendo del tipo de muestra, como una alternativa a la utilización de metanol, los tiempos de secado después del montaje con agua se pueden reducir a ~ 2 hr (véase 3.3.3.1), dando como resultado igualmente bueno calidad del ARN.Realización de un ensayo para probar la calidad de ARN obtenido mediante el montaje, ya sea en agua o metanol para el tipo celular y la especie de interés se recomienda en el comienzo de un nuevo proyecto.
LAM es una tecnología de gran alcance para el Análisis de la transcripción
En conclusión, hemos optimizado con éxito y se aplica la combinación de LAM y el análisis del transcriptoma tipo de células específicas por microarrays y RNA-Seq a diferentes células del linaje germinal sexual y apomictic en Arabidopsis thaliana, y en Boechera spp., Lo que permite el análisis de la transcripción comparativos (véase también la Figura 5) 7,11,13,14. El método descrito tiene una serie de ventajas en comparación con otras tecnologías que permiten el análisis de la transcripción específica del tipo celular. Es importante destacar que, dependiendo de la reconocibilidad de los tipos o tejidos de interés en la sección de células, se puede aplicar a tipos de células raras tanto de modeloy especies no modelo, tales como las células del gametofito femenino maduro en Boechera spp., o puede incluso ser utilizados para aislar dominios celulares, por ejemplo, mitades polares de las células 19. Aplicaciones similares no serían posibles con otros métodos que se basan en fluorescente activadas por la clasificación de células o núcleos (FACS / FANS) 10.
Un inconveniente importante del método es el requisito de tiempo. Mientras que la fijación e inclusión no requiere disponer de manos sobre el Extended tiempo y al mismo tiempo se ha hecho para una gran cantidad de flores, LAM como tal es muy lento y, para un análisis específico del tipo celular, típicamente 3 días a 3 semanas de LAM (en promedio 5 horas por día en el microscopio láser) tiene que ser planificado. A este respecto, es útil hacer algunas pruebas previas para la velocidad de aislamiento del tipo celular específico dirigido a diseñar adecuadamente el estudio. Además, incluso cuando se utiliza este protocolo optimizado, los ensayos para probar la calidad del ARN son altamente resobresaliente.
En resumen, LAM es una herramienta poderosa para el análisis de la transcripción en la resolución de los tipos de células individuales o incluso subdominios de células, lo que no se puede lograr usando métodos alternativos existentes. En este sentido, lleva un enorme potencial para permitir los análisis, por ejemplo, de los procesos de desarrollo, con una muy alta resolución temporal y espacial. Esto fue ejemplificado por los análisis de los transcriptomes de células en todos los pasos clave de la reproducción sexual y la apomixis en Arabidopsis y Boechera 7,11,13,14.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | VWR | 1,009,861,000 | absolute EMPROVE Ph Eur,BP,USP |
| 15 ml falcon centrifuge tubes | VWR | 62406-200 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2939AA | |
| Acetic Acid | Applichem | A3686,2500 | 100% Molecular biology grade |
| Ambion Nuclease free water | life technologies | AM9932 | |
| ASP200 S | Leica | 14048043624 | tissue processor |
| black cardboard | can be purchased in special paper shops | ||
| DNA- and RNAse-free Frame Slides | Micro Dissect GmbH | 1, 4 µm PET-membrane; can also be purchased from Leica | |
| Dumond Forceps | Actimed | 0208-5SPSF-PS | |
| ethanol lamp | |||
| exsiccator | Sigma-Aldrich | Z354074-1EA | Nalgene Vaccuum Dessicator or similar equipment |
| filter tips 10 µl | Axon Lab AG | AL60010 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 1,000 µl | Axon Lab AG | AL60010 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 20 µl | Axon Lab AG | AL60020 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 200 µl | Axon Lab AG | AL60200 | can be replaced by similar tips |
| forceps precision | VWE | 232-1221 | |
| glass slide holder | Huber & Co.AG | 10.0540.01 | Färbekästen nach Hellendahl |
| glass staining trough | Huber & Co.AG | 10.0570.01 | Färbekasten |
| Heated Paraffin Embedding Module Leica | Leica | Leica EG 1150 H | blocking station, similar devises are suitable |
| Heating and Drying Table | Medax | 15501 | other models and/or suppliers are suitable |
| ice bucket | VWR ice bucket with lid | 10146-184 | similar buckets equally suitable |
| light table | UVP An Analytical Jena Company | TW-26 | white light transluminator |
| microscope slide | Thermo Scientific | 10143562CE | cut edges |
| microtome blade | Thermo Scientific | FEAHS35 | S35 microtome blade disposable |
| MMI Cell Cut Plus Instrument | MMI (Molecular Machines and Industries) | ||
| Non-stick, RNAse free Microfuge tubes, 2 ml | life technologies | AM12475 | |
| Paraplast X-TRA | Roth | X882.2 | for histology |
| PicoPure RNA Isolation Kit | life technologies | KIT0204 | Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit |
| plastic balancing trays | Semadeni AG | 2513 | |
| plastic box | Semadeni AG | 2971 | Plastikdose PS |
| plastic lid for heating plate | homemade | ||
| preparation needle | VWR | 631-7159 | |
| RNA 6000 Pico Kit | Agilent | 5067-1513 | |
| RNAse free microfuge tubes | life technologies | AM12400 | |
| RNAse ZAP Decontamination Solution | life technologies | AM9780 | |
| Semi-automated Rotary Microtome | Leica | RM2245 | similar devices are equally suitable |
| Tissue Loc Histo Screen Cassettes | Thermo Scientific | C-1000_AQ | similar cassettes of other suppliers are suitable |
| Tubes with adhesive lid, without diffusor 500 µl | MMI (Molecular Machines and Industries) | 50204 | |
| Xylol (Isomere) ROTIPURAN | VWR | 4436.2 | min. 99%, p.a., ACS, ISO SP |
| process embedding cassettes | Leica | 14039440000 | Leica Jet Cassette I without lid |
| Universal Oven | Memmert | UF55 | other models and/or suppliers are suitable |
References
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