Introduction
組織レベルで行わ転写の研究では、専門性の高いまれ細胞型のトランスクリプトームは、多くの場合、より豊かな周囲の細胞によってマスクされています。このような専門性の高い細胞型のための例は、植物中の女性の生殖細胞系列（生殖細胞系列）の細胞です。女性の生殖細胞系列は、花の1,2の雌ずい群内部の種子の前駆体を胚珠を開発内で指定されています。大胞子母細胞（MMC）は、女性の生殖細胞系列の最初のセルです。それを低減大胞子のテトラッドを形成する減数分裂を受けます。合胞体に、 すなわち 、典型的には、これらの大胞子のうちの1つのみが生き残り、細胞質分裂せず、有糸分裂分割します。 3 antipodals、2助細胞、卵、および中心細胞：これらの有糸分裂は、典型的には、4つの細胞タイプで構成されて成熟した配偶体を形成し、細胞化が続いています。卵と中央細胞が堂中に2つの精細胞により受精を受ける女性の配偶子です開発シード1,2の胚と胚乳に生じさせるBLE受精。 80種子密接に関連属Boecheraで花あたりの開発-約50の一方で性的なモデル系のシロイヌナズナでは、唯一〜50個の種子は、花ごとに開発しています。このように、女性の生殖細胞系列は、このような細胞の仕様や分化などの発達過程を研究するための優れたモデル作り、わずか数専門性の高い細胞タイプで構成されています。
また、植物の再生を支配する遺伝子調節プロセスへの洞察は、印加された値とすることができます。植物では、種子（アポミクシス）を通じて両方有性と無性生殖が発生する可能性があります。有性生殖は、集団における遺伝的多様性を生成しながら、アポミクシスはマザー工場に遺伝的に同一であるクローン子孫の形成につながります。複雑な母系遺伝子型はできる限りそのため、アポミクシスは、農業と種子生産のアプリケーションのための大きな可能性を秘めています数世代3,4,5にわたって変化していない維持します。アポミクシスが自然にすべての主要な作物種では発生しませんので、作物におけるアポミクシスの工学は大きな関心の3,4,5です。無配偶生殖の根底にある遺伝的および分子的基礎は十分に詳細6で理解されていないため、この長期的な目標を達成することは困難です。
アポミクシス再生を支配する転写基礎への洞察を得るために、細胞型特異的転写プロファイリングレーザ支援顕微解剖（LAM）と次世代シーケンシング（NGS）を使用して、非常に強力なアプローチ7,8を表します 。 LAMは、最初の動物と生物医学研究のために設立されました。過去数年間にLAMは、植物生物学6,9,10に適用されています。個々の細胞や組織の種類のプロファイリングを可能にする他の方法とは対照的に、LAMは、マーカーライン6,9,10の生成を必要としません。したがって、それはアプリすることができます事前の分子の知識なしには、いかなる細胞または組織型に嘘をつきました。 LAMの別の利点は、それがあれば、セル位置および/または構造的特徴に基づいて、乾燥セクションに認識できるように、任意の細胞型に適用することが可能です。 LAMは、処理中の転写プロファイルの変化を防止する、固定された組織を使用するさらなる利点を有します。
目的の組織、 例えば、花の組織は、前パラフィンワックスに包埋した非架橋固定剤で固定されています。パラフィンワックスに埋め込 みが確立されたプロトコル9,11以下、手動で行うことができます。しかし、ワックスで脱水し、浸潤のための自動化組織プロセッサの使用は、一般に、RNAの品質および組織形態の保全の観点から、より高い再現性をもたらします。樹脂中に組織を埋め込 む別の戦略もうまくLAM 8によって細胞型特異的な分析のために使用されてきました。しかし、AUTOMの使用多くのサンプルは一度ハンズオン時間の最小値を必要に処理できるように、ワックスに埋め込むためated組織プロセッサは、非常に時間が効率的です。 RNAの品質の一般的に有意な損失は固定および埋め込み時に発生しませんが、ミクロトームで薄片の製造および、特には、LAMのために使用frameslidesへの実装は、RNAの質の保全のための重要なステップのまま。これは、前述されたテープ移送システムの使用は、このステップ12で、より良好なRNAの質をもたらすことが記載されています。しかし、これは、スライドの準備中に追加の時間のかかるステップを追加し、また、特別な装置を必要とします。以下に説明する最適化されたプロトコルは、再現性の遺伝子チップと次世代シーケンシング（NGS）は7,11,13,14に近づくと転写プロファイリングのために十分な品質であるRNAを産生します。また、使用されるレーザ顕微解剖顕微鏡を用いて、単離された細胞型の高純度ROUTありますinely 7,11,13,14を生産しました 。
属Boecheraはアポミクシス生殖の重要なステップを研究するための優れたモデルシステムです。 Boecheraにおいて、異なる性的及びアポミクシスアク種々の同定されており、比較のために使用することができる15,16,17分析します 。性的シロイヌナズナ及びアポミクシスBoecheraから女性の生殖細胞系列からの細胞の細胞型特異的トランスクリプトームの比較では、我々はそれによって7をアポミクシス支配する規制プロセスの新たな側面を特定する、示差的に発現している遺伝子および経路を同定しました。さらに、この研究は小さく、まれな細胞タイプの細胞型特異的転写分析のためのLAMの適合性を検証しました。すでに植物種の様々な異なる細胞型の分析のためにこのプロトコルを使用しているが、プロトコルに、種および組織特異的修飾は、特定の場合には必要とされ得ます。
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Protocol
注：このプロトコルは、組織標本、レーザ支援顕微解剖、および転写プロファイリングのためのRNA抽出を説明します。常にプロトコルのすべてのステップを通して手袋を使用しています。使用される各化学物質の安全指示を研究し、検討してください。特に、キシロールは有害であると手袋を貫通することができ、そのメタノールは毒性であることに留意してください。使用されているすべての機器の場合は、それに応じてユーザーマニュアルを参照してください。
1.ガラス製品からのRNA分解酵素活性の取り外しおよびその他の機器
- 使用前に、RNアーゼフリーの品質を確保するために前に180℃で〜8時間焼成したアルミニウム箔の任意のガラス製品を包みます。
- 任意の金属表面を処理（ 例えば、ピンセット）だけでなく、作業台と適切なRNA分解酵素除染液と加 熱プレート。その後、除染液を除去するためにRNaseフリー水で表面を洗浄します。その後、70％エタノールでさらに表面を洗浄。
- すべてのPLAを使用してくださいチック消耗品（ 例えば、チューブ）ブランドの新しい任意の前処理なし。可能な場合は、RNaseフリーすることが認定されているプラスチック製の消耗品を使用します。
2.組織固定
- （3：1;（v / v）のエタノール：酢酸）農家の固定液の10ミリリットルを準備し、新鮮な15mlチューブに氷の上。 （必ず使用前に新鮮なファーマーズ固定液を準備します）。代替的に、非架橋固定剤のエタノール：酢酸（5：1、v / v）の18を使用することができます。
- 関心の発達段階で芽を収集するためにピンセットの罰金のペアを使用してください。直ちに氷冷固定液に芽を沈めます。 シロイヌナズナやBoecheraから〜20芽や花の固定のための固定液の10ミリリットルを使用してください：大きい花と植物種を使用する場合には、固定前に小さな断片を生成するために、かみそりの刃で花を解剖することをお勧めします。
- inflorの3最大の花芽 - 成熟した配偶体を得るためには、2を骨抜き収穫前2日escence。
- 氷と乾燥器の底を埋めます。直接彼らは倒れることができないように氷にそれらを置くことによって、または適切なホルダーを使用することにより、サンプル、 例えば、花を含むチューブを開き、氷の上に置きます。真空は、真空の放出前に15分間浸透させます。
- 15分間に一度真空浸透を繰り返します。
- 氷の上に真空や店舗で一晩（〜12時間）をリリース。蓋やアルミ箔と氷のバケツをカバーし、解凍から氷を防止するために、4℃ルームや冷蔵庫でバケットを格納します。注：固定時間を延長することはお勧めしません。
3.組織の埋め込み、薄い断面化、およびLAMのためのスライドへの取り付け
- 組織の埋め込み。
- 純エタノールおよびRNaseフリー水を用いて調製し、70％エタノールに固定液を交換します。さらなる処理まで氷上でサンプルを残します。 embeを開始サンプルのdding同じ日。何の組織処理機が利用できない場合には、他の場所9,11を説明するように手動埋め込 みに進み、ステップ3.1.11に進みます。
- 静かにピンセットで組織包埋カセットにサンプルを転送します。しっかりとカセットを閉じます。重要なステップ：このステップの間にサンプルの偶数部分的な乾燥を避けてください。ピンセットで試料の圧搾を避けてください。
注意：鉛筆は、理想的には、カセットの傾斜面に書き込むことによって、使用されるべきであるカセットにラベルを付けるには。 - すべての材料がカセットに転送され、埋め込みマシンがロードできるようになるまで70％エタノール中の芽や花を搭載した包埋カセットを保管してください。この目的のために、70％エタノールを充填したガラス染色トラフを使用します。
- マシンのレトルトから組織プロセッサのバスケットを取り外し、上部に面した斜面で、同じ方向にバスケットに包埋カセットを移します。 CRITICAL STEP：組織のいずれの乾燥を防ぐために、すぐにこれを実行します。一度に多くの包埋カセットを処理する場合は、前のサンプルをロードする70％エタノールで満たされた適切なRNAseを含まない容器にバスケットを置きます。
- バスケットの蓋を置き、レトルトに戻しバスケットを置きます。レトルトを閉じます。
注：組織プロセッサは自動的にサンプルを脱水、キシロールに溶剤を変更し、溶融したパラフィンワックスで浸潤を行います。典型的には、これは、一晩行われます。 - 組織プロセッサのプログラムを起動します。推奨標準設定は浸潤に続いて室温で1時間70％エタノール、3回1時間90％エタノール、3回1時間の100％EtOH、2回1時間100％キシロール、1時間1時間15分100％キシロール、あります1時間および56℃11で3時間のために1時間のためのパラフィンワックスで2回。
注：ブロッキングステーションが溶融ワックスで準備ができていることを確実にするために、開始の数時間前にマシンを切り替えますかおおよその開始時間を選択するためにタイマー機能を使用します。
注：場合、組織は56℃で、直後にパラフィンワックスより長いインキュベーション時間を処理することができないではなく、56°Cで3時間の可能です。機器のマニュアルを参照してください。 「空のレトルト」コマンドが承認されるまでは一般的に、組織とのカセットは自動的に溶けたロウのままになります。組織処理を開始するときに、ワックスが溶融されていない場合は、レトルト70％エタノールで充填し、開始する準備ができるまで、プログラムは保留のままです。 - レトルトを空にし、すぐにブロッキング駅に56℃のパラフィンワックス浴にサンプルを転送します。バスケットから蓋を外し、その蓋をブロッキング駅のパラフィン浴をカバーしています。
- バスケット内のカセットがあるとして、ブロッキングステーションの表面のパイルのような多くの新鮮なバランストレイは56℃に加熱しました。
注：エタノール耐性永久マーカーは使用することができますdはバランストレーの底にラベルを付けます。アセトン耐性マーカーが推奨されていません。 - ブロッキングステーションを使用して、56℃で溶融パラフィンワックスと予め温めた新鮮なプラスチック分散トレイを満たします。 、パラフィン槽の蓋を持ち上げ、一度に1つのカセットをピックアップし、ピンセットを使用してバランスをとるトレイに56℃の流動パラフィンワックスにカセットからサンプルを転送します。
重要なステップ：すぐに働くことによってカセットの処理中にサンプルを囲むワックスの任意の硬化を避けてください。- ワックスの硬化前の準備針を使用して、必要に応じて位置が全てのサンプル。典型的には、いくつかの花は個別方向に約1cm離間平衡トレイに配置されています。
- すべてのサンプルが転送されるまで、ステップ3.1.9を繰り返します。
- バック組織プロセッサにバスケットを置き、適切なプログラム（ユーザーマニュアルを参照）を使用してレトルトをクリーニングします。
- 組織プロセッサとブロッキングステーションのスイッチをオフにします。ステップ3.1.13に進みます。
- ケースではない組織浸潤機なし埋め込み局は56℃のパラフィンワックスを溶融する加熱炉を使用し、使用できません。ベンチに、ワックスにサンプルを転送し、プラスチック製のバランストレイに溶けたロウを記入し、サンプルを配置するために準備針を使用します。
- 4°Cでサンプルを保存する前に3時間 - パラフィンワックスが〜1、室温で硬化することを可能にします。サンプルは、その後、新たに処理または数ヶ月まで保存することができます。
- LAMのための薄い切片とスライドの準備。
- 下からワックスブロックを照明光テーブルの上に、周囲のプラスチックトレーからのサンプルとパラフィンワックスを除去します。 例えば 、組織を含む二乗ワックスブロックを解剖。、芽や花を、RNAseを含まないカミソリの刃を使用して。この目的のために、常にワックスブロックの上の方のサンプルを配向（も参照してください。
- 一度にLAMのために使用されるべき全てのサンプルのワックスブロックを準備します。
- 下からワックスブロックを照明光テーブルの上に、周囲のプラスチックトレーからのサンプルとパラフィンワックスを除去します。 例えば 、組織を含む二乗ワックスブロックを解剖。、芽や花を、RNAseを含まないカミソリの刃を使用して。この目的のために、常にワックスブロックの上の方のサンプルを配向（も参照してください。
- 硬化パラフィンワックスで満たされたカセットを埋め込む処理するためにブロックをマウント：エタノールランプを使用して、適切なへらの先端の小片またはパラフィンワックスの液滴を溶融し、埋め込まれた組織と（支持体の上にブロックを修正するためにホットワックスを使用一番上）。
- ワックスは4℃で少なくとも20分間硬化することができます。
- ライトテーブルの上にかみそりの刃でサンプルを周囲の余剰ワックスを削除します。平行なエッジ（ 図1参照）と正方形の表面を維持することを確認します。
- 42℃に加熱プレートを設定します。
- 安全にミクロトームにサンプルをマウントし、6準備 - 10μmの厚さの切片を。ミクロトームを用いて製造元の説明書を参照してください。注：シンナーのセクションでは、多くの場合、より良い構造の解像度が得られますが、higheのRNA量が多いですR品質は、より厚いセクションを得ることができます。 Boecheraの細胞が配偶体の成熟のために我々は、デフォルトとして7ミクロンを使用します。ミクロトームナイフ以上のサンプルではなく、ゆっくりと移動すると、多くの場合、より良い組織学になります。
- LAMスライドでそれらを配置する前に、下部の黒いボール紙とプラスチック製の箱に15センチメートル - 常に約10の長さでパラフィンリボンを転送します。
- 可能な場合は、解剖スコープの下で、 例えば 、目的の細胞または組織タイプ、胚珠を含むパラフィン片の一部を事前に選択して、残りを捨てます。
- 加熱プレート上に上に平らな面で - 金属枠のスライド（10典型的には、5）の必要量を配置します。
- ピペット〜1 - スライドのプラスチック部品にRNAseを含まない水の2ミリリットル。プラスチック製の窓にまたがるのに十分な長さの5センチメートル - カミソリの刃を使用して、約4の短い断片にパラフィンリボンをカット。 Uピンセット、理想的にはパラフィンストリップはスライドのプラスチック製の窓上に互いに平行に配置する準備針をSE。慎重に水を除去し、バックスライドを配置するために一端でスライドを持ち上げます。
- また、化学フード下で加熱板を配置します。表面を濡らすのに十分なだけのスライドのプラスチック部分に少量のメタノールを適用します（これは、スライドの若干の波打ちを引き起こす可能性があります）。スライド上のパラフィンストリップを配置します。
注：可能な場合、毒性の理由から、メタノールの使用を避けます。ただし、この段階でメタノールを使用することは、水に取り付けることによって達成品質が十分でない場合に、RNAの品質を改善します。達成RNAの品質は、調査中の細胞型および種に応じて変化するように、それは、新しいプロジェクトの開始時にこれらの選択肢をテストする価値があります。
- また、化学フード下で加熱板を配置します。表面を濡らすのに十分なだけのスライドのプラスチック部分に少量のメタノールを適用します（これは、スライドの若干の波打ちを引き起こす可能性があります）。スライド上のパラフィンストリップを配置します。
- 〜12時間42℃で加熱プレート上で一晩スライドを乾燥させます。加熱プレートをカバーしてスライドには触れていないプラスチック製のふた。プラスチック製の蓋は空気の交換を妨げないことを確認してください。これに蓋を持ち上げることがピペットボックスまたは同様に配置することができる目指します。
- あるいは、2つの時間の最小値、または組織が完全に乾燥した表示されるまでの乾燥時間を短縮します。コレクションにスライスからの時間の短縮は、RNAの質を改善することができます。
- 化学フード、脱ワックススライド適切なスライドホルダーを使用して、キシロールで10分間、2回の下で。完全に乾燥した状態で保管されている金属フレームのより広い端をタッチしてスライドの除去を可能にするだけでなく、各スライドのプラスチック部分を沈めるようにしてください。
- スライドは前LAMへの化学フードの下で〜10分間乾燥することができます。
注：すぐに処理されないスライドは、組織が数時間までのために上に向けて、42℃で背加熱プレート上に配置することができます。これは、さらなる処理までRNAの品質を損なうことから、任意の湿度を防ぐことができます。
4.レーザーアシストマイクロダイセクション（LAM）
注：LAMのための手順が使用される機器によって異なります。このプロトコルの特定の詳細は、特定の機器と静電気力を利用して、キャップのサンプルを収集する技術に適合されています。また、詳細があっても、ソフトウェアの異なるバージョン間で異なる場合があります。詳細な説明、機器やソフトウェアについての具体的な手順については、メーカーの説明書、ユーザーハンドブックを参照してください。
- LAM（コンピュータ、顕微鏡、レーザーコントロールボックス）のための装置のスイッチをオンにします。
- 顕微鏡とレーザーを操縦プログラムを起動します。
- コントロールボックス上の対応するボタンを押すことにより、レーザのスイッチをオンにします。
- キャップホルダーにキャップ（ディフューザなしで0.5ミリリットルを、）を配置し、機器でそれを配置します。
- 顕微鏡用スライドガラスとLAMのスライドをサポートしています。とスライドの平らな表面ことを確認してください付着した組織は、スライドガラスに面します。
- 下にスライドガラスを持つ楽器でスライドを配置します。
- 4X目的を選択します。プログラムでは、「アップ」の位置にキャップを移動し、スライドのスキャンを行うために進むことを選択します。
- スライドを検索し、興味の構造を識別します。ピンポイントおよび切断工程のための正確な位置に戻すことができるように、スライド上の位置を保存します。
- 適切な目的（ 例えば 、40Xまたは60X）を選択します。
- 必要に応じて、レーザ速度、焦点、およびレーザーパワーを調整し、また、機器のユーザーマニュアルを参照することにより、ステージ移動を較正します。アカウントが関心のある特定の組織のために設定されると、設定を再利用することができます。
- 理想的には、組織のない膜の一部に、プログラムの「レーザーショット」ボタンを押して、シングルショットによるレーザ位置を確認します。
- 必要であれば、目に従うことによって、レーザーの位置を較正します楽器用の電子メーカーの指示。
- 押されたマウスの右ボタンを保ち、モニタ上のソフトウェアのウィンドウのすべての四隅に明らかな構造を移動することによって、目的のキャリブレーションを確認します。明白な構造に関して、手の位置はすべての4つのコーナーで同じであることを確認してください。そうでない場合は、ソフトウェアのマニュアル、次の目標を調整します。
- 「ダウン」位置にあるキャップを、 例えば 、卵細胞を目的の細胞型または組織の境界をマークする「ハンド・ペン」ツールを使用します。 「カット」を押して、レーザーで目的の細胞を分析。注：多くの場合、セルの周囲に境界線が完全に一度に解剖されなかった場合に繰り返される必要が切片。この場合には、自動的に標準としてセクションの2反復を行うためのソフトウェアを設定することをお勧めします。
- キャップを持ち上げて、関心のある構造を持つ次の保存された位置に移動します。繰り返し手順4.131スライドから関心のあるすべての細胞が収集されるまで、次のセル部を分析するための手順の。キャップが新しいセクションは、キャップ上の空の位置にこだわっていることのように配置されていることを確認します。
注：組織の大部分を分離するために推奨される（ 例えば、花全体またはその一部のセクション）新鮮なキャップ上の単一のセル部の分離後の各スライドから。これらは、RNAの品質管理のために使用することができます。 - スライドを削除し、手順4.4繰り返して、次のスライドに進みます - 4.14に4.9と4.13を。
- すべてのスライドから目的の細胞タイプまで、繰り返しステップ4.15および関連する手順は、単離されています。注：〜4よりも長く収穫することは推奨されません - 同じキャップに5時間。
- 視覚的に、試料の非特異的な汚染を排除するためにLAM後キャップ面を検査します。非解剖組織はホイルで保護されていますが、塵は静電付着する表面に固執することができます。
- TO視覚的に、キャップを検査機器からスライドを削除します。 "ダウン」位置にキャップホルダを配置し、4Xの目的で表面を検査します。
- ほこりの小片が表示されている場合には、小さな（2μl）をピペットチップでそれらを削除します。また、スライド（なし組織）の自由部分にキャップを置き、バック機器のスライドをマウントし、完全にレーザーを使用して汚染を破壊します。
- 閉じるキャップ、さらに使用するまで-80℃での乾燥セクションを凍結します。必要な場合、試料は数週間まで保存することができます。しかし、この段階で迅速に進んことをお勧めします。
5. RNAの分離および品質管理
注：RNAは、RNAの少量のに適した任意の方法によって単離することができます。このプロトコルではRNAの少量のために指定されたRNA単離キットを使用することが記載されています。製造元の指示に従ってください。
- に接続されているサンプルとチューブを使用してくださいキャップ直接または-80°Cから除去した後。
- チューブを開き、慎重にフィルターチップを使用して、各チューブの壁に抽出緩衝液の11μLをピペット。サンプル間のヒントを変更します。
- 蓋を閉め、チューブのキャップまでの抽出緩衝液を振ります。
- 42℃に予熱した加熱炉内でダウンキャップでチューブを置きます。製造者の指示に従って30分間インキュベートします。
- カラム調製については、製造元の指示に従って、チューブの底にエキスを集めます。
- 個別に各チューブ/キャップのための5.1.2 - 複数のキャップからの材料は、一つのサンプルに結合する必要がある場合は、ステップ5.1.1に進みます。
- （製造元の手順を参照してください）その後、一本のチューブに1サンプルのための抽出物をプールし、EtOHの当量を添加する前にピペットを用いてプールされた抽出物の量を測定します。
- ことを確認のEt量OH列をロードする前に追加されたがプールされた抽出物の量に等しいです。
- EtOHでのRNA沈殿させた後、製造者の指示に従って列の読み込みに迅速に進んでください。 100×gでの遠心分離工程でプロトコルを続行します。
- 各収集管の内容物がカラムを通過した後、フロースルー以下の製造者の指示を除去するために30秒間16,000×gでの遠心分離工程を行います。
- 製造者の指示に従ってRNA抽出および精製に進みます。
- カラムの溶出緩衝液をロードした後、カラムを1分間インキュベートすることを可能にします。製造元の説明書の指示に従って遠心分離にチューブをロードし続けます。注：溶出前に100×gで1分間の追加の遠心分離工程を、溶出の効率を高めることができるプロトコルに示されるように。
- 続きからRNAを抽出このプロトコルの5.2.7へのステップ5.1以下のRNAの品質管理のためのrols（より大きな組織切片）。
- 製造者の指示に従ってRNAピコチップを用いたバイオアナライザー上の各対照試料のRNA品質制御負荷1μlの希釈していない全RNAのため。
注：抽出されたRNAは、マイクロアレイまたはRNA-、配列番号7,11,13,14を用いた線形増幅およびトランスクリプトーム解析のために使用することができます。品質管理は、少なくとも7のRNA完全性番号（RIN）を示すべきであるサプライヤーの数が増幅に適したキットを提供する理想的には、適切な例9に記載されています。
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Representative Results
サンプル調製とLAMは、連続工程で行われています
連続したステップの数は、LAM（ 図1）によって選択された細胞型からの転写分析のためのRNAを調製する必要があります。これは、RNA集団は、収穫後に変わらないことを確実にするために、花の収穫と直接固定することから始まります。組織は、埋め込まれた切片、スライドに取り付けられています。これは、LAMによる細胞および一つまたは複数のキャップ（ 図1）の細胞型特異的セクションのプールの単離を可能にします。材料はその後凍結直接RNA抽出によって処理することができます。別に両方のモデルと非モデル種における分析LAMの利点は、細胞型特異的に適用されるべきで、この方法は時間がかかりむしろ残ります。作業時間のうちの少なくとも1週間は、時々より、TIからのステップのために必要とされますRNA抽出にssue収穫（ 図1）。これは、LAMの数日間にわたって採取し、多くの場合、セクションは、1つの生物学的サンプルとRNA抽出にプールされていることを考慮する必要があります。最大100〜までのセクションでは、一日あたりの単離されたとBoechera卵細胞について、サンプル当たり少なくとも〜200のセクションの使用が強く推奨されています。
目的の細胞型の単離は、ドライセクションでの視認性に依存します
細胞型特異的部分の分離は、プロトコルの最も時間のかかるステップです。これまで、このステップのない自動化を伴う試料の複雑な性質のために開発されていません。乾燥セクションは低コントラストを有しており、切断面が胚珠をW異なる角度で配向されているという事実に起因し、サンプル間で変化するためのソフトウェアツールを使用して、関心のある細胞の同定は不可能です組織をithin（ 図2）。それにもかかわらず、成熟した女性の助細胞と配偶体、卵細胞、および中央のセル（正反対の細胞は受精前に縮退）のユニークな形態は、研究者によって卵細胞（;図3、図2B、C）の明確な同定を可能にします。実際、Boecheraのdivaricarpaで、卵細胞は、多くの場合、準備中にビットを縮小するため、周囲の組織、高純度で卵細胞集団を単離するための有利な特徴（ 図 2B、C;図3）から分離します。
LAM後のキャップの目視検査が推奨されます
LAM後はキャップ表面の目視検査は、埃によって、 例えば 、サンプルのいずれかの可能性のある汚染の同定を可能にします。また、それ自体ことを確実にするために有用ですctionsは、時折のセクションでは、手順の間に迷子に、キャップに固執します。典型的に、多くの選択されたセクションは、 例えば 、卵細胞は、LAMの数時間次々キャップで見ることができます。
設立ワークフローは、再現性良いRNAの品質に結果
女性の配偶体からの細胞型特異的LAMアイソレーションから、全RNA量はごく低いngの範囲です。 RNAのこの制限量はLAM後のRNAの品質管理のための近似値として、各スライドの大きい組織から単離された代表的なコントロールを使用することが必要になります。これは、Bからの細胞型特異的RNAの比較によって実証されますより大きな組織領域からの対照と比較してdivaricarpa卵細胞は、同様のRNAの質（ 図4A、B）を示し、同じスライドから単離しました。 RIN番号＆＃と高いRNAの品質にこの方法を使用して、良いです8805; 7を再現性が得られます。達成されたRNAの質はなくアポミクシス中央セルの助細胞、またはアポミクシス初期細胞にアポミクシス卵細胞中で発現さ236遺伝子の同定につながる、細胞型特異的RNA-のSeqに適した、また細胞または中シロイヌナズナの成熟した性的配偶体（ 図5）7。
図1：プロトコルのステップのスキーム、ステップごとに必要な最小限の時間を示す関心のある花や組織の固定は、一晩に行われます。翌日、埋め込みは、プロトコルの3日目に埋め込まれた材料が得られ、一晩実行され、開始されます。日にワックスブロックに包埋サンプルから始まる3ミクロトーム切片を生成することができます。薄いパラフィン切片のリボンは、スライド上にマウントし、一晩放置して乾燥させています。にLAMの数日間に電子が一つの生物学的反復のための十分な材料を得るために必要とされるであろう。 RNAの単離および品質管理の後、RNA-のSeq用のライブラリの準備がトランスクリプトーム解析を準備するために行うことができる。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：卵細胞が原因雌性配偶体の特徴的な形態 （A）成熟した雌性配偶体（ タデタイプ）の模式図（B - C） に、薄い部分で明確に識別されているの女性配偶体を保有胚珠を通じて薄片。 Boecheraのdivaricarpa。卵細胞がはっきりと見えます。 E、助細胞：Sにより、多くの場合、雌性配偶体の形態ではないすべての細胞型（卵細胞に、中央のセル：CC）は、単一のセクションに表示されます。スケールバー=50μmでは。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Boechera divaricarpa。A の卵細胞 と Bの成熟した配偶体のC.セクションの図3. LAM 、BおよびDの前に7ミクロンでdivaricarpa、レーザ装置（卵細胞：E、助細胞：S、中央のセル：CC）と顕微解剖後。スケールバー=50μmでは。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
<強い>レーザー解剖卵細胞と制御部の図4. RNAの品質。コントロールと同じスライドから収穫（B）より大きな組織領域と比較して、卵細胞のセクションから分析として（A）RNAの品質。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
236アポミクシス卵細胞で発現する遺伝子が、どちらもアポミクシス中央のセルで、の助細胞のアポミクシスと性的成熟した配偶体またはの細胞と比較してのみアポミクシス卵細胞で発現する遺伝子の図5.同定はアポミクシス初期セル。ヒートマップBの、またはアポミクシス初期セルgunnisonianaもAの成熟した性的配偶体の細胞シロイヌナズナ 7階層サンプルおよび遺伝子のクラスタリングは、ユークリッド距離と階層的凝集クラスタリングに基づいていました。赤は高発現と黒の低い発現を示しています。色は、行ごとにスケーリングされます。アポ：アポミクシスこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
プロトコルは、異なる細胞や組織の種類に適しています
トランスクリプトームと組み合わせLAMは、マイクロアレイ分析により、またはRNA-のSeqは、発達または生理学的プロセス7-11,13,14を調節する遺伝子活性の特定のパターンへの洞察を得るための貴重なツールです。しかし、任意の所与の細胞型のため、この方法の適合性は、構造的な問題に決定的に依存しています。セルがはっきりと見えるとLAMのために使用されるドライセクションで明確に識別する必要があります。 Boecheraのdivaricarpaでは、配偶体の形態は、卵細胞（ 図2、図3）を簡単に識別することができます。最後に、特定の細胞集団の単離の速度はまた、細胞型は、新しいスライドをスライドの交換及び走査ような1つのスライド上で見つけることができる周波数に依存し、時間のかかる工程です。 250セルの宗派 - 細胞型、少なくとも200上の依存を考えますイオンは、サンプルごとにプールする必要があり、特定の研究デザインのための方法の適合性は、LAMのステップのための時間要件に大きく依存します。
また、組織の形態に応じて、それは6ミクロンに切片の厚さを減少させるために構造の点で有利であるかもしれません。同様に、理想的には≥8μmの厚い部分は、典型的には、組織切片の同量よりわずかに高い質の高いRNAの量およびRNAをもたらします。実現可能なLAMによって分離を行うためには10μm - また、関心対象の細胞は、8の少なくとも直径を有しているべきです。
原理的には、ここで説明するプロトコルは、遠縁種由来の異なる細胞および組織型に調整することができます。しかし、RNAの質も同じ種7,10,13の異なる細胞型の間で変化することができます。このプロトコルは、小型で、重要な細胞型に基づいて調整されています。したがって、現在broadeに適用することができますさらに調整することなく、サンプルのRレンジ。プロトコルのわずかな変更にもかかわらず、調査中の細胞型および種に応じて、必要な場合があります。形態およびRNAの品質を比較するための新しい種または細胞型のための方法を設定するときは、最初に両方の代替固定剤を使用することをお勧めします（プロトコル1.1を参照）。
原則として、プロトコルは、に適合させることができ、レーザーマイクロダイセクション9に適した別の器具を用いて行います。しかし、機器は、サンプリングの技術に、並びに、レーザパワーと適用することができるレーザビームの最小幅の両方において変化することに留意する必要があります。特に小細胞や組織領域の単離のために、狭いレーザー経路が得られるレーザーが適しています。我々が使用する楽器のレーザービームが（〜1μmの広い）かなり細かく、小細胞の解剖を可能にします。セルを収集するサンプリング技術静電付着による粘着性のキャップ面上のLSは、小細胞型および単一セル部の単離のために特に有利です。これは、静電効果によるサンプル損失のリスクを最小限に抑えることができます。
得られたRNAの品質はまた、転写分析のために重要です
成功したRNA-のSeqライブラリーの調製のための最も重要なポイントの一つは、RNAの品質です。増幅キットのいくつかのプロバイダはさらに低い整合性のRNAのために彼らの技術を最適化しているが、いずれかのマイクロアレイまたはRNA-のSeqによってトランスクリプトーム解析の後に得られたデータの品質は、典型的には、入力RNAの品質と共に増加します。この確立されたプロトコルを使用して、優れた再現性の高いRNAの女性の生殖組織の異なる発生段階のための品質とシロイヌナズナとBoecheraにおける生殖細胞系列が得られた（ 例えば、 図4）。この方法は適用可能であるがまた、より遠縁の種（ 例えば、トマト、未発表）のため、それは例えば、小さな最適化または修飾は、種、組織の種類に応じて必要とされ得ることを考慮し、さらに実験室環境などの必要があり、高湿度スライドの準備とLAM中にRNAの完全性を損なう可能性があります。
プロトコルの間の重要なステップは、スライドにサンプルを含む区分ワックスストライプの実装です。ここでは、特に、水との接触は重要なステップです。エタノールによって水を交換しても分離（未発表）した後、RNAの完全性の有意な改善をもたらすものではないが、メタノールによる水の交換はありません。しかし、メタノールは、化学フードの下と、細心の注意を払って取り扱ってください。試料の種類に応じて、メタノールの使用の代替として、水と取り付け後の乾燥時間は、同様に良好なRNAの質をもたらす、（3.3.3.1参照）〜2時間とすることができます。目的の細胞型および種のいずれかのために、水またはメタノールに取り付けることによって達成さRNAの品質をテストするために試用版を実行することは、新しいプロジェクトの開始時に推奨されます。
LAMは、転写分析のための強力な技術であります
結論として、我々が正常に最適化され、LAMとシロイヌナズナのとBoechera属における性的及びアポミクシス生殖系列系統の異なる細胞へのマイクロアレイおよびRNA-のSeqによる細胞型特異的トランスクリプトーム解析の組み合わせを適用している。、このように比較転写分析を可能にします7,11,13,14（また、 図5を参照）。記載された方法は、細胞型特異的転写分析を可能にする他の技術に比べて多くの利点を有します。重要なことには、セクション内の関心の細胞型または組織の認識に応じて、両方のモデルのまれな細胞タイプに適用することができますこのようなBoechera属中の成熟雌性配偶体の細胞などの非モデル種、またはそれも細胞ドメイン、 例えば 、セル19の極性の半体を単離することができます。同様のアプリケーションでは、細胞または核（FACS / FANS）10の蛍光活性化ソーティングに依存する他の方法では不可能であろう。
この方法の主な欠点は、時間要件です。固定および埋め込みはハンズオン時間を延長する必要はありませんと同時に花の大量のために行われてできますが、のようなLAMは非常に時間がかかると、細胞型特異的分析のために、典型的には3日の3週間です（レーザー顕微鏡での一日あたりの平均5時間での）LAMを計画する必要があります。この点において、適切に研究を設計することが目標と特定の細胞型の単離の速度のためにいくつかの予備テストを行うために有用です。この最適化されたプロトコルを用いてもまた、RNAの品質をテストするための試験は非常に再され賞賛しました。
要約すると、LAMは、別の既存の方法を用いて達成することができなかった個々の細胞型、あるいは細胞のサブドメインの解像度で転写分析のための強力なツールです。この点において、非常に高い時間および空間分解能で、発生過程の、例えば 、分析を可能にするために大きな可能性を有します。これは、 シロイヌナズナとBoechera 7,11,13,14における性的及びアポミクシス生殖のすべての重要なステップで細胞のトランスクリプトームの分析によって例示されました。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | VWR | 1,009,861,000 | absolute EMPROVE Ph Eur,BP,USP |
| 15 ml falcon centrifuge tubes | VWR | 62406-200 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2939AA | |
| Acetic Acid | Applichem | A3686,2500 | 100% Molecular biology grade |
| Ambion Nuclease free water | life technologies | AM9932 | |
| ASP200 S | Leica | 14048043624 | tissue processor |
| black cardboard | can be purchased in special paper shops | ||
| DNA- and RNAse-free Frame Slides | Micro Dissect GmbH | 1, 4 µm PET-membrane; can also be purchased from Leica | |
| Dumond Forceps | Actimed | 0208-5SPSF-PS | |
| ethanol lamp | |||
| exsiccator | Sigma-Aldrich | Z354074-1EA | Nalgene Vaccuum Dessicator or similar equipment |
| filter tips 10 µl | Axon Lab AG | AL60010 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 1,000 µl | Axon Lab AG | AL60010 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 20 µl | Axon Lab AG | AL60020 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 200 µl | Axon Lab AG | AL60200 | can be replaced by similar tips |
| forceps precision | VWE | 232-1221 | |
| glass slide holder | Huber & Co.AG | 10.0540.01 | Färbekästen nach Hellendahl |
| glass staining trough | Huber & Co.AG | 10.0570.01 | Färbekasten |
| Heated Paraffin Embedding Module Leica | Leica | Leica EG 1150 H | blocking station, similar devises are suitable |
| Heating and Drying Table | Medax | 15501 | other models and/or suppliers are suitable |
| ice bucket | VWR ice bucket with lid | 10146-184 | similar buckets equally suitable |
| light table | UVP An Analytical Jena Company | TW-26 | white light transluminator |
| microscope slide | Thermo Scientific | 10143562CE | cut edges |
| microtome blade | Thermo Scientific | FEAHS35 | S35 microtome blade disposable |
| MMI Cell Cut Plus Instrument | MMI (Molecular Machines and Industries) | ||
| Non-stick, RNAse free Microfuge tubes, 2 ml | life technologies | AM12475 | |
| Paraplast X-TRA | Roth | X882.2 | for histology |
| PicoPure RNA Isolation Kit | life technologies | KIT0204 | Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit |
| plastic balancing trays | Semadeni AG | 2513 | |
| plastic box | Semadeni AG | 2971 | Plastikdose PS |
| plastic lid for heating plate | homemade | ||
| preparation needle | VWR | 631-7159 | |
| RNA 6000 Pico Kit | Agilent | 5067-1513 | |
| RNAse free microfuge tubes | life technologies | AM12400 | |
| RNAse ZAP Decontamination Solution | life technologies | AM9780 | |
| Semi-automated Rotary Microtome | Leica | RM2245 | similar devices are equally suitable |
| Tissue Loc Histo Screen Cassettes | Thermo Scientific | C-1000_AQ | similar cassettes of other suppliers are suitable |
| Tubes with adhesive lid, without diffusor 500 µl | MMI (Molecular Machines and Industries) | 50204 | |
| Xylol (Isomere) ROTIPURAN | VWR | 4436.2 | min. 99%, p.a., ACS, ISO SP |
| process embedding cassettes | Leica | 14039440000 | Leica Jet Cassette I without lid |
| Universal Oven | Memmert | UF55 | other models and/or suppliers are suitable |
References
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