Introduction
In studi trascrizionali fatto a livello dei tessuti, i trascrittomi di tipi di cellule altamente specializzate, ma rare sono spesso mascherati da i più abbondanti cellule circostanti. Un esempio di tali tipi di cellule altamente specializzate sono le cellule della linea riproduttivo femminile (germinale) in piante. La linea germinale femminile è specificato all'interno di ovuli in via di sviluppo, i precursori di semi all'interno del gineceo del 1,2 fiore. La cellula madre megaspore (MMC) è la prima cellula della linea germinale femminile. Subisce meiosi per formare una tetrade di macrospora ridotti. Tipicamente, solo uno di questi macrospora sopravvive e divide mitoticamente senza citochinesi, cioè, in un sincizio. Questi mitosi sono seguiti da cellularization per formare il gametofito maturo, che in genere si compone di quattro tipi di cellule: tre antipodals, due celle synergid, l'uovo e la cellula centrale. Le cellule uovo e centrali sono i gameti femminili che vengono fecondati da due spermatozoi durante doufecondazione ble per dare origine a un embrione e endosperma del seme 1,2 sviluppo. Nel sessuale sistema modello Arabidopsis thaliana, solo ~ 50 semi si sviluppano per fiore mentre circa 50 - 80 semi si sviluppano per fiori in genere strettamente correlati Boechera. Così, la linea germinale femminile è costituito da pochi tipi di cellule altamente specializzate, che lo rende un ottimo modello per lo studio dei processi di sviluppo, come ad esempio le specifiche e la differenziazione cellulare.
Inoltre, approfondimenti sui processi di regolazione genica che regolano la riproduzione delle piante possono essere di valore applicata. Nelle piante, può avvenire sia riproduzione sessuata e asessuata attraverso i semi (apomissia). Mentre riproduzione sessuale genera la diversità genetica in una popolazione, Apomixis conduce alla formazione di progenie clonale che è geneticamente identica alla pianta madre. Pertanto, apomissia ha un grande potenziale per le applicazioni in agricoltura e produzione di sementi, come anche complesse genotipi materni puòessere mantenuta inalterata per diverse generazioni 3,4,5. Perché apomissia non si trova naturalmente in tutte le principali specie coltivate, la progettazione di apomissia nelle colture è di grande interesse 3,4,5. Tuttavia, questo obiettivo a lungo termine è difficile da raggiungere perché la base genetica e molecolare alla base di apomissia non viene compreso in modo sufficientemente dettagliato 6.
Per acquisire conoscenze in base trascrizionale che regolano la riproduzione apomittica, specifici per tipo di cellula trascrizionale profilatura mediante microdissezione laser assistita (LAM) e sequenziamento di nuova generazione (NGS) rappresenta un approccio molto potente 7,8. LAM è stata in primo luogo stabilito per l'animale e la ricerca biomedica. Negli ultimi anni LAM è stata anche applicata alla biologia vegetale 6,9,10. A differenza di altri metodi che consentano profilatura dei singoli tipi di cellule e tessuti, LAM non richiede la generazione di linee marcatore 6,9,10. Pertanto, può essere appmentito a qualsiasi tipo di cellula o tessuto senza conoscenza molecolare preventiva. Un altro vantaggio di LAM è che può essere applicato a qualsiasi tipo di cellula finché la cella può essere riconosciuta in sezioni asciutte base alla posizione e / o caratteristiche strutturali. LAM ha il vantaggio aggiuntivo che vengono utilizzati tessuti fissati, che impedisce variazioni del profilo trascrizionale durante la lavorazione.
Il tessuto di interesse, ad esempio, il tessuto floreale, è fissato in un fissativo non reticolazione prima inclusione in paraffina. Incorporare in cera di paraffina può essere effettuata manualmente, seguendo i protocolli stabiliti 9,11. Tuttavia, l'impiego di un processore tessuti automatizzato per la disidratazione e l'infiltrazione con la cera genera risultati riproducibilità in termini di conservazione della qualità dell'RNA e morfologia tissutale. La strategia alternativa di incorporare tessuti in resina è stato anche utilizzato con successo per le analisi specifiche per tipo di cellula da LAM 8. Tuttavia, l'uso di un automprocessatore ated per l'incorporamento in cera è molto tempo efficiente, come molti campioni possono essere trattati contemporaneamente richiedono un minimo di mani-in tempo. Mentre tipicamente alcuna perdita significativa di qualità dell'RNA avviene durante la fissazione e inclusione, la preparazione di sezioni sottili con il microtomo e, in particolare, il montaggio sulle frameslides utilizzati per LAM rimane un punto critico per la conservazione della qualità dell'RNA. Ciò è stato notato in precedenza e l'uso di un sistema di trasferimento nastro è stato descritto per una migliore qualità dell'RNA in questa fase 12. Tuttavia, questo aggiunge un passo tempo supplementare durante la preparazione dei vetrini e richiede anche attrezzature speciali. Il protocollo ottimizzato descritto di seguito produce riproducibile RNA che è di qualità sufficiente per profilatura trascrizionale con GeneChip e Next Generation Sequencing (NGS) si avvicina 7,11,13,14. Inoltre, con il microscopio microdissezione laser utilizzato, un'elevata purezza dei tipi di cellule isolate è rottainely prodotto 7,11,13,14.
Il genere Boechera è un sistema modello eccellente per studiare i passaggi chiave della riproduzione apomittica. In Boechera, una varietà di diverse adesioni sessuali e apomittici sono stati identificati e può essere utilizzato per analisi comparative 15,16,17. In un confronto di trascrittomi cellule specifiche per il tipo di cellule della linea germinale femminile da Arabidopsis sessuale e apomittica Boechera, abbiamo identificato geni e vie che sono espressi in modo differenziale, individuando così nuovi aspetti dei processi regolamentari che disciplinano Apomixis 7. Inoltre, questo studio ha verificato l'idoneità di LAM per specifico tipo cellulare trascrizionale analisi di tipi di cellule piccole e rare. Abbiamo già usato questo protocollo per l'analisi dei diversi tipi di cellule in una varietà di specie vegetali, ma specie-e modifiche tessuto-specifici al protocollo può essere richiesto in alcuni casi.
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Protocol
Nota: Questo protocollo descrive la preparazione dei tessuti, laser assistita microdissezione, e l'estrazione di RNA per il profiling trascrizionale. Utilizzare sempre guanti durante tutte le fasi del protocollo. Studiare e prendere in considerazione le norme di sicurezza per ogni sostanza chimica utilizzata. In particolare, tenere a mente che lo xilolo è dannoso e può penetrare i guanti e che il metanolo è tossico. Per tutti gli strumenti utilizzati, consultare manuali d'uso di conseguenza.
1. Rimozione di RNasi attività da cristalleria e altre apparecchiature
- Prima dell'uso, avvolgere qualsiasi vetreria in un foglio di alluminio prima della cottura per ~ 8 ore a 180 ° C per assicurare la qualità RNAsi gratuito.
- Trattare superfici metalliche (ad esempio, pinzetta) nonché il banco di lavoro e la piastra di riscaldamento con una soluzione adeguata decontaminazione RNAsi. In seguito, lavare le superfici con acqua RNasi-free per rimuovere la soluzione di decontaminazione. Successivamente, pulire le superfici ulteriormente con il 70% EtOH.
- Utilizzare tutti plasmateriali di consumo tic (ad esempio, tubi) nuovo di zecca, senza alcun pre-trattamento. Se disponibile, utilizzare materiali di consumo di plastica che sono certificati da RNasi libero.
2. Tissue Fissazione
- Preparare 10 ml di fissativo del contadino (3: 1; v / v di etanolo: acido acetico) in una provetta da 15 ml fresco su ghiaccio. (Sempre preparare fissativo del contadino fresco prima dell'uso). In alternativa, l'etanolo non reticolazione fissativo: acido acetico (5: 1; v / v) può essere utilizzato 18.
- Utilizzare un bel paio di pinzette per raccogliere gemme nella fase di sviluppo di interesse. Immediatamente immergere orecchie nel fissativo ghiacciata. Utilizzare 10 ml di fissativo per la fissazione del ~ 20 boccioli o fiori da Arabidopsis o Boechera. Nota: Quando si utilizza specie vegetali con fiori più grandi si raccomanda di sezionare i fiori con una lametta per generare piccoli pezzi prima della fissazione.
- Al fine di ottenere gametofiti maturi, evirare i 2 - 3 grandi boccioli di fiori, il inflorescence 2 giorni prima del raccolto.
- Riempire il fondo di un essiccatore con ghiaccio. Aprire le provette contenenti i campioni, ad esempio, fiori, e disporli sul ghiaccio, sia mettendoli direttamente nel ghiaccio in un modo che non possano cadere o utilizzando un supporto adeguato. Vuoto infiltrarsi per 15 minuti prima del rilascio del vuoto.
- Ripetere la infiltrazione sotto vuoto una volta per 15 min.
- Rilasciare la notte del vuoto e conservare (~ 12 ore) su ghiaccio. Coprire il secchio ghiaccio con un foglio di coperchio o di alluminio e memorizzare il secchio in una camera C 4 ° o in frigorifero per impedire al ghiaccio di scongelamento. Nota: Prolungare il tempo di fissazione non è raccomandato.
3. Tessuto Embedding, sottile sezionamento, e Montaggio su diapositive per LAM
- Tissue incorporamento.
- Sostituire il fissativo al 70% di etanolo a base di etanolo puro e acqua libera RNAsi. Lasciare i campioni in ghiaccio fino al procedimento. Inizia embeggiunta dei campioni nello stesso giorno. Nel caso in cui nessuna macchina tissue-trattamento è disponibile, procedere alla incorporamento manuale come descritto altrove 9,11 e continuare con il passo 3.1.11.
- trasferire delicatamente i campioni di tessuto cassette embedding con un paio di pinzette. Saldamente chiudere le cassette. PUNTO CRITICO: Evitare l'essiccazione anche parziale del campione durante questa fase. Evitare di schiacciare dei campioni con le pinzette.
Nota: per etichettare le cassette una matita deve essere utilizzato, idealmente scrivendo sulla superficie inclinata del cassetto. - Conservare la cassetta incorporamento caricato con i germogli o fiori in etanolo al 70% fino a che tutto il materiale viene trasferito cassette e la macchina incorporamento può essere caricato. A questo scopo, utilizzare un trogolo di vetro colorazione riempito con il 70% di etanolo.
- Rimuovere il cestello del processore tessuti dalla storta della macchina e trasferire le cassette di incorporamento a canestro con le superfici inclinate verso la parte superiore e nella stessa direzione. CRIFASE TICAL: Eseguire questo rapidamente per evitare l'asciugatura dei tessuti. Se l'elaborazione di molte cassette incorporamento in una sola volta, posizionare il cestello in un apposito RNasi libero contenitore riempito con il 70% di etanolo prima di caricare i campioni.
- Mettere il coperchio sul cestello e mettere il cestello nella storta. Chiudere la storta.
Nota: Il processore tessuto disidrata automaticamente i campioni, cambia il solvente xilolo, e fa l'infiltrazione con paraffina fusa. Tipicamente, questo viene fatto durante la notte. - Avviare il programma del processore tessuti. impostazioni standard consigliate sono 1 hr 70% EtOH, tre volte 1 hr 90% EtOH, tre volte 1 hr 100% EtOH, due volte 1 hr 100% Xylol, una volta 1 ora e 15 min 100% xilolo a temperatura ambiente, seguita da infiltrazione paraffina due volte per 1 ora e una volta per 3 ore a 56 ° C 11.
Nota: per garantire che la stazione di blocco è pronto con la cera fusa, accendere la macchina diverse ore prima di iniziare outilizzare la funzione timer per selezionare il tempo approssimativo di partenza.
Nota: Nel caso il tessuto non può essere elaborato subito dopo, tempi di incubazione più lunghi in cera di paraffina a 56 ° C sono possibile invece di 3 ore a 56 ° C. Fare riferimento al manuale d'uso dello strumento. In genere, le cassette con i tessuti rimarranno automaticamente in cera fusa fino a quando è stato approvato il comando "vuoto storta". Se la cera non è sciolto quando si avvia il processore tessuti, la storta viene riempita con il 70% di etanolo e il programma resta in attesa fino pronto per iniziare. - Svuotare storta e trasferire immediatamente i campioni ad un bagno di paraffina a 56 ° C in una stazione di bloccaggio. Rimuovere il coperchio dal cestello e coprire il bagno di paraffina della stazione di blocco con il suo coperchio.
- Pile come molti vassoi bilanciamento fresche sulla superficie della stazione di blocco riscaldata a 56 ° C in quanto vi sono cassette nel cestello.
Nota: un pennarello indelebile etanolo-resistenti può essere utilizzatod etichettare fondo dei vassoi di bilanciamento. marcatori permanenti Acetone-resistenti non sono raccomandati. - Utilizzando la stazione di blocco, riempire un vassoio di plastica di bilanciamento fresca pre-riscaldato con paraffina fusa a 56 ° C. Sollevare il coperchio del bagno di paraffina, prelevare una cassetta solo alla volta e trasferire i campioni dalle cassette alla cera di paraffina liquida a 56 ° C nel vassoio bilanciamento usando un paio di pinzette.
PUNTO CRITICO: Evitare l'indurimento della cera che circonda il campione durante la manipolazione della cassetta lavorando rapidamente.- Posizionare tutti i campioni in base alle esigenze utilizzando un ago di preparazione prima dell'indurimento della cera. Tipicamente, molti fiori sono disposti in un vassoio bilanciamento distanziati individualmente circa 1 cm in ogni direzione.
- Ripetere il punto 3.1.9 fino a quando tutti i campioni vengono trasferiti.
- Posizionare il cestello al processore tessuti e pulire la risposta utilizzando un apposito programma (consultare il manuale).
- Spegnere il processore dei tessuti e la stazione di blocco. Continuare con il passaggio 3.1.13.
- Nel caso in cui nessuna macchina infiltrazione in tessuti e nessuna stazione incorporamento è disponibile, utilizzare un forno di riscaldamento per sciogliere la cera di paraffina a 56 ° C. In panchina, riempire la cera fusa in vassoi di bilanciamento plastica, trasferire i campioni alla cera e utilizzare aghi preparazione per posizionare i campioni.
- Lasciare la cera di paraffina per indurire a temperatura ambiente per ~ 1 - 3 ore prima di memorizzare i campioni a 4 ° C. I campioni possono essere successivamente elaborati fresco o conservati fino a diversi mesi.
- Preparazione di sezioni sottili e scivoli per LAM.
- Su un tavolo luce che illumina il blocco di cera dal basso, rimuovere la paraffina con i campioni dai vassoi di plastica circostanti. Sezionare un blocco di cera quadrato che contiene il tessuto, per esempio., Un bocciolo o un fiore, con una lama di rasoio libera RNAsi. A questo scopo, orientare sempre i campioni verso la parte superiore del blocco di cera (vedi anche
- Preparare blocchi di cera di tutti i campioni che devono essere utilizzati per LAM alla volta.
- Su un tavolo luce che illumina il blocco di cera dal basso, rimuovere la paraffina con i campioni dai vassoi di plastica circostanti. Sezionare un blocco di cera quadrato che contiene il tessuto, per esempio., Un bocciolo o un fiore, con una lama di rasoio libera RNAsi. A questo scopo, orientare sempre i campioni verso la parte superiore del blocco di cera (vedi anche
- Montare i blocchi per elaborare embedding cassette riempite di paraffina indurita: sciogliere un piccolo pezzo o goccia di paraffina sulla punta di una spatola appropriato utilizzando una lampada etanolo e utilizzare la cera calda per fissare il blocco sul supporto (con i tessuti incorporati in cima).
- Lasciare che la cera per indurire per almeno 20 minuti a 4 ° C.
- Rimuovere la cera surplus circonda il campione con una lama di rasoio sul tavolo luminoso. Assicurarsi di mantenere una superficie quadrata con bordi paralleli (vedi Figura 1).
- Impostare la piastra riscaldante a 42 ° C.
- Sicura montare i campioni al microtomo e preparare 6 - 10 sezioni micron di spessore. Fare riferimento alle istruzioni del produttore per l'utilizzo del microtomo. Nota: Mentre le sezioni più sottili spesso dare una migliore risoluzione strutturale, maggiore quantità di RNA di highequalità r può essere ottenuta con sezioni più spesse. Per le cellule del Boechera maturano gametofiti usiamo 7 micron come predefinito. Muoversi piuttosto lentamente con i campioni sopra il coltello microtomo si traduce spesso in una migliore istologia.
- Trasferire sempre i nastri paraffina ad una lunghezza di circa 10 - 15 cm in una scatola di plastica con un cartoncino nero sul fondo prima posizionandoli in diapositive LAM.
- Se possibile, pre-selezionare le parti delle strisce di paraffina contenenti le cellulo o di tessuti tipi di interesse, ad esempio, ovuli, sotto una dissezione-scope e scartare il resto.
- Posizionare la quantità necessaria di guide metalliche cornice (tipicamente 5 - 10) con la superficie piana superiore sulla piastra riscaldante.
- Pipetta ~ 1 - 2 ml di RNasi acqua libera sulla parte in plastica della diapositiva. Utilizzando una lama di rasoio, tagliare i nastri di paraffina in brevi pezzi di circa 4 - 5 cm abbastanza a lungo per attraversare le finestre di plastica. USE un paio di pinzette e un ago di preparazione per posizionare idealmente le strisce paraffina paralleli tra loro sulle finestre di plastica delle diapositive. Sollevare delicatamente il vetrino ad una estremità per rimuovere l'acqua e posizionare le diapositive.
- In alternativa, posizionare la piastra di riscaldamento sotto una cappa chimica. Applicare una piccola quantità di metanolo per la parte in plastica della slitta appena sufficiente a bagnare la superficie (questo può causare una leggera ondulazione delle diapositive). Mettere le strisce di paraffina sulle diapositive.
Nota: Per motivi di tossicità, evitare l'uso di metanolo, se possibile. Tuttavia, l'uso di metanolo in questa fase non migliora la qualità dell'RNA nel caso la qualità ottenuta montando su acqua non è sufficiente. Vale la pena testare queste alternative all'inizio di un nuovo progetto, come la qualità dell'RNA ottenuto varia con il tipo cellulare e specie in esame.
- In alternativa, posizionare la piastra di riscaldamento sotto una cappa chimica. Applicare una piccola quantità di metanolo per la parte in plastica della slitta appena sufficiente a bagnare la superficie (questo può causare una leggera ondulazione delle diapositive). Mettere le strisce di paraffina sulle diapositive.
- Essiccare i vetrini overnight sulla piastra riscaldante a 42 ° C per ~ 12 ore. Coprire la piastra di riscaldamento conun coperchio di plastica che non tocca le diapositive. Assicurarsi che il coperchio di plastica non impedisce il ricambio d'aria. A questo scopo il coperchio può essere posizionato su scatole pipette o simili da sollevare.
- In alternativa, ridurre il tempo di essiccazione per un minimo di due ore o fino a quando il tessuto appare completamente asciutte. La riduzione del tempo da affettare alla raccolta può migliorare la qualità dell'RNA.
- Sotto una cappa chimica, de-la cera le slitte 2 volte per 10 min in xilolo secondo adeguati portavetrini. Assicurarsi per immergere completamente la parte in plastica di ogni diapositiva solo, ma per consentire la rimozione della slitta toccando l'estremità più ampia del telaio metallico che viene mantenuta asciutta.
- Lasciare i vetrini si asciughino per ~ 10 minuti sotto il cofano chimica prima di LAM.
I vetrini non immediatamente elaborati possono essere reimmessi sul piastra riscaldante a 42 ° C con il tessuto rivolto verso l'alto fino a qualche ora. Questo consentirà di evitare l'umidità da compromettere la qualità dell'RNA fino al procedimento.
4. microdissezione laser assistita (LAM)
Nota: La procedura per LAM varierà con lo strumento utilizzato. Alcuni dettagli di questo protocollo sono adattati ad uno strumento specifico e la tecnologia di raccolta dei campioni su un facendo uso tappo di forze elettrostatiche. Inoltre, i dettagli possono variare anche tra le diverse versioni del software. Si prega di fare riferimento alle istruzioni del produttore e manuali utente per una descrizione dettagliata e istruzioni specifiche su strumenti e software.
- Accendere i dispositivi per la LAM (computer, microscopio, scatola di controllo laser).
- Avviare il programma di sterzo al microscopio e al laser.
- Accendere il laser premendo il tasto corrispondente sul quadro di comando.
- Inserire un tappo (0,5 ml, senza diffusore) nel supporto tappo e posizionarlo nello strumento.
- Sostenere il vetrino LAM con un vetrino per microscopia. Assicurarsi che la superficie piana della slitta con iltessuto allegato si affaccia sul vetrino.
- Posizionare il vetrino nello strumento con il vetrino sotto.
- Selezionare l'obiettivo 4X. Nel programma, selezionare per spostare il tappo in posizione "up" e procedere a fare una scansione del vetrino.
- Ricerca tra la slitta e identificare le strutture di interesse. Individuare e salvare le loro posizioni sul vetrino per poter tornare nella posizione esatta per la fase di taglio.
- Selezionare l'obiettivo appropriata (ad esempio 40X o 60X).
- Se necessario, regolare la velocità del laser, messa a fuoco, e la potenza del laser, e anche calibrare il movimento scenico facendo riferimento al manuale d'uso dello strumento. Una volta che un account è impostato per il tessuto specifico di interesse, le impostazioni possono essere riutilizzati.
- Verifica posizione del laser da un solo colpo premendo il tasto "tiro laser" del programma, idealmente in una parte della membrana, senza tessuto.
- Se necessario, calibrare la posizione del laser seguendo thle istruzioni del produttore e per lo strumento.
- Verificare la calibrazione dell'obiettivo spostando una struttura ovvia a tutti i quattro angoli della finestra software sul monitor, mantenendo premuto il tasto destro del mouse. Verificare che la posizione della mano rispetto alla struttura evidente è la stessa in tutti i quattro angoli. In caso contrario, calibrare gli obiettivi seguenti manuale del software.
- Con il tappo in posizione di 'down', utilizzare lo strumento 'mano-pen' per segnare i confini del tipo di cellula o tessuto di interesse, ad esempio, la cellula uovo. Sezionare la cella di interesse con il laser premendo 'tagliare'. Nota: Spesso, sezionamento deve essere ripetuta se il bordo intorno alla cella non era del tutto sezionato in una sola volta. In questo caso, si raccomanda di impostare il software per effettuare automaticamente due ripetizioni della sezione come standard.
- Sollevare il tappo e passare alla successiva posizione salvata con la struttura di interesse. Ripetere il punto 4.13della procedura di sezionare sezioni cella successiva fino a quando tutte le cellule di interesse da una diapositiva sono raccolti. Assicurarsi che il tappo è posizionato in modo che la nuova sezione attacca ad una posizione vuota sul tappo.
Nota: Si raccomanda di isolare pezzi più grandi di tessuti (per esempio, le sezioni di fiori intere o parti di esso) di ogni diapositiva dopo l'isolamento delle sezioni singola cellula su un tappo di fresco. Questi possono essere usati per il controllo qualità dell'RNA. - Rimuovere il vetrino e continuare con la diapositiva successiva ripetendo i passaggi 4,4-4,9 e 4,13-4,14.
- Ripetere il passaggio 4.15 e passaggi relativi fino a quando i tipi di cellule di interesse da tutti i vetrini sono stati isolati. Nota: Non è raccomandato di raccogliere per più di ~ 4-5 ore sulla stessa tappo.
- Visivamente la superficie tappo dopo LAM di escludere contaminazioni non specifici del campione. Mentre i tessuti non-sezionato sono protette con la pellicola, la polvere può aderire alla superficie a causa di adesione elettrostatica.
- To controllare visivamente il tappo, rimuovere il vetrino dallo strumento. Posizionare il supporto tappo nella posizione di 'down' e ispezionare la superficie con l'obiettivo 4X.
- Nel caso in cui piccoli pezzi di polvere sono visibili, rimuoverli con un piccolo (2 ml) punta della pipetta. In alternativa, montare il vetrino sullo strumento, posizionare il cappuccio su una parte libera della slitta (non tessuti), e distruggere completamente la contaminazione con il laser.
- Chiudere tappi e congelare sezioni secco a -80 ° C fino a nuovo uso. Se necessario, i campioni possono essere conservati fino a diverse settimane. Tuttavia, procedendo rapidamente a questa fase è raccomandato.
5. RNA Isolamento e Controllo Qualità
Nota: RNA può essere isolato mediante qualsiasi metodo adatto per piccole quantità di RNA. In questo protocollo l'uso di un kit di isolamento di RNA specificato per piccole quantità di RNA è descritto. Seguire le istruzioni del produttore.
- Utilizzare i tubi con il campione attaccato allail tappo direttamente o dopo la rimozione da -80 ° C.
- Aprire i tubi e pipetta accuratamente 11 ml di tampone di estrazione alla parete di ogni tubo con puntali con filtro. Cambiare punte tra i campioni.
- Chiudere il coperchio e agitare il tampone di estrazione verso il tappo della provetta.
- Collocare le provette con il tappo verso il basso in un forno di riscaldamento preriscaldato a 42 ° C. Incubare per 30 minuti seguendo le istruzioni del produttore.
- Seguire le istruzioni del produttore per la preparazione colonna e raccogliendo l'estratto al fondo delle provette.
- Se il materiale da più di un tappo deve essere combinati in un unico campione, procedere con passaggi 5.1.1 - 5.1.2 singolarmente per ogni tubo / cap.
- In seguito, in comune gli estratti di un campione in una provetta e misurare la quantità di estratto in pool con una pipetta prima dell'aggiunta di una quantità equivalente di EtOH (vedi le istruzioni del produttore).
- Assicurarsi che la quantità di EtOH aggiunto prima di caricare la colonna è pari al volume dell'estratto pool.
- Dopo RNA precipitazione con EtOH, procedere rapidamente al caricamento delle colonne seguenti istruzioni del produttore. Continuare il protocollo con la fase di centrifugazione 100 x g.
- Dopo il contenuto di ciascuna provetta di raccolta sono stati passati attraverso la colonna, effettuare una fase di centrifugazione 16.000 xg per 30 secondi per rimuovere istruzioni flow-through seguente costruttore.
- Continuare con l'estrazione di RNA e la purificazione seguendo le istruzioni del produttore.
- Dopo il caricamento del tampone di eluizione a colonna che la colonna incubare per 1 min. Continuare a caricare i tubi nella centrifuga seguendo le istruzioni riportate le istruzioni del produttore. Nota: Un passo centrifugazione supplementare per 1 min a 100 xg prima eluizione come indicato nel protocollo può aumentare l'efficienza di eluizione.
- Estrarre l'RNA dal CONTRols (sezioni di tessuto più grandi) per il controllo qualità dell'RNA seguenti operazioni 5.1 a 5.2.7 del presente protocollo.
- Per RNA carico il controllo di qualità 1 ml di RNA totale diluito di ciascun campione di controllo sul Bioanalyzer utilizzando un RNA Pico Chip seguendo le istruzioni del produttore.
Nota: L'RNA estratto può essere utilizzato per l'amplificazione lineare e analisi del trascrittoma utilizzando microarrays o RNA-Seq 7,11,13,14. Idealmente, il controllo di qualità dovrebbe indicare un RNA Integrity Number (RIN) di almeno 7. Un numero di fornitori fornire kit adatti per l'amplificazione, esempi adatti sono riportati nella 9.
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Representative Results
Preparazione del campione e LAM sono fatte in fasi consecutive
Un certo numero di passi consecutivi sono necessari per preparare RNA per l'analisi trascrizionale di tipi cellulari selezionati da LAM (Figura 1). Questo inizia con la raccolta dei fiori e la fissazione immediata per garantire che la popolazione RNA rimane invariato dopo la raccolta. Il tessuto è inserito, sezionato, e montate su slitte. Questo permette di isolare le cellule LAM e il raggruppamento delle sezioni tipo-specifici cellulari su uno o più tappi (Figura 1). Il materiale può essere congelata dopo o elaborato direttamente per estrazione di RNA. Oltre al vantaggio di LAM sia applicabile per la cella di tipo-specifiche analisi in entrambe le specie modello e non del modello, il metodo rimane piuttosto tempo. Almeno una settimana di lavoro, a volte più, è necessario per i passi da tiraccolta SSUE per l'estrazione di RNA (Figura 1). Esso deve essere preso in considerazione che spesso sezioni raccolte nell'arco di diversi giorni di LAM sono raggruppati in una estrazione del campione e RNA biologico. Per le cellule uovo Boechera, l'uso di almeno ~ 200 sezioni per campione è altamente raccomandato, con un massimo di ~ 100 sezioni isolati al giorno.
L'isolamento della cella tipi di interesse dipende dalla loro visibilità nelle sezioni a secco
L'isolamento delle sezioni specifiche del tipo di cellula è il passo più in termini di tempo del protocollo. Finora, nessuna automazione di questa fase è stato sviluppato a causa della natura complessa dei campioni. L'identificazione delle cellule di interesse mediante software non è praticabile perché le sezioni asciutte contrasto è basso ed il piano di sezione varia tra i campioni a causa del fatto che ovuli sono orientati ad angoli diversi well'ambito del tessuto (Figura 2). Tuttavia, la morfologia unica del gametofito femminile maturo con i synergids, cellula uovo, e la cellula centrale (cellule degenerano antipodi prima della fecondazione) permette l'identificazione univoca delle cellule uovo dal ricercatore (Figura 2B, C; Figura 3). Infatti, in Boechera divaricarpa, la cellula uovo spesso restringe un po 'durante la preparazione e quindi separa dai tessuti circostanti, una caratteristica vantaggiosa per l'isolamento di popolazioni di cellule uovo alla elevata purezza (Figura 2B, C; la figura 3).
Ispezione visiva della PAC dopo il LAM è Recensione positiva
Controllo visivo della superficie della calotta dopo LAM consente l'individuazione di eventuali contaminazioni del campione, ad esempio, dalla polvere. Inoltre, è utile per verificare che seZIONI attaccano al tappo, come a volte le sezioni si perdono durante la procedura. In genere, molte sezioni selezionate, ad esempio, le cellule uovo, può essere visto su un tappo dopo diverse ore di LAM.
Il flusso di lavoro Fondata Risultati e riproducibile in buona qualità RNA
Da specifici del tipo di cellule isolamenti Lam Da gametofito femminile, importi totali di RNA sono solo nel range ng basso. Questa quantità limitante di RNA rende necessario utilizzare un controllo rappresentante isolata da grandi tessuti di ogni diapositiva come approssimazione per il controllo qualità RNA dopo LAM. Ciò è dimostrato dal confronto di RNA delle cellule tipo-specifica da B. cellule uovo divaricarpa rispetto ai controlli da aree di tessuto grandi isolati dalle stesse diapositive, indicando simile qualità RNA (Figura 4A, B). Usando questo metodo, un bene da alta qualità RNA con i numeri Rin & #8805; 7 è riproducibile ottenuto. La qualità dell'RNA ottenuto era adatto per cellule tipo-specifici RNA-Seq, portando all'identificazione di 236 geni espressi nella cellula uovo apomittico ma non nella cella apomittico centrale, cellule synergid o cellula iniziale apomittica, né nelle cellule o gametophyte sessuale maturo di Arabidopsis thaliana (Figura 5) 7.
Figura 1:. Schema delle fasi del protocollo, che indica il tempo minimo richiesto per ogni passo Fissazione dei fiori o tessuti di interesse è fatto durante la notte. Il giorno successivo, l'incorporamento è avviato, che corre per tutta la notte, con conseguente materiale incorporato al giorno 3 del protocollo. Al giorno 3 sezioni microtomo a partire da campioni incorporati nei blocchi di cera possono essere generati. I nastri di sezioni sottili di paraffina sono montate su vetrini e lasciate asciugare per una notte. Soprae per diversi giorni di LAM sarà necessario per ottenere abbastanza materiale per una replica biologica. Dopo l'isolamento dell'RNA e controllo di qualità, la preparazione libreria per RNA-Seq può essere eseguita per preparare l'analisi del trascrittoma. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Le cellule uovo sono chiaramente identificabili nelle sezioni sottili, a causa della morfologia caratteristica del gametofito femminile (A) Schema del maturo gametofito femminile (tipo Polygonum) (B - C) Le sezioni sottili attraverso ovuli che ospitano gametofito femminile in.. Boechera divaricarpa. cellule uovo sono chiaramente visibili. A causa della morfologia del gametofito femminile spesso non tutti i tipi di cellule (cellule uovo: e, synergids: s, Cellula centrale: cc) sono visibili in una singola sezione. Barre di scala = 50 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. LAM di ovociti di Boechera divaricarpa. A e C. Sezione della gametofito maturo di B. divaricarpa a 7 micron prima e, B e D, dopo microdissezione con il dispositivo laser (cellula uovo: e, synergids: s, cellula centrale: cc). Barre di scala = 50 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
<strong> Figura 4. RNA qualità di ovociti laser-dissezionato e sezioni di controllo. (A) di qualità RNA come analizzato da sezioni di cellule uovo rispetto alle aree di tessuto più grandi (B) raccolte dalle stesse diapositive come controlli. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. L'identificazione di geni espressi solo nella cella apomittica uovo rispetto alle cellule del apomittica e sessuali gametofiti maturi o la cellula iniziale apomittica. Heatmap di 236 geni espressi nella cellula uovo apomittica Ma né nella cella centrale apomittica, cellule synergid o apomittica cellula iniziale di B. gunnisoniana né le cellule del gametofito sessuale maturo di A. thaliana 7 gerarchicaraggruppamento di campioni e geni si è basata su distanza euclidea e gerarchica agglomerative clustering. Red denota un'alta espressione e bassa espressione nero. I colori sono scalati per riga. apo:. apomittica Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il protocollo è adatto a diversi tipi di tessuto cellulare e
LAM combinato con trascrittoma analisi per microarrays o RNA-Seq è un valido strumento per acquisire conoscenze in modelli specifici di attività dei geni che regolano i processi di sviluppo o fisiologici 7-11,13,14. Tuttavia, l'idoneità di questo metodo per un dato tipo di cellula dipende criticamente sui problemi strutturali. La cella deve essere chiaramente visibili e senza ambiguità identificabile in sezioni secco utilizzato per LAM. In Boechera divaricarpa, la morfologia del gametofito permette una facile identificazione della cellula uovo (Figura 2, Figura 3). Alla fine, la velocità di isolamento di una popolazione di cellule specifica dipende anche dalla frequenza alla quale il tipo di cellula può essere trovato su un vetrino, scambiandosi diapositive e scansione nuove diapositive sono passi molto tempo. Dato che dipende dal tipo di cellula, di almeno 200 - 250 sect celluleioni devono essere riuniti per campione, l'adeguatezza del metodo per un certo disegno studio dipende in gran parte dai requisiti di tempo per il passo LAM.
Inoltre, a seconda della morfologia del tessuto, potrebbe essere vantaggiosa in termini di struttura per ridurre lo spessore delle sezioni a 6 micron. Allo stesso modo, le sezioni più spesse di una posizione ideale ≥ 8 micron tipicamente producono una maggior quantità di RNA e l'RNA di qualità leggermente superiore dalla stessa quantità di sezioni di tessuto. Inoltre, le cellule di interesse dovrebbero avere almeno un diametro di 8 - 10 micron a rendere l'isolamento da LAM fattibile.
In linea di principio, il protocollo descritto qui può essere regolata a diversi tipi di cellule e tessuti di specie imparentati alla lontana. Tuttavia, la qualità dell'RNA può variare anche tra differenti tipi di cellule della stessa specie 7,10,13. Questo protocollo è stato regolato in base a tipi di cellule piccole e critiche. Quindi, può ora essere applicato ad un broadeserie R di campioni senza ulteriori regolazioni. potrebbero tuttavia essere necessarie lievi modifiche del protocollo, a seconda del tipo di cellula e specie in esame. Si consiglia di utilizzare prima entrambi i fissativi alternativi (vedi protocollo 1.1) quando si imposta il metodo per una nuova specie o tipo di cellula per un confronto tra morfologia e qualità dell'RNA.
In linea di principio, il protocollo può essere adattato a ed eseguita con strumenti diversi adatti per microdissezione laser 9. Tuttavia, occorre notare che gli strumenti variano sia in potenza del laser e la larghezza minima del fascio laser che può essere applicato, come pure nella tecnologia di campionamento. In particolare per l'isolamento di piccole cellule e aree di tessuto, laser conseguente un percorso laser stretto sono più adatti. Il raggio laser dello strumento che usiamo è piuttosto bene (~ 1 micron ampia) e permette la dissezione di piccole cellule. La tecnologia di campionamento della raccolta del cells su una superficie della calotta adesiva per adesione elettrostatica è particolarmente vantaggioso per le piccole tipi di cellule e l'isolamento delle sezioni di cellule singole. Ciò minimizza il rischio di perdita del campione da effetti elettrostatici.
Il Quality RNA ottenuto è importante per l'ulteriore analisi trascrizionali
Uno dei punti più critici per il successo di preparazione biblioteca RNA-Seq è la qualità dell'RNA. Mentre diversi fornitori di kit di amplificazione ottimizzati loro tecnologia per l'RNA di integrità anche inferiore, la qualità dei dati ottenuti dopo analisi trascrittoma da uno microarrays o RNA-Seq aumenta tipicamente con la qualità dell'RNA ingresso. Usando questo protocollo stabilito, il bene e altamente riproducibile qualità RNA per le diverse fasi di sviluppo dei tessuti riproduttivi femminili e la linea germinale in Arabidopsis e Boechera è stato ottenuto (ad esempio, figura 4). Mentre il metodo è applicabileanche per le specie più distante connessi (es, pomodoro, non pubblicato), deve essere preso in considerazione che le piccole ottimizzazioni o modifiche possono essere richiesti a seconda della specie, tipo di tessuto, e anche l'ambiente di laboratorio come, per esempio, una elevata umidità potrebbe compromettere l'integrità del RNA durante la preparazione del vetrino e LAM.
Un punto critico durante il protocollo è il montaggio delle strisce di cera sezionate contenenti i campioni ai vetrini. Qui, in particolare, il contatto di acqua è un passaggio critico. Durante la sostituzione dell'acqua da EtOH non comporta alcun miglioramento significativo di integrità dell'RNA dopo l'isolamento (non pubblicato), la sostituzione di acqua metanolo fa. Tuttavia, il metanolo deve essere maneggiato solo sotto la cappa chimica e con grande cura. A seconda del tipo di campione, come alternativa all'uso di metanolo, i tempi di essiccazione dopo montaggio con acqua può essere ridotto a ~ 2 h (vedere 3.3.3.1), con conseguente altrettanto buona qualità dell'RNA.Esecuzione di una prova per verificare la qualità dell'RNA ottenuto montando sia su acqua o metanolo per il tipo di cellula e specie di interesse è raccomandato all'inizio di un nuovo progetto.
LAM è una tecnologia potente per le analisi trascrizionali
In conclusione, abbiamo ottimizzato con successo e applicato la combinazione di LAM e cellule tipo-specifica analisi del trascrittoma da microarray e RNA-Seq alle diverse cellule del sessuale e apomittica lignaggio linea germinale in Arabidopsis thaliana e Boechera spp., Permettendo così analisi trascrizionali comparative (vedi anche figura 5) 7,11,13,14. Il metodo descritto porta una serie di vantaggi rispetto ad altre tecnologie che consentono specifico tipo di analisi trascrizionale delle cellule. È importante sottolineare che, a seconda della riconoscibilità dei tipi di cellule o tessuti di interesse in sezione, può essere applicato a tipi di cellule rare sia modelloe specie non modello, come le cellule del gametofito femminile matura in Boechera spp., o può anche essere utilizzati per isolare domini cellulari, ad esempio, metà polari di cellule 19. Applicazioni simili non sarebbero possibili con altri metodi che si basano su fluorescenti attivato l'ordinamento delle cellule o nuclei (FACS / ventilatori) 10.
Un grave inconveniente del metodo è il requisito di tempo. Mentre la fissazione e incorporamento non richiede hands-on estesi di tempo e, contemporaneamente, possono stato fatto per una grande quantità di fiori, LAM in quanto tale, è molto in termini di tempo e, per un'analisi specifica per tipo di cellula, in genere 3 giorni per 3 settimane di LAM (in media 5 ore al giorno al microscopio laser) deve essere pianificato. A questo proposito, è utile fare alcuni test preliminari per la velocità di isolamento del tipo di cellula specifica mirata per progettare correttamente lo studio. Inoltre, anche quando si utilizza questo protocollo ottimizzato, prove per testare la qualità dell'RNA sono altamente riCommended.
In sintesi, LAM è un potente strumento per l'analisi trascrizionale alla risoluzione di tipi di cellule singole o anche sottodomini di cellule, che non potrebbe essere raggiunto utilizzando metodi alternativi esistenti. A questo proposito, sopporta enorme potenziale per consentire analisi, ad esempio, dei processi di sviluppo, con una risoluzione temporale e spaziale molto elevata. Questo è stato esemplificato dalle analisi dei trascrittomi di cellule in tutte le fasi chiave della riproduzione sessuale e apomittica in Arabidopsis e Boechera 7,11,13,14.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | VWR | 1,009,861,000 | absolute EMPROVE Ph Eur,BP,USP |
| 15 ml falcon centrifuge tubes | VWR | 62406-200 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2939AA | |
| Acetic Acid | Applichem | A3686,2500 | 100% Molecular biology grade |
| Ambion Nuclease free water | life technologies | AM9932 | |
| ASP200 S | Leica | 14048043624 | tissue processor |
| black cardboard | can be purchased in special paper shops | ||
| DNA- and RNAse-free Frame Slides | Micro Dissect GmbH | 1, 4 µm PET-membrane; can also be purchased from Leica | |
| Dumond Forceps | Actimed | 0208-5SPSF-PS | |
| ethanol lamp | |||
| exsiccator | Sigma-Aldrich | Z354074-1EA | Nalgene Vaccuum Dessicator or similar equipment |
| filter tips 10 µl | Axon Lab AG | AL60010 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 1,000 µl | Axon Lab AG | AL60010 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 20 µl | Axon Lab AG | AL60020 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 200 µl | Axon Lab AG | AL60200 | can be replaced by similar tips |
| forceps precision | VWE | 232-1221 | |
| glass slide holder | Huber & Co.AG | 10.0540.01 | Färbekästen nach Hellendahl |
| glass staining trough | Huber & Co.AG | 10.0570.01 | Färbekasten |
| Heated Paraffin Embedding Module Leica | Leica | Leica EG 1150 H | blocking station, similar devises are suitable |
| Heating and Drying Table | Medax | 15501 | other models and/or suppliers are suitable |
| ice bucket | VWR ice bucket with lid | 10146-184 | similar buckets equally suitable |
| light table | UVP An Analytical Jena Company | TW-26 | white light transluminator |
| microscope slide | Thermo Scientific | 10143562CE | cut edges |
| microtome blade | Thermo Scientific | FEAHS35 | S35 microtome blade disposable |
| MMI Cell Cut Plus Instrument | MMI (Molecular Machines and Industries) | ||
| Non-stick, RNAse free Microfuge tubes, 2 ml | life technologies | AM12475 | |
| Paraplast X-TRA | Roth | X882.2 | for histology |
| PicoPure RNA Isolation Kit | life technologies | KIT0204 | Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit |
| plastic balancing trays | Semadeni AG | 2513 | |
| plastic box | Semadeni AG | 2971 | Plastikdose PS |
| plastic lid for heating plate | homemade | ||
| preparation needle | VWR | 631-7159 | |
| RNA 6000 Pico Kit | Agilent | 5067-1513 | |
| RNAse free microfuge tubes | life technologies | AM12400 | |
| RNAse ZAP Decontamination Solution | life technologies | AM9780 | |
| Semi-automated Rotary Microtome | Leica | RM2245 | similar devices are equally suitable |
| Tissue Loc Histo Screen Cassettes | Thermo Scientific | C-1000_AQ | similar cassettes of other suppliers are suitable |
| Tubes with adhesive lid, without diffusor 500 µl | MMI (Molecular Machines and Industries) | 50204 | |
| Xylol (Isomere) ROTIPURAN | VWR | 4436.2 | min. 99%, p.a., ACS, ISO SP |
| process embedding cassettes | Leica | 14039440000 | Leica Jet Cassette I without lid |
| Universal Oven | Memmert | UF55 | other models and/or suppliers are suitable |
References
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