Introduction
في دراسات النسخي به على مستوى الأنسجة، وغالبا ما يتم حجب ترنسكربيتوم من أنواع الخلايا المتخصصة جدا ولكن نادرة من الخلايا المحيطة بها أكثر وفرة. مثال لمثل هذه أنواع الخلايا المتخصصة جدا هي خلايا النسب التناسلي للأنثى (الخط الجرثومي) في النباتات. يتم تحديد سلالة الجرثومية الإناث داخل البويضات النامية، والسلائف من البذور داخل وزيم من 1،2 زهرة. الخلية أبواغ الضخمة الأم (MMC) هي الخلية الأولى من سلالة الجرثومية الإناث. فإنه يخضع لالانقسام الاختزالي لتشكيل الرباعيات انخفاض megaspores. عادة، واحد فقط من هذه megaspores على قيد الحياة ويقسم ميتوتيكلي دون الانقسام السيتوبلازمي، أي في مخلى. يتم اتباع هذه mitoses من cellularization لتشكيل الأمشاج ناضجة، الذي يتكون عادة من أربعة أنواع الخلايا: ثلاثة antipodals، خليتين synergid، والبيض، والخلية المركزية. الخلايا البيض والمركزية هي الأمشاج الأنثوية التي تحصل المخصبة من قبل اثنين من الخلايا المنوية خلال ضوالإخصاب بلي لتؤدي إلى الجنين والسويداء من 1،2 البذور النامية. في النظام النموذجي نبات الأرابيدوبسيس thaliana الجنسي، فقط ~ 50 البذور تنمو في زهرة حين أن حوالي 50 - 80 وضع البذور في زهرة في جنس ترتبط ارتباطا وثيقا Boechera. وهكذا، فإن سلالة الجرثومية الإناث يتكون من عدد قليل من أنواع الخلايا المتخصصة للغاية، مما يجعلها نموذجا ممتازا لدراسة العمليات التنموية، مثل مواصفات الخلايا والتمايز.
وعلاوة على ذلك، يمكن رؤية واضحة حول العمليات التنظيمية الجينات التي تنظم تكاثر النبات تكون ذات قيمة تطبيقية. في النباتات، ويمكن أن يحدث كل من التكاثر الجنسي واللاجنسي من خلال البذور (تكاثر لاتعرسي). في حين التكاثر الجنسي يولد التنوع الجيني في عدد السكان، تكاثر لاتعرسي يؤدي إلى تشكيل ذرية نسيلي مطابق وراثيا للنبات الأم. لذلك، تكاثر لاتعرسي لديها امكانات كبيرة للتطبيقات في مجال الإنتاج الزراعي والبذور، وكذلك يمكن المورثات الأمهات حتى المعقدةالإبقاء دون تغيير على مدى أجيال عدة 3،4،5. بسبب تكاثر لاتعرسي لا تحدث طبيعيا في أي نوع من المحاصيل الرئيسية، هندسة تكاثر لاتعرسي في المحاصيل ذات 3،4،5 اهتمام كبير. ومع ذلك، فإن هذا الهدف على المدى الطويل هو من الصعب تحقيق لأنه لم يفهم الأساس الجيني والجزيئي الكامن وراء تكاثر لاتعرسي بتفصيل كاف 6.
للحصول على نظرة ثاقبة أساس النسخي تحكم الاستنساخ apomictic، خلية نوع محدد النسخي التنميط باستخدام تسليخ مجهري بمساعدة الليزر (لام) وتسلسل الجيل القادم (خ ع) يمثل طريقة فعالة جدا 7،8. وأول مرة يتم إنشاء LAM للبحوث الطبية الحيوية الحيوانية و. في السنوات القليلة الماضية، كما تم تطبيق لام لبيولوجيا النبات 6،9،10. وعلى النقيض من أساليب أخرى تسمح التنميط من أنواع الخلايا والأنسجة الفردية، لا لام لا تتطلب جيل من خطوط علامة 6،9،10. لذلك، يمكن أن يكون التطبيقكذب على أي خلية أو نسيج نوع دون معرفة الجزيئية السابقة. ميزة أخرى للام هو أنه يمكن تطبيقها على أي نوع من الخلايا طالما يمكن التعرف على الخلية في أقسام الجافة على أساس الموقف و / أو السمات الهيكلية. لام لديه ميزة إضافية أن تستخدم الأنسجة الثابتة، والذي يمنع التغييرات في الشخصية النسخي أثناء معالجة.
الأنسجة من الاهتمام، على سبيل المثال، الأنسجة النباتية، ثابتة في تثبيتي غير يشابك قبل التضمين في شمع البارافين. التضمين في شمع البارافين ويمكن أن يتم يدويا، بعد البروتوكولات المعمول 9،11. ومع ذلك، فإن استخدام معالج النسيج الآلي للجفاف وتسلل مع الشمع النتائج بشكل عام في أعلى استنساخ من حيث الحفاظ على الحمض النووي الريبي الجودة والتشكل الأنسجة. كما تم استخدام استراتيجية بديلة من تضمين الأنسجة في الراتنج بنجاح لتحليل نوع معين من الخلايا LAM 8. ومع ذلك، فإن استخدام وسيلة أبواATED معالج الأنسجة مبنية الشمع هو وقتا طويلا جدا كفاءة، كما العديد من العينات يمكن معالجتها في تتطلب مرة واحدة كحد أدنى من التدريب العملي في الوقت المحدد. في حين تحدث عادة أي خسائر كبيرة في الحمض النووي الريبي الجودة أثناء التثبيت والتضمين، وإعداد الشرائح الرقيقة مع مشراح، وعلى وجه الخصوص، وتصاعد على frameslides تستخدم للام يبقى خطوة حاسمة للحفاظ على نوعية الحمض النووي الريبي. وقد سبق الإشارة إلى ذلك، وصفت استخدام نظام نقل الشريط أن يؤدي إلى تحسين نوعية الحمض النووي الريبي في هذه الخطوة 12. ومع ذلك، وهذا يضيف خطوة إضافية تستغرق وقتا طويلا أثناء إعداد الشرائح ويتطلب أيضا معدات خاصة. بروتوكول الأمثل هو موضح أدناه ينتج بتكاثر الحمض النووي الريبي التي هي ذات نوعية كافية لتحديد ملامح النسخي مع GeneCHIPs والجيل القادم التسلسل (خ ع) النهج 7،11،13،14. وبالإضافة إلى ذلك، مع المجهر تسليخ مجهري الليزر المستخدمة، ونقاء عالية من أنواع الخلايا المعزولة هو هزيمةأنتجت inely 7،11،13،14.
جنس Boechera هو نظام نموذجا ممتازا لدراسة الخطوات الرئيسية لاستنساخ apomictic. في Boechera، وقد تم تحديد مجموعة متنوعة من مختلف انضمام الجنسية وapomictic، ويمكن استخدامها لتحليلات مقارنة 15،16،17. في مقارنة بين ترنسكربيتوم خلية نوع محدد من الخلايا من سلالة الجرثومية الإناث من نبات الأرابيدوبسيس الجنسي وapomictic Boechera، حددنا الجينات والممرات التي يتم التعبير عنها بشكل مختلف، وبالتالي تحديد جوانب جديدة من العمليات التنظيمية التي تحكم تكاثر لاتعرسي 7. وبالإضافة إلى ذلك، التحقق منها هذه الدراسة مدى ملاءمة لام لنوع محدد خلية النسخي تحليل أنواع الخلايا الصغيرة ونادرة. لقد استخدمت بالفعل هذا البروتوكول لتحليل أنواع مختلفة من الخلايا في مجموعة متنوعة من أنواع النباتات، ولكن species- وقد تكون هناك حاجة تعديلات الأنسجة محددة للبروتوكول في بعض الحالات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: يصف هذا البروتوكول إعداد الأنسجة، ليزر بمساعدة تسليخ مجهري، واستخراج الحمض النووي الريبي لتحديد ملامح النسخي. دائما استخدام قفازات في جميع الخطوات من البروتوكول. دراسة والنظر في تعليمات السلامة لكل المواد الكيميائية المستخدمة. على وجه الخصوص، أن نضع في اعتبارنا أن زايلول هو ضار ويمكن ان تخترق قفازات والميثانول السامة. لجميع الأدوات المستخدمة، يرجى الرجوع إلى دليل المستخدم وفقا لذلك.
1. إزالة آخر ريبونوكلياز من الأواني الزجاجية ومعدات أخرى
- قبل استخدامها، والتفاف أي الأواني الزجاجية في رقائق الألومنيوم قبل الخبز ل~ 8 ساعة على حرارة 180 درجة مئوية لضمان ريبونوكلياز عالية الجودة مجانا.
- علاج أي الأسطح المعدنية (على سبيل المثال، زوج من ملاقط)، وكذلك العمل على مقاعد البدلاء ولوحة التدفئة مع محلول تطهير ريبونوكلياز المناسب. بعد ذلك، وغسل الأسطح بالماء خالية من ريبونوكلياز لإزالة الحل إزالة التلوث. وفي وقت لاحق، وتنظيف الأسطح مع مزيد من ETOH 70٪.
- استخدام كل بلاسالمواد الاستهلاكية التشنج (على سبيل المثال، وأنابيب) العلامة التجارية الجديدة من دون أي معالجة مسبقة. إذا كان متوفرا، استخدام المواد الاستهلاكية البلاستيكية التي هي معتمدة إلى أن ريبونوكلياز مجانا.
2. الأنسجة التثبيت
- إعداد 10 مل من تثبيتي المزارعين (3: 1؛ ت / ت الإيثانول: حامض الخليك) في أنبوب 15 مل الطازجة على الجليد. (دائما إعداد تثبيتي المزارع الطازج قبل الاستخدام). وكبديل لذلك، والإيثانول غير يشابك مثبت: حامض الخليك (5: 1؛ ت / ت) يمكن استخدامها 18.
- استخدام زوج جيد من ملاقط لجمع البراعم في هذه المرحلة التنموية التي تهم. غمر فورا البراعم في تثبيتي الجليد الباردة. استخدام 10 مل من تثبيتي للتثبيت من ~ 20 براعم الزهور أو من نبات الأرابيدوبسيس أو Boechera ملاحظة: عند استخدام الأنواع النباتية مع الزهور الكبيرة فمن المستحسن أن تشريح الزهور بشفرة حلاقة لتوليد أجزاء أصغر قبل التثبيت.
- من أجل الحصول على نابتة عرسية ناضجة، تؤدي إلى إضعاف و2-3 أكبر براعم زهرة inflorescence 2 أيام قبل الحصاد.
- ملء الجزء السفلي من exsiccator مع الثلج. فتح الأنابيب التي تحتوي على عينات، على سبيل المثال، والزهور، ووضعها على الجليد، إما عن طريق وضعها مباشرة في الجليد في هذه الطريقة أنها لا يمكن أن تقع على أو باستخدام حامل المناسب. فراغ التسلل لمدة 15 دقيقة قبل إطلاقها من فراغ.
- تكرار تسلل فراغ مرة واحدة لمدة 15 دقيقة.
- الافراج عن فراغ وتخزينها بين عشية وضحاها (~ 12 ساعة) على الجليد. تغطية دلو الثلج مع غطاء أو رقائق الألومنيوم وتخزين دلو في غرفة C 4 درجات أو الثلاجة من أجل منع الجليد من الذوبان. ملاحظة: إطالة الوقت التثبيت غير مستحسن.
3. الأنسجة التضمين، رقيقة باجتزاء، وتصاعد على الشرائح للام
- الأنسجة التضمين.
- تبادل تثبيتي إلى 70٪ من الإيثانول أعدت مع الإيثانول النقي وريبونوكلياز المياه مجانا. ترك العينات على الجليد حتى مزيد من المعالجة. بدء embedding من العينات في نفس اليوم. في القضية رقم آلة معالجة الأنسجة متاح، انتقل إلى تضمين اليدوي كما هو موضح في أماكن أخرى 9،11 وتابع الخطوة 3.1.11.
- نقل بلطف عينات لأشرطة الأنسجة تضمين مع زوج من ملاقط. بحزم إغلاق أشرطة. خطوة حاسمة: تجنب تجفيف حتى الجزئي للعينة خلال هذه الخطوة. تجنب الضغط من عينات مع ملاقط.
ملاحظة: لتسمية أشرطة يجب استخدام قلم رصاص، من الناحية المثالية عن طريق الكتابة على سطح مائل للكاسيت. - تخزين كاسيت تضمين محملة براعم الزهور أو في الايثانول 70٪ حتى يتم نقل جميع المواد لأشرطة وآلة تضمين يمكن تحميل. لهذا الغرض، واستخدام حوض الزجاج تلطيخ مليئة الايثانول 70٪.
- إزالة سلة من المعالج الأنسجة من معوجة الجهاز ونقل أشرطة التضمين إلى سلة مع أسطح مائلة تواجه أعلى وفي نفس الاتجاه. CRIالخطوة TICAL: تنفيذ ذلك بسرعة لمنع أي جفاف الأنسجة. إذا تجهيز العديد من أشرطة التضمين في آن واحد، ضع سلة إلى ريبونوكلياز حاوية حرة المناسبة مليئة الايثانول 70٪ قبل تحميل العينات.
- وضع غطاء على السلة ووضع سلة العودة الى معوجة. إغلاق معوجة.
ملاحظة: المعالج الأنسجة يجفف تلقائيا العينات، تغير المذيب إلى زايلول، ويفعل تسلل مع شمع البارافين ذاب. عادة، يتم ذلك بين عشية وضحاها. - بدء تشغيل البرنامج من المعالج الأنسجة. الإعدادات القياسية الموصى بها هي 1 ساعة 70٪ ETOH، ثلاث مرات 1 ساعة 90٪ ETOH، ثلاث مرات 1 ساعة 100٪ ETOH، مرتين 1 ساعة 100٪ زايلول، مرة واحدة 1 ساعة 15 دقيقة 100٪ زايلول في درجة حرارة الغرفة، تليها تسلل مع شمع البارافين مرتين لمدة 1 ساعة ومرة واحدة لمدة 3 ساعة على 56 درجة مئوية (11).
ملاحظة: للتأكد من أن محطة حجب جاهزة مع الشمع ذاب، تبديل الجهاز على عدة ساعات قبل بداية أواستخدام وظيفة موقت لتحديد وقت انطلاق تقريبي.
ملاحظة: في حالة الأنسجة لا يمكن معالجة بعد ذلك على الفور، مرات حضانة أطول في شمع البارافين في 56 درجة مئوية والممكن بدلا من ساعة 3 عند 56 درجة مئوية. الرجوع إلى دليل المستخدم من الصك. عادة، فإن الأشرطة مع الأنسجة تبقى تلقائيا في ذاب الشمع حتى تتم الموافقة على "معوجة فارغة" القيادة. إذا لم يتم ذاب الشمع عند بدء تشغيل معالج الأنسجة، ويتم تعبئة معوجة مع الايثانول 70٪ ويبقى البرنامج على عقد حتى على استعداد للبدء. - إفراغ معوجة ونقل على الفور العينات إلى حمام شمع البارافين عند 56 درجة مئوية في محطة حظر. إزالة الغطاء من السلة وتغطية حمام البارافين من محطة حجب مع غطائه.
- يسخن كومة العديد من صواني موازنة جديدة على سطح محطة الحجب إلى 56 درجة مئوية كما أن هناك أشرطة في السلة.
ملاحظة: إن علامة دائمة مقاومة للالإيثانول يمكن استخدامهاد لتسمية الجزء السفلي من علب موازنة. لا ينصح علامات دائمة مقاومة للالأسيتون. - باستخدام محطة الحجب، وملء علبة موازنة بلاستيكية جديدة قبل تحسنت مع شمع البارافين ذاب عند 56 درجة مئوية. رفع غطاء للحمام البارافين، والتقاط كاسيت واحد فقط في وقت واحد ونقل عينات من أشرطة للشمع البرافين السائل عند 56 درجة مئوية في علبة التوازن باستخدام زوج من ملاقط.
خطوة حاسمة: تجنب أي تصلب شمع المحيطة العينة أثناء التعامل مع الكاسيت من خلال العمل بسرعة.- ضع كل العينات وفقا لاحتياجات باستخدام إبرة التحضير قبل تصلب الشمع. عادة، يتم ترتيب العديد من الزهور في علبة موازنة متباعدة بشكل فردي حوالي 1 سم في كل اتجاه.
- كرر الخطوة 3.1.9 حتى يتم نقل جميع العينات.
- وضع سلة العودة إلى المعالج الأنسجة وتنظيف معوجة باستخدام البرنامج المناسب (يرجى الرجوع إلى دليل المستخدم).
- إيقاف معالج الأنسجة ومحطة حظر. تابع الخطوة 3.1.13.
- في حال لم آلة تسلل الأنسجة وليس محطة التضمين المتاحة، واستخدام فرن تسخين لإذابة شمع البارافين عند 56 درجة مئوية. على مقاعد البدلاء، وملء الشمع ذاب في صواني موازنة البلاستيكية، ونقل العينات إلى الشمع، واستخدام الإبر تمهيدا لوضع العينات.
- السماح للشمع البارافين لتتصلب في درجة حرارة الغرفة ل~ 1-3 ساعة قبل تخزين العينات في 4 درجات مئوية. ويمكن بعد ذلك عينات سيتم تجهيزها حديثا أو تخزينها لمدة تصل إلى عدة أشهر.
- إعداد أقسام وشرائح رقيقة للام.
- على طاولة ضوء ينير كتلة الشمع من أسفل، وإزالة شمع البارافين مع عينات من الصواني البلاستيكية المحيطة بها. تشريح خارج كتلة الشمع التربيعية التي تحتوي على الأنسجة، وعلى سبيل المثال، برعم أو زهرة، وذلك باستخدام ريبونوكلياز الحلاقة المجانية شفرة. لتحقيق هذا الهدف، ودائما توجيه عينات نحو الجزء العلوي من كتلة الشمع (انظر أيضا
- إعداد كتل الشمع من جميع العينات التي ينبغي استخدامها للام في وقت واحد.
- على طاولة ضوء ينير كتلة الشمع من أسفل، وإزالة شمع البارافين مع عينات من الصواني البلاستيكية المحيطة بها. تشريح خارج كتلة الشمع التربيعية التي تحتوي على الأنسجة، وعلى سبيل المثال، برعم أو زهرة، وذلك باستخدام ريبونوكلياز الحلاقة المجانية شفرة. لتحقيق هذا الهدف، ودائما توجيه عينات نحو الجزء العلوي من كتلة الشمع (انظر أيضا
- جبل الكتل لمعالجة تضمين أشرطة مليئة شمع البارافين تصلب: تذوب قطعة صغيرة أو قطرة من شمع البارافين على طرف ملعقة المناسبة باستخدام مصباح الإيثانول واستخدام الشمع الساخن لإصلاح كتلة على الدعم (مع الأنسجة جزءا لا يتجزأ من في القمة).
- السماح للشمع لتتصلب لمدة 20 دقيقة على الأقل في 4 درجات مئوية.
- إزالة الشمع فائض المحيطة عينة بشفرة حلاقة على الطاولة الخفيفة. تأكد للحفاظ على سطح مربع مع حواف متوازية (انظر الشكل 1).
- تعيين لوحة التدفئة إلى 42 درجة مئوية.
- جبل بأمان العينات إلى مبضع للفحص المجهري وإعداد 6-10 ميكرون أبواب سميكة. الرجوع إلى إرشادات الشركة المصنعة لاستخدام مبضع للفحص المجهري. ملاحظة: في حين أقسام أرق وغالبا ما تعطي قرار الهيكلي أفضل، كمية أكبر من الحمض النووي الريبي من higheويمكن الحصول على جودة ص مع أقسام سمكا. لخلايا Boechera تنضج نابتة عرسية نستخدم 7 ميكرون كما الافتراضي. تتحرك ببطء مع العينات على السكين مشراح غالبا ما يؤدي إلى أفضل الأنسجة.
- نقل دائما شرائط البارافين بطول حوالي 10-15 سم في صندوق من البلاستيك مع الكرتون الأسود في الأسفل قبل وضعهم في الشرائح لام.
- إذا كان ذلك ممكنا، قبل تحديد أجزاء من شرائط البارافين تحتوي على الخلوي أو أنسجة أنواع من الفائدة، على سبيل المثال، البويضات، تحت النطاق تشريح وتجاهل بقية.
- ضع المبلغ المطلوب من الشرائح مؤطرة المعدنية (عادة 5-10) مع سطح مستو على رأس على لوحة التدفئة.
- الماصة ~ 1-2 مل من ريبونوكلياز المياه مجانا على جزء من البلاستيك من الشريحة. باستخدام شفرة حلاقة، وقطع شرائط البارافين في قطع قصيرة من حوالي 4-5 سم طويلة بما يكفي لتغطي النوافذ البلاستيكية. Uحد ذاتها زوج من ملاقط وإبرة تمهيدا لوضع مثالي شرائط البارافين موازية لبعضها البعض على نوافذ من البلاستيك الشرائح. رفع بعناية الشريحة في نهاية واحدة لإزالة المياه ووضع الشرائح الظهر.
- بدلا من ذلك، وضع لوحة التدفئة تحت غطاء الكيميائية. تطبيق كمية صغيرة من الميثانول إلى جزء من البلاستيك من الشريحة فقط كافية لتبلل السطح (وهذا يمكن أن يؤدي إلى تجعد طفيف للشرائح). وضع شرائط البارافين على الشرائح.
ملاحظة: لأسباب التسمم، وتجنب استخدام الميثانول إن أمكن. ومع ذلك، فإن استخدام الميثانول في هذه الخطوة لا تحسين نوعية الحمض النووي الريبي في حالة نوعية من قبل المتزايدة على المياه التي تحققت ليست كافية. ومن الجدير اختبار هذه البدائل في بداية مشروع جديد، حيث أن الحمض النووي الريبي الجودة تحقق يختلف مع نوع من الخلايا والأنواع قيد التحقيق.
- بدلا من ذلك، وضع لوحة التدفئة تحت غطاء الكيميائية. تطبيق كمية صغيرة من الميثانول إلى جزء من البلاستيك من الشريحة فقط كافية لتبلل السطح (وهذا يمكن أن يؤدي إلى تجعد طفيف للشرائح). وضع شرائط البارافين على الشرائح.
- تجفيف الشرائح بين عشية وضحاها على لوحة التدفئة في 42 درجة مئوية لمدة 12 ساعة ~. تغطية لوحة التدفئة معغطاء البلاستيك الذي لا يمس الشرائح. تأكد من أن غطاء من البلاستيك لا يمنع تبادل الهواء. لهذا الهدف غطاء يمكن وضعها على علب الماصة أو ما شابه ذلك لرفعه.
- بدلا من ذلك، والحد من وقت التجفيف لمدة لا تقل عن ساعتين أو حتى تظهر الأنسجة جافة تماما. الحد من الوقت تشريح لجمع من قد يحسن نوعية الحمض النووي الريبي.
- تحت غطاء الكيميائية، وإزالة الشمع الشرائح 2 مرات لمدة 10 دقيقة في زايلول باستخدام حاملي الشرائح المناسبة. تأكد من أن يغرق بالكامل جزء من البلاستيك من كل شريحة فقط ولكن السماح بإزالة الشريحة عن طريق لمس نهاية أوسع من الإطار المعدني التي يتم الاحتفاظ بها جافة.
- السماح للشرائح لتجف لمدة 10 دقيقة ~ تحت غطاء الكيميائية قبل لام.
ملاحظة: الشرائح يتم معالجتها فورا يمكن وضعها مرة أخرى على لوحة التدفئة في 42 درجة مئوية مع الأنسجة التي تواجه تصل لمدة تصل إلى عدة ساعات. هذا سيمنع أي الرطوبة من المساومة على جودة RNA حتى مزيد من المعالجة.
4. تسليخ مجهري بمساعدة الليزر (لام)
ملاحظة: الإجراء للام تختلف مع الأداة المستخدمة. يتم تكييفها بعض التفاصيل من هذا البروتوكول إلى أداة محددة والتكنولوجيا لجمع العينات على استخدام صنع غطاء من قوات كهرباء. وبالإضافة إلى ذلك، قد تختلف التفاصيل حتى بين الإصدارات المختلفة من البرنامج. يرجى الرجوع إلى تعليمات الشركة الصانعة وكتيبات المستخدم للحصول على وصف مفصل وتعليمات محددة بشأن الأدوات والبرمجيات.
- التبديل على الأجهزة للام (الكمبيوتر، المجهر، مربع عنصر التحكم ليزر).
- بدء تشغيل البرنامج توجيه المجهر والليزر.
- التبديل على الليزر عن طريق الضغط على زر المقابلة على السيطرة على المربع.
- وضع سقف (0.5 مل، دون موزع موجات الصوت بالتساوي) في حامل الغطاء ووضعه في الصك.
- دعم الشريحة لام مع شريحة زجاجية للفحص المجهري. تأكد من أن سطح مستو من الشريحة معالأنسجة المرفقة تواجه شريحة زجاجية.
- ضع الشريحة في الصك مع شريحة زجاجية تحت.
- حدد الهدف 4X. في البرنامج، وتحديد لتحريك الحد الأقصى للموقف "حتى"، والشروع في إجراء الفحص الشريحة.
- بحث عن طريق الشريحة وتحديد هياكل الفائدة. تحديد وحفظ مواقعهم على الشريحة لتكون قادرة على نقل مرة أخرى إلى الموضع الدقيق للخطوة القطع.
- تحديد الهدف المناسب (على سبيل المثال 40X أو 60X).
- إذا لزم الأمر، وضبط سرعة الليزر، والتركيز، وقوة الليزر، وكذلك معايرة حركة مرحلة بالرجوع إلى دليل المستخدم من الصك. مرة واحدة يتم تعيين حساب يصل للأنسجة معينة من الفائدة، ويمكن إعادة استخدامها الإعدادات.
- التحقق من موقف ليزر برصاصة واحدة عن طريق الضغط على زر "طلقة ليزر" للبرنامج، من الناحية المثالية في جزء من الغشاء دون الأنسجة.
- إذا لزم الأمر، معايرة موقف الليزر باتباع عشرتعليمات الإلكترونية المصنعة للصك.
- تحقق من معايرة الهدف عن طريق تحريك هيكل واضحا للجميع الزوايا الأربع من نافذة البرنامج على الشاشة، والحفاظ على زر الفأرة الأيمن الضغط عليه. تأكد من أن الموقف من ناحية فيما يتعلق هيكل واضح هو نفسه في جميع الزوايا الأربع. إلا معايرة الأهداف التالية دليل البرامج.
- مع سقف في موقف "أسفل"، استخدام أداة "اليد القلم 'للاحتفال حدود نوع من الخلايا أو الأنسجة من الاهتمام، على سبيل المثال، خلية البويضة. تشريح الخلية في المصالح مع ليزر عن طريق الضغط على 'قطع'. ملاحظة: في كثير من الأحيان، باجتزاء احتياجات أن يتكرر إذا كانت الحدود حول الخلية لم يكن تشريح تماما في آن واحد. في هذه الحالة، فمن المستحسن لوضع برنامج للقيام اثنين من يكرر القسم كمعيار تلقائيا.
- رفع الغطاء والانتقال إلى موقف حفظها المقبل مع هيكل من الفائدة. كرر الخطوة 4.13من إجراء تشريح الأقسام الخلية التالية حتى يتم جمع كل خلايا الفائدة من شريحة واحدة. تأكد من وضع الغطاء في هذه الطريقة أن القسم الجديد العصي لموقف فارغة على الغطاء.
ملاحظة: من المستحسن لعزل أكبر قطعة من الأنسجة (على سبيل المثال، أجزاء من الزهور كلها أو أجزاء منها) من كل شريحة بعد عزل أقسام خلية واحدة على سقف جديد. هذه يمكن استخدامها لمراقبة الجودة الحمض النووي الريبي. - إزالة الشريحة وتواصل مع الشريحة التالية بتكرار الخطوات 4،4-4،9 و4،13-4،14.
- وقد تم عزل كرر الخطوة 4.15 والخطوات ذات الصلة الى أن أنواع الخلايا من الاهتمام من كافة الشرائح. ملاحظة: لا ينصح لموسم الحصاد لمدة أطول من ~ 4-5 ساعة على نفس الغطاء.
- تفقد البصر سطح الغطاء بعد LAM استبعاد التلوث غير محددة من العينة. في حين أن الأنسجة غير تشريح محمية مع احباط، ويمكن أن الغبار عصا على السطح بسبب التصاق كهرباء.
- تس بصريا تفقد كأب، وإزالة الشريحة من الصك. وضع حامل غطاء في موقف 'أسفل' وافحص السطح مع الهدف 4X.
- في حالة قطع صغيرة من الغبار مرئية، إزالتها مع صغيرة (2 ميكرولتر) ماصة. بدلا من ذلك، جبل الشريحة مرة أخرى على الصك، ضع الغطاء على جزء خالية من الشريحة (لا الأنسجة)، وتدمر تماما من التلوث باستخدام الليزر.
- قبعات وثيقة وتجميد الأجزاء الجافة في -80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى. إذا لزم الأمر، والعينات ويمكن تخزينها لمدة تصل إلى عدة أسابيع. ومع ذلك، وانطلاقا بسرعة في هذه الخطوة ينصح.
5. عزل الحمض النووي الريبي ومراقبة الجودة
ملاحظة: RNA يمكن عزلها بأي طريقة مناسبة لكميات صغيرة من الحمض النووي الريبي. في هذا البروتوكول وصفت استخدام طقم RNA العزلة المحددة لكميات صغيرة من الحمض النووي الريبي. اتبع إرشادات الشركة المصنعة.
- استخدام أنابيب مع العينة المرفقة لغطاء إما مباشرة أو بعد إزالة من -80 درجة مئوية.
- فتح الأنابيب والماصة بعناية 11 ميكرولتر من استخراج العازلة على جدار كل أنبوب باستخدام نصائح فلتر. تغيير نصائح بين العينات.
- إغلاق الغطاء ويهز استخراج العازلة وصولا الى الحد الأقصى من الأنبوب.
- وضع أنابيب مع غطاء أسفل في فرن مسخن التدفئة إلى 42 درجة مئوية. احتضان لمدة 30 دقيقة بعد تعليمات الشركة الصانعة.
- اتبع إرشادات الشركة المصنعة لإعداد عمود وجمع استخراج في الجزء السفلي من الأنابيب.
- إذا كانت المادة من الغطاء أكثر من واحد يجب أن تكون مجتمعة في عينة واحدة، والمضي قدما بخطوات 5.1.1 - 5.1.2 بشكل فردي لكل أنبوب / سقف.
- بعد ذلك، تجميع مقتطفات لعينة واحدة في أنبوب واحد وقياس كمية استخراج المجمعة مع ماصة قبل إضافة مبلغ مساو من ETOH (انظر تعليمات الشركة الصانعة).
- تأكد من أن كمية إتوأضاف OH قبل تحميل العمود يساوي حجم استخراج المجمعة.
- بعد هطول الأمطار RNA مع ETOH، والمضي قدما بسرعة في التحميل من الأعمدة التالية تعليمات الشركة الصانعة. مواصلة بروتوكول مع خطوة الطرد المركزي 100 x ج.
- بعد أن تم تمرير محتويات كل أنبوب جمع من خلال العمود، نفذ خطوة الطرد المركزي 16000 x ج لمدة 30 ثانية لإزالة إرشادات الشركة المصنعة التدفق من خلال التالي ل.
- تواصل مع استخراج الحمض النووي الريبي وتنقية باتباع تعليمات الشركة الصانعة.
- بعد تحميل وشطف العازلة إلى العمود السماح العمود لاحتضان لمدة 1 دقيقة. الاستمرار في تحميل هذه الانابيب بداخل الطرد المركزي اتباع التعليمات في تعليمات الشركة الصانعة. ملاحظة: خطوة الطرد المركزي إضافية لمدة 1 دقيقة في 100 x ج قبل شطف كما هو مشار إليه في البروتوكول يمكن أن تزيد من كفاءة شطف.
- استخراج الحمض النووي الريبي من تابعسيادة القانون والأمن (أقسام الأنسجة أكبر) لمراقبة الجودة RNA الخطوات التالية 5.1 إلى 5.2.7 من هذا البروتوكول.
- لRNA تحميل مراقبة الجودة 1 ميكرولتر الحمض النووي الريبي مجموع مخفف من كل عينة السيطرة على Bioanalyzer باستخدام الحمض النووي الريبي بيكو رقاقة باتباع إرشادات الشركة المصنعة.
ملاحظة: استخراج الحمض النووي الريبي يمكن أن تستخدم لتضخيم الخطي والتحليل Transcriptome على استخدام المجهرية أو RNA تسلسل 7،11،13،14. من الناحية المثالية، ينبغي أن يذكر في مراقبة الجودة والنزاهة عدد RNA (رين) من 7. ما لا يقل عن عدد من الموردين توفر مجموعات مناسبة لالتضخيم، وهناك أمثلة مناسبة في 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تتم تحضير عينة ولام في خطوات متتالية
وثمة حاجة إلى عدد من الخطوات المتتالية للتحضير الحمض النووي الريبي لتحليل النسخي من أنواع الخلايا التي اختارها لام (الشكل 1). ويبدأ هذا الحصاد من الزهور والتثبيت على الفور للتأكد من أن سكان RNA لم يتغير بعد الحصاد. تم تضمين الأنسجة، ومقطوع، والتي شنت على الشرائح. وهذا يسمح للعزل الخلايا عن طريق لام وتجميع الأجزاء نوع محدد خلية على واحد أو عدة قبعات (الشكل 1). المواد يمكن أن تجمد بعد ذلك أو معالجتها مباشرة عن طريق استخراج الحمض النووي الريبي. وبصرف النظر عن الاستفادة من لام لتكون قابلة للتطبيق لخلية نوع محدد يحلل في كل من الأنواع نموذج وغير النموذجية، يبقى الأسلوب بدلا تستغرق وقتا طويلا. أسبوع واحد على الأقل من وقت العمل، وأحيانا أكثر من ذلك، هناك حاجة لخطوات من منظمة الشفافية الدوليةحصاد ssue لاستخراج الحمض النووي الريبي (الشكل 1). لا بد من الأخذ في الاعتبار أن يتم تجميع غالبا أقسام حصادها على مدى عدة أيام من لام في عينة وRNA استخراج البيولوجية واحدة. للخلايا البيض Boechera، واستخدام لا يقل عن 200 ~ أقسام لكل عينة ينصح بشدة، مع عزل ما يصل الى 100 ~ الأقسام يوميا.
عزل أنواع خلية من الفائدة يعتمد على الرؤية في أقسام الجافة
العزلة من المقاطع نوع معين الخلية هو الأكثر خطوة تستغرق وقتا طويلا للبروتوكول. حتى الآن، وقد وضعت لا أتمتة هذه الخطوة نظرا للطبيعة المعقدة للعينات. تحديد الخلايا ذات الاهتمام باستخدام أداة البرنامج ليس مجديا لأن أقسام الجافة بدرجة تباين منخفضة ويختلف الطائرة قسم بين العينات يرجع ذلك إلى حقيقة أن البويضات موجهة في زوايا مختلفة ثithin الأنسجة (الشكل 2). ومع ذلك، فإن التشكل فريدة من النبات العروسي ناضجة الإناث مع synergids، خلية بويضة وخلية المركزية (خلايا المتناقضة تتحول قبل الإخصاب) يسمح بتحديد واضح للخلايا البيض التي كتبها الباحث (الشكل 2B، C، الشكل 3). في الواقع، في Boechera divaricarpa، خلية البويضة غالبا ما ينكمش قليلا خلال إعداد وبالتالي يفصل من الأنسجة المحيطة بها، وهي ميزة مفيدة لعزل السكان خلية البويضة في نقاء عالية (الشكل 2B، C، الشكل 3).
يوصى التفتيش البصري للكاب بعد LAM
الفحص البصري من سطح الغطاء بعد LAM يسمح بالتعرف إلى أي من التلوث المحتملة من العينة، على سبيل المثال، من خلال الغبار. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه من المفيد للتأكد من أن حد ذاتهاctions عصا إلى الحد الأقصى، وأحيانا أقسام تضيع أثناء العملية. عادة، العديد من المقاطع المحددة، على سبيل المثال، خلايا البيض، يمكن أن ينظر في سقف واحد بعد عدة ساعات من لام.
سير العمل تأسست النتائج بتكاثر بحسن RNA الجودة
من نوع محدد خلية العزلة لام من نابتة عرسية الإناث، يبلغ مجموع RNA هي فقط في حدود نانوغرام منخفضة. هذا المبلغ الحد من الحمض النووي الريبي يجعل من الضروري استخدام عنصر تحكم تمثيلية معزولة عن الأنسجة أكبر من كل شريحة وشكل تقريبي لمراقبة الجودة RNA بعد لام. ويتجلى ذلك من خلال مقارنة الحمض النووي الريبي خلية نوع محدد من B. خلايا divaricarpa البيض بالمقارنة مع الضوابط من مناطق الأنسجة أكبر معزولة من نفس الشرائح، مشيرا إلى الحمض النووي الريبي الجودة مماثلة (الشكل 4A، B). باستخدام هذه الطريقة، وهي جيدة لنوعية الحمض النووي الريبي عالية مع أرقام رين & #8805؛ 7 تم الحصول عليها بتكاثر. وكانت نوعية الحمض النووي الريبي التي تحققت مناسبة للخلية نوع محدد RNA تسلسل، مما أدى إلى تحديد 236 الجينات التي أعرب عنها في خلية بويضة apomictic ولكن ليس في الخلية apomictic المركزية، خلية synergid، أو الخلايا الأولية apomictic، ولا في الخلايا أو الأمشاج الجنسي ناضجة من thaliana نبات الأرابيدوبسيس (الشكل 5) 7.
ويتم مخطط للخطوات من البروتوكول، مشيرا في الوقت الحد الأدنى المطلوبة في الخطوة التثبيت من الزهور أو أنسجة الفائدة بين عشية وضحاها: الشكل 1. في اليوم التالي، وبدأ التضمين، الذي يعمل طوال الليل، مما أسفر عن المواد المضمنة في يوم 3 من البروتوكول. في يوم 3 أقسام مشراح بدءا من عينات جزءا لا يتجزأ من كتل الشمع يمكن أن تتولد. هي التي شنت على شرائط من المقاطع البارافين رقيقة على الشرائح وتترك لتجف بين عشية وضحاها. علىسوف تكون هناك حاجة الإلكترونية لعدة أيام من LAM للحصول على ما يكفي من المواد لتكرار البيولوجي واحدة. بعد عزل الحمض النووي الريبي ومراقبة الجودة، وإعداد مكتبة للRNA تسلسل يمكن القيام بها لإعداد تحليل Transcriptome على. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: خلايا البيض التعرف بوضوح في أقسام رقيقة، نظرا لمورفولوجيا المميزة من الأمشاج أنثى (A) رسم تخطيطي للناضجة الأمشاج الإناث (نوع بوليغونوم) (B - C) الشرائح الرقيقة من خلال البويضات إيواء نابتة عرسية الإناث في. Boechera divaricarpa. خلايا البيض هي واضحة للعيان. ويرجع ذلك إلى التشكل من الأمشاج الإناث في كثير من الأحيان ليست كل أنواع الخلايا (خلية البويضة: ه، synergids: الصورةالخلية المركزية: ج ج) واضحة في مقطع واحد. الحانات النطاق = 50 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. لام من خلايا البيض من Boechera divaricarpa. A و C. قسم النبات العروسي ناضجة من B. divaricarpa في 7 ميكرون قبل و، B و D، بعد تسليخ مجهري مع جهاز الليزر (خلية البويضة: ه، synergids: الصورة، الخلية المركزية: ج ج). الحانات النطاق = 50 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
<قوي> الشكل 4. RNA الجودة من خلايا البيض تشريح الليزر وأقسام التحكم. (A) الحمض النووي الريبي الجودة كما تم تحليلها من أقسام خلية بويضة بالمقارنة مع (ب) مناطق الأنسجة أكبر تحصد من نفس الشرائح والضوابط. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5. تحديد الجينات التي أعرب عنها فقط في خلية Apomictic البيض بالمقارنة مع خلايا من Apomictic والجنسية نابتة عرسية الناضجة أو Apomictic الخلية الأولي. مخطط النشاط من 236 الجينات التي أعرب عنها في خلية بويضة apomictic لكن لا في الخلية المركزية apomictic، خلية synergid ، أو الخلايا الأولية apomictic باء gunnisoniana ولا خلايا النبات العروسي الجنسي ناضجة من أ. thaliana 7 الهرميواستند تجميع العينات والجينات على المسافة الإقليدية والتكتلات agglomerative الهرمي. الأحمر يدل على التعبير عالية والأسود منخفض التعبير. يتم تحجيم الألوان في صف واحد. APO: apomictic الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بروتوكول غير مناسبة للخلية مختلفة وأنواع الأنسجة
لام جنبا إلى جنب مع Transcriptome على التحليلات التي المجهرية أو RNA تسلسل هو أداة قيمة لاكتساب نظرة ثاقبة لأنماط معينة من النشاط الجيني تنظيم العمليات التنموية أو الفسيولوجية 7-11،13،14. ومع ذلك، فإن ملاءمة هذه الطريقة لأي نوع خلية معينة تعتمد بشكل كبير على القضايا الهيكلية. تحتاج الخلية لتكون مرئية بشكل واضح ويسهل تبين بشكل لا لبس فيه في الفروع الجافة المستخدمة للام. في Boechera divaricarpa، مورفولوجيا النبات العروسي يسمح للسهولة التعرف على خلية البويضة (الشكل 2 الشكل 3). في النهاية، وسرعة عزل السكان خلية معينة يعتمد أيضا على التردد الذي نوع من الخلايا يمكن العثور على شريحة واحدة، كما تبادل الشرائح ومسح شرائح جديدة هي الخطوات تستغرق وقتا طويلا. وبالنظر إلى أن تعتمد على نوع من الخلايا، لا يقل عن 200 - 250 طائفة خليةيجب تجميع أيونات لكل عينة، وملاءمة طريقة لتصميم دراسة معينة تعتمد إلى حد كبير على متطلبات الوقت للخطوة لام.
وبالإضافة إلى ذلك، اعتمادا على التشكل من الأنسجة، وأنه قد يكون من المفيد من حيث الهيكل للحد من سمك الأقسام إلى 6 ميكرون. وبالمثل، أقسام سمكا من الناحية المثالية ≥ 8 ميكرومتر يؤدي عادة إلى ارتفاع كمية الحمض النووي الريبي والحمض النووي الريبي أعلى قليلا جودة من نفس الكمية من أقسام الأنسجة. وبالإضافة إلى ذلك، يجب أن يكون خلايا الفائدة ما لا يقل قطرها من 8-10 ميكرون لجعل العزلة التي كتبها LAM ممكنا.
من حيث المبدأ، على بروتوكول الموصوفة هنا يمكن تعديلها لخلية والأنسجة المختلفة أنواع من الأنواع بعيدة الصلة. ومع ذلك، يمكن أن الحمض النووي الريبي الجودة تختلف حتى بين أنواع مختلفة من الخلايا من نفس النوع 7،10،13. تم تعديل هذا البروتوكول على أساس أنواع الخلايا الصغيرة والحرجة. وبالتالي، فإنه يمكن تطبيقها الآن لbroadeمجموعة ص العينات دون مزيد من التعديلات. قد تكون هناك حاجة مع ذلك تعديلات طفيفة على البروتوكول، وهذا يتوقف على نوع من الخلايا والأنواع قيد التحقيق. فمن المستحسن أن أول استخدام كل مثبتات بديلة (انظر بروتوكول 1.1) عند إعداد طريقة للحصول على أنواع جديدة أو نوع من الخلايا للمقارنة بين الشكل ونوعية الحمض النووي الريبي.
من حيث المبدأ، على بروتوكول يمكن أن تتكيف مع وتنفيذ بأدوات مختلفة مناسبة لتسليخ مجهري ليزر 9. ومع ذلك، لا بد من الإشارة إلى أن الصكوك تختلف سواء في قوة الليزر وعرض الحد الأدنى من شعاع الليزر التي يمكن تطبيقها، وكذلك في تقنية أخذ العينات. لا سيما بالنسبة لعزل الخلايا الصغيرة والمناطق الأنسجة، وأشعة الليزر مما أدى إلى مسار الليزر ضيق تتلاءم بشكل أفضل. شعاع ليزر من الصك الذي نستعمله هو ليس على ما يرام (~ 1 ميكرون واسع) ويسمح تشريح خلايا صغيرة. تكنولوجيا أخذ العينات من جمع سلليرة سورية على سطح الغطاء لزجة من الالتصاق الكهربائي هو مفيد بشكل خاص لأنواع الخلايا الصغيرة وعزل أقسام خلية واحدة. هذا يقلل من مخاطر الخسارة عينة من آثار كهرباء.
جودة RNA التي يتم الحصول عليها من المهم بالنسبة للتحليلات الترانسكربتي المزيد
واحدة من النقاط الأكثر أهمية لنجاح إعداد مكتبة RNA يليها هو نوعية الحمض النووي الريبي. بينما العديد من موفري مجموعات التضخيم الأمثل التكنولوجيا من أجل RNA النزاهة أقل من ذلك، ونوعية البيانات التي تم الحصول عليها بعد التحليل Transcriptome على إما عن طريق المجهرية أو RNA تسلسل يزيد عادة مع نوعية الحمض النووي الريبي الإدخال. باستخدام هذا البروتوكول المعمول بها، تم الحصول جيدة وقابلة للتكرار للغاية الحمض النووي الريبي الجودة لمراحل النمو المختلفة من الأنسجة التناسلية للأنثى وسلالة الجرثومية في نبات الأرابيدوبسيس وBoechera (على سبيل المثال، الشكل 4). في حين أن الطريقة تنطبقأيضا الأنواع أكثر بعيدة الصلة (على سبيل المثال، الطماطم، غير منشورة)، فإنه يحتاج إلى أن تؤخذ بعين الاعتبار أن أمثل صغيرة أو تعديلات قد تكون هناك حاجة تبعا للأنواع، نوع الأنسجة، وحتى البيئة المختبر، على سبيل المثال، ارتفاع نسبة الرطوبة قد تعرض سلامة الحمض النووي الريبي خلال إعداد الشرائح ولام.
خطوة حاسمة خلال البروتوكول هو تركيب للخطوط الشمع مقطوع تحتوي على عينات على الشرائح. هنا، ولا سيما لجهة الاتصال على المياه هو خطوة حاسمة. في حين استبدال المياه ETOH لا تؤدي إلى أي تحسن كبير في سلامة الحمض النووي الريبي بعد العزلة (غير منشورة)، واستبدال الماء الميثانول لا. ومع ذلك، ينبغي التعامل مع الميثانول فقط تحت غطاء محرك السيارة الكيميائية ومع عناية كبيرة. اعتمادا على نوع العينة، كبديل لاستخدام الميثانول، وتجفيف مرات بعد تصاعد مع المياه التي يمكن تخفيضها إلى ~ 2 ساعة (انظر 3.3.3.1)، مما أدى في الحمض النووي الريبي الجودة جيدة على حد سواء.أداء محاكمة لاختبار الحمض النووي الريبي الجودة من تصاعد إما على الماء أو الميثانول لنوع الخلية ونوع من الاهتمام الحاصل ينصح في بداية مشروع جديد.
لام هو تقنية قوية للتحليلات الترانسكربتي
في الختام، لقد بنجاح الأمثل وتطبيق مزيج من لام وتحليل Transcriptome على خلية نوع محدد من القطع الصغيرة وRNA تسلسل إلى خلايا مختلفة من سلالة سلالة الجرثومية الجنسي وapomictic في thaliana نبات الأرابيدوبسيس وفي Boechera النيابة، مما يسمح التحليلات النسخي المقارنة (انظر أيضا الشكل 5) 7،11،13،14. الطريقة الموصوفة يحمل عددا من المزايا بالمقارنة مع غيرها من التكنولوجيات السماح خلية التحليل النسخي نوع معين. الأهم من ذلك، اعتمادا على التعرف عليها من أنواع الخلايا أو الأنسجة من الفائدة في هذا الباب، فإنه يمكن تطبيقها على أنواع الخلايا نادرة من كلا نموذجوالأنواع غير النموذجية، مثل خلايا الأمشاج الإناث الناضجة في Boechera النيابة، أو أنه يمكن حتى أن تستخدم لعزل المجالات الخلوية، على سبيل المثال، نصفين القطبية الخلايا 19. سوف تطبيقات مماثلة لن يكون ممكنا مع الطرق الأخرى التي تعتمد على الفلورسنت تنشيط فرز الخلايا أو النوى (FACS / FANS) 10.
والعيب الرئيسي لهذه الطريقة متطلبات الوقت. في حين أن تثبيت والتضمين لا تتطلب التدريب العملي على تمديد الوقت ويمكن في نفس الوقت تم القيام به لكمية كبيرة من الزهور، ولام على هذا النحو هو بالذات، وبالنسبة لتحليل نوع معين الخلية، وتستغرق وقتا طويلا عادة 3 أيام إلى 3 أسابيع من لام (في المتوسط 5 ساعة يوميا في المجهر ليزر) يحتاج إلى تخطيط. وفي هذا الصدد، فإنه من المفيد القيام ببعض الاختبارات المسبقة لسرعة عزلة من نوع خلية معينة مستهدفة لتصميم بشكل صحيح الدراسة. وبالإضافة إلى ذلك، حتى عند استخدام هذا البروتوكول الأمثل، والتجارب لاختبار الحمض النووي الريبي الجودة يعاد للغايةأثنى الأعضاء.
وباختصار، لام هو أداة قوية لتحليل النسخي على قرار من أنواع الخلايا الفردية أو حتى نطاقات فرعية من الخلايا، وهو ما لا يمكن تحقيقه باستخدام الطرق البديلة القائمة. في هذا الصدد، أنه يحمل إمكانات هائلة للسماح التحليلات، على سبيل المثال، من العمليات التنموية، مع القرار الزماني والمكاني عالية جدا. وقد اتضح ذلك من خلال تحليلات ترنسكربيتوم من الخلايا في كل الخطوات الرئيسية لالتكاثر الجنسي وapomictic في نبات الأرابيدوبسيس وBoechera 7،11،13،14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | VWR | 1,009,861,000 | absolute EMPROVE Ph Eur,BP,USP |
| 15 ml falcon centrifuge tubes | VWR | 62406-200 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2939AA | |
| Acetic Acid | Applichem | A3686,2500 | 100% Molecular biology grade |
| Ambion Nuclease free water | life technologies | AM9932 | |
| ASP200 S | Leica | 14048043624 | tissue processor |
| black cardboard | can be purchased in special paper shops | ||
| DNA- and RNAse-free Frame Slides | Micro Dissect GmbH | 1, 4 µm PET-membrane; can also be purchased from Leica | |
| Dumond Forceps | Actimed | 0208-5SPSF-PS | |
| ethanol lamp | |||
| exsiccator | Sigma-Aldrich | Z354074-1EA | Nalgene Vaccuum Dessicator or similar equipment |
| filter tips 10 µl | Axon Lab AG | AL60010 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 1,000 µl | Axon Lab AG | AL60010 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 20 µl | Axon Lab AG | AL60020 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 200 µl | Axon Lab AG | AL60200 | can be replaced by similar tips |
| forceps precision | VWE | 232-1221 | |
| glass slide holder | Huber & Co.AG | 10.0540.01 | Färbekästen nach Hellendahl |
| glass staining trough | Huber & Co.AG | 10.0570.01 | Färbekasten |
| Heated Paraffin Embedding Module Leica | Leica | Leica EG 1150 H | blocking station, similar devises are suitable |
| Heating and Drying Table | Medax | 15501 | other models and/or suppliers are suitable |
| ice bucket | VWR ice bucket with lid | 10146-184 | similar buckets equally suitable |
| light table | UVP An Analytical Jena Company | TW-26 | white light transluminator |
| microscope slide | Thermo Scientific | 10143562CE | cut edges |
| microtome blade | Thermo Scientific | FEAHS35 | S35 microtome blade disposable |
| MMI Cell Cut Plus Instrument | MMI (Molecular Machines and Industries) | ||
| Non-stick, RNAse free Microfuge tubes, 2 ml | life technologies | AM12475 | |
| Paraplast X-TRA | Roth | X882.2 | for histology |
| PicoPure RNA Isolation Kit | life technologies | KIT0204 | Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit |
| plastic balancing trays | Semadeni AG | 2513 | |
| plastic box | Semadeni AG | 2971 | Plastikdose PS |
| plastic lid for heating plate | homemade | ||
| preparation needle | VWR | 631-7159 | |
| RNA 6000 Pico Kit | Agilent | 5067-1513 | |
| RNAse free microfuge tubes | life technologies | AM12400 | |
| RNAse ZAP Decontamination Solution | life technologies | AM9780 | |
| Semi-automated Rotary Microtome | Leica | RM2245 | similar devices are equally suitable |
| Tissue Loc Histo Screen Cassettes | Thermo Scientific | C-1000_AQ | similar cassettes of other suppliers are suitable |
| Tubes with adhesive lid, without diffusor 500 µl | MMI (Molecular Machines and Industries) | 50204 | |
| Xylol (Isomere) ROTIPURAN | VWR | 4436.2 | min. 99%, p.a., ACS, ISO SP |
| process embedding cassettes | Leica | 14039440000 | Leica Jet Cassette I without lid |
| Universal Oven | Memmert | UF55 | other models and/or suppliers are suitable |
References
- Maheshwari, P. An Introduction to the Embryology of Angiosperms. , McGraw-Hill. New York. (1950).
- Willemse, M. T. M., Van Went, J. L. The female gametophyte. Embryology of Angiosperms. Johri, B. M. , Springer-Verlag. Berlin. 159-196 (1984).
- Koltunow, A. M., Bicknell, R. A., Chaudhury, A. M. Apomixis: Molecular strategies for the generation of genetically identical seeds without fertilization. Plant Physiol. 108, 1345-1352 (1995).
- Vielle-Calzada, J. P., Crane, C., Stelly, D. M. Apomixis - the asexual revolution. Science. 274, 1322-1323 (1996).
- Grossniklaus, U., Koltunow, A., van Lookeren Campagne, M. A bright future for apomixis. Trends Plant Sci. 3, 415-416 (1998).
- Schmidt, A., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. Plant germline formation: molecular insights define common concepts and illustrate developmental flexibility in apomictic and sexual reproduction. Development. 142, 229-241 (2015).
- Schmidt, A., et al. Apomictic and sexual germline development differ with respect to cell cycle, transcriptional, hormonal and epigenetic regulation. PLOS GENET. 10, e1004476 (2014).
- Okada, T., et al. Enlarging cells initiating apomixis in Hieractium praealtum transition to an embryo sac program prior to entering mitosis. Plant Physiol. 163, 216-231 (2013).
- Wuest, S. E., Grossniklaus, U. Laser-assisted microdissection applied to floral tissues. Methods Mol Biol. 1110, 329-344 (2014).
- Wuest, S. E., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. Cell-specific expression profiling of rare cell types as exemplified by its impact on our understanding of female gametophyte development. Curr Opin Plant Biol. 16 (1), 41-49 (2013).
- Wuest, S. E., et al. Arabidopsis female gametophyte gene expression map reveals similarities between plant and animal gametes. Curr Biol. 20, 1-7 (2010).
- Cai, S., Lashbrook, C. C. Laser capture microdissection of plant cells from tape-transferred paraffin sections promotes recovery of structurally intact RNA for global gene profiling. Plant J. 48 (4), 628-637 (2006).
- Schmidt, A., Wuest, S. E., Vijverberg, K., Baroux, C., Kleen, D., Grossniklaus, U. Transcriptome analysis of the Arabidopsis megaspore mother cell uncovers the importance of RNA helicases for plant germ line development. PLOS BIOL. 9, e1001155 (2011).
- Schmid, M. W., Schmidt, A., Klostermeier, U. C., Barann, M., Rosenstiel, P., Grossniklaus, U. A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA sequencing. PLOS ONE. 7, e29685 (2012).
- Mau, M., et al. Hybrid apomicts trapped in the ecological niches of their sexual ancestors. Proc Natl Acad Sci.U S A. 112 (18), 2357-2365 (2015).
- Aliyu, O. M., Seifert, M., Corral, J. M., Fuchs, J., Sharbel, T. F. Copy number variation in transcriptionally active regions of sexual and apomictic Boechera. demonstrates independently derived apomictic lineages. Plant Cell. 25 (10), 3808-3823 (2013).
- Corral, J. M., et al. A conserved apomixis-specific polymorphism is correlated with exclusive exonuclease expression in premeiotic ovules of apomictic boechera species. Plant Physiol. 163 (4), 1660-1672 (2013).
- Deeken, R., Ache, P., Kajahn, I., Klinkenberg, J., Bringmann, G., Hedrich, R. Identification of Arabidopsis thaliana. phloem RNAs provides a search criterion for phloem-based transcripts hidden in complex datasets of microarray experiments. Plant J. 55, 746-775 (2008).
- Schmid, M. W. Genome Scale Quantitative Biology in Arabidopsis thaliana. , University of Zürich. PhD Thesis 40-104 (2015).
