Introduction
Dans les études de transcription effectuées au niveau des tissus, les transcriptomes de types de cellules hautement spécialisées, mais rares sont souvent masqués par les cellules environnantes plus abondantes. Un exemple de ces types de cellules hautement spécialisées sont les cellules de la lignée de reproduction féminin (germinale) dans les plantes. La lignée germinale femelle est spécifié dans les ovules en développement, les précurseurs de graines à l' intérieur du gynécée du 1,2 fleur. La cellule mégaspore mère (MMC) est la première cellule de la lignée germinale femelle. Il subit la méiose pour former une tétrade de mégaspores réduits. En règle générale, une seule de ces mégaspores survit et se divise en mitose sans cytokinèse, soit dans un syncytium. Ces mitoses sont suivis par cellularisation pour former le gamétophyte mature, qui se compose généralement de quatre types de cellules: trois antipodes, deux cellules synergide, l'œuf et la cellule centrale. Les cellules d'oeufs et centrales sont les gamètes femelles qui se fécondés par deux spermatozoïdes pendant doufertilisation ble pour donner naissance à l'embryon et de l' albumen du 1,2 de graines de développement. Dans le sexuel système modèle Arabidopsis thaliana, seulement ~ 50 graines se développent par fleur tandis qu'environ 50 - 80 graines se développent par fleur dans le genre étroitement apparenté Boechera. Ainsi, la lignée germinale femelle se compose de seulement quelques types de cellules hautement spécialisées, ce qui en fait un excellent modèle pour étudier les processus de développement, tels que la spécification et la différenciation cellulaire.
En outre, un aperçu des processus de régulation des gènes régissant la reproduction des plantes peuvent être de valeur appliquée. Chez les plantes, à la fois la reproduction sexuée et asexuée par graines (apomixie) peut se produire. Bien que la reproduction sexuelle génère la diversité génétique dans une population, apomixie conduit à la formation de la progéniture clonale qui est génétiquement identique à la plante mère. Par conséquent, l'apomixie a un grand potentiel pour des applications dans l'agriculture et la production de semences, comme les génotypes maternels même complexes peuventêtre maintenu inchangé pendant plusieurs générations 3,4,5. Parce que apomixie ne se produit pas naturellement dans toutes les principales espèces cultivées, l'ingénierie de l' apomixie dans les cultures est d' une grande 3,4,5 d'intérêt. Cependant, cet objectif à long terme est difficile à réaliser parce que la base génétique et moléculaire sous - jacente de l' apomixie on ne comprend pas suffisamment détaillée 6.
Pour obtenir un aperçu de la base de la transcription qui régissent la reproduction apomictique, une cellule de type spécifique de transcription profilage à l' aide microdissection assistée par laser (LAM) et le séquençage de prochaine génération (NGS) représente une approche très puissante 7,8. LAM a d'abord été mis en place pour les animaux et la recherche biomédicale. Au cours des dernières années LAM a également été appliquée à la biologie végétale 6,9,10. Contrairement à d' autres méthodes permettant de profilage de types de cellules et de tissus, LAM ne nécessite pas la génération des lignes de marquage 6,9,10. Par conséquent, il peut être applimenti à une cellule ou d'un tissu de type sans connaissance moléculaire préalable. Un autre avantage de LAM est qu'il peut être appliqué à tout type de cellule aussi longtemps que la cellule peut être reconnu dans les sections sèches en fonction de la position et / ou les caractéristiques structurelles. LAM présente l'avantage supplémentaire que les tissus fixes sont utilisés, ce qui empêche toute modification du profil de transcription lors du traitement.
Le tissu d'intérêt, par exemple, le tissu floral, est fixé dans un fixateur non réticulant avant l'enrobage dans la paraffine. Incorporation dans la cire de paraffine peut être fait manuellement, en suivant les protocoles établis 9,11. Cependant, l'utilisation d'un processeur de tissu automatisé pour la déshydratation et l'infiltration avec la cire se traduit généralement par une reproductibilité élevée en termes de conservation de la qualité de l'ARN et la morphologie du tissu. La stratégie alternative d'incorporation des tissus en résine a également été utilisé avec succès pour des analyses spécifiques de type cellulaire par LAM 8. Cependant, l'utilisation d'un automprocesseur de tissus ATED pour l'enrobage dans de la cire est très efficace du temps, car de nombreux échantillons peuvent être traités à la fois exigeant un minimum de temps sur les mains. Bien qu'elle soit généralement pas de perte significative de qualité de l'ARN a lieu lors de la fixation et l'intégration, la préparation de sections minces avec le microtome et, en particulier, leur montage sur les frameslides utilisés pour LAM restent une étape essentielle pour la préservation de la qualité de l'ARN. Cela a déjà été noté et l'utilisation d'un système de transfert de bande a été décrite pour aboutir à une meilleure qualité de l' ARN à cette étape 12. Toutefois, cela ajoute une étape de temps supplémentaire lors de la préparation des diapositives et nécessite également un équipement spécial. Le protocole optimisé décrit ci - dessous produit reproductible ARN qui est d' une qualité suffisante pour le profilage transcriptionnel avec GeneChips et Next Generation Sequencing (NGS) approches 7,11,13,14. En outre, avec le microscope à microdissection laser utilisé, avec une pureté élevée des types de cellules isolées est routinely produit 7,11,13,14.
Le genre Boechera est un excellent modèle pour étudier les principales étapes de la reproduction apomictique. Dans Boechera, une variété de différentes accessions sexuelles et apomictiques ont été identifiés et peut être utilisé pour des analyses comparatives 15,16,17. Dans une comparaison des transcriptomes type de cellules spécifiques de cellules de la lignée germinale femelle d'Arabidopsis sexuelle et apomictique Boechera, nous avons identifié les gènes et les voies qui sont exprimés différemment, identifiant ainsi les nouveaux aspects des processus réglementaires régissant apomixie 7. En outre, cette étude a vérifié l'aptitude des cellules LAM pour la transcription spécifique du type d'analyses de types de cellules petites et rares. Nous avons déjà utilisé ce protocole pour l'analyse des différents types de cellules dans une variété d'espèces végétales, mais l'espèce et des modifications spécifiques de tissus au protocole peut être nécessaire dans certains cas.
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Protocol
Remarque: Ce protocole décrit la préparation des tissus, laser assistée par microdissection, et l'extraction de l'ARN pour le profilage transcriptionnel. Utilisez toujours des gants dans toutes les étapes du protocole. Étudier et examiner les consignes de sécurité pour chaque produit chimique utilisé. En particulier, gardez à l'esprit que Xylol est nuisible et peut pénétrer des gants et que le méthanol est toxique. Pour tous les instruments utilisés, s'il vous plaît se référer à des manuels d'utilisation en conséquence.
1. Suppression de RNAse Activité de verrerie et d'autres équipement
- Avant utilisation, envelopper toute la verrerie dans une feuille d'aluminium avant la cuisson pendant environ 8 heures à 180 ° C pour assurer la qualité RNAse libre.
- Traiter toutes les surfaces métalliques (par exemple, une paire de pinces), ainsi que le banc de travail et la plaque chauffante avec une solution de décontamination RNAse appropriée. Ensuite, laver les surfaces avec de l'eau sans RNAse pour éliminer la solution de décontamination. Par la suite, nettoyez les surfaces plus loin avec 70% EtOH.
- Utilisez tous les plasconsommables tic (par exemple, tubes) flambant neuf sans aucun prétraitement. Si possible, utilisez des consommables en plastique qui sont certifiés pour être RNase.
2. La fixation tissulaire
- Préparer 10 ml de fixateur de fermier (3: 1; v / v d'éthanol: acide acétique) dans un nouveau tube de 15 ml sur la glace. (Toujours préparer le fixateur de fermier frais avant utilisation). En variante, l'éthanol non réticulant fixatif: acide acétique (5: 1, v / v) peut être utilisé 18.
- Utilisez une belle paire de pinces pour recueillir des bourgeons au stade de développement d'intérêt. plonger immédiatement bourgeons dans le fixateur glacée. Utilisez 10 ml de fixateur pour la fixation de ~ 20 bourgeons ou des fleurs de Arabidopsis ou Boechera Note:. Lors de l' utilisation des espèces végétales avec de plus grandes fleurs , il est recommandé de disséquer les fleurs avec une lame de rasoir pour générer de plus petits morceaux avant la fixation.
- Afin d'obtenir gamétophytes matures, émasculer les 2 - 3 grands boutons de fleurs de la inflorescence 2 jours avant la récolte.
- Remplissez le fond d'un dessiccateur avec de la glace. Ouvrez les tubes contenant les échantillons, par exemple, des fleurs, et les placer sur la glace, que ce soit en les mettant directement dans la glace d'une manière qu'ils ne peuvent pas tomber ou en utilisant un support approprié. Infiltre sous vide pendant 15 minutes avant la libération du vide.
- Répéter l'infiltration sous vide, une fois pendant 15 min.
- Relâchez le vide et le magasin pendant une nuit (~ 12 h) sur la glace. Couvrir le seau à glace avec un couvercle ou une feuille d'aluminium et de stocker le seau dans une chambre ou C réfrigérateur 4 ° pour empêcher la glace de la décongélation. Remarque: Prolonger la durée de fixation est pas recommandé.
3. Enrobage des tissus, Thin Sectionnement et Montage sur Diapositives pour LAM
- plongement des tissus.
- Remplacez le fixateur à 70% d'éthanol préparé avec de l'éthanol pur et RNAse eau libre. Laissez les échantillons sur la glace jusqu'à ce que le traitement ultérieur. Démarrez embedding des échantillons du même jour. Dans le cas où aucune machine de tissu de traitement est disponible, passez à l' intégration manuelle comme décrit par ailleurs 9,11 et passez à l' étape 3.1.11.
- transférer délicatement les échantillons à cassettes de tissus intégrant avec une paire de pinces. Bien fermer les cassettes. ÉTAPE CRITIQUE: Éviter le séchage même partielle de l'échantillon au cours de cette étape. Ne pas tordre des échantillons avec la pince à épiler.
Remarque: Pour étiqueter les cassettes d'un crayon doit être utilisé, idéalement en écrivant sur la surface inclinée de la cassette. - Rangez la cassette enrobage chargé des bourgeons ou des fleurs dans 70% d'éthanol jusqu'à ce que tout le matériel est transféré à cassettes et la machine enrobage peut être chargé. A cet effet, utiliser une cuve de coloration de verre rempli de 70% d'éthanol.
- Retirer le panier de traitement de tissu provenant de la cornue de la machine et transférer les cassettes d'encastrement dans le panier avec les surfaces inclinées faisant face à la partie supérieure et dans la même direction. CRISTEP TICAL: Effectuez cette rapidement pour éviter tout dessèchement des tissus. Si le traitement de nombreuses cassettes d'enrobage à la fois, placez le panier dans un récipient sans RNAse approprié rempli de 70% d'éthanol avant le chargement des échantillons.
- Mettez le couvercle sur le panier et mettre le panier de nouveau dans la cornue. Fermez la cornue.
Remarque: Le processeur de tissus déshydrate automatiquement les échantillons, change le solvant Xylol, et fait l'infiltration avec de la cire de paraffine fondue. Typiquement, cela se fait pendant une nuit. - Démarrer le programme du processeur de tissus. réglages standards recommandés sont 1 h 70% EtOH, trois fois 1 h 90% EtOH, trois fois 1 h 100% EtOH, deux fois 1 h 100% Xylol, une fois 1 h 15 min 100% Xylol à la température ambiante, suivie par infiltration avec de la cire de paraffine à deux reprises pendant 1 heure et une heure pendant 3 heures à 56 ° C 11.
Remarque: Pour veiller à ce que la station de blocage est prêt avec la cire fondue, allumer la machine plusieurs heures avant le début ouutiliser la fonction de minuterie pour sélectionner l'heure de départ approximative.
Remarque: Dans le cas où le tissu ne peut pas être traitée immédiatement après, de plus longues durées d'incubation dans la cire de paraffine à 56 ° C sont possibles au lieu de 3 heures à 56 ° C. Reportez-vous au manuel d'utilisation de l'instrument. En règle générale, les cassettes avec les tissus restent automatiquement dans la cire fondue jusqu'à ce que la commande "vide de l'autoclave" est approuvé. Si la cire est pas fondu lors du démarrage du processeur de tissus, la cuve est remplie de 70% d'éthanol et le programme reste en attente jusqu'à ce prêt à démarrer. - Vider la cuve et les transférer immédiatement les échantillons dans un bain de paraffine à 56 ° C dans un poste de blocage. Retirez le couvercle du panier et couvrir le bain de la station de blocage avec son couvercle de paraffine.
- Pieu de nombreux plateaux d'équilibrage frais sur la surface de la station de blocage est chauffé à 56 ° C, comme il y a des cassettes dans le panier.
Note: Un marqueur permanent éthanol résistant peut être utiliséd pour étiqueter le fond des plateaux d'équilibrage. marqueurs permanents Acétone résistant ne sont pas recommandés. - Utilisation de la station de blocage, remplir un nouveau plateau en plastique d'équilibrage préchauffé avec de la cire de paraffine fondue à 56 ° C. Soulevez le couvercle du bain de paraffine, ramasser une cassette seulement à un moment et transférer les échantillons des cassettes à la cire de paraffine liquide à 56 ° C dans le bac d'équilibrage en utilisant une paire de pinces.
ÉTAPE CRITIQUE: Éviter tout durcissement de la cire entourant l'échantillon lors de la manipulation de la cassette en travaillant rapidement.- Placez tous les échantillons en fonction des besoins à l'aide d'une aiguille de préparation avant le durcissement de la cire. Habituellement, plusieurs fleurs sont disposées dans un plateau d'équilibrage espacés individuellement environ 1 cm dans chaque direction.
- Répétez l'étape 3.1.9 jusqu'à ce que tous les échantillons sont transférés.
- Placez le panier vers le processeur de tissus et nettoyer la cornue en utilisant un programme approprié (voir le mode d'emploi).
- Eteignez processeur de tissus et de la station de blocage. Passez à l'étape 3.1.13.
- Dans le cas où aucune machine d'infiltration des tissus et aucune station d'enrobage est disponible, utiliser un four de chauffage pour faire fondre la cire de paraffine à 56 ° C. Sur le banc, remplir la cire fondue dans des plateaux d'équilibrage en plastique, transférer les échantillons à la cire, et d'utiliser des aiguilles de préparation pour positionner les échantillons.
- Laissez la cire de paraffine pour durcir à température ambiante pendant environ 1 à 3 heures avant de stocker les échantillons à 4 ° C. Les échantillons peuvent ensuite être traités ou fraîchement stockés jusqu'à plusieurs mois.
- Préparation des sections minces et lames pour LAM.
- Sur une table lumineuse éclairant le bloc de cire d'en bas, enlever la cire de paraffine avec les échantillons provenant des plateaux en plastique environnants. Disséquer un bloc de cire carré contenant le tissu, par exemple., Un bourgeon ou d'une fleur, en utilisant une lame de rasoir RNAse gratuit. Dans ce but, orienter toujours les échantillons vers le haut du bloc de cire (voir aussi
- Préparer des blocs de cire de tous les échantillons qui doivent être utilisés pour LAM à la fois.
- Sur une table lumineuse éclairant le bloc de cire d'en bas, enlever la cire de paraffine avec les échantillons provenant des plateaux en plastique environnants. Disséquer un bloc de cire carré contenant le tissu, par exemple., Un bourgeon ou d'une fleur, en utilisant une lame de rasoir RNAse gratuit. Dans ce but, orienter toujours les échantillons vers le haut du bloc de cire (voir aussi
- Monter les blocs pour traiter l'intégration des cassettes remplies de cire de paraffine durcie: faire fondre un petit morceau ou gouttelette de cire de paraffine sur la pointe d'une spatule appropriée à l'aide d'une lampe à l'éthanol et utiliser la cire chaude pour fixer le bloc sur le support (avec les tissus intégrés en haut).
- Laissez la cire durcir pendant au moins 20 min à 4 ° C.
- Retirer la cire excédentaire entourant l'échantillon avec une lame de rasoir sur la table lumineuse. Assurez - vous de garder une surface carrée avec des bords parallèles (voir la figure 1).
- Placer la plaque de chauffage à 42 ° C.
- En toute sécurité monter les échantillons au microtome et préparer 6 - 10 um sections épaisses. Reportez-vous aux instructions du fabricant pour l'utilisation du microtome. Note: Bien que des sections plus minces donnent souvent une meilleure résolution structurelle, plus grande quantité d'ARN de highela qualité de r peut être obtenu avec des sections plus épaisses. Pour les cellules de Boechera matures gamétophytes nous utilisons 7 um comme valeur par défaut. Déplacement plutôt lentement avec les échantillons sur le couteau microtome se traduit souvent par une meilleure histologie.
- Toujours transférer les rubans de paraffine à une longueur d'environ 10 à 15 cm dans une boîte en plastique avec un carton noir au fond avant de les positionner dans les diapositives de la MAMA.
- Si possible, pré-sélectionner les parties des bandes de paraffine contenant les types de cellules ou de tissus d'intérêt, par exemple, les ovules, en vertu d' une dissection étendue et jeter le reste.
- Placer la quantité nécessaire de diapositives encadrées de métal (typiquement 5 à 10) avec la surface plane sur le dessus de la plaque chauffante.
- Pipet ~ 1 - 2 ml de RNAse eau libre sur la partie en plastique de la glissière. En utilisant une lame de rasoir, couper les rubans de paraffine en petits morceaux d'environ 4 - 5 cm suffisamment longue pour couvrir les fenêtres en matière plastique. USE paire de pinces et une aiguille de préparation pour placer idéalement les bandes de paraffine parallèles les unes aux autres sur les fenêtres en matière plastique des lamelles. Soulevez délicatement la lame à une extrémité pour éliminer l'eau et placer les diapositives en arrière.
- Sinon, placez la plaque chauffante sous une hotte chimique. Appliquer un petit volume de méthanol à la partie plastique de la glissière juste suffisante pour mouiller la surface (ce qui peut provoquer une légère ondulation des lames). Placez les bandes de paraffine sur les lames.
Remarque: Pour des raisons de toxicité, éviter l'utilisation de méthanol si possible. Cependant, l'utilisation de méthanol à cette étape n'améliorer la qualité de l'ARN dans le cas où la qualité obtenue par le montage de l'eau est insuffisante. Il est intéressant de tester ces alternatives au début d'un nouveau projet, comme la qualité de l'ARN obtenu varie selon le type et les espèces cellule sous enquête.
- Sinon, placez la plaque chauffante sous une hotte chimique. Appliquer un petit volume de méthanol à la partie plastique de la glissière juste suffisante pour mouiller la surface (ce qui peut provoquer une légère ondulation des lames). Placez les bandes de paraffine sur les lames.
- Sécher les lames durant la nuit sur la plaque chauffante à 42 ° C pendant environ 12 heures. Couvrir la plaque chauffante avecun couvercle en plastique qui ne touche pas les diapositives. Assurez-vous que le couvercle en plastique ne fait pas obstacle à l'échange d'air. Dans ce but, le couvercle peut être placé sur des boîtes de pipette ou similaire à soulever.
- Vous pouvez également réduire le temps de séchage à un minimum de deux heures ou jusqu'à ce que le tissu semble totalement sec. La réduction du temps de tranchage de collecte peut améliorer la qualité de l'ARN.
- Sous une hotte chimique, de la cire les diapositives 2 fois pendant 10 min en Xylol utilisant des supports de lames appropriées. Assurez-vous de plonger entièrement la partie en plastique de chaque diapositive seulement, mais pour permettre le retrait de la lame en touchant l'extrémité la plus large du cadre métallique qui est maintenu au sec.
- Laisser les lames sécher pendant environ 10 min sous le capot chimique avant LAM.
Note: Les lames ne sont pas immédiatement traitées peuvent être placés en arrière sur la plaque chauffante à 42 ° C avec le tissu vers le haut jusqu'à quelques heures. Cela permettra d'éviter toute humidité de compromettre la qualité de l'ARN jusqu'au traitement.
4. microdissection assistée par laser (LAM)
Remarque: La procédure de LAM variera en fonction de l'instrument utilisé. Certains détails de ce protocole sont adaptés à un instrument spécifique et la technologie de la collecte des échantillons sur une utilisation bouchon de fabrication de forces électrostatiques. De plus, les détails peuvent varier même entre les différentes versions du logiciel. S'il vous plaît se référer aux instructions du fabricant et des manuels d'utilisation pour une description détaillée et des instructions spécifiques sur l'instrument et du logiciel.
- Allumez les appareils pour LAM (ordinateur, microscope, boîtier de commande de laser).
- Démarrez le programme de pilotage du microscope et laser.
- Allumez le laser en appuyant sur la touche correspondante sur le boîtier de commande.
- Placer un bouchon (0,5 ml, sans diffuseur) dans le porte-bouchon et le positionner dans l'instrument.
- Soutenir la lame de LAM avec une lame de verre pour la microscopie. Veiller à ce que la surface plane de la lame avec latissu attaché fait face à la lame de verre.
- Placer la lame dans l'instrument avec la lame de verre en dessous.
- Sélectionnez l'objectif 4X. Dans le programme, sélectionnez pour déplacer le bouchon à la position «haut» et procédera à une analyse de la diapositive.
- Recherchez dans la diapositive et identifier les structures d'intérêt. Pinpoint et enregistrer leurs positions sur la diapositive pour être en mesure de revenir à la position exacte pour l'étape de coupe.
- Sélectionnez l'objectif approprié (par exemple 40X ou 60X).
- Si nécessaire, ajuster la vitesse du laser, mise au point, et la puissance du laser, et étalonner aussi le mouvement de la scène en se référant au manuel d'utilisation de l'instrument. Une fois qu'un compte est mis en place pour le tissu d'intérêt spécifique, les paramètres peuvent être réutilisés.
- Vérifiez la position du laser par un seul coup en appuyant sur le bouton "tir laser" du programme, idéalement dans une partie de la membrane sans tissu.
- Si nécessaire, calibrer la position du laser en suivant ièmeles instructions du fabricant de e pour l'instrument.
- Vérifier l'étalonnage de l'objectif en déplaçant une structure évidente à tous les quatre coins de la fenêtre du logiciel sur le moniteur, en maintenant le bouton droit de la souris enfoncé. Vérifier que la position de la main par rapport à la structure évidente est la même dans les quatre coins. Sinon calibrer les objectifs suivants le manuel du logiciel.
- Avec le bouchon dans la position «bas», utilisez l'outil «main-plume» pour marquer les frontières du type de cellule ou de tissu d'intérêt, par exemple, la cellule œuf. Disséquer la cellule d'intérêt avec le laser en appuyant sur «couper». Note: Souvent, sectionnant doit être répété si la frontière autour de la cellule n'a pas été entièrement disséqué à la fois. Dans ce cas, il est recommandé de configurer le logiciel pour faire automatiquement deux répétitions de la section en tant que norme.
- Soulevez le couvercle et passer à la position enregistrée suivante avec la structure d'intérêt. Répétez l'étape 4.13de la procédure de disséquer les sections cellulaires suivantes jusqu'à ce que toutes les cellules d'intérêt à partir d'une diapositive sont collectées. Assurez-vous que le bouchon est placé de manière à ce que la nouvelle section tient à une position vide sur le bouchon.
Note: Il est recommandé d'isoler les gros morceaux de tissus (par exemple, des sections de fleurs entières ou des parties de celui - ci) de chaque diapositive après l'isolement de sections de cellules isolées sur un chapeau frais. Ceux-ci peuvent être utilisés pour le contrôle de la qualité de l'ARN. - Retirer la lame et continuer avec la diapositive suivante en répétant les étapes 04.04 à 04.09 et 4.13 à 4.14.
- Répétez l'étape 4.15 et étapes connexes jusqu'à ce que les types d'intérêt de toutes les diapositives de cellules ont été isolées. Note: Il est recommandé de ne pas récolter plus longtemps que ~ 4-5 h sur le même cap.
- Inspecter visuellement la surface du capuchon après LAM pour exclure les contaminations non spécifiques de l'échantillon. Alors que les tissus non-disséqués sont protégés avec la feuille, de la poussière peut adhérer à la surface due à l'adhérence électrostatique.
- To inspecter visuellement le bouchon, retirer la lame de l'instrument. Placez le support de bouchon dans la position «bas» et inspecter la surface avec l'objectif 4X.
- En cas de petits morceaux de poussière sont visibles, retirez-les avec une petite (2 pi) pointe de la pipette. Vous pouvez également monter la glissière sur l'instrument, placer le bouchon sur une partie libre de la glissière (aucun tissus), et détruire complètement la contamination en utilisant le laser.
- Fermer casquettes et geler les sections sèches à -80 ° C jusqu'à utilisation ultérieure. Si nécessaire, les échantillons peuvent être conservés pendant plusieurs semaines. Cependant, procéder rapidement à cette étape est recommandée.
5. Isolement de l'ARN et de contrôle de la qualité
Remarque: L'ARN peut être isolé par tout procédé approprié pour de petites quantités d'ARN. Dans ce protocole, l'utilisation d'un kit d'isolement d'ARN spécifié pour de petites quantités d'ARN est décrite. Suivez les instructions du fabricant.
- Utilisez les tubes avec l'échantillon attaché àle bouchon soit directement, soit après le retrait de -80 ° C.
- Ouvrez les tubes et pipeter avec soin 11 pi de tampon d'extraction à la paroi de chaque tube à l'aide des conseils de filtre. Changer conseils entre les échantillons.
- Fermer le couvercle et secouer le tampon d'extraction vers le bouchon du tube.
- Placer les tubes avec le bouchon vers le bas dans un four de chauffage préchauffé à 42 ° C. Incuber pendant 30 min en suivant les instructions du fabricant.
- Suivre les instructions du fabricant pour la préparation de la colonne et en recueillant l'extrait au fond des tubes.
- Si le matériau de plus d'un bouchon doit être combiné en un seul échantillon, suivez les étapes 5.1.1 - 5.1.2 individuellement pour chaque tube / bouchon.
- Ensuite, mettre en commun les extraits d'un échantillon dans un tube et de mesurer la quantité d'extrait commun avec une pipette avant l'addition d'une quantité équivalente de EtOH (voir les instructions du fabricant).
- Veiller à ce que la quantité de EtOH ajouté, avant le chargement de la colonne est égal au volume de l'extrait mis en commun.
- Après la précipitation de l'ARN avec de l'EtOH, de procéder rapidement au chargement des colonnes en suivant les instructions du fabricant. Poursuivre le protocole avec l'étape de centrifugation à 100 xg.
- Après que le contenu de chaque tube de collecte ont été passés à travers la colonne, effectuer une étape de centrifugation 16.000 xg pendant 30 secondes pour éliminer les instructions du fabricant accréditives suivant.
- Continuer avec l'extraction de l'ARN et la purification en suivant les instructions du fabricant.
- Après le chargement du tampon d'élution de la colonne permet la colonne à incuber pendant 1 min. Continuer à charger les tubes dans la centrifugeuse en suivant les instructions dans les instructions du fabricant. Note: Une étape de centrifugation supplémentaire pendant 1 min à 100 xg avant l'élution comme indiqué dans le protocole peut augmenter l'efficacité de l'élution.
- Extraire l'ARN à partir de la suiteRols (sections de tissus plus grandes) pour le contrôle de la qualité de l'ARN en suivant les étapes 5.1 à 5.2.7 de ce protocole.
- Pour l'ARN qualité charge de commande 1 pl d'ARN total non dilué de chaque échantillon de contrôle sur le Bioanalyseur en utilisant un ARN Pico Chip suivant les instructions du fabricant.
Remarque: L'ARN extrait peut être utilisé pour une amplification linéaire et l' analyse du transcriptome en utilisant des microréseaux ou de l' ARN-Seq 7,11,13,14. Idéalement, le contrôle de la qualité doit indiquer un numéro d' intégrité de l' ARN (RIN) d'au moins 7. Un certain nombre de fournisseurs de fournir des kits appropriés pour l' amplification, des exemples appropriés sont donnés dans 9.
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Representative Results
Préparation d' échantillons et LAM sont effectuées dans les étapes consécutives
Un certain nombre d'étapes successives sont nécessaires pour préparer l' ARN pour une analyse de la transcription à partir de types de cellules sélectionnées par le LAM (figure 1). Ceci commence par la récolte des fleurs et une fixation immédiate pour assurer que la population d'ARN reste inchangée après la récolte. Le tissu est noyé, sectionné, et monté sur des glissières. Cela permet l'isolement des cellules par LAM et la mise en commun des sections spécifiques de type cellulaire sur un ou plusieurs casquettes (figure 1). Le matériau peut ensuite être congelé ou traité directement par extraction d'ARN. Outre l'avantage de la MAMA soit applicable pour le type spécifique de cellule dans les deux analyses des espèces modèles et non-modèle, le procédé reste assez de temps. Au moins une semaine du temps de travail, parfois plus, est nécessaire pour les étapes de tirécolte ssu à l' extraction d'ARN (Figure 1). Il doit être pris en compte que, souvent, les sections récoltées sur plusieurs jours de LAM sont regroupés dans un échantillon et de l'ARN extraction biologique. Pour les cellules d'oeufs Boechera, l'utilisation d'au moins ~ 200 coupes par échantillon est fortement recommandé, avec jusqu'à environ 100 parties isolées par jour.
Isolement des cellules Types d'intérêt dépend de leur visibilité dans les sections sèches
L'isolement des sections spécifiques de type cellulaire est l'étape la plus chronophage du protocole. Jusqu'à présent, aucune automatisation de cette étape a été mise au point en raison de la nature complexe des échantillons. L'identification des cellules d'intérêt à l'aide d'un outil logiciel est impossible parce que les sections sèches ont un faible contraste et le plan de coupe varie entre les échantillons en raison du fait que les ovules sont orientés à des angles différents wurant du tissu (figure 2). Néanmoins, la morphologie unique du gamétophyte femelle adulte avec les synergides, cellule œuf, et la cellule centrale (cellules antipodaux dégénèrent avant la fécondation) permet l'identification sans ambiguïté des cellules d'oeufs par le chercheur (Figure 2B, C; Figure 3). En effet, dans Boechera divaricarpa, l'ovule se rétrécit souvent un peu lors de la préparation et sépare des tissus environnants, une caractéristique avantageuse pour l'isolement de populations de cellules d'oeufs à haute pureté (figure 2B, C; figure 3) ainsi.
Inspection visuelle du Cap après LAM est Recommandé
Une inspection visuelle de la surface de capuchon après LAM permet l'identification de toute contamination possible de l'échantillon, par exemple, par la poussière. En outre, il est utile de faire en sorte que le soictions collent à la casquette, que parfois sections se perdent pendant la procédure. En règle générale, de nombreuses sections choisies, par exemple, les cellules d'oeuf, peut être vu sur un cap après plusieurs heures de LAM.
Le flux de travail établi de façon reproductible Résultats dans Good RNA Qualité
De cellules isolements LAM spécifiques du type de gamétophytes femelles, le total des quantités d'ARN ne sont que dans la plage de ng faible. Cette quantité limitante d'ARN, il est nécessaire d'utiliser un contrôle représentant isolé de grands tissus de chaque diapositive comme une approximation pour le contrôle de la qualité de l'ARN après LAM. Ceci est démontré par une comparaison de l' ARN d'un type cellulaire spécifique de B. divaricarpa cellules d'oeufs par rapport aux contrôles de plus grandes surfaces de tissu isolé à partir des mêmes diapositives, indiquant la qualité de l' ARN similaire (figure 4A, B). En utilisant cette méthode, un bon de haute qualité de l'ARN avec des numéros RIN & #8805; 7 est obtenue de façon reproductible. La qualité de l'ARN obtenu est adapté à un type cellulaire spécifique de l'ARN-Seq, ce qui conduit à l'identification de 236 gènes exprimés dans la cellule œuf apomictique, mais pas dans la cellule apomictique centrale, une cellule synergide ou une cellule initiale apomictique, ni dans les cellules ou le gamétophyte sexuelle mature de Arabidopsis thaliana (Figure 5) 7.
Figure 1:. Schéma des étapes du protocole, indiquant le temps minimal requis par l' étape de fixation des fleurs ou des tissus d'intérêt se fait jour au lendemain. Le lendemain, l'incorporation est lancé, qui se déroule pendant la nuit, ce qui entraîne dans le matériel embarqué au jour 3 du protocole. Au jour 3 sections microtome à partir des échantillons intégrés dans des blocs de cire peuvent être générés. Les rubans des coupes minces de paraffine sont montées sur lames et laissées sécher pendant une nuit. Sure à plusieurs jours de LAM sera nécessaire pour obtenir suffisamment de matériel pour une répétition biologique. Après isolement de l' ARN et le contrôle de qualité, la préparation de bibliothèque pour l' ARN-Seq peut être effectuée pour préparer l' analyse du transcriptome. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Les cellules d'oeufs sont clairement identifiables dans les sections minces, En raison de la morphologie caractéristique du gamétophyte femelle (A) Dessin schématique du gamétophyte femelle adulte (type Polygonum) (B - C) sections minces par ovules hébergeant gamétophytes femelles dans.. divaricarpa Boechera. cellules d'oeufs sont clairement visibles. En raison de la morphologie de la gamétophyte femelle souvent pas tous les types cellulaires (cellules d'œuf, synergides: e: s, Cellule centrale: cc) sont visibles dans une seule section. Barres d'échelle = 50 pm. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. LAM de cellules d'oeufs de Boechera divaricarpa. A et C. Section du gamétophyte mature de B. divaricarpa à 7 pm avant et, B et D, après microdissection avec le dispositif laser (cellule d'oeuf: e, synergides: s, cellule centrale: cc). Barres d'échelle = 50 pm. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
<strong> Figure 4. Qualité de l'ARN des cellules d'oeufs Laser-disséqués et contrôle Sections. (A) la qualité de l' ARN comme analysé à partir de sections de cellules d'œuf par rapport à (B) zones de tissu plus grandes récoltés à partir des mêmes diapositives que les contrôles. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. Identification des gènes exprimés seulement dans la cellule apomictique Egg par rapport aux cellules de apomictique et gamétophytes Mature sexuels ou la cellule initiale apomictique. Heatmap de 236 gènes exprimés dans la cellule œuf apomictique mais ni dans la cellule centrale apomictique, cellule synergide ou cellule initiale apomictique de B. gunnisoniana ni les cellules du gamétophyte sexuelle mature de A. thaliana 7 hiérarchiquele regroupement des échantillons et des gènes a été basée sur la distance euclidienne et le regroupement hiérarchique. Rouge représente une expression élevée et une faible expression noir. Les couleurs sont mises à l'échelle par ligne. apo:. apomictique S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Le protocole est adapté à différents types de cellules et de tissus
LAM combinée avec transcriptome analyse par microarrays ou ARN-Seq est un outil précieux pour mieux comprendre les modèles spécifiques de l' activité des gènes régulant les processus de développement ou physiologiques 7-11,13,14. Cependant, la pertinence de cette méthode pour tout type de cellule donné dépend de façon critique sur les questions structurelles. La cellule doit être clairement visible et identifiable sans ambiguïté dans les sections sèches utilisées pour LAM. Dans Boechera divaricarpa, la morphologie du gamétophyte permet une identification facile de la cellule d'oeuf (figure 2, figure 3). En fin de compte, la vitesse d'isolement d'une population cellulaire spécifique dépend aussi de la fréquence à laquelle le type de cellule se trouvent sur une glissière, en échangeant des diapositives et le balayage de nouvelles diapositives sont des étapes chronophages. Etant donné que dépendant du type cellulaire, au moins 200-250 cellule sections devraient être regroupés par échantillon, la pertinence de la méthode pour une certaine conception de l'étude dépend en grande partie sur les exigences de temps pour l'étape de LAM.
En outre, en fonction de la morphologie du tissu, il peut être avantageux en termes de structure afin de réduire l'épaisseur des sections de 6 um. De même, les sections plus épaisses de 8 pm, idéalement ≥ entraînent généralement une quantité importante d'ARN et l'ARN d'une qualité légèrement supérieure à partir de la même quantité de coupes de tissus. En outre, les cellules d'intérêt doivent avoir au moins un diamètre de 8 à 10 um pour rendre l'isolement par LAM réalisable.
En principe, le protocole décrit ici peut être adapté aux différents types d'espèces lointainement apparentées cellulaires et tissulaires. Cependant, la qualité de l' ARN peut même varier entre les types de la même espèce 7,10,13 cellulaires différentes. Ce protocole a été ajustée en fonction des types de cellules petites et critiques. Ainsi, on peut maintenant être appliquée à un broadegamme de r d'échantillons sans autres ajustements. De légères modifications du protocole pourraient néanmoins être nécessaires, en fonction du type et des espèces cellule sous enquête. Il est recommandé d'utiliser d'abord les deux fixateurs alternatifs (voir le protocole 1.1) lors de la mise en place de la méthode pour une nouvelle espèce ou type de cellule pour une comparaison de la morphologie et de la qualité de l'ARN.
En principe, le protocole peut être adapté et réalisé avec des instruments différents appropriés pour microdissection laser 9. Cependant, il faut noter que les instruments varient à la fois de la puissance du laser et la largeur minimale du faisceau laser qui peut être appliqué, aussi bien que dans la technologie de l'échantillonnage. En particulier pour l'isolement des petites cellules et des zones de tissu, des lasers résultant dans un trajet de laser étroit sont mieux adaptées. Le faisceau laser de l'instrument que nous utilisons est assez fine (~ 1 um large) et permet une dissection de petites cellules. La technologie d'échantillonnage de la collecte des cells sur une surface de bouchon collant par adhésion électrostatique est particulièrement avantageux pour les types de petites cellules et l'isolement des sections de cellules isolées. Cela réduit le risque de perte de l'échantillon par des effets électrostatiques.
La qualité de l' ARN obtenu est important pour la poursuite des analyses transcriptionnelles
L'un des points les plus critiques pour la réussite de la préparation de la bibliothèque ARN-Seq est la qualité de l'ARN. Bien que plusieurs fournisseurs de kits d'amplification optimisés leur technologie pour l'ARN de l'intégrité encore plus faible, la qualité des données obtenues après analyse de transcriptome soit par microarrays ou ARN-Seq augmente généralement avec la qualité de l'ARN d'entrée. L' utilisation de ce protocole établi, bon et hautement reproductible la qualité de l' ARN pour différents stades de développement des tissus reproducteurs féminins et la lignée germinale chez Arabidopsis et Boechera ont été obtenus (par exemple, la figure 4). Bien que le procédé est applicableaussi pour les espèces plus lointainement apparentées (par exemple, la tomate, non publié), il doit être pris en compte que les petites optimisations ou des modifications peuvent être nécessaires en fonction de l'espèce, le type de tissu, et même l'environnement de laboratoire, par exemple, un taux d' humidité élevé pourrait compromettre l'intégrité de l'ARN lors de la préparation de diapositives et LAM.
Une étape critique au cours du protocole est le montage des bandes de cire sectionné contenant les échantillons à lames. Ici, en particulier le contact avec l'eau est une étape critique. En remplaçant l'eau par de l'EtOH ne conduit pas à une amélioration significative de l'intégrité de l'ARN après isolement (non publié), le remplacement de l'eau par le méthanol ne. Cependant, le méthanol ne doit être manipulé sous le capot chimique et avec grand soin. En fonction du type d'échantillon, comme une alternative à l'utilisation de méthanol, le temps de séchage après le montage de l'eau peut être réduite à ~ 2 h (voir 3.3.3.1), ce qui entraîne également une bonne qualité de l'ARN.Effectuer un essai pour tester la qualité de l'ARN obtenu par le montage soit sur l'eau ou du méthanol pour le type de cellule et des espèces d'intérêt est recommandé au début d'un nouveau projet.
LAM est une technologie puissante pour les analyses transcriptionnelles
En conclusion, nous avons optimisé et appliqué avec succès la combinaison de LAM et l' analyse du transcriptome type cellulaire spécifique par microarrays et ARN-Seq à différentes cellules de la lignée germinale sexuelle et apomictique chez Arabidopsis thaliana et Boechera spp., Permettant ainsi des analyses comparatives de la transcription (voir aussi la figure 5) 7,11,13,14. Le procédé décrit porte un certain nombre d'avantages par rapport à d'autres technologies permettant l'analyse de la transcription spécifique d'un type cellulaire. Surtout, en fonction de la perceptibilité de types ou de tissus d'intérêt, dans la partie la cellule, elle peut être appliquée à des types de cellules rares du modèle à la foiset les espèces non-modèles, tels que les cellules du gamétophyte femelle mature dans Boechera spp., ou il peut même être utilisé pour isoler les domaines cellulaires, par exemple, les moitiés polaires des cellules 19. Des applications similaires ne serait pas possible avec d' autres méthodes qui reposent sur fluorescent activé le tri des cellules ou des noyaux (FACS / FANS) 10.
Un inconvénient majeur de cette méthode est l'exigence de délai. Alors que la fixation et l'intégration ne nécessitent mains sur étendues de temps et peuvent en même temps été fait pour une grande quantité de fleurs, LAM en tant que telle est très consommatrice en temps et, pour une analyse spécifique de type cellulaire, typiquement 3 jours à 3 semaines LAM (en moyenne 5 heures par jour au microscope laser) doit être planifié. À cet égard, il est utile de faire quelques pré-tests pour la vitesse d'isolement du type de cellule spécifique ciblée pour concevoir correctement l'étude. En outre, même en utilisant ce protocole optimisé, des essais pour tester la qualité de l'ARN sont fortement refélicité.
En résumé, LAM est un outil puissant pour l'analyse de la transcription à la résolution de types de cellules individuelles ou même des sous-domaines de cellules, qui ne pouvait être obtenue en utilisant les méthodes existantes de rechange. À cet égard, il porte un énorme potentiel pour permettre des analyses, par exemple, des processus de développement, avec une résolution spatiale et temporelle très élevée. Cela a été illustré par les analyses des transcriptomes des cellules à toutes les étapes clés de la reproduction sexuée et apomictique chez Arabidopsis et Boechera 7,11,13,14.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | VWR | 1,009,861,000 | absolute EMPROVE Ph Eur,BP,USP |
| 15 ml falcon centrifuge tubes | VWR | 62406-200 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2939AA | |
| Acetic Acid | Applichem | A3686,2500 | 100% Molecular biology grade |
| Ambion Nuclease free water | life technologies | AM9932 | |
| ASP200 S | Leica | 14048043624 | tissue processor |
| black cardboard | can be purchased in special paper shops | ||
| DNA- and RNAse-free Frame Slides | Micro Dissect GmbH | 1, 4 µm PET-membrane; can also be purchased from Leica | |
| Dumond Forceps | Actimed | 0208-5SPSF-PS | |
| ethanol lamp | |||
| exsiccator | Sigma-Aldrich | Z354074-1EA | Nalgene Vaccuum Dessicator or similar equipment |
| filter tips 10 µl | Axon Lab AG | AL60010 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 1,000 µl | Axon Lab AG | AL60010 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 20 µl | Axon Lab AG | AL60020 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 200 µl | Axon Lab AG | AL60200 | can be replaced by similar tips |
| forceps precision | VWE | 232-1221 | |
| glass slide holder | Huber & Co.AG | 10.0540.01 | Färbekästen nach Hellendahl |
| glass staining trough | Huber & Co.AG | 10.0570.01 | Färbekasten |
| Heated Paraffin Embedding Module Leica | Leica | Leica EG 1150 H | blocking station, similar devises are suitable |
| Heating and Drying Table | Medax | 15501 | other models and/or suppliers are suitable |
| ice bucket | VWR ice bucket with lid | 10146-184 | similar buckets equally suitable |
| light table | UVP An Analytical Jena Company | TW-26 | white light transluminator |
| microscope slide | Thermo Scientific | 10143562CE | cut edges |
| microtome blade | Thermo Scientific | FEAHS35 | S35 microtome blade disposable |
| MMI Cell Cut Plus Instrument | MMI (Molecular Machines and Industries) | ||
| Non-stick, RNAse free Microfuge tubes, 2 ml | life technologies | AM12475 | |
| Paraplast X-TRA | Roth | X882.2 | for histology |
| PicoPure RNA Isolation Kit | life technologies | KIT0204 | Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit |
| plastic balancing trays | Semadeni AG | 2513 | |
| plastic box | Semadeni AG | 2971 | Plastikdose PS |
| plastic lid for heating plate | homemade | ||
| preparation needle | VWR | 631-7159 | |
| RNA 6000 Pico Kit | Agilent | 5067-1513 | |
| RNAse free microfuge tubes | life technologies | AM12400 | |
| RNAse ZAP Decontamination Solution | life technologies | AM9780 | |
| Semi-automated Rotary Microtome | Leica | RM2245 | similar devices are equally suitable |
| Tissue Loc Histo Screen Cassettes | Thermo Scientific | C-1000_AQ | similar cassettes of other suppliers are suitable |
| Tubes with adhesive lid, without diffusor 500 µl | MMI (Molecular Machines and Industries) | 50204 | |
| Xylol (Isomere) ROTIPURAN | VWR | 4436.2 | min. 99%, p.a., ACS, ISO SP |
| process embedding cassettes | Leica | 14039440000 | Leica Jet Cassette I without lid |
| Universal Oven | Memmert | UF55 | other models and/or suppliers are suitable |
References
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