Introduction
במחקרי תעתיק נעשו ברמת הרקמה, transcriptomes של סוגי תאים מיוחדים אבל נדירים מאוד לעתים קרובות הם רעול פנים על ידי התאים שמסביב שופעים יותר. דוגמא עבור תאים מסוגים אלה מאוד מיוחדים הם התאים של שושלת הרבייה הנשית (germline) בצמחים. Germline הנקבה המצוין בתוך ביציות מתפתחות, המבשרים של זרעים בתוך gynoecium של 1,2 הפרח. תא אמא megaspore (MMC) הוא התא הראשון של germline הנשי. זה עובר המיוזה לגבש הטטרדה של megaspores מופחת. בדרך כלל, רק אחד megaspores אלה שורד ומחלק mitotically ללא cytokinesis, כלומר, בתוך syncytium. mitoses אלה ואחריו cellularization כדי ליצור את גמטופיט הבוגרת, אשר בדרך כלל מורכב מארבעה סוגי תאים: שלושה antipodals, שני תאים synergid, ביצה, והתא המרכזי. תאי הביצה ומרכזיים הם הגמטות נקבה כי לקבל מופרת על ידי שני תאי זרע במהלך douהפריה ble כדי להצמיח את העובר ואת האנדוספרם של 1,2 הזרע המתפתח. ב thaliana ארבידופסיס מערכת מודל המיני, רק ~ 50 זרעים לפתח לכל פרח בעוד כ -50 - 80 זרעים לפתח לכל פרח הסוג הקשור קשר ההדוק Boechera. לפיכך, germline הנשי מורכב רק כמה מאוד סוגי תאים מיוחדים, מה שהופך אותו מודל מצוין ללמוד תהליכים התפתחותיים, כגון תא מפרט והבחנה.
יתר על כן, תובנה התהליכים רגולטוריים גן מסדירי רביית צמח יכולות להיות בעל ערך שימושי. בצמחים, הוא רבייה מינית מינית באמצעות זרעים (apomixis) יכולה להתרחש. בעוד רבייה מינית מייצר מגוון גנטי באוכלוסייה, apomixis מוביל להיווצרות של צאצא משובט זהה גנטי לצמח האם. לכן, apomixis יש פוטנציאל גדול עבור יישומי חקלאות וייצור זרע, כמו גנוטיפים אימהי מורכב אפילו יכוללהישמר ללא שינוי במשך כמה דורות 3,4,5. בגלל apomixis אינו מתרחש באופן טבעי בכל מיני יבול עיקריים, ההנדסה של apomixis בגידולים הוא של 3,4,5 עניין רב. עם זאת, המטרה ארוך הטווח הזה קשה להשיג כי הבסיס הגנטי ואת המולקולריים שבבסיס של apomixis אינו מובן בפירוט מספיק 6.
כדי לקבל תובנות לתוך הבסיס תעתיק המסדירים רבייה apomictic, פרופיל תעתיק סוג תא ספציפי באמצעות microdissection לייזר בסיוע (LAM) וסדר הדור הבא (NGS) מייצג גישה מאוד חזק 7,8. LAM הוקם הראשון עבור בעלי חיים המחקר הביו-רפואי. בשנים האחרונות LAM גם יושם לביולוגיה צמח 6,9,10. בניגוד לשיטות אחרות המאפשרות אפיון של סוגי תאים ורקמות פרט, LAM אינו מחייב את הדור של קווי סמן 6,9,10. לכן, זה יכול להיות אפליקציהשייקר סוג תא או רקמה שהיא ללא ידע מולקולרי מוקדם. יתרון נוסף של LAM הוא שזה יכול להיות מיושם על כל סוג תא כל עוד התא ניתן להכיר בסעיפים יבשים על בסיס מיקום ו / או תכונות מבניות. יש LAM יתרון הנוסף רקמות קבועות משמשות, אשר מונע שינויים של פרופיל התעתיק במהלך עיבוד.
הרקמה של עניין, למשל, רקמת פרחים, הוא קבוע מקבע הלא crosslinking לפני הטבעה ב פרפין. שיבוץ שעוות פרפין ניתן לעשות זאת באופן ידני, לאחר פרוטוקולים הוקמו 9,11. עם זאת, השימוש של מעבד רקמות אוטומטי התייבשות וחדירה עם השעווה בדרך כלל תוצאות שחזור גבוה במונחים של שימור איכות RNA ומורפולוגיה רקמות. האסטרטגיה החלופית הטבעת רקמות שרף גם שמשה בהצלחה עבור ניתוחי סוג תא ספציפי על ידי LAM 8. עם זאת, השימוש של automמעבד רקמות ated מוטבע שעווה מאוד זמן יעיל, כפי שניתן לעבד דגימות רבות בבת אחת המחייב מינימום של הידיים על הזמן. בעוד בדרך כלל ללא אובדן משמעותי של איכות RNA מתרחש במהלך קיבעון והטבעה, הכנת חלקים דקים עם microtome ו, בפרט, גוברת על frameslides המשמש LAM נשארה צעד קריטי לשמירה על איכות RNA. זה כבר ציין בעבר ושימוש מערכת העברת קלטת תואר לגרום איכות RNA טובה יותר בשלב זה 12. עם זאת, זה מוסיף נדבך נוסף גוזל זמן במהלך תקופת ההכנה של השקופיות וגם דורש ציוד מיוחד. פרוטוקול אופטימיזציה המתואר להלן reproducibly מייצרת RNA כי הוא באיכות מספקת עבור פרופיל תעתיק עם GeneCHIPs ואת הדור הבא הרצף (NGS) מתקרב 7,11,13,14. בנוסף, עם מיקרוסקופ microdissection הליזר המשמש, טוהר גבוה של סוגי התאים המבודדים היא תבוסהinely מיוצר 7,11,13,14.
סוג Boechera היא מערכת מודל מצוינת לחקר השלבים העיקריים של רביית apomictic. בשנת Boechera, מגוון של הצטרפויות מיניות apomictic שונים זוהה וניתן להשתמש בו עבור השוואתי מנתח 15,16,17. בהשוואת transcriptomes סוג תא ספציפי של תאים מן germline נקבה מן ארבידופסיס מינית apomictic Boechera, זיהינו גנים ושבילים באים לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי, ובכך לזהות היבטים חדשים של תהליכים רגולטוריים המסדירים apomixis 7. בנוסף, מחקר זה אימת את התאמתו של LAM עבור תעתיק סוג תא ספציפי מנתח של סוגי תאים קטנים ונדירים. אנחנו כבר השתמשנו בפרוטוקול זה לניתוח של תאים מסוגים שונים במגוון של מיני צמחים, אבל מינים ושינויים ספציפי רקמות לפרוטוקול עשויים להידרש במקרים מסוימים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: פרוטוקול זה מתאר הכנת הרקמה, microdissection בסיוע לייזר, והפקת RNA עבור פרופיל תעתיק. תמיד להשתמש בכפפות לאורך כל השלבים של הפרוטוקול. ללמוד ולשקול את הוראות הבטיחות עבור כל כימיקל המשמש. בפרט, יש לזכור כי Xylol מזיק ויכול לחדור כפפות מתנול כי הוא רעיל. עבור כל המכשירים המשמשים, עיין מדריכים למשתמש בהתאם.
הסרת 1. פעילות RNase מ זכוכית וציוד אחר
- לפני השימוש, לעטוף כל כלי זכוכית בנייר אלומיניום לפני האפייה עבור ~ 8 שעות ב 180 מעלות צלזיוס על מנת להבטיח RNAse איכות חינם.
- פנקו את כל משטחי מתכת (למשל, פינצטה) וכן הספסל העבודה ואת צלחת חימום עם פתרון טיהור RNase המתאים. לאחר מכן, לשטוף את המשטחים עם מים RNAse ללא להסיר את פתרון טיהור. בהמשך לכך, לנקות את המשטחים נוספים עם 70% EtOH.
- השתמש בכל היציקהמתכלה טיק (למשל, צינורות) חדש לגמרי ללא כל טיפול מקדים. אם זמין, השתמש מתכלה פלסטיק שיאושרו להיות RNase חינם.
קיבוע רקמות 2.
- כן 10 מיליליטר של המקבע של החקלאי (3: 1; V / V אתנול: חומצה אצטית) בצינור 15 מיליליטר טרי על קרח. (תמיד להכין המקבע של פארמר הטרי לפני השימוש). כחלופה, אתנול מקבע הלא crosslinking: חומצה אצטית (5: 1; v / v) יכול לשמש 18.
- השתמש זוג קנס של פינצטה לאסוף ניצנים בשלב ההתפתחותי של עניין. מיד לצלול ניצנים מקבע קר כקרח. השתמש 10 מ"ל של מקבע קיבעון של ~ 20 ניצנים או פרחים ארבידופסיס או Boechera הערה:. בעת שימוש מיני צמחים עם פרחים גדולים מומלץ לנתח את הפרחים עם סכין גילוח ליצור חתיכות קטנות לפני קיבוע.
- על מנת לקבל גמטופיט בוגרת, לעקר את 2 - 3 ניצני פרחים גדולים של inflorescence 2 ימים לפני הקציר.
- מלאו את התחתון של exsiccator עם קרח. פתח את צינורות המכילים דגימות, למשל, פרחים, ומניחים אותם על קרח, או על ידי הצבת אותם ישירות לתוך קרח בצורה שהם לא יכולים ליפול או באמצעות בעל המתאים. אבק לחדור במשך 15 דקות לפני השחרור של שואב האבק.
- חזור על חדירת אבק פעם במשך 15 דקות.
- שחרר את לילה ואקום ולאחסן (~ 12 שעות) על קרח. מכסים את דלי קרח עם רדיד המכסה או אלומיניום ולאחסן בדלי בחדר 4 ° C. או במקרר כדי למנוע את הקרח מפשיר. הערה: הארכת זמן הקיבעון אינו מומלץ.
רקמות 3. טבעת, חתך דק, ואת הרכבה על שקופיות LAM
- הטבעת רקמות.
- להחליף מקבע 70% אתנול מוכן עם אתנול טהור ומים חינם RNAse. השאירו את דגימות קרח עד לעיבוד נוסף. התחל לפdding של הדגימות באותו היום. במקרה לא מכונה לעיבוד רקמות זמין, המשך הטבעה ידנית כמתואר במקום אחר 9,11 ולהמשיך עם צעד 3.1.11.
- בעדינות להעביר את דגימות קלטות הטבעת רקמות עם פינצטה. היטב לסגור את הקלטות. שלב קריטי: הימנע גם ייבוש חלקי של המדגם במהלך שלב זה. הימנע סחיטה של דגימות עם פינצטה.
הערה: כדי לתייג את קלטות עיפרון אמור לשמש, באופן אידיאלי על ידי כתיבה על המשטח המשופע של הקלטת. - אחסן את קלטת ההטבעה עמוסה ניצנים או הפרחים באתנול 70% עד שכל החומר מועבר קלטות ומכונת ההטבעה ניתן לטעון. לשם כך, השתמש שוקת מכתים זכוכית מלאה 70% אתנול.
- הסר את הסל של מעבד הרקמה מן הגבה של המכונה ולהעביר את קלטות הטבעה לסל עם המשטחים נוטים מול העליון באותו הכיוון. CRISTEP tical: בצע את זה מהר כדי למנוע כל ייבוש של הרקמות. אם עיבוד רב קלטות הטבעה בבת אחת, למקם את הדלי לתוך מיכל בחינם מתאים RNAse מלא 70% אתנול לפני טעינת הדגימות.
- שים את המכסה על מהסל ושמה סל חזרה לתוך הגבה. סגור את הגבה.
הערה: מעבד הרקמות אוטומטיות מייבש את הדגימות, משנה את ממס Xylol, ועושה חדיר עם שעוות פרפין מומסת. בדרך כלל, זה נעשה בין לילה. - הפעל את התוכנית של מעבד רקמות. ההגדרות הרגילות המומלצות הן 1 hr 70% EtOH, שלוש פעמים 1 hr 90% EtOH, שלוש פעמים 1 hr 100% EtOH, פעמיים 1 hr 100% Xylol, פעם אחת 1 hr 15 min 100% Xylol בטמפרטורת החדר, ואחריו חדירת עם שעוות פרפין פעמיים עבור שעה 1 ופעם אחת עבור 3 שעות ב 56 ° C 11.
הערה: כדי להבטיח שתחנת החסימה מוכנה עם השעווה המותכת, פעולת כלי בכמה שעות לפני התחילה אולהשתמש בפונקציית טיימר לבחירת זמן ההתחלה למידע.
הערה: במידת הרקמה לא יכולה להיות מעובד מייד לאחר מכן, פעמי דגירה כבר שעוות פרפין ב 56 מעלות צלזיוס אפשרית במקום hr 3 ב 56 מעלות צלזיוס. עיין במדריך למשתמש של המכשיר. בדרך כלל, הקלטות עם רקמות תישארנה אוטומטית שעווה מותכת עד הפקודה "גבה ריק" מאושרת. אם השעווה לא נמס כאשר מתחילים את מעבד רקמות, המענה מתמלא 70% אתנול ו התוכנית נשאר בהמתנה עד מוכן להתחיל. - רוקן את הגבה ומיד להעביר את דגימות אמבטיה שעוות פרפין ב 56 מעלות צלזיוס בתחנת החסימה. מסיר את המכסה מהסל ולכסות באמבטיה פרפין של תחנת החסימה עם המכסה שלה.
- פלומה כמו רבי מגשי איזון טריים על פני השטח של תחנת חסימת מחומם ל 56 מעלות צלזיוס כפי שיש קלטות בסל.
הערה: סמן קבע עמיד אתנול יכול להיות שימושד לתייג התחתון של מגשי איזון. סמנים קבעו עמיד אצטון אינם מומלצים. - באמצעות תחנת החסימה, למלא מגש איזון פלסטיק מחומם מראש טרי עם שעוות פרפין נמסה ב 56 מעלות צלזיוס. הרם את המכסה של אמבטית פרפין, להרים קלטת אחת בלבד בכל פעם, להעביר את הדגימות מן הקלטות אל פרפין הנוזלי ב 56 מעלות צלזיוס במגש האיזון באמצעות פינצטה.
שלב קריטי: הימנע מכל התקשות של שעווה סביב המדגם בזמן הטיפול קלטת ע"י עבודה במהירות.- מקם את כל דגימות בהתאם לצרכים באמצעות מחט הכנה לפני התקשות של שעווה. בדרך כלל, כמה פרחים מסודרים מגש איזון בנפרד במרווחים על 1 ס"מ לכל כיוון.
- חזור על שלב 3.1.9 עד שכל הדגימות מועברות.
- מניח את הסל בחזרה למעבד הרקמות ולנקות את הגבה באמצעות תכנית מתאימה (עיין במדריך למשתמש).
- כבו מעבד רקמות ותחנת החסימה. המשך לשלב 3.1.13.
- במקרה לא מכונת חדירה לרקמות שום תחנת הטבעה זמינה, להשתמש בתנור חימום כדי להמס פראפין ב- C ° 56. על הספסל, למלא את השעווה נמסה מגשים איזון פלסטיק, להעביר את דגימות השעווה, ולהשתמש מחטים כנות כדי למקם את הדגימות.
- אפשר פראפין להקשיח בטמפרטורת החדר למשך ~ 1 - 3 שעות לפני אחסון דגימות ב 4 ° C.. דוגמאות ניתן לאחר מכן תעובדנה טריות או לאחסן עד מספר חודשים.
- הכנה סעיפים ומגלשות דקים LAM.
- על שולחן אור המאיר את גוש השעווה מלמטה, להסיר את שעוות פרפין עם הדגימות מן מגשי הפלסטיק שמסביב. לנתח את גוש שעווה בריבוע המכיל את הרקמות, למשל., ניצן או פרח, באמצעות סכין גילוח חינם RNAse. למטרה זו, תמיד לכוון את הדגימות לעבר החלק העליון של בלוק השעווה (ראה גם
- כן בלוקי שעווה של כל הדגימות שאמורות לשמש LAM בכל פעם.
- על שולחן אור המאיר את גוש השעווה מלמטה, להסיר את שעוות פרפין עם הדגימות מן מגשי הפלסטיק שמסביב. לנתח את גוש שעווה בריבוע המכיל את הרקמות, למשל., ניצן או פרח, באמצעות סכין גילוח חינם RNAse. למטרה זו, תמיד לכוון את הדגימות לעבר החלק העליון של בלוק השעווה (ראה גם
- הר בלוקים כדי לעבד הטבעת קלטות מלאות שעוות פרפין מוקשה: להמס חתיכה או טיפה קטנה של שעוות פרפין על הקצה של מרית מתאימה באמצעות מנורת אתנול ולהשתמש השעווה החמה לתקן את הבלוק על התמיכה (עם הרקמות המוטבעות לְמַעלָה).
- אפשר השעווה להתקשות במשך לפחות 20 דקות ב 4 ° C.
- הסר עודף שעווה סביב המדגם עם סכין גילוח על שולחן האור. הקפד לשמור משטח מרובע עם קצוות מקבילים (ראה איור 1).
- הגדר את צלחת חימום עד 42 מעלות צלזיוס.
- בבטחה הר דגימות אל microtome ולהכין 6 - 10 חלקים עבים מיקרומטר. עיין בהוראות היצרן עבור באמצעות microtome. הערה: בעוד חלקים מדללים לעתים קרובות ינתנו רזולוציה יותר מבחינת מבנה, כמות גדולה של RNA של higheאיכות r ניתן להשיג עם ממקטעים עבים. עבור התאים של Boechera להבשיל גמטופיט אנו משתמשים 7 מיקרומטר כברירת המחדל. העברה די לאט עם הדגימות על סכין microtome לעתים קרובות תוצאות היסטולוגיה טובה יותר.
- תמיד להעביר את הסרטים פרפין באורך של כ 10 - 15 ס"מ לתוך קופסת פלסטיק עם קרטון שחור בתחתית לפני מיצוב אותם שקופיות LAM.
- במידת האפשר, מראש לבחור את החלקים של רצועות פרפין המכיל סוגי cell- או רקמות של עניין, למשל, הביציות, תחת-היקף הניתוחים וזורקים את השאר.
- מניחים את הכמות הנדרשת של שקופיות במסגרת מתכת (בדרך כלל 5 - 10) עם משטח ישר על צלחת חימום.
- Pipet ~ 1 - 2 מיליליטר מים חינם RNAse מצד הפלסטיק של השקופית. באמצעות סכין גילוח, לחתוך את סרטי פרפין קטעים קצרים של כ 4 - 5 סנטימטר ארוך מספיק על מנת לגשר את חלונות הפלסטיק. Use פינצטה ומחט הכנה אידיאלי למקם את רצועות פרפין מקבילים זה לזה על חלונות פלסטיק של השקופיות. רם בזהירות את השקף בקצה אחד כדי להסיר את המים ומניחים את השקופיות בחזרה.
- לחלופין, למקם את צלחת חימום מתחת למכסה המנוע כימי. החל נפח קטן של מתנול לחלק הפלסטיק של השקופיות רק מספיק כדי להרטיב את המשטח (זה יכול לגרום קמטים קלים של השקופיות). מניחים את רצועות פרפין בשקופיות.
הערה: מטעמי רעילות, למנוע שימוש של מתנול במידת האפשר. עם זאת, השימוש של מתנול בשלב זה עושה לשפר את איכות RNA במקרה איכות מושגת על ידי גובר על מים אינה מספיקה. כדאי בדיקת חלופות אלה בתחילתו של פרויקט חדש, כמו איכות RNA מושגת משתנה עם סוג תא ומינים תחת חקירה.
- לחלופין, למקם את צלחת חימום מתחת למכסה המנוע כימי. החל נפח קטן של מתנול לחלק הפלסטיק של השקופיות רק מספיק כדי להרטיב את המשטח (זה יכול לגרום קמטים קלים של השקופיות). מניחים את רצועות פרפין בשקופיות.
- לייבש את השקופיות לילה על צלחת חימום על 42 מעלות צלזיוס במשך ~ 12 שעות. מכסים את צלחת חימום עםמכסה פלסטיק כי לא נוגע שקופיות. ודא את מכסה הפלסטיק אינו מונע את חילופי האוויר. ליעד זה על המכסה ניתן להציב על תיבות pipet או דומה יוסר.
- לחלופין, להפחית את זמן הייבוש עד למינימום של שעות או עד הרקמה מופיעה לגמרי יבשה. צמצום הזמן שעובר חיתוך לאוסף עשוי לשפר את איכות RNA.
- מתחת למכסה מנוע כימי, דה-שעוות השקופיות 2 פעמים במשך 10 דקות ב Xylol באמצעות בעלי שקופיות מתאימים. הקפד להטביע את חלק פלסטיק מלא של כל שקופית, אלא כדי לאפשר הסרה של השקופית על ידי נגיעה בקצה הרחב של מסגרת מתכת כי נשמר יבש.
- אפשר השקופיות להתייבש במשך 10 דקות ~ מתחת למכסה המנוע כימי לפני LAM.
הערה: שקופיות לא מעובד מיד ניתן להציב שוב על הצלחת חימום על 42 מעלות צלזיוס עם הרקמה פונה כלפי מעלה עד כמה שעות. זה ימנע כל לחות מן להתפשר על איכות RNA עד לעיבוד נוסף.
4. Microdissection בסיוע לייזר (LAM)
הערה: נוהל LAM ישתנה בהתאם המכשיר בשימוש. פרטים מסוימים של פרוטוקול זה מותאמים למכשיר מסוים ואת הטכנולוגיה של איסוף הדגימות על הִשׁתַמְשׁוּת כובע של כוחות אלקטרוסטטיים. בנוסף, פרטים עשויים להשתנות גם בין גרסאות שונות של התוכנה. עיין להוראות יצרן ספרי משתמש עבור תיאור מפורט והנחיות ספציפיות על מכשיר ותוכנה.
- הפעילו את ההתקנים עבור LAM (מחשב, מיקרוסקופ, תיבת הבקרה לייזר).
- הפעל את התוכנית הגה מיקרוסקופ לייזר.
- הפעילו את הלייזר על ידי לחיצה על הכפתור המתאים על תיבת הבקרה.
- מניחים כובע (0.5 מ"ל, ללא diffusor) לתוך מחזיק כובע ולמקם אותו המכשיר.
- תמיכת שקופית LAM עם זכוכית שקופית עבור במיקרוסקופ. ודא שמשטח השטוח של שקופיות עםרקמות המצורפות פונות שקופיות הזכוכית.
- במקום להחליק את המכשיר כאשר שקופיות זכוכית מתחת.
- בחר את המטרה 4X. בתכנית, בחר להעביר את הכובע לתפקיד "למעלה" או להמשיך לבצע סריקה של השקופית.
- חיפוש דרך השקופית ולזהות את המבנים של עניין. לאתר ולשמור עמדותיהם בשקופית להיות מסוגל לנוע בחזרה למיקום המדויק עבור שלב החיתוך.
- בחר את המטרה המתאימה (למשל 40X או 60X).
- במידת הצורך, להתאים את מהירות לייזר, להתמקד, כוח לייזר, וגם לכייל את התנועה הבמה על ידי פנייה במדריך למשתמש של המכשיר. ברגע שהחשבון מוגדר עבור רקמות ספציפיות של עניין, ניתן לעשות שימוש חוזר בהגדרות.
- בדוק את המיקום לייזר על ידי ירייה אחת על ידי לחיצה על "ירה לייזר" כפתור של התוכנית, באופן אידיאלי ב חלק של הממברנה ללא רקמות.
- במידת הצורך, לכייל את העמדה לייזר ידי ביצוע הדואר להוראות היצרן עבור המכשיר.
- בדוק את הכיול של המטרה על ידי הזזת מבנה ברור לכל ארבעת הפינות של חלון תוכנה על המסך, תוך שמירה על הכפתור הימני של העכבר לחוץ. בדוק כי המיקום של היד ביחס למבנה הברור הוא זהה בכל ארבע הפינות. אחרת לכייל את המטרות הבאות במדריך התוכנה.
- עם הכובע במצב 'למטה', השתמש בכלי 'יד-עט' כדי לסמן את הגבולות של סוג התא או רקמה של עניין, למשל, תא הביצית. לנתח את התא עניין עם הלייזר על ידי לחיצה על 'לחתוך'. הערה: לעתים קרובות, חתך יש צורך לחזור אם הגבול סביב התא לא היה גזור לגמרי בבת אחת. במקרה זה, מומלץ להגדיר את התוכנה כדי לעשות אוטומטי ולשני שידורים חוזרים של הסעיף כסטנדרט.
- הרם את המכסה ולעבור לתפקיד הבא הציל את המבנה של עניין. חזור על שלב 4.13של ההליך כדי לנתח את הקטעים בתא הסמוך עד שכל התאים של עניין משקופית אחת נאספים. ודא הכובע ממוצבת בצורת הקטע החדש נדבק עמדה ריקה על הכובע.
הערה: מומלץ לבודד חתיכות גדולות של רקמות (למשל, קטעים כולו פרחים או חלקים ממנה) מן כל שקופית לאחר בידוד סעיפי תא בודדים על כובע טרי. אלה יכולים לשמש לבקרת איכות RNA. - להסיר את השקופית ולהמשיך עם לשקופית הבאה על ידי חזרה על שלבים 4.4 - 4.9 ואת 4.13 כדי 4.14.
- חזור על שלב 4.15 צעדים בנושא עד סוגי התאים של עניין מכל השקופיות בודדו. הערה: לא מומלץ למסוק יותר מ ~ 4 - 5 שעות על אותו הכובע.
- ראייה לבדוק את שטח הכובע אחרי LAM להוציא זיהומים נוקבים של המדגם. בעוד הרקמות הלא גזור מוגנים עם רדיד, אבק יכול מקל על פני השטח עקב הידבקות אלקטרוסטטי.
- To בדוק חזותית את הכובע, להסיר את השקופית מהמכשיר. מניחים את בעל כובע במצב 'למטה' ולבדוק את השטח במטרה 4X.
- במקרה חתיכות קטנות של אבק גלויות, להסיר אותם עם קצה פיפטה קטן (2 μl). לחלופין, הר השקופית בחזרה על המכשיר, מניח את הכובע על חלק חופשי של השקופית (לא רקמות), ובאופן מוחלט להרוס את הזיהום באמצעות הליזר.
- כמוסות לסגור ולהקפיא את הסעיפים היבשים ב -80 ° C עד לשימוש נוסף. במידת הצורך, דוגמאות ניתן לאחסן עד מספר שבועות. עם זאת, ממשיך במהירות בשלב זה מומלץ.
5. בידוד RNA ובקרת איכות
הערה: RNA יכול להיות מבודד על ידי כל שיטה מתאימה כמויות קטנות של RNA. בפרוטוקול זה שימוש ערכת בידוד RNA שצוינה עבור כמויות קטנות של RNA מתואר. פעל על פי הוראות היצרן.
- השתמש צינורות עם המדגם מצורףהכובע במישרין או לאחר הוצאתו -80 מעלות צלזיוס.
- פתח את הצינורות ובזהירות pipet 11 μl של חיץ חילוץ אל הקיר של צינור אחד באמצעות טיפי סינון. שינוי עצות בין דגימות.
- סגור את המכסה ולנער למאגר החילוץ עד הכובע של הצינור.
- מניחים את הצינורות עם כובע למטה בתנור חימום שחומם מראש ל 42 מעלות צלזיוס. דגירה למשך 30 דקות בעקבות הוראות היצרן.
- פעל על פי הוראות היצרן להכנת טור ואיסוף התמצית בתחתית הצינורות.
- אם חומר מיותר מ כובע אחד צריך להיות משולב לתוך דגימה אחת, להמשיך בצעדים 5.1.1 - 5.1.2 בנפרד עבור כל שפופרת / כובע.
- לאחר מכן, בריכת תמציות עבור דגימה אחת בצינור אחד למדוד את כמות תמצית ונקווה עם טפטפת לפני תוספת של כמות שווה של EtOH (ראו הוראות היצרן).
- ודא שכמות EtOH הוסיף לפני טעינת העמודה היא שווה לנפח של התמצית תיקווה.
- לאחר ממטרים RNA עם EtOH, להמשיך במהירות הטעינה של העמודים הבאים הוראות היצרן. המשך הפרוטוקול עם צעד צנטריפוגה 100 XG.
- אחרי התוכן של כל צינור איסוף הועבר דרך העמודה, לבצע צעד צנטריפוגה XG 16,000 למשך 30 שניות כדי להסיר את הוראות יצרן זרימה דרך הבא.
- המשך עם מיצוי RNA וטיהור הבא הוראות היצרן.
- לאחר הטעינה של למאגר elution לעמודה לאפשר בעמודה כדי לדגור במשך 1 דקות. המשך לטעון את הצינורות לתוך צנטריפוגה בעקבות ההוראות להוראות היצרן. הערה: צעד צנטריפוגה נוסף עבור 1 דקות ב 100 XG לפני elution כמצוין בפרוטוקול יכול להגביר את היעילות של elution.
- חלץ RNA מן ההמשךrols (סעיפי רקמות גדולים) לבקרת איכות RNA ביצוע שלבי 5.1 5.2.7 של פרוטוקול זה.
- עבור עומס בקרת איכות RNA 1 μl רנ"א הכל חי של כל דגימה שליטה על Bioanalyzer באמצעות שבב RNA פיקו בעקבות הוראות היצרן.
הערה: RNA החילוץ יכול לשמש הגברה ליניארית וניתוח transcriptome באמצעות מערכים או RNA-seq 7,11,13,14. באופן אידיאלי, בקרת האיכות צריכה להצביע על מספר Integrity RNA (רין) של לפחות 7. מספר הספקים לספק ערכות מתאימות הגברה, דוגמאות מתאימות ניתנות 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הכנת המדגם LAM נעשים צעדים עוקבים
מספר צעדים רצופים נדרשים להכין RNA לניתוח תעתיק סוגי תאים שנבחרו על ידי LAM (איור 1). זה מתחיל עם הקציר של פרחי קיבעון מיידי על מנת להבטיח כי אוכלוסיית RNA נותרת ללא שינוי לאחר קציר. הרקמה מוטבעת, מחולק, רכובה על שקופיות. זה מאפשר הבידוד של התאים על ידי LAM ואת איגום סעיפי סוג תא ספציפי על כובעים אחד או כמה (איור 1). החומר יכול להיות קפוא לאחר מכן או מעובד באופן ישיר על ידי מיצוי RNA. מלבד היתרון של LAM יהיה ישים עבור סוג תא ספציפי המנתח בשני מיני המודל והלא-מודל, השיטה נשארת זולל-הזמן. לפחות שבוע של זמן עבודה, לפעמים יותר, נדרש עבור הצעדים מן tiקציר ssue כדי מיצוי RNA (איור 1). זה צריך להילקח בחשבון כי לעתים קרובות חלקים שנקטפו על פני כמה ימים של LAM הם אספו במדגם והפקת RNA אחד ביולוגית. עבור תאי ביצת Boechera, השימוש לפחות ~ 200 סעיפים לדגימה מומלץ מאוד, עם עד ~ 100 חלקים מבודדים ליום.
בידוד של סוגי התאים של ריבית תלוי הראות שלהם בסעיפים יבשים
בידוד של סעיפי סוג התא ספציפי הוא הצעד הכי הזמן רב של הפרוטוקול. עד כה, לא אוטומציה של שלב זה פותחה בשל האופי המורכב של דגימות. זיהוי של התאים בעלי עניין באמצעות כלי תוכנה הוא לא ריאלי, כי הסעיפים היבשים יש ניגודיות נמוכה ומטוס הסעיף משתנה בין הדגימות בשל העובדה כי ביציות מכוונות בזוויות שונות within הרקמה (איור 2). אף על פי כן, המורפולוגיה הייחודית של גמטופיט הנקבה הבוגר עם synergids, תא ביצית, והתא המרכזי (תאים נגדיים להידרדר לפני ההפריה) מאפשרת זיהוי חד המשמעי של תאי ביצה על ידי החוקר (התרשים 2B, C; איור 3). ואכן, Boechera divaricarpa, תא הביצה לעתים קרובות מתכווץ קצת במהלך הכנה ובכך מפריד בין הרקמות הסובבות, תכונת יתרון עבור הבידוד של אוכלוסיות תאי ביצת טוהר גבוה (איור 2 ב, ג; איור 3).
בדיקה ויזואלית של השווי לאחר LAM מומלץ
בדיקה ויזואלית של פני שטח הכובע אחרי LAM מאפשרת זיהוי של כל זיהומים אפשריים של המדגם, למשל, על ידי אבק. בנוסף, כדאי לוודא כי sections מקל על הכובע, כמו מדי פעם קטעים לאיבוד במהלך ההליך. בדרך כלל, רבי קטעים נבחרים, למשל, תאי ביצה, ניתן לראות על כובע אחד לאחר מספר שעות של LAM.
זרימת העבודה שהוקמו תוצאות reproducibly בטוב RNA איכות
מ בידודי LAM סוג ספציפי תא מפני גמטופיט נקבה, כמויות רנ"א הכל הן רק בטווח ng הנמוך. סכום הגבלה זו של RNA עושה את זה צורך להשתמש מלא נציג מבודד מרקמות גדולות של כל שקופית כקירוב לבקרת איכות RNA לאחר LAM. זו באה לידי ביטוי על ידי השוואה של RNA סוג תא ספציפי מב תאי ביצת divaricarpa בהשוואה לקבוצת ביקורת מאזורים רקמות גדולים מהבודדים מאותו השקופיות, המציין איכות RNA דומה (איור 4 א, ב). באמצעות שיטה זו, טוב לאיכות RNA גבוהה עם מספרי RIN & #8805; 7 מתקבל reproducibly. איכות RNA שהושגה הייתה מתאימה תא סוג ספציפי RNA-seq, מוביל לזיהוי של 236 גנים הביעו בתא הביצה apomictic אך לא בתא המרכזי apomictic, תא synergid, או התא ראשוני apomictic, ולא בתאים או גמטופיט מינית בוגרת של thaliana ארבידופסיס (איור 5) 7.
איור 1:. Scheme של הצעדים לפרוטוקול, המציין את הזמן המינימאלי הנדרש לכל שלב קיבוע של הפרחים או רקמות של העניין נעשה בין הלילה. למחרת, הטבעה הוא התחיל, אשר פועל במשך הלילה, וכתוצאה מכך החומר מוטבע ביום 3 לפרוטוקול. באותו יום 3 חלקי microtome החל דגימות מוטבעות בבלוקי שעווה יכולים להיוצר. הסרטים של חלקי פרפין דקים הם רכובים על שקופיות והשאירו לייבוש למשך הלילה. עַלדואר לכמה ימים של LAM יידרש להשיג מספיק חומר לשכפל ביולוגי אחד. לאחר בידוד RNA ובקרת איכות, הכנת הספרייה RNA-seq ניתן לבצע כדי להכין ניתוח transcriptome. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: תאי ביצה הם ברורים זיהוי בסעיפים רזים, בשל המורפולוגיה האופיינית של גמטופיט הנקבה (א) הציור סכמטי של גמטופיט נקבה הבוגר (סוג Polygonum) (ב - ג) סעיפים דקים דרך ביציות מחסות גמטופיט נשי.. Boechera divaricarpa. תאי ביצה גלויים לעין. בשל המורפולוגיה של גמטופיט הנקבה לעתים קרובות לא כל סוגי תאים (תא ביצית: דואר, synergids: שניותתא מרכזי,: cc) גלוי בחלק מסוים. ברי סולם = 50 מיקרומטר. לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. LAM של תאי ביצת Boechera divaricarpa. A ו- C. סעיף של גמטופיט הבוגרת של B. divaricarpa ב -7 מיקרומטר לפני, B ו- D, לאחר microdissection עם מכשיר הלייזר (תא ביצית: דואר, synergids: שניות, תא מרכזי: cc). ברי סולם = 50 מיקרומטר. לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
<strong> איור 4. RNA איכות תאי ביצה גזור ליזר וסעיפי בקרה. (א) איכות RNA כפי שנותח ממקטעי תא ביצית לעומת (B) אזורי רקמות גדולים שנקטפו מאותו השקופיות כקבוצת ביקורת. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
זיהוי איור 5. של גנים הביעו היחיד בתא Apomictic בייץ לעומת התאים של Apomictic ומינית למבוגרי גמטופיט או התא הראשוני Apomictic. Heatmap של 236 גנים הביעו בתא הביצה apomictic אך לא בתא המרכזי apomictic, תא synergid , התא הראשוני apomictic או של B. gunnisoniana ולא התאים של גמטופיט המינית הבוגרת של A. thaliana 7 מבנה היררכיאשכולות של דגימות וגנים התבססו על מרחק האוקלידית ו באשכולות agglomerative היררכיים. האדום מסמל ביטוי גבוה וביטוי נמוך שחור. צבעים הם מדורגים בכל שורה. apo:. apomictic אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול הוא מתאים תאים שונים וסוגי רקמות
LAM בשילוב עם transcriptome מנתח ידי microarrays או RNA-seq היא כלי רב ערך כדי לקבל תובנות לתוך דפוסים מסוימים של פעילות גנים ויסות תהליכים התפתחותיים או פיזיולוגיים 7-11,13,14. עם זאת, את התאמתו של שיטה זו עבור כל סוג תא נתון תלויה באופן מכריע בעיות מבניות. התא צריך להיות ברור לעין וקלה לזיהוי חד משמעי בסעיפים היבשים המשמשים LAM. בשנת Boechera divaricarpa, את המורפולוגיה של גמטופיט מאפשר זיהוי קל של תא הביצית (איור 2, איור 3). בסופו של הדבר, את המהירות של בידוד של אוכלוסיית תא ספציפית גם תלויה בתדירות שבה בסוג התא ניתן למצוא בשקופית אחת, כמו החלפת שקופיות וסריקת שקופיות חדשות צעדים גוזלים זמן. בהתחשב בכך תלוי בסוג התא, לפחות 200 - כת תא 250יונים צריכים להיות ונקוו לדגימה, התאמתו של השיטה עבור מערך מחקר מסוים תלויה במידה רבה על דרישות הזמן לצעד LAM.
בנוסף, תלוי את המורפולוגיה של הרקמה, זה יכול להיות יתרון מבחינת מבנה כדי להפחית את העובי של החלקים עד 6 מיקרומטר. באופן דומה, ממקטעים עבים של אידיאלי ≥ 8 מיקרומטר בדרך כלל לגרום כמות RNA גבוהה ו- RNA של איכות גבוהה במקצת מאותה הכמות של סעיפי רקמות. בנוסף, התאים של עניין צריכים לפחות בקוטר של 8 - 10 מיקרומטר לעשות בידוד LAM הריאלי.
באופן עקרוני, הפרוטוקול המתואר כאן יכול להיות מותאם סוגי תאים ורקמות שונים ממינים קרובים רחוק. עם זאת, איכות RNA יכול להשתנות אפילו בין תאים מסוגים שונים מאותו המין 7,10,13. פרוטוקול זה הותאם מבוסס על סוגי תאים קטנים קריטיים. לכן, זה יכול להיות מיושם כעת על broadeמגוון r של דגימות ללא התאמות נוספות. שינויים קלים של הפרוטוקול אולי בכל זאת יידרשו, תלוי בסוג תא מינים תחת חקירה. מומלץ הראשון להשתמש בשני fixatives החלופי (ראה פרוטוקול 1.1) בעת הגדרת שיטת זן חדש או סוג תא בחינה השוואתית של מורפולוגיה ואיכות RNA.
בעיקרון, פרוטוקול יכול להיות מותאם והופיע עם כלי נגינה שונים מתאים microdissection לייזר 9. עם זאת, צריך לציין כי הכלים להשתנות הן כוח לייזר ואת רוחב מינימלי של קרן לייזר כי יכול להיות מיושם, כמו גם את הטכנולוגיה של הדגימה. במיוחד עבור הבידוד של תאים קטנים באזורי רקמות, לייזרים וכתוצאה מכך נתיב ליזר צר מתאימים יותר. קרן הלייזר של המכשיר אנו משתמשים הוא די בסדר (~ 1 מיקרומטר רחב) ומאפשר דיסקציה של תאים קטנים. טכנולוגית הדגימה של איסוף cells על משטח כובע דביק על ידי הדבקת אלקטרוסטטית יתרון במיוחד עבור סוגי תאים קטנים ובידוד סעיפי תא בודדים. זו מקטינה את הסיכון של אובדן מדגם ידי השפעות אלקטרוסטטי.
איכות RNA המתקבל היא חשובה עבור ניתוח נוסף תעתיק
אחת הנקודות הקריטיות ביותר עבור הכנת ספרייה מוצלחת-Seq RNA הוא איכות RNA. בעוד ספקים כמה ערכות הגברת אופטימיזציה הטכנולוגיה שלהם עבור RNA של שלמות אפילו נמוכה, איכות הנתונים שהתקבלו לאחר ניתוח transcriptome על ידי אחד microarrays או RNA-seq בדרך כלל עולה עם איכות RNA הקלט. שימוש בפרוטוקול הקימו פה, טוב מאוד לשחזור איכות RNA לשלבים התפתחותיים שונים של רקמות הרבייה הנשית ואת germline ב ארבידופסיס Boechera הושג (למשל, איור 4). בעוד השיטה ישימהגם עבור מינים יותר קרובים רחוק (למשל, עגבניות, לא פורסם), זה צריך להילקח בחשבון כי אופטימיזציות או שינויים קטנים עשויה להידרש בהתאם למין, סוג הרקמה, ואף סביבת המעבדה כמו, למשל, לחות גבוהה אולי להתפשר על היושרה RNA במהלך הכנת שקופיות LAM.
שלב קריטי במהלך הפרוטוקול הוא ההרכבה של פסי שעווה המחולקים המכילים דגימות על השקופיות. כאן, בפרט הקשר למים הוא שלב קריטי. תוך החלפת מים על ידי EtOH לא תביא לשום שיפור משמעותי של שלמות RNA לאחר בידוד (לא פורסם), החלפת מים על ידי מתנול עושה. עם זאת, מתנול צריכים להיות מטופלים רק מתחת למכסה המנוע כימי בזהירות רבה. בהתאם לסוג המדגם, כחלופה לשימוש במתנול, פעמי הייבוש לאחר הרכבה עם מים, ניתן להפחית עד ~ 2 שעות (ראה 3.3.3.1), וכתוצאה מכך איכות RNA טובה באותה מידה.ביצוע בדיקה כדי לבדוק את איכות RNA מושגת על ידי הרכבה או על מים או מתנול עבור סוג התא ומינים של עניין מומלץ בתחילת פרויקט חדש.
LAM היא טכנולוגיה רב עוצמה עבור ניתוח תעתיק
לסיכום, יש לנו מותאם בהצלחה ויישם את השילוב של LAM וניתוח transcriptome סוג תא ספציפי על ידי microarrays ו- RNA-Seq לתאים שונים של השושלת germline מינית apomictic ב thaliana ארבידופסיס וב spp Boechera., ובכך מאפשר ניתוחים תעתיק השוואתי (ראה גם איור 5) 7,11,13,14. השיטה המתוארת נושאה מספר היתרונות לעומת טכנולוגיות אחרות המאפשרות ניתוח תעתיק סוג תא ספציפי. חשוב לציין, תלוי מזהים של סוגי תאים או רקמות של עניין בסעיף, זה יכול להיות מיושם על סוגי תאים נדירים של שני מודלומינים שאינם מודל, כגון תאי גמטופיט הנקבה הבוגר Boechera spp., או שזה יכול גם לשמש כדי לבודד תחומים הסלולר, למשל, חצי קוטב של תאים 19. יישומים דומים לא יהיו אפשריים עם שיטות אחרות המבוססות על מיון מופעל ניאון של תאים או גרעינים (FACS / FANS) 10.
החיסרון העיקרי של השיטה הוא הדרישה בעניין הזמן. בעוד קיבעון והטבעה ואינה דורשת להאריך הידיים על הזמן והוא יכול היה לעשות בו זמנית עבור כמות גדולה של פרחים, LAM וככזה הוא זמן רב מאוד, לניתוח סוג תא ספציפי, בדרך כלל 3 ימים עד 3 שבועות של LAM (ב -5 שעות בממוצע ליום ב המיקרוסקופ הליזר) צריך להיות מתוכנן. מבחינה זו, כדאי לעשות קצת בדיקות טרום עבור המהירות של בידוד של תאים מהסוג הספציפי המכוון לעצב המחקר כראוי. בנוסף, גם בעת שימוש בפרוטוקול אופטימיזציה זו, ניסויים כדי לבדוק את איכות RNA הם מאוד מחדשמְקוּלָס.
לסיכום, LAM הוא כלי רב עצמה עבור ניתוח התעתיק ברזולוציה של סוגי תאים בודדים או אפילו תחומי משנה של תאים, אשר לא ניתן להשיג באמצעות שיטות קיימות חלופיות. מבחינה זו, היא נושאת פוטנציאל אדיר כדי לאפשר ניתוחים, למשל, של תהליכים התפתחותיים, עם רזולוציה של זמן ומרחב גבוה מאוד. זה בא לידי ביטוי על ידי הניתוחים של transcriptomes של תאים בכלל השלבים העיקריים של רבייה מינית apomictic ב ארבידופסיס Boechera 7,11,13,14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | VWR | 1,009,861,000 | absolute EMPROVE Ph Eur,BP,USP |
| 15 ml falcon centrifuge tubes | VWR | 62406-200 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2939AA | |
| Acetic Acid | Applichem | A3686,2500 | 100% Molecular biology grade |
| Ambion Nuclease free water | life technologies | AM9932 | |
| ASP200 S | Leica | 14048043624 | tissue processor |
| black cardboard | can be purchased in special paper shops | ||
| DNA- and RNAse-free Frame Slides | Micro Dissect GmbH | 1, 4 µm PET-membrane; can also be purchased from Leica | |
| Dumond Forceps | Actimed | 0208-5SPSF-PS | |
| ethanol lamp | |||
| exsiccator | Sigma-Aldrich | Z354074-1EA | Nalgene Vaccuum Dessicator or similar equipment |
| filter tips 10 µl | Axon Lab AG | AL60010 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 1,000 µl | Axon Lab AG | AL60010 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 20 µl | Axon Lab AG | AL60020 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 200 µl | Axon Lab AG | AL60200 | can be replaced by similar tips |
| forceps precision | VWE | 232-1221 | |
| glass slide holder | Huber & Co.AG | 10.0540.01 | Färbekästen nach Hellendahl |
| glass staining trough | Huber & Co.AG | 10.0570.01 | Färbekasten |
| Heated Paraffin Embedding Module Leica | Leica | Leica EG 1150 H | blocking station, similar devises are suitable |
| Heating and Drying Table | Medax | 15501 | other models and/or suppliers are suitable |
| ice bucket | VWR ice bucket with lid | 10146-184 | similar buckets equally suitable |
| light table | UVP An Analytical Jena Company | TW-26 | white light transluminator |
| microscope slide | Thermo Scientific | 10143562CE | cut edges |
| microtome blade | Thermo Scientific | FEAHS35 | S35 microtome blade disposable |
| MMI Cell Cut Plus Instrument | MMI (Molecular Machines and Industries) | ||
| Non-stick, RNAse free Microfuge tubes, 2 ml | life technologies | AM12475 | |
| Paraplast X-TRA | Roth | X882.2 | for histology |
| PicoPure RNA Isolation Kit | life technologies | KIT0204 | Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit |
| plastic balancing trays | Semadeni AG | 2513 | |
| plastic box | Semadeni AG | 2971 | Plastikdose PS |
| plastic lid for heating plate | homemade | ||
| preparation needle | VWR | 631-7159 | |
| RNA 6000 Pico Kit | Agilent | 5067-1513 | |
| RNAse free microfuge tubes | life technologies | AM12400 | |
| RNAse ZAP Decontamination Solution | life technologies | AM9780 | |
| Semi-automated Rotary Microtome | Leica | RM2245 | similar devices are equally suitable |
| Tissue Loc Histo Screen Cassettes | Thermo Scientific | C-1000_AQ | similar cassettes of other suppliers are suitable |
| Tubes with adhesive lid, without diffusor 500 µl | MMI (Molecular Machines and Industries) | 50204 | |
| Xylol (Isomere) ROTIPURAN | VWR | 4436.2 | min. 99%, p.a., ACS, ISO SP |
| process embedding cassettes | Leica | 14039440000 | Leica Jet Cassette I without lid |
| Universal Oven | Memmert | UF55 | other models and/or suppliers are suitable |
References
- Maheshwari, P. An Introduction to the Embryology of Angiosperms. , McGraw-Hill. New York. (1950).
- Willemse, M. T. M., Van Went, J. L. The female gametophyte. Embryology of Angiosperms. Johri, B. M. , Springer-Verlag. Berlin. 159-196 (1984).
- Koltunow, A. M., Bicknell, R. A., Chaudhury, A. M. Apomixis: Molecular strategies for the generation of genetically identical seeds without fertilization. Plant Physiol. 108, 1345-1352 (1995).
- Vielle-Calzada, J. P., Crane, C., Stelly, D. M. Apomixis - the asexual revolution. Science. 274, 1322-1323 (1996).
- Grossniklaus, U., Koltunow, A., van Lookeren Campagne, M. A bright future for apomixis. Trends Plant Sci. 3, 415-416 (1998).
- Schmidt, A., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. Plant germline formation: molecular insights define common concepts and illustrate developmental flexibility in apomictic and sexual reproduction. Development. 142, 229-241 (2015).
- Schmidt, A., et al. Apomictic and sexual germline development differ with respect to cell cycle, transcriptional, hormonal and epigenetic regulation. PLOS GENET. 10, e1004476 (2014).
- Okada, T., et al. Enlarging cells initiating apomixis in Hieractium praealtum transition to an embryo sac program prior to entering mitosis. Plant Physiol. 163, 216-231 (2013).
- Wuest, S. E., Grossniklaus, U. Laser-assisted microdissection applied to floral tissues. Methods Mol Biol. 1110, 329-344 (2014).
- Wuest, S. E., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. Cell-specific expression profiling of rare cell types as exemplified by its impact on our understanding of female gametophyte development. Curr Opin Plant Biol. 16 (1), 41-49 (2013).
- Wuest, S. E., et al. Arabidopsis female gametophyte gene expression map reveals similarities between plant and animal gametes. Curr Biol. 20, 1-7 (2010).
- Cai, S., Lashbrook, C. C. Laser capture microdissection of plant cells from tape-transferred paraffin sections promotes recovery of structurally intact RNA for global gene profiling. Plant J. 48 (4), 628-637 (2006).
- Schmidt, A., Wuest, S. E., Vijverberg, K., Baroux, C., Kleen, D., Grossniklaus, U. Transcriptome analysis of the Arabidopsis megaspore mother cell uncovers the importance of RNA helicases for plant germ line development. PLOS BIOL. 9, e1001155 (2011).
- Schmid, M. W., Schmidt, A., Klostermeier, U. C., Barann, M., Rosenstiel, P., Grossniklaus, U. A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA sequencing. PLOS ONE. 7, e29685 (2012).
- Mau, M., et al. Hybrid apomicts trapped in the ecological niches of their sexual ancestors. Proc Natl Acad Sci.U S A. 112 (18), 2357-2365 (2015).
- Aliyu, O. M., Seifert, M., Corral, J. M., Fuchs, J., Sharbel, T. F. Copy number variation in transcriptionally active regions of sexual and apomictic Boechera. demonstrates independently derived apomictic lineages. Plant Cell. 25 (10), 3808-3823 (2013).
- Corral, J. M., et al. A conserved apomixis-specific polymorphism is correlated with exclusive exonuclease expression in premeiotic ovules of apomictic boechera species. Plant Physiol. 163 (4), 1660-1672 (2013).
- Deeken, R., Ache, P., Kajahn, I., Klinkenberg, J., Bringmann, G., Hedrich, R. Identification of Arabidopsis thaliana. phloem RNAs provides a search criterion for phloem-based transcripts hidden in complex datasets of microarray experiments. Plant J. 55, 746-775 (2008).
- Schmid, M. W. Genome Scale Quantitative Biology in Arabidopsis thaliana. , University of Zürich. PhD Thesis 40-104 (2015).
