Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Laser-assistert mikrodisseksjon (LAM) som et verktøy for Transkripsjonell Profilering av individuelle celletyper

Published: May 10, 2016 doi: 10.3791/53916

Introduction

I transkripsjons studier gjort på vevet nivå, er transcriptomes av høyt spesialiserte, men sjeldne celletyper ofte maskert av de mer rikelig omkringliggende cellene. Et eksempel på slike svært spesialiserte celletyper er de cellene i det kvinnelige reproduksjons avstamning (kimlinje) i planter. Den kvinnelige kimcellelinje er spesifisert innenfor utviklings ovules, forløperne til frøene inni gynoecium av blomsten 1,2. Den megaspore morcellen (MMC) er den første cellen i den kvinnelige germline. Det gjennomgår meiose for å danne en tetrad av redusert megaspores. Vanligvis er bare en av disse megaspores overlever og skiller mitotisk uten cytokinese, dvs. i et syncytium. Disse mitoser følges av cellularization for å danne den modne gametofytt, som typisk består av fire celletyper: tre antipodals, to synergid celler, egg, og den sentrale celle. Egg og sentrale celler er de kvinnelige kjønnscellene som blir befruktet av to sædceller under douold befruktning for å gi opphav til embryoet og endosperm av utviklingsland frø 1,2. I den seksuelle modellsystemet Arabidopsis thaliana, bare ~ 50 frø utvikle per blomst mens om lag 50 - 80 frø utvikle per blomst i nært beslektede slekten Boechera. Således, den kvinnelige kimlinje består av bare noen få høyt spesialiserte celletyper, noe som gjør det til et utmerket modell for å studere utviklingsmessige prosesser, slik som celle spesifikasjon og differensiering.

Videre kan innsikt i genet regulatoriske prosesser som styrer anlegget reproduksjon være av anvendt verdi. I planter, kan både seksuell og aseksuell reproduksjon gjennom frø (apomiksis) forekomme. Mens seksuell reproduksjon genererer genetiske mangfoldet i en befolkning, apomiksis fører til dannelsen av klonal avkom som er genetisk identisk med morplanten. Derfor har apomiksis stort potensial for bruk i landbruket og frøproduksjon, som selv komplekse mors genotyper kanopprettholdes uendret over flere generasjoner 3,4,5. Fordi apomiksis ikke naturlig forekommer i noen store avlings arter, er prosjektering av apomiksis i avlinger av stor interesse 3,4,5. Dette er imidlertid et langsiktig mål vanskelig å oppnå fordi den underliggende genetiske og molekylære grunnlaget for apomiksis ikke blir forstått i tilstrekkelig detalj seks.

For å få innsikt i transkripsjons basis styrende småarter reproduksjon, celletype-spesifikke transcriptional profilering ved hjelp av laser-assistert mikrodisseksjon (LAM) og neste generasjons sekvensering (NGS) representerer et svært kraftig tilnærming 7,8. LAM først har blitt etablert for dyr og biomedisinsk forskning. I de siste årene LAM har også blitt brukt til plantebiologi 6,9,10. I motsetning til andre fremgangsmåter slik at profileringen av individuelle celletyper og vev, ikke LAM ikke krever generering av iletau 6,9,10. Derfor kan det være appløy til en celle eller vevstype uten molekylær kunnskap. En annen fordel med LAM er at den kan brukes på alle celletype så lenge cellen kan gjenkjennes i tørre deler basert på posisjon og / eller strukturelle trekk. LAM har den ytterligere fordel at faste vev er brukt, som forhindrer endring av den transkripsjonelle profilen under behandlingen.

Vevet av interesse, for eksempel, floral vev, er festet i et ikke-kryssbinding fiksativ før innstøping i parafinvoks. Innstøping i parafinvoks kan gjøres manuelt, følger etablerte protokoller 9,11. Men bruk av en automatisert vev prosessor for dehydrering og infiltrering med voks generelt resulterer i høyere reproduserbarhet når det gjelder bevaring av RNA kvalitet og vev morfologi. Den alternative strategi med å bygge inn vev i harpiks har også blitt brukt med hell for celletype-spesifikk analyse av LAM 8. Imidlertid har bruken av en automrerte vev prosessor for innebygging i voks er svært tidseffektiv, som mange prøver kan behandles samtidig krever et minimum av hands-on tid. Mens vanligvis ingen signifikant tap av RNA kvalitet oppstår under fiksering og forankring, ved fremstilling av tynne seksjoner med mikrotomen og, i særdeleshet, montering på frameslides som brukes for LAM forblir et kritisk trinn for preservering av RNA kvalitet. Det har tidligere blitt nevnt og anvendelsen av et bånd overføringssystem har blitt beskrevet til å resultere i bedre RNA kvalitet på dette trinnet 12. Men dette legger et ekstra tidkrevende trinn under forberedelse av lysbildene og krever også spesialutstyr. Den optimaliserte protokollen beskrevet nedenfor reproduserbart produserer RNA som er av tilstrekkelig kvalitet for transkripsjonen profilering med GeneCHIPs og Next Generation Sequencing (NGS) nærmer 7,11,13,14. I tillegg, med laser mikrodisseksjon mikroskop, en høy renhet av de isolerte celletypene er fluktinely produsert 7,11,13,14.

Slekten Boechera er en utmerket modellsystem for å studere de viktigste trinnene av småarter reproduksjon. I Boechera, har en rekke forskjellige seksuelle og småarter akses blitt identifisert, og kan brukes for komparative analyser 15,16,17. I en sammenligning av celletype-spesifikke transcriptomes av celler fra den kvinnelige kimlinje fra seksuell Arabidopsis og småarter Boechera identifiserte vi gener og stier som er forskjellig uttrykt, og dermed identifisere nye sider ved reguleringsprosessene som styrer apomiksis 7. I tillegg har denne undersøkelsen bekreftet egnetheten LAM for celletype-spesifikk transcriptional analyser av små og sjeldne celletyper. Vi har allerede benyttet denne protokollen for analyse av forskjellige celletyper i en rekke forskjellige plantearter, men arts- og vevs-spesifikke modifikasjoner av protokollen kan være nødvendig i visse tilfeller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Merk: Denne protokollen beskriver vev forberedelse, laser assistert mikrodisseksjon, og RNA ekstraksjon for transkripsjonen profilering. Bruk alltid hansker gjennom alle trinnene i protokollen. Studere og vurdere sikkerhetsinstruksjonene for hvert kjemikalie som brukes. Spesielt husk at xylol er skadelig og kan trenge hansker og at metanol er giftig. For alle instrumenter som brukes, kan du se i brukermanualer tilsvarende.

1. Fjerning av RNase aktivitet fra Glass og annet utstyr

  1. Før bruk, vikle noen glass i aluminiumsfolie før baking for ~ 8 timer ved 180 ° C for å sikre RNase fritt kvalitet.
  2. Behandle metallflater (f.eks pinsett) samt en arbeidsbenk og varmeplaten med en passende RNAse dekontaminering løsning. Deretter vaskes overflatene med RNase-fritt vann for å fjerne dekontaminering løsning. Deretter rengjør flatene ytterligere med 70% EtOH.
  3. Bruk alle plastic forbruksvarer (for eksempel rør) splitter ny uten forbehandling. Hvis tilgjengelig, kan du bruke plast forbruksvarer som er sertifisert til å bli RNase gratis.

2. Tissue Fixation

  1. Fremstille 10 ml gårdbruker fiksativ (3: 1; v / v etanol: eddiksyre) i en frisk 15 ml tube på is. (Alltid forberede fersk gårdbruker fiksativ før bruk). Som et alternativ kan den ikke-tverrbindende bindemiddel etanol: eddiksyre (5: 1; volum / volum) kan brukes 18.
  2. Bruk en fin pinsett til å samle knopper på utviklingsstadiet av interesse. Umiddelbart senk knopper i det iskalde fiksativ. Bruk 10 ml fiksativ for fiksering av ~ 20 knopper eller blomster fra Arabidopsis eller Boechera. Merk: Når du bruker plantearter med større blomster, anbefales det å dissekere blomster med et barberblad for å generere mindre biter før fiksering.
    1. For å få modne Gametofytt, kastrere de 2 - 3 største blomsterknopper av inflorescence 2 dager før innhøsting.
  3. Fyll bunnen av en exsiccator med is. Åpne rørene inneholder prøvene, f.eks blomster, og plassere dem på is, enten ved direkte å sette dem inn i isen på en måte at de ikke kan velte eller ved å bruke en passende holder. Vakuum infiltrere i 15 minutter før frigjøring av vakuumet.
    1. Gjenta vakuum infiltrering en gang i 15 min.
  4. Slipp vakuum og butikken over natten (~ 12 timer) på is. Dekk isen bøtte med et lokk eller aluminiumsfolie og lagre bøtte i et 4 ° C kjøleskap rom eller for å hindre isen fra tining. Merk: forlenging av festetiden er ikke anbefalt.

3. Tissue Embedding, Thin Seksjonering, og Montering på Slides for LAM

  1. Tissue embedding.
    1. Bytt fiksativ til 70% etanol forberedt med ren etanol og RNase fritt vann. La prøvene på is inntil videre behandling. Begynn embedding av prøvene på samme dag. I sak nr vev-behandling maskin er tilgjengelig, går du videre til manuell embedding som beskrevet andre steder 9,11 og fortsetter med trinn 3.1.11.
    2. overføre forsiktig prøvene til vev embedding kassetter med en pinsett. Fast lukke kassettene. KRITISK STEP: Unngå selv delvis tørking av prøven under dette trinnet. Unngå å klemme av prøver med pinsett.
      Merk: For å merke kassettene en blyant bør brukes, helst ved å skrive på den skrå overflaten av kassetten.
    3. Oppbevar embedding kassett lastet med knopper eller blomster i 70% etanol inntil alt materiale er overført til kassetter og innebygging maskinen kan lastes. For dette formål bruke et glass farging trau fylt med 70% etanol.
    4. Ta ut kurven av vevet prosessoren fra retorten av maskinen og overfører innebygging kassettene til kurven med de skråstilte overflater som vender mot toppen og i samme retning. CRITiske STEP: Utfør denne raskt for å hindre uttørking av vev. Hvis behandlingen mange embedding kassetter samtidig, plasserer kurven i en egnet RNase gratis container fylt med 70% etanol før lasting av prøvene.
    5. Sett lokket på kurven og sett kurven tilbake i retorten. Lukk retorten.
      Merk: Vevet prosessor tørker automatisk prøvene, endres det løsningsmiddel som xylol, og gjør infiltrering med smeltet parafinvoks. Vanligvis er dette gjort over natten.
    6. Start programmet av vevet prosessoren. Anbefalte standardinnstillingene er 1 time 70% EtOH, tre ganger i en time 90% EtOH, tre ganger i en time 100% EtOH, to ganger 1 t 100% xylol, en gang 1 t 15 min 100% xylen ved værelsestemperatur, etterfulgt av infiltrering med parafinvoks to ganger i 1 time og en gang i 3 timer ved 56 ° C 11.
      Merk: For å sikre at blokker stasjonen er klar med voks smeltet, slå maskinen på flere timer før start ellerbruke timerfunksjonen til å velge omtrentlig starttid.
      Merk: Hvis vevet kan ikke behandles umiddelbart etterpå, lengre inkubasjonstid i parafinvoks ved 56 ° C er mulig i stedet for 3 timer ved 56 ° C. Se i bruksanvisningen for instrumentet. Vanligvis vil kassettene med vev automatisk forbli i smeltet voks til de "tom retorten" -kommandoen er godkjent. Hvis voks ikke er smeltet når du starter vevet prosessor, er retorten fylt med 70% etanol og programmet er fortsatt på vent til den er klar til å starte.
    7. Tøm retorten og umiddelbart overføre prøvene til en parafinvoks bad ved 56 ° C i en blokkering stasjon. Fjern lokket fra kurven og dekke parafin bad av blokkering stasjonen med lokket.
    8. Pile så mange friske balanserende magasinene på overflaten av den blokkerende stasjon oppvarmet til 56 ° C, så er det kassetter i kurven.
      Merk: En etanol fast sprittusj kan være brukd å merke bunnen av balanserings skuffene. Aceton-resistente permanente markører anbefales ikke.
    9. Bruke blokkering stasjon, fylle en forvarmet frisk plast balansering brett med smeltet parafinvoks ved 56 ° C. Løft lokket på parafin bad, plukke opp en kassett bare om gangen og overføre prøvene fra kassettene til flytende parafin voks ved 56 ° C i balansebrettet ved hjelp av en pinsett.
      KRITISK STEP: Unngå enhver herding av voks rundt prøven ved håndtering kassetten ved å jobbe raskt.
      1. Posisjonere alle prøvene i henhold til behovene ved hjelp av et preparat nål før størkning av voksen. Vanligvis er flere blomster anordnet i en balanserende brett individuelt plassert ca 1 cm i hver retning.
      2. Gjenta trinn 3.1.9 inntil alle prøver blir overført.
    10. Plasser kurven tilbake til vevet prosessor og rengjør retorten ved hjelp av et egnet program (se bruksanvisningen).
    11. Slå av vev prosessor og blokkering stasjon. Fortsett med trinn 3.1.13.
    12. I sak nr vevsinfiltrasjon maskin og ingen embedding stasjonen er tilgjengelig, kan du bruke en varmeovnen å smelte parafinvoks ved 56 ° C. På benken, fyller smeltet voks i plast balanserende skuffer, overføre prøvene til voks, og bruke forberedelse nåler til å plassere prøvene.
    13. Tillat parafinvoks for å herde ved romtemperatur i ~ 1 - 3 timer før den lagres prøvene ved 4 ° C. Prøvene kan deretter behandles ferskt eller lagres i opp til flere måneder.
  2. Utarbeidelse av tynne snitt og lysbilder for LAM.
    1. På en lys bord belyse voks blokken nedenfra, fjerne parafinvoks med prøvene fra de omkringliggende plast skuffer. Dissekere ut en kvadratisk voks blokk inneholder vev, f.eks., En knopp eller blomst, ved hjelp av en RNase frie barberblad. For å oppnå dette målet, alltid orientere prøvene mot toppen av voksblokken (også se
    2. Fremstille voks blokker med alle prøvene som skal brukes for LAM om gangen.
  3. Montere blokkene for å behandle innstøping kassetter fylt med herdet parafinvoks: smelte et lite stykke eller dråpe av parafinvoks på spissen av en egnet spatel ved hjelp av en Etanol lampe og bruker varmt voks for å feste blokken på bæreren (med innebygde vev på toppen).
    1. La voksen for å herde i minst 20 minutter ved 4 ° C.
  4. Fjerne overskytende voks som omgir prøven med et barberblad på lysbordet. Sørg for å holde en kvadratisk overflate med parallelle kanter (se figur 1).
  5. Sett varmeplate til 42 ° C.
  6. Trygt montere prøvene til mikrotomen og forberede 6 - 10 um tykke seksjoner. Se produsentens instruksjoner for bruk av mikrotom. Merk: Mens tynnere partier vil ofte gi bedre strukturell oppløsning, større mengde RNA av higher kvalitet kan oppnås med tykkere seksjoner. For cellene Boechera modne Gametofytt bruker vi 7 mikrometer som standard. Flytte heller sakte med prøvene over mikrotomkniv ofte resulterer i bedre histologi.
  7. overføre alltid parafin bånd til en lengde på ca 10 - 15 cm i en plastboks med en svart papp i bunnen før du plasserer dem i LAM lysbilder.
  8. Hvis mulig, pre-velge de delene av parafin strips som inneholder celle- eller vevstyper av interesse, for eksempel ovules, under en dissekere-omfang og kast resten.
  • Utarbeidelse av lysbilder for LAM.
    1. Plasser den nødvendige mengden av metall-innrammet lysbilder (typisk 5-10) med den flate på toppen på varmeplaten.
    2. Pipettér ~ 1 - 2 ml RNase fritt vann på plastdelen av raset. Ved hjelp av et barberblad, kutt parafin bånd i korte stykker av ca 4-5 cm lange nok til å strekke seg over plast vinduer. USE en pinsett og en forberedelse nål å ideelt sted parafin strimler parallelt med hverandre på plast Vinduer av lysbilder. Løft forsiktig lysbildet i den ene enden for å fjerne vannet og legg lysbildene tilbake.
      1. Alternativt, plasser varmeplate under en kjemisk hette. Anvende et lite volum av metanol til plast del av sleiden akkurat tilstrekkelig til å fukte overflaten (dette kan føre til en liten korrugering av lysbildene). Plasser parafin strimler på lysbildene.
        Merk: Av hensyn til giftighet, unngå bruk av metanol hvis mulig. Imidlertid gjør bruken av metanol ved dette trinnet forbedre RNA kvaliteten i tilfelle av kvaliteten oppnås ved å montere på vannet er ikke tilstrekkelig. Det er verdt å teste disse alternativene ved starten av et nytt prosjekt, som RNA kvalitet oppnås varierer med celletype og arts under etterforskning.
    3. Tørk glir over natten på varmeplate ved 42 ° C i ~ 12 timer. Dekk varmeplaten medet plastlokk som ikke berører lysbilder. Pass på at plastlokket ikke er til hinder for utveksling av luft. Til dette tar sikte på at lokket kan settes på pipettes bokser eller lignende som skal løftes.
      1. Alternativt kan redusere tørketiden til et minimum to timer eller inntil vev vises helt tørr. Reduksjon av tid fra kutting til samling kan forbedre RNA kvalitet.
    4. Under en kjemisk hette, de-voks lysbildene 2 ganger for 10 min i xylen ved hjelp av egnede glideholdere. Sørg for å fullt senke plast delen av hvert bilde bare, men å tillate fjerning av raset ved å berøre den bredere enden av metallrammen som holdes tørr.
    5. La lysbilder tørke i ~ 10 minutter under kjemisk panseret før LAM.
      Note: Slides ikke umiddelbart behandlet kan plasseres tilbake på varmeplaten ved 42 ° C med vevet vendt opp i opptil et par timer. Dette vil hindre fuktighet fra å gå på akkord RNA kvalitet inntil videre prosessering.
  • 4. Laser-assistert mikrodisseksjon (LAM)

    Merk: Fremgangsmåten for LAM vil variere med instrumentet brukes. Enkelte detaljer om denne protokollen er tilpasset et bestemt instrument og teknologi for å samle inn prøvene på en cap gjøre bruk av elektrostatiske krefter. I tillegg kan detaljene varierer også mellom ulike versjoner av programvaren. Vennligst referer til produsentens instruksjoner og brukerhåndbøker for en detaljert beskrivelse og spesifikke instruksjoner om instrument og programvare.

    1. Slå på enhetene for LAM (datamaskin, mikroskop, laser kontrollboks).
    2. Start programmet styre mikroskopet og laser.
    3. Slå på laseren ved å trykke på den tilsvarende knappen på kontrollboksen.
    4. Plassere en hette (0,5 ml, uten diffusor) inn i hetten holderen og plassere den i instrumentet.
    5. Støtt LAM lysbilde med et objektglass for mikroskopi. Pass på at den flate overflaten av lysbildet medvev festet vender glass-slide.
    6. Plasser raset i instrumentet med glass skyve under.
    7. Velg 4X Objective. I programmet velger å flytte lokket til "opp" posisjon og fortsette å gjøre en skanning av raset.
    8. Søk gjennom raset og identifisere strukturer av interesse. Finne og redde sine posisjoner på lysbildet for å være i stand til å flytte tilbake til den nøyaktige posisjonen for skjæring trinn.
    9. Velg riktig objektiv (f.eks 40X eller 60X).
    10. Om nødvendig, juster laser hastighet, fokus og laser makt, og også kalibrere scenen bevegelsen ved å henvise til bruksanvisningen for instrumentet. Når en konto er satt opp for den spesifikke vev av interesse, kan innstillingene gjenbrukes.
    11. Verifisere laser stilling ved hjelp av et enkelt skudd ved å trykke på "laser shot" -knappen av programmet, ideelt sett i en del av membranen uten vev.
      1. Hvis det er nødvendig, kalibrere laseren posisjon ved å følge the produsentens instruksjoner for instrumentet.
    12. Kontroller kalibreringen av målet ved å flytte en åpenbar struktur til alle fire hjørner av programvaren vinduet på skjermen, holde høyre museknapp. Sjekk at posisjonen av hånden i forhold til den åpenbare struktur er den samme i alle fire hjørner. Ellers kalibrere målene følgende programvareveiledningen.
    13. Med hetten i "ned" posisjon, bruk 'hand-penn "verktøy for å markere grensene til celletype eller vev av interesse, for eksempel, eggcellen. Dissekere cellen av interesse med laseren ved å trykke "klipp". Merk: Ofte seksjonering må gjentas hvis kant rundt cellen ikke var helt dissekert på en gang. I dette tilfelle anbefales det å innstille programvare for å automatisk gjøre to ganger i seksjonen som en standard.
    14. Løft lokket og gå til neste lagrede posisjon med strukturen av interesse. Gjenta trinn 4.13av den prosedyre å dissekere neste celle seksjonene inntil alle celler av interesse fra ett lysbilde er samlet inn. Pass på at lokket er plassert på en måte som den nye delen holder seg til en tom plass på hetten.
      Merk: Det anbefales å isolere større biter av vev (for eksempel deler av hele blomster eller deler av det) fra hvert lysbilde etter isolering av encellete seksjoner på en ny lue. Disse kan brukes for RNA kvalitetskontroll.
    15. Fjern lysbildet og fortsette med neste lysbilde ved å gjenta trinn 04.04 til 04.09 og 04.13 til 04.14.
    16. Gjenta trinn 4.15 og relaterte trinn inntil celletyper av interesse fra alle lysbilder har vært isolert. Merk: Det anbefales ikke å høste mer enn ~ 4-5 timer på samme cap.
    17. Inspiser cap overflaten etter LAM å ekskludere uspesifikke forurensing av prøven. Mens de ikke-dissekert vev er beskyttet med folie, kan støv feste seg til overflaten på grunn av elektrostatisk vedheft.
      1. To visuelt inspisere lokket, fjerne lysbildet fra instrumentet. Plassere lokket holderen i "ned" -posisjon og inspisere overflaten med 4X objektiv.
      2. Ved små biter av støv er synlige, fjerne dem med en liten (2 mL) pipette. Alternativt, montere lysbildet tilbake på instrumentet, plasserer lokket på en gratis del av lysbildet (ingen vev), og fullstendig ødelegge forurensning ved hjelp av laser.
    18. Lukk caps og fryse de tørre delene ved -80 ° C inntil videre bruk. Om nødvendig, kan prøvene oppbevares i opptil flere uker. Men fortsetter raskt på dette trinnet er anbefalt.

    5. RNA Isolation og kvalitetskontroll

    Merk: RNA kan isoleres ved hvilken som helst fremgangsmåte egnet for små mengder RNA. I denne protokollen er beskrevet anvendelse av en RNA-isolering kit som er angitt for små mengder RNA. Følg produsentens instruksjoner.

    1. Bruk rør med prøven festet tilhetten enten direkte eller etter fjerning fra -80 ° C.
      1. Åpne rørene og omhyggelig pipettér 11 ul av ekstraksjonsbuffer til veggen av hvert rør ved hjelp av filterspisser. Endre tips mellom prøvene.
      2. Lukk lokket og rist utvinning buffer ned til korken av røret.
      3. Plasser rørene med hetten ned i et varme ovn forvarmet til 42 ° C. Inkuber i 30 min å følge produsentens instruksjoner.
    2. Følg produsentens instruksjoner for kolonnepreparat og samle ekstraktet på bunnen av rørene.
      1. Dersom materialet fra flere enn en hette som må kombineres i en prøve, fortsett med trinn 5.1.1 - 5.1.2 individuelt for hvert rør / cap.
      2. Etterpå, basseng ekstraktene for en prøve i et rør og måle mengden av samlede ekstrakt med en pipette før tilsetning av en ekvivalent mengde av EtOH (se produsentens instruksjoner).
      3. Sørg for at mengden av EtOH tilsettes før lasting av kolonnen er lik volumet av det sammenslåtte ekstrakt.
      4. Etter RNA nedbør med EtOH, gå raskt til lasting av kolonnene følgende produsentens instruksjoner. Fortsett protokollen sammen med 100 xg sentrifugeringstrinn.
      5. Etter at innholdet i hver oppsamlingsrøret er ført gjennom kolonnen, utføre en 16.000 x g sentrifugeringstrinn i 30 sekunder for å fjerne gjennomstrømnings å følge produsentens instruksjoner.
      6. Fortsett med RNA ekstraksjon og rensing følge produsentens instruksjoner.
      7. Etter lasting av elueringsbuffer til kolonnen tillate søylen inkuberes i 1 min. Fortsett å laste rørene inn i sentrifugen følge instruksjonene i produsentens instruksjoner. NB: Et ytterligere sentrifugeringstrinn i 1 min ved 100 x g før eluering som angitt i protokollen kan øke effektiviteten av eluering.
    3. Utdrag RNA fra fortsrols (større vevssnitt) for RNA kvalitetskontroll følgende trinn 5.1 til 5.2.7 av denne protokollen.
    4. For RNA kvalitetskontroll last 1 mL ufortynnet total RNA av hver kontrollprøve på Bioanalyzer ved hjelp av en RNA Pico Chip følge produsentens instruksjoner.
      Merk: Det ekstraherte RNA kan brukes for lineær forsterkning og transkriptomet analyse ved hjelp av mikromatriser eller RNA-Seq 7,11,13,14. Ideelt sett bør den kvalitetskontroll indikere et RNA Integrity nummer (RIN) på minst 7. En rekke leverandører gi passende sett for amplifisering, er egnede eksempler gitt i 9.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Prøvepreparering og LAM er gjort i påfølgende trinn

    En rekke av på hverandre følgende trinn er nødvendig for å fremstille RNA-transkripsjonen for analyse i utvalgte celletyper ved LAM (figur 1). Dette starter med innhøstingen av blomster og umiddelbar fiksering for å sikre at RNA befolkningen forblir uendret etter høsting. Vevet er innebygd, seksjonert og montert på lysbilder. Dette tillater isolering av cellene ved LAM og sammenføring av celletypespesifikke seksjoner på en eller flere hetter (figur 1). Materialet kan fryses etterpå eller direkte behandles av RNA-ekstraksjon. Bortsett fra fordelen av LAM å være anvendelig for celletype-spesifikke analyser i både modell og ikke-modell art, forblir metoden heller tidkrevende. Minst en uke av arbeidstiden, noen ganger mer, er nødvendig for trinnene fra tissue avling til RNA ekstraksjon (figur 1). Det må tas hensyn til at ofte deler høstes i løpet av flere dager med LAM er samlet i en biologisk prøve og RNA ekstraksjon. For Boechera eggceller, er bruken av minst ~ 200 deler per prøve sterkt anbefalt, med opp til ~ 100 seksjonene isoleres per dag.

    Isolasjon av celletyper av interesse avhenger av deres synlighet i Dry §§

    Isolering av celletypespesifikke seksjoner er den mest tidkrevende trinn av protokollen. Hittil har ingen automatisering av dette trinnet er utviklet på grunn av den komplekse natur av prøvene. Identifikasjon av celler av interesse ved hjelp av et programvareverktøy er ikke mulig fordi de tørre delene har lav kontrast og tverrsnittsplanet varierer mellom prøvene på grunn av det faktum at ovuler er orientert i forskjellige vinkler wTVen på vevet (figur 2). Ikke desto mindre, den unike morfologien av det modne hunn gametofytt med synergids, egg celle, og den sentrale celle (antipodal celler degenerert før befruktning) gjør det mulig å entydig identifikasjon av eggceller av forskeren (figur 2B, C; figur 3). Faktisk, i Boechera divaricarpa, eggcellen krymper ofte litt under fremstilling og således skiller fra det omgivende vev, en funksjon fordelaktig for isolering av egg cellepopulasjoner med høy renhet (figur 2B, C, figur 3).

    Visuell inspeksjon av Cap etter LAM er Anbefaler

    Visuell inspeksjon av hetten overflaten etter LAM tillater identifisering av eventuelle forurensninger i prøven, for eksempel ved støv. I tillegg, er det nyttig å sikre at den i seg selvctions holde seg til cap, som tidvis deler tapt under prosedyren. Vanligvis mange utvalgte deler, f.eks eggceller, kan sees på en cap etter flere timer med LAM.

    Den Etablert Arbeidsflyt reproduserbart Resultater i god RNA kvalitet

    Fra celletypespesifikke LAM isoleringer fra kvinnelige Gametofytt, totalt RNA beløpene er bare i lav ng serien. Dette begrenser mengden av RNA som gjør det nødvendig å anvende en representativ styre isolert fra større vev av hvert lysbilde som en approksimasjon for RNA kvalitetskontroll etter LAM. Dette er demonstrert ved en sammenligning av celletype-spesifikk RNA fra B. divaricarpa eggceller som sammenlignet med kontroller fra større vevsområder isolert fra de samme lysbilder, indikerer tilsvarende RNA-kvalitet (figur 4A, B). Ved hjelp av denne metoden, en god til høy RNA kvalitet med RIN tall & #8805; 7 er reproduserbart oppnådd. RNA kvalitet oppnådd var egnet for celletype-spesifikk RNA-Seq, som fører til identifisering av 236 gener uttrykt i småarter eggcelle, men ikke i den småarter sentrale celle, synergid celle, eller småarter første celle, og heller ikke i cellene eller den moden seksuell gametofytt av vårskrinneblom (figur 5) 7.

    Figur 1
    Figur 1:. Scheme av trinnene i protokollen, noe som indikerer minimal tid Må per trinn Fiksering av blomster eller vev av interesse er gjort over natten. Den neste dag blir innebygging i gang, som går over natten, noe som resulterer i innleiret materiale på dag 3 av protokollen. På dag 3 mikrotom seksjoner med start fra innebygd prøver i voks blokker kan genereres. Båndene på de tynne parafinsnitt er montert på objektglass og tørkes over natten. Påe til flere dager med LAM vil være nødvendig for å få nok materiale for en biologisk replikere. Etter RNA isolering og kvalitetskontroll, kan biblioteket forberedelse for RNA-Seq bli utført for å forberede transkriptomet analyse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figur 2
    Figur 2: eggceller er klart identifiserbar i tynne deler, på grunn av den karakteristiske morfologi Female gametofytt (A) Skjematisk tegning av modne kvinnelige gametofytt (Polygonum type) (B - C) Tynne seksjoner gjennom ovules husing kvinnelige Gametofytt i.. Boechera divaricarpa. Eggceller er klart synlig. På grunn av morfologien av den kvinnelige gametofytt ofte ikke alle celletyper (eggcellen: e, synergids: s, Sentral celle: cc) er synlige i en enkelt seksjon. Skala barer = 50 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figur 3
    Figur 3. LAM av eggceller av Boechera divaricarpa. A og C. Seksjon for den modne gametofytt av B. divaricarpa på 7 pm før og, B og D, etter mikrodisseksjon med laserenhet (eggcellen: e, synergids: s, sentral celle: cc). Skala barer = 50 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figur 4
    <strong> Figur 4. RNA Quality of Laser-dissekert eggceller og kontroll §§. (A) RNA kvalitet som analyseres fra eggcellen seksjoner i forhold til (B) større vev områder høstet fra de samme lysbildene som kontroller. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figur 5
    Figur 5. Identifisering av gener uttrykkes bare i småarter eggcellen i forhold til Celler av småarter og Seksuelle Eldre Gametofytt eller småarter Initial Cell. Heatmap av 236 gener uttrykt i småarter eggcellen, men verken i småarter sentrale cellen, synergid celle eller småarter første cellen i B. gunnisoniana eller cellene i modne seksuell gametofytt av A. thaliana 7 Hierarkiskclustering av prøver og gener var basert på Euklidsk avstand og hierarkisk agglomerative clustering. Red betegner høy uttrykk og svart lav uttrykk. Fargene er skalert per rad. apo. småarter Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Protokollen er egnet for ulike celler og vev Typer

    LAM kombinert med transkriptomet analyser av mikromatriser eller RNA-Seq er et verdifullt verktøy for å få innsikt i bestemte mønstre av genaktivitet som regulerer utvikling eller fysiologiske prosesser 7-11,13,14. Imidlertid egnetheten av denne metode for en gitt celletype er kritisk avhengig av strukturelle problemer. Cellen må være godt synlig og entydig identifiserbare i de tørre delene som brukes for LAM. I Boechera divaricarpa, morfologi av gametofytt gir en enkel identifisering av eggcellen (Figur 2, Figur 3). Til slutt, hastigheten på isolering av en spesifikk cellepopulasjon er også avhengig av frekvens ved hvilken celletype kan finnes på en slide, som utveksler slides og skanning nye lysbilder er tidkrevende trinn. Gitt at avhengig av celletypen, i det minste 200-250 celle sektioner bør samles per prøve, egnetheten av fremgangsmåten for en viss inklusjon stor grad avhenger av tidskravene for LAM trinnet.

    I tillegg, avhengig av morfologien av vevet, kan det være fordelaktig med hensyn til strukturen for å redusere tykkelsen av seksjonene til 6 um. På tilsvarende måte tykkere deler av en ideell ≥ 8 um resulterer typisk i økt mengde RNA og RNA av litt høyere kvalitet fra den samme mengde av vevssnitt. I tillegg bør cellene av interesse har minst en diameter på 8 - 10 um for å sikre isolasjon av LAM gjennomførbart.

    I prinsippet kan den protokoll som er beskrevet her kan justeres til forskjellige celletyper og vev fra fjernere beslektede arter. Imidlertid kan RNA kvalitet variere til og med mellom forskjellige celletyper av samme art 7,10,13. Denne protokollen er justert basert på små og kritiske celletyper. Dermed kan det nå påføres en broader utvalg av prøver uten ytterligere justeringer. Små modifikasjoner i protokollen kan likevel være nødvendig, avhengig av celletype og art som undersøkes. Det anbefales å først bruke både alternative fiksativ (se protokoll 1.1) når du setter opp metoden for en ny art eller celletype for en sammenligning av morfologi og RNA kvalitet.

    I prinsippet kan protokollen tilpasses og utført med ulike instrumenter som egner seg for laser mikrodisseksjon 9. Imidlertid må det bemerkes at de instrumenter som varierer både i lasereffekten og den minimale bredde av laserstrålen som kan bli anvendt, så vel som i teknologien for prøvetaking. Spesielt for isolering av små celler og vev områder, lasere som resulterer i en smal laserbane er bedre egnet. Laserstrålen av instrumentet vi bruker er ganske fine (~ 1 um bred) og gjør det mulig for disseksjon av små celler. Prøvetakingen teknologi for innsamling cells på et klebrig cap overflate ved elektrostatisk adhesjon er særlig fordelaktig for små celletyper og isolering av enkeltcelleseksjoner. Dette minimerer risikoen for prøven tap av elektro effekter.

    RNA Kvalitet innhentet er viktige for videre Transkripsjon Analyser

    En av de mest kritiske punktene for vellykket RNA-Seq bibliotek forberedelse er RNA kvalitet. Mens flere leverandører av forsterkersett optimalisert deres teknologi for RNA av enda lavere integritet, og kvaliteten av de data som oppnås etter transkriptomet analyse av enten mikromatriser eller RNA-Seq øker vanligvis med kvaliteten av input RNA. Ved hjelp av denne etablerte protokoll, var god og meget reproduserbar RNA kvalitet for forskjellige utviklingsstadier av den kvinnelige reproduktive vev og kimlinje i Arabidopsis og Boechera erholdt (for eksempel figur 4). Selv om fremgangsmåten er anvendeligogså for mer fjernt beslektede arter (f.eks, tomat, upublisert), må det tas hensyn til at små optimaliseringer eller modifikasjoner som kan være nødvendig, avhengig av arten, vevstype, og til og med laboratoriemiljø som, for eksempel, en høy luftfuktighet kan kompromittere RNA integritet under lysbilde forberedelse og LAM.

    Et kritisk punkt i protokollen er monteringen av seksjonert voks striper som inneholder prøvene til lysbildene. Her, særlig kontakt til vann er et kritisk trinn. Mens erstatte vann med EtOH ikke fører til noen vesentlig forbedring av RNA integritet etter isolering (upublisert), erstatning av vann med metanol gjør. Imidlertid methanol bare skal administreres under kjemisk hette og med stor forsiktighet. Avhengig av prøvetypen, som et alternativ til bruk av metanol, kan tørketiden etter montering med vann bli redusert til ~ 2 timer (se 3.3.3.1), som resulterer i like god RNA kvalitet.Utføre en studie for å teste RNA kvaliteten oppnås ved å montere enten på vann eller metanol for celletype og arter av interesse anbefales ved starten av et nytt prosjekt.

    LAM er en kraftig teknologi for Transkripsjon Analyser

    Avslutningsvis har vi lykkes optimalisert og anvendt en kombinasjon av LAM og celletype-spesifikke transkriptomet analyse av mikromatriser og RNA-Seq til ulike celler i seksuell og småarter germline avstamning i Arabidopsis thaliana og Boechera spp., Og dermed gir komparative transkripsjons analyser (se også figur 5) 7,11,13,14. Metoden som er beskrevet bærer en rekke fordeler i forhold til andre teknologier som lar celletype-spesifikk transkripsjonen analyse. Viktigere, avhengig av recognizability av celletyper eller vev av interesse i seksjonen, det kan brukes for å sjeldne celletyper, både modellenog ikke-modell arter, for eksempel celler av de modne hunn gametofytt i Boechera spp., eller den kan også brukes til å isolere cellulære domener, for eksempel, polare halvdeler av celler 19. Lignende søknader vil ikke være mulig med andre metoder som er avhengige av fluorescerende aktivert sortering av celler eller kjerner (FACS / fans) 10.

    En stor ulempe ved fremgangsmåten er den tidskrav. Mens fiksering og forankring ikke kreve utvidet hands-on tid og kan samtidig blitt gjort for en stor mengde av blomster, LAM som sådan er meget tidskrevende, og for en celletype-spesifikk analyse, typisk 3 dager til 3 uker etter LAM (i gjennomsnitt fem timer per dag på lasermikroskop) må planlegges. I denne forbindelse er det nyttig å gjøre noen pre-tester for hastigheten for isolering av spesifikke celletype rettet til riktig utforming studien. I tillegg, selv når denne er optimalisert protokollen, forsøk for å teste kvaliteten RNA er sterkt recommended.

    Oppsummert er LAM et kraftig verktøy for transkripsjons analyse ved oppløsning av individuelle celletyper eller underdomener av celler, som ikke kan oppnås ved hjelp av alternative eksisterende metoder. I dette henseende, bærer det et stort potensial for å tillate analyser, for eksempel, av utviklingsprosesser, med en meget høy tidsmessig og romlig oppløsning. Dette ble eksemplifisert ved analysene av transcriptomes celler på alle viktige skritt for seksuell og småarter reproduksjon i Arabidopsis og Boechera 7,11,13,14.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Ethanol VWR 1,009,861,000 absolute EMPROVE Ph Eur,BP,USP
    15 ml falcon centrifuge tubes VWR 62406-200
    2100 Bioanalyzer Agilent G2939AA
    Acetic Acid Applichem A3686,2500 100% Molecular biology grade
    Ambion Nuclease free water life technologies AM9932
    ASP200 S Leica 14048043624 tissue processor 
    black cardboard can be purchased in special paper shops
    DNA- and RNAse-free Frame Slides Micro Dissect GmbH 1, 4 µm PET-membrane; can also be purchased from Leica
    Dumond Forceps Actimed 0208-5SPSF-PS
    ethanol lamp
    exsiccator Sigma-Aldrich Z354074-1EA Nalgene Vaccuum Dessicator or similar equipment
    filter tips 10 µl Axon Lab AG AL60010 can be replaced by similar tips
    filter tips 1,000 µl Axon Lab AG AL60010 can be replaced by similar tips
    filter tips 20 µl Axon Lab AG AL60020 can be replaced by similar tips
    filter tips 200 µl Axon Lab AG AL60200 can be replaced by similar tips
    forceps precision VWE 232-1221
    glass slide holder Huber & Co.AG 10.0540.01 Färbekästen nach Hellendahl
    glass staining trough Huber & Co.AG 10.0570.01 Färbekasten
    Heated Paraffin Embedding Module Leica Leica Leica EG 1150 H blocking station, similar devises are suitable
    Heating and Drying Table Medax 15501 other models and/or suppliers are suitable
    ice bucket VWR ice bucket with lid  10146-184 similar buckets equally suitable
    light table UVP An Analytical Jena Company TW-26  white light transluminator
    microscope slide Thermo Scientific 10143562CE cut edges
    microtome blade Thermo Scientific FEAHS35 S35 microtome blade disposable
    MMI Cell Cut Plus Instrument MMI (Molecular Machines and Industries)
    Non-stick, RNAse free Microfuge tubes, 2 ml life technologies AM12475
    Paraplast X-TRA Roth X882.2 for histology
    PicoPure RNA Isolation Kit life technologies KIT0204 Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit
    plastic balancing trays Semadeni AG 2513
    plastic box Semadeni AG 2971 Plastikdose PS
    plastic lid for heating plate homemade
    preparation needle VWR 631-7159
    RNA 6000 Pico Kit Agilent 5067-1513
    RNAse free microfuge tubes life technologies AM12400
    RNAse ZAP Decontamination Solution life technologies AM9780
    Semi-automated Rotary Microtome  Leica RM2245 similar devices are equally suitable
    Tissue Loc Histo Screen Cassettes Thermo Scientific C-1000_AQ similar cassettes of other suppliers are suitable
    Tubes with adhesive lid, without diffusor 500 µl  MMI (Molecular Machines and Industries) 50204
    Xylol (Isomere) ROTIPURAN VWR 4436.2 min. 99%, p.a., ACS, ISO SP
    process embedding cassettes Leica 14039440000 Leica Jet Cassette I without lid
    Universal Oven Memmert UF55 other models and/or suppliers are suitable

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Maheshwari, P. An Introduction to the Embryology of Angiosperms. , McGraw-Hill. New York. (1950).
    2. Willemse, M. T. M., Van Went, J. L. The female gametophyte. Embryology of Angiosperms. Johri, B. M. , Springer-Verlag. Berlin. 159-196 (1984).
    3. Koltunow, A. M., Bicknell, R. A., Chaudhury, A. M. Apomixis: Molecular strategies for the generation of genetically identical seeds without fertilization. Plant Physiol. 108, 1345-1352 (1995).
    4. Vielle-Calzada, J. P., Crane, C., Stelly, D. M. Apomixis - the asexual revolution. Science. 274, 1322-1323 (1996).
    5. Grossniklaus, U., Koltunow, A., van Lookeren Campagne, M. A bright future for apomixis. Trends Plant Sci. 3, 415-416 (1998).
    6. Schmidt, A., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. Plant germline formation: molecular insights define common concepts and illustrate developmental flexibility in apomictic and sexual reproduction. Development. 142, 229-241 (2015).
    7. Schmidt, A., et al. Apomictic and sexual germline development differ with respect to cell cycle, transcriptional, hormonal and epigenetic regulation. PLOS GENET. 10, e1004476 (2014).
    8. Okada, T., et al. Enlarging cells initiating apomixis in Hieractium praealtum transition to an embryo sac program prior to entering mitosis. Plant Physiol. 163, 216-231 (2013).
    9. Wuest, S. E., Grossniklaus, U. Laser-assisted microdissection applied to floral tissues. Methods Mol Biol. 1110, 329-344 (2014).
    10. Wuest, S. E., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. Cell-specific expression profiling of rare cell types as exemplified by its impact on our understanding of female gametophyte development. Curr Opin Plant Biol. 16 (1), 41-49 (2013).
    11. Wuest, S. E., et al. Arabidopsis female gametophyte gene expression map reveals similarities between plant and animal gametes. Curr Biol. 20, 1-7 (2010).
    12. Cai, S., Lashbrook, C. C. Laser capture microdissection of plant cells from tape-transferred paraffin sections promotes recovery of structurally intact RNA for global gene profiling. Plant J. 48 (4), 628-637 (2006).
    13. Schmidt, A., Wuest, S. E., Vijverberg, K., Baroux, C., Kleen, D., Grossniklaus, U. Transcriptome analysis of the Arabidopsis megaspore mother cell uncovers the importance of RNA helicases for plant germ line development. PLOS BIOL. 9, e1001155 (2011).
    14. Schmid, M. W., Schmidt, A., Klostermeier, U. C., Barann, M., Rosenstiel, P., Grossniklaus, U. A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA sequencing. PLOS ONE. 7, e29685 (2012).
    15. Mau, M., et al. Hybrid apomicts trapped in the ecological niches of their sexual ancestors. Proc Natl Acad Sci.U S A. 112 (18), 2357-2365 (2015).
    16. Aliyu, O. M., Seifert, M., Corral, J. M., Fuchs, J., Sharbel, T. F. Copy number variation in transcriptionally active regions of sexual and apomictic Boechera. demonstrates independently derived apomictic lineages. Plant Cell. 25 (10), 3808-3823 (2013).
    17. Corral, J. M., et al. A conserved apomixis-specific polymorphism is correlated with exclusive exonuclease expression in premeiotic ovules of apomictic boechera species. Plant Physiol. 163 (4), 1660-1672 (2013).
    18. Deeken, R., Ache, P., Kajahn, I., Klinkenberg, J., Bringmann, G., Hedrich, R. Identification of Arabidopsis thaliana. phloem RNAs provides a search criterion for phloem-based transcripts hidden in complex datasets of microarray experiments. Plant J. 55, 746-775 (2008).
    19. Schmid, M. W. Genome Scale Quantitative Biology in Arabidopsis thaliana. , University of Zürich. PhD Thesis 40-104 (2015).

    Tags

    Plant Biology , Celletype-spesifikke kvinnelig germline gametofytt laser-assistert mikrodisseksjon anlegg reproduksjon RNA kvalitet transkriptom
    Laser-assistert mikrodisseksjon (LAM) som et verktøy for Transkripsjonell Profilering av individuelle celletyper
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Florez Rueda, A. M., Grossniklaus,More

    Florez Rueda, A. M., Grossniklaus, U., Schmidt, A. Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types. J. Vis. Exp. (111), e53916, doi:10.3791/53916 (2016).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter