Introduction
I transkriptions studier som utförts på vävnadsnivå, är transcriptomes av högspecialiserade men sällsynta celltyper ofta maskeras av rikligare omgivande celler. Ett exempel för sådana högspecialiserade celltyper är cellerna i det kvinnliga reproduktiva härstamning (arvslinjen) i växter. Den kvinnliga könsceller anges i utvecklings fröämnen, föregångarna av frön inuti gynoecium av blomman 1,2. Den megaspore modercellen (MMC) är den första cellen i den kvinnliga könsceller. Den genomgår meios för att bilda en tetrad av reducerade megaspores. Typiskt, bara en av dessa megaspores lever och delar mitotiskt utan cytokines, det vill säga i en syncytium. Dessa mitoses följs av cellularization att bilda den mogna gametofyten, som vanligtvis består av fyra celltyper: tre antipodals, två synergid celler, ägg, och den centrala cellen. Ägg och centrala celler är de kvinnliga könsceller som får befruktas av två spermier under double befruktning för att ge upphov till embryot och frövitan av utvecklingsländerna utsäde 1,2. I den sexuella modellsystemet Arabidopsis thaliana, endast ~ 50 frön utvecklas per blomma medan cirka 50-80 frön utvecklas per blomma i närbesläktade släktet indiantravar. Således, den kvinnliga könsceller består av endast ett fåtal högt specialiserade celltyper, vilket gör den till en utmärkt modell för att studera utvecklingsprocesser, såsom cell specifikation och differentiering.
Dessutom kan insikter i genreglerande processer som styr anläggningen reproduktion vara av Applied Value. I växter, kan både sexuell och asexuell fortplantning genom frön (apomixis) inträffa. Medan sexuell reproduktion genererar genetisk mångfald i en population, apomixis leder till bildandet av klon avkommor som är genetiskt identisk med moderplantan. Därför har apomixis stor potential för tillämpningar inom jordbruk och utsädesproduktion, som även komplexa moderns genotyper kanhållas oförändrad under flera generationer 3,4,5. Eftersom apomixis inte förekommer naturligt i några större grödor, är konstruktionen av apomixis i grödor av stort intresse 3,4,5. Detta är dock långsiktiga målet svårt att uppnå eftersom det underliggande genetiska och molekylära grunden för apomixis inte förstås tillräckligt detaljerat sex.
För att få insikt i transkriptions grunden styr apomiktiska reproduktion, celltyp-specifik transkriptionsprofilering med hjälp av laser-assisted microdissection (LAM) och nästa generations sekvensering (NGS) representerar en mycket kraftfull metod 7,8. LAM har först fastställts för djur och biomedicinsk forskning. Under de senaste åren LAM har också använts för växtbiologi 6,9,10. I motsats till andra metoder som möjliggör profilering av enskilda cell- och vävnadstyper, inte LAM inte kräva generering av markörlinjer 6,9,10. Därför kan det vara appljugit för någon cell eller vävnadstyp utan molekylär kunskap. En annan fördel med LAM är att den kan appliceras på vilken celltyp som helst så länge som cellen kan redovisas i torra avsnitt baserat på befattning och / eller strukturella egenskaper. LAM har den ytterligare fördelen att fixerade vävnader används, vilket förhindrar förändringar i transkriptionsprofilen under bearbetningen.
Vävnaden av intresse, t.ex., blom vävnad, är fixerad i ett icke-tvärbindande fixativ innan inbäddning i paraffinvax. Inbäddning i paraffin kan göras manuellt, efter etablerade protokoll 9,11. Emellertid har användningen av en automatiserad vävnadsprocessor för dehydrering och infiltration med vaxet resulterar i allmänhet i högre reproducerbarhet när det gäller bevarande av RNA kvalitet och vävnads morfologi. Den alternativa strategin att bädda vävnader i harts har också med framgång använts för cell typspecifika analyser av LAM 8. Emellertid har användningen av en autompade vävnadsprocessor för inbäddning i vax är mycket tidseffektivt, så många prover kan behandlas samtidigt kräver ett minimum av hands-on tid. Även typiskt ingen signifikant förlust av RNA kvalitet inträffar under fixering och inbäddning, framställning av tunna sektioner med mikrotom och i synnerhet montering på frameslides används för LAM fortfarande ett kritiskt steg för att bevara RNA kvalitet. Detta har tidigare noterats och användning av ett system band överföring har beskrivits att resultera i bättre RNA kvalitet i detta steg 12. Men lägger detta en extra tidskrävande steg under framställningen av bilderna och även kräver speciell utrustning. Den optimerade protokoll beskrivs nedan reproducerbart producerar RNA som är av tillräcklig kvalitet för transkriptionell profilering med GeneCHIPs och Next Generation Sequencing (NGS) närmar 7,11,13,14. Dessutom, med laser microdissection mikroskop som används, är en hög renhet av de isolerade celltyper routinely producerade 7,11,13,14.
Släktet indiantravar är ett utmärkt modellsystem för att studera de viktigaste stegen av apomiktiska reproduktion. I indiantravar har en mängd olika sexuella och apomiktiska anslutningar identifierats och kan användas för jämförande analyser 15,16,17. Vid en jämförelse av celltyp-specifika transcriptomes av celler från den kvinnliga könsceller från sexuell Arabidopsis och apomiktiska indiantravar, identifierade vi gener och vägar som differentiellt uttrycks, därigenom identifiera nya aspekter av regleringsprocesser som styr apomixis 7. Dessutom verifierade denna studie lämpligheten LAM för celltyp-specifik transkriptions analyser av små och sällsynta celltyper. Vi har redan använt detta protokoll för analys av olika celltyper i en mängd olika växtarter, men art- och vävnadsspecifika ändringar i protokollet kan krävas i vissa fall.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: Detta protokoll beskriver vävnadspreparat, laser assisterad microdissection, och RNA-extraktion för transkriptionsprofilering. Använd alltid handskar i alla steg i protokollet. Studera och överväga säkerhetsanvisningar för varje kemikalie som används. Framför allt kom ihåg att Xylol är skadligt och kan tränga handskar och att metanol är giftigt. För alla instrument som används, hänvisas till bruksanvisningar i enlighet därmed.
1. Borttagning av RNAse aktivitet från Glas och annan utrustning
- Före användning, lindas varje glasvaror i aluminiumfolie före bakning för ~ 8 timmar vid 180 ° C för att säkerställa RNAse fri kvalitet.
- Behandla eventuella metallytor (t.ex., pincett) såväl som arbetsbänken och värmeplattan med en lämplig RNAse dekontamineringslösning. Efteråt, tvätta ytorna med RNas-fritt vatten för att avlägsna dekontamineringslösningen. Därefter rengöra ytorna ytterligare med 70% EtOH.
- Använd alla plastic förbruknings (t.ex. rör) helt nya utan någon förbehandling. Om tillgängligt, använd plastförbrukningsartiklar som är certifierade att RNas-fritt.
2. Vävnads Fixering
- Förbered 10 ml av bondens fixativ (3: 1; volym / volym etanol: ättiksyra) i en fräsch 15 ml rör på is. (Förbereda alltid färskt bondens fixativ före användning). Som ett alternativ, den icke-tvärbindande fixativ etanol: ättiksyra (5: 1; volym / volym) kan användas 18.
- Använd en fin pincett för att samla knoppar på utvecklingsstadiet av intresse. Omedelbart dränka knoppar i den iskalla fixativ. Använd 10 ml fixativ för fixering av ~ 20 knoppar eller blommor från Arabidopsis eller indiantravar Anm. Vid användning av växtarter med större blommor rekommenderas att dissekera blommor med ett rakblad för att generera mindre bitar före fixering.
- För att erhålla mogna gametofyter, emasculate de 2 - 3 största blomknoppar av den inflorescence 2 dagar före skörd.
- Fyll botten av en exsickator med is. Öppna rören innehållande proven, t.ex., blommor, och placera dem på is, antingen genom att direkt sätta dem in i isen på ett sätt att de inte kan ramla omkull eller genom användning av en lämplig hållare. Vakuum infiltrera i 15 min före frisättning av vakuumet.
- Upprepa vakuuminfiltrering gång under 15 min.
- Släpp vakuumet och lagra över natten (~ 12 timmar) på is. Täck ice hink med ett lock eller aluminiumfolie och lagra skopan i en 4 ° C rum eller kylskåp för att förhindra isen från upptining. Notera: Förlängning fixeringstiden rekommenderas inte.
3. Tissue Bädda, Thin Sektione och montering på objektglas för LAM
- Vävnads inbäddning.
- Utbyta fixativ till 70% etanol framställd med ren etanol och RNAse fritt vatten. Lämnar proverna på is tills vidare behandling. starta embedding av proverna samma dag. I fall ingen vävnadsbearbetningsmaskin är tillgänglig, fortsätt till manuell inbäddning som beskrivs på annat håll 9,11 och fortsätta med steg 3.1.11.
- överföra försiktigt proverna till vävnads bädda kassetter med en pincett. Ordentligt stänga kassetterna. Kritiskt steg: Undvik även partiell torkning av provet under detta steg. Undvik att klämma av prover med pincett.
Notera: För att märka kassetterna en penna bör användas, helst genom att skriva på den lutande ytan av kassetten. - Förvara inbäddning kassett med knoppar eller blommor i 70% etanol tills allt material överförs till kassetter och inbäddning maskinen kan laddas. För detta ändamål använder en glas färgning tråg fyllt med 70% etanol.
- Avlägsna korgen med de vävnadsprocessor från retorten av maskinen och överföra inbäddningsrestriktioner kassetterna till korgen med de lutande ytor som vetter mot den övre och i samma riktning. CRITiska STEG: Utför detta snabbt för att förhindra uttorkning av vävnaderna. Om bearbetning många bädda kassetter på en gång, placera korgen i en lämplig RNAse fri behållare fylld med 70% etanol före lastning proverna.
- Sätt på locket på korgen och sätta korgen tillbaka i retorten. Stäng retorten.
Obs! Vävnadsprocessor torkar automatiskt proverna ändrar lösningsmedlet Xylol, och gör infiltration med smält paraffin. Typiskt görs detta över natten. - Starta programmet för vävnadsprocessor. Rekommenderade standardinställningar är en hr 70% EtOH, tre gånger 1 timme 90% EtOH, tre gånger 1 hr 100% EtOH, två gånger en timme 100% Xylol, en gång en timme 15 min 100% Xylol vid rumstemperatur, följt av infiltration med paraffinvax två gånger under 1 h och en gång under 3 h vid 56 ° C 11.
Obs: För att säkerställa att den blockerande stationen är klar med vaxet smälte, stänga av maskinen på flera timmar innan start ellerAnvänd timerfunktionen för att välja den ungefärliga starttiden.
Obs: Om vävnaden inte kan behandlas direkt efteråt, längre inkubationstider i paraffinvax vid 56 ° C är möjliga i stället för 3 h vid 56 ° C. Se bruksanvisningen för instrumentet. Vanligtvis kommer kassetterna med vävnaderna automatiskt kvar i smält vax till "tom retort" kommandot godkänns. Om vaxet inte smälts vid start av vävnadsprocessor är retorten fylld med 70% etanol och programmet kvar på is tills redo att börja. - Tömma retorten och omedelbart överföra proven till ett paraffinvax bad vid 56 ° C i en blockeringsstation. Ta bort locket från korgen och täcka paraffin bad av blockeringsstation med dess lock.
- Lugg så många färska balanserings brickor på ytan av den blockerande stationen upphettades till 56 ° C som det finns kassetter i korgen.
Obs: En etanolresistenta permanent markör kan användasd att märka botten av balanseringsfacken. Acetonbeständig permanenta markörer rekommenderas inte. - Med hjälp av blockeringsstationen, fylla en förvärmd färsk plast balansering bricka med smält paraffin vid 56 ° C. Lyft på locket av paraffin bad, plocka upp en kassett endast åt gången och överföra prover från kassetterna till flytande paraffin vax vid 56 ° C i balanseringsfacket med hjälp av en pincett.
Kritiskt steg: Undvik härdning av vax som omger provet vid hantering av kassetten genom att arbeta snabbt.- Placera alla prover enligt de behov som använder ett preparat nål innan härdning av vaxet. Typiskt är flera blommor arrangerade i en balanseringsfacket individuellt placerade ca 1 cm i varje riktning.
- Upprepa steg 3.1.9 tills alla prover överförs.
- Placera korgen tillbaka till vävnadsprocessor och rengör retorten med hjälp av ett lämpligt program (se instruktionsboken).
- Stäng av vävnadsprocessor och blockerande station. Fortsätt med steg 3.1.13.
- Om ingen vävnadsinfiltration maskin och ingen inbäddning station är tillgänglig, använd en värmeugn för att smälta paraffin vid 56 ° C. På bänken, fylla smält vax i plastbalanserings brickor, överföra proverna till vax och använda förberedelse nålar för att placera proverna.
- Tillåta paraffinvax att härda vid rumstemperatur under ~ 1 - 3 h innan förvaring av proverna vid 4 ° C. Prover kan därefter bearbetas färsk eller lagras i upp till flera månader.
- Framställning av tunna sektioner och rutschbanor för LAM.
- På ett ljusbord som belyser vaxblock underifrån, ta bort paraffinvaxet med proverna från de omgivande plasttråg. Dissekera ut en fyrkantig vaxblock innehåller vävnaden, t ex., En knopp eller blomma, med hjälp av en RNAse fri rakblad. För detta ändamål alltid orientera proverna mot toppen av vaxet blocket (se även
- Förbereda vax block av alla prover som ska användas för LAM i taget.
- På ett ljusbord som belyser vaxblock underifrån, ta bort paraffinvaxet med proverna från de omgivande plasttråg. Dissekera ut en fyrkantig vaxblock innehåller vävnaden, t ex., En knopp eller blomma, med hjälp av en RNAse fri rakblad. För detta ändamål alltid orientera proverna mot toppen av vaxet blocket (se även
- Montera blocken för att bearbeta bädda kassetter fyllda med härdat paraffinvax: smälta en liten bit eller droppe av paraffinvax på spetsen av en lämplig spatel med hjälp av en Etanol lampa och använda varmt vax för att fixera blocket på stödet (med inbäddade vävnader överst).
- Tillåta vaxet att hårdna under åtminstone 20 min vid 4 ° C.
- Ta bort överskotts vax som omger provet med ett rakblad på ljusbordet. Se till att hålla en kvadratisk yta med parallella kanter (se figur 1).
- Ställ in värmeplattan till 42 ° C.
- Säker montera proven till mikrotomen och förbereda 6 - 10 um tjocka sektioner. Se tillverkarens instruktioner för användning av mikrotomen. Obs: Även tunnare sektioner ger ofta bättre strukturell upplösning, större mängd RNA higher kvalitet kan erhållas med tjockare sektioner. För cellerna i indiantravar mogna gametofyter använder vi 7 pm som standard. Flytta ganska långsamt med proverna över mikrotomen kniven ofta resulterar i bättre histologi.
- överföra alltid paraffin band med en längd av ca 10-15 cm i en plastlåda med en svart kartong längst ned innan du placerar dem i LAM diabilder.
- Om möjligt, i förväg välja de delar av paraffin remsor innehållande cell- eller vävnadstyper av intresse, t.ex. ovuler, under en dissekera-scope och kassera resten.
- Placera önskad mängd metall inramade diabilder (typiskt 5-10) med den plana ytan ovanpå på värmeplattan.
- Pipettera ~ 1 - 2 ml RNas-fritt vatten på plastdelen av bilden. Med hjälp av ett rakblad, skär paraffin band i korta bitar av ca 4-5 cm tillräckligt länge för att spänna plastfönster. Usyns en pincett och en förberedelse nål för att idealt placera paraffin remsorna parallellt med varandra på plastfönster i bilderna. Lyft försiktigt sliden vid en ände för att avlägsna vattnet och placera glasen tillbaka.
- Alternativt, placera värmeplattan under en kemisk huva. Applicera en liten volym metanol för att plastdelen av sliden precis tillräcklig för att väta ytan (detta kan orsaka en lätt korrugering av bilderna). Placera paraffin ränder på bilderna.
Obs: På grund av toxicitet, undvika användning av metanol om möjligt. Emellertid är användningen av metanol vid detta steg gör förbättra RNA kvalitet ifall kvaliteten uppnås genom montering på vatten är inte tillräcklig. Det är värt att testa dessa alternativ i början av ett nytt projekt, som RNA kvalitet som uppnås varierar med celltyp och art under utredning.
- Alternativt, placera värmeplattan under en kemisk huva. Applicera en liten volym metanol för att plastdelen av sliden precis tillräcklig för att väta ytan (detta kan orsaka en lätt korrugering av bilderna). Placera paraffin ränder på bilderna.
- Torka glasen över natten på värmeplattan vid 42 ° C under ~ 12 timmar. Täcka värmeplattan medett plastlock som inte vidrör glasen. Se till att plastlocket inte förhindrar utbyte av luft. För detta ändamål locket kan placeras på pipet lådor eller liknande att lyftas.
- Alternativt minska torktiden till minst två timmar eller tills vävnaden visas helt torr. Minskningen av tiden från skivning till samlingen kan förbättra RNA kvalitet.
- Enligt en kemisk huv, de-vax sliderna 2 gånger under 10 min i Xylol användning av lämpliga glidhållare. Se till att fullständigt dränka den plastiska delen av varje bild endast men för att tillåta avlägsnande av sliden genom att röra den bredare änden av metallram som hålls torr.
- Låt bilderna torka i ~ 10 min under den kemiska huven före LAM.
Note: Slides inte omedelbart bearbetade kan placeras tillbaka på värmeplattan vid 42 ° C med vävnaden uppåt under upp till några timmar. Detta kommer att förhindra fukt från att kompromissa RNA kvalitet tills vidare bearbetning.
4. Laserassisterad Microdissection (LAM)
Notera: Proceduren för LAM kommer att variera med det instrument som används. Vissa detaljer i detta protokoll är anpassade till ett specifikt instrument och tekniken för att samla in prover på en mössa som utnyttjar elektrostatiska krafter. Dessutom kan detaljer variera till och med mellan olika versioner av programvaran. Se tillverkarens instruktioner och användarhandböcker för en detaljerad beskrivning och specifika instruktioner om instrument och programvara.
- Slå på enheterna för LAM (dator, mikroskop, laser kontrollbox).
- Starta programmet styr mikroskopet och lasern.
- Slå på lasern genom att trycka på motsvarande knapp på kontrollboxen.
- Placera ett lock (0,5 ml, utan diffusor) in i hatthållaren och placera den i instrumentet.
- Stötta LAM glida med en glasskiva för mikroskopi. Se till att den plana ytan av objektglaset med detvävnad fäst vänd mot objektglas.
- Placera bilden i instrumentet med objektglaset under.
- Välj 4X mål. I programmet väljer att flytta locket till "upp" och fortsätta att göra en genomsökning av bilden.
- Sök igenom bilden och identifiera strukturer av intresse. Precisera och spara sina positioner på bilden för att kunna flytta tillbaka till den exakta positionen för skärningssteget.
- Välj lämpligt mål (t.ex. 40X eller 60X).
- Om det behövs, justera laserns hastighet, fokus och lasereffekt, och även kalibrera scenen rörelse genom att hänvisa till bruksanvisningen för instrumentet. När ett konto är inställd för den specifika vävnaden av intresse, kan inställningarna återanvändas.
- Kontrollera laser position genom ett enda skott genom att trycka på "laser shot" -knappen av programmet, helst i en del av membranet utan vävnad.
- Om det behövs, kalibrera laserläget genom att följa the tillverkarens anvisningar för instrumentet.
- Kontrollera kalibreringen av målet genom att flytta en uppenbar struktur till alla fyra hörn av fönstret programvara på skärmen, hålla höger musknapp nedtryckt. Kontrollera att positionen för hand med avseende på den uppenbara strukturen är densamma i alla fyra hörnen. Annars kalibrera mål efter mjukvarumanualer.
- Med locket i "ner" -läge, använd "hand-penna" verktyg för att markera gränser celltyp eller vävnad av intresse, till exempel, äggcellen. Dissekera cellen av intresse med lasern genom att trycka på "cut". Observera: Ofta sektione behöver upprepas om gränsen runt cellen inte var helt dissekeras på en gång. I detta fall är det lämpligt att ställa in programmet att automatiskt göra två upprepningar av sektionen som en standard.
- Lyfta locket och flytta till nästa sparade position med strukturen av intresse. Upprepa steg 4,13förfarandet att dissekera nästa cell sektioner tills alla celler av intresse från en bild samlas. Kontrollera att locket är placerat på ett sådant sätt att den nya sektionen fastnar på en tom position på locket.
Obs: Det rekommenderas att isolera större bitar av vävnader (t.ex. delar av hela blommor eller delar av det) från varje bild efter isolering av encelliga avsnitt om ett nytt lock. Dessa kan användas för RNA kvalitetskontroll. - Ta bilden och fortsätta med nästa bild genom att upprepa steg från 4,4 till 4,9 och 4,13 till 4,14.
- Upprepa steg 4,15 och tillhörande steg tills de celltyper av intresse från alla objektglas har isolerats. Obs: Det är inte rekommenderat att skörda längre än ~ 4-5 timmar på samma locket.
- Inspektera lockytan efter LAM att utesluta ospecifika kontaminering av provet. Medan de icke-dissekeras vävnader skyddas med folie, kan damm fastnar på ytan på grund av elektrostatisk vidhäftning.
- To visuellt inspektera locket, ta bort bilden från instrumentet. Placera locket hållaren i "ner" -läge och inspektera ytan med 4X objektiv.
- Vid små bitar av damm är synlig, ta bort dem med en liten (2 pl) pipettspets. Alternativt, montera glida tillbaka på instrumentet, placera locket på en fri del av bilden (ingen vävnader), och helt förstöra föroreningen med hjälp av laser.
- Close kapsyler och frysa de torra avsnitten vid -80 ° C tills vidare användning. Om så erfordras, kan proverna förvaras i upp till flera veckor. Emellertid fortskrider snabbt vid detta steg rekommenderas.
5. RNA-isolering och kvalitetskontroll
Notera: RNA kan isoleras genom vilken metod som helst som lämpar sig för små mängder av RNA. I detta protokoll beskrivs användning av ett RNA-isoleringskit som anges för små mängder av RNA. Följ tillverkarens instruktioner.
- Använda rören med provet fäst tilllocket antingen direkt eller efter avlägsnande från -80 ° C.
- Öppna rören och försiktigt pipettera 11 | il extraktionsbuffert till väggen i varje rör med hjälp av filterspetsar. Ändra pipettspetsar mellan prover.
- Stäng locket och skaka extraktionsbuffert ner till locket på röret.
- Placera rören med locket nedåt i en värmeugn förvärmd till 42 ° C. Inkubera i 30 min genom att följa tillverkarens instruktioner.
- Följ tillverkarens instruktioner för kolumn framställning och uppsamling av extraktet på botten av rören.
- Om material från mer än ett lock måste kombineras till ett prov, fortsätt med steg 5.1.1 - 5.1.2 individuellt för varje rör / cap.
- Efteråt, slå samman extrakten för en prov i ett rör och mäta mängden poolade extraktet med en pipett före tillsats av en ekvivalent mängd av EtOH (se tillverkarens anvisningar).
- Se till att den mängd EtOH tillsätts innan du lägger kolonnen är lika med volymen av den poolade extraktet.
- Efter RNA-utfällning med EtOH, gå snabbt till lastning av kolumnerna följande tillverkarens instruktioner. Fortsätt protokollet med 100 xg centrifugeringssteget.
- Efter innehållet i varje uppsamlingsröret har passerat genom kolonnen, utför en 16.000 xg centrifugeringssteg under 30 sekunder för att avlägsna genomflödes enlighet med tillverkarens instruktioner.
- Fortsätt med RNA-extraktion och rening i enlighet med tillverkarens instruktioner.
- Efter laddning av elueringsbufferten till kolonnen låta kolonnen inkubera under 1 min. Fortsätt att ladda rören i centrifugen följa instruktionerna i tillverkarens anvisningar. Obs: Ett ytterligare centrifugeringssteg under 1 min vid 100 xg före eluering som anges i protokollet kan öka effektiviteten i eluering.
- Extrahera RNA från fortsrols (större vävnadssnitt) för RNA kvalitetskontroll följande steg 5.1 till 5.2.7 av detta protokoll.
- För RNA kvalitetskontroll lasten 1 | il outspädd totalt RNA för varje kontrollprov på Bioanalyzer med användning av en RNA-Pico Chip enligt tillverkarens instruktioner.
Obs: Det extraherade RNA: t kan användas för linjär förstärkning och transkriptom analys med användning av mikromatriser eller RNA-Seq 7,11,13,14. Helst ska kvalitetskontroll indikera en RNA Integrity Number (RIN) på minst 7. Ett antal leverantörer tillhandahåller lämpliga kit för förstärkning, är lämpliga exempel ges i nio.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Provberedning och LAM görs i varandra följande steg
Ett antal på varandra följande steg krävs för att förbereda RNA för transkriptionsanalys från utvalda celltyper av LAM (Figur 1). Det börjar med skörden av blommor och omedelbar fixering för att säkerställa att RNA-populationen är oförändrad efter skörd. Vävnaden är inbäddad, snittades och monterades på objektglas. Detta möjliggör isolering av cellerna genom LAM och sammanslagning av celltyp specifika sektioner vid ett eller flera lock (Figur 1). Materialet kan frysas efteråt eller direkt behandlas av RNA-extraktion. Bortsett från fördelen med LAM att gälla för celltyp specifika analyser i både modell och icke-modellarter, förblir metod ganska tidskrävande. Minst en vecka av arbetstiden, ibland mer, krävs för de olika stegen från tissue skörd till RNA-extraktion (Figur 1). Det måste tas hänsyn till att ofta avsnitt som skördats under flera dagar av LAM samlas i ett biologiskt prov och RNA-extraktion. För indiantravar äggceller, är användningen av åtminstone ~ 200 sektioner per prov rekommenderas, med upp till ~ 100 sektioner isoleras per dag.
Isolering av de celltyper av intresse beror på deras synlighet i torra avsnitt
Isolering av cell typspecifika avsnitt är den mest tidskrävande steg i protokollet. Hittills har ingen automatisering av detta steg tagits fram på grund av den komplicerade karaktären av proverna. Identifiering av cellerna av intresse med användning av ett verktyg är inte möjligt eftersom de torra sektioner har låg kontrast och snittplanet varierar mellan proven på grund av det faktum att ovules är orienterade i olika vinklar wnom vävnaden (figur 2). Ändå den unika morfologin hos mogna kvinnor gametofyten med synergids, äggcell, och den centrala cellen (antipodiska celler degenererar före befruktning) möjliggör entydig identifiering av äggceller forskaren (Figur 2B, C, Figur 3). Ja, i indiantravar divaricarpa krymper äggcell ofta lite under framställning och således separerar från de omgivande vävnaderna, en funktion fördelaktig för isolering av ägget cellpopulationer vid hög renhet (Figur 2B, C, Figur 3).
Visuell inspektion av Cap efter LAM rekommenderas
Visuell inspektion av locket ytan efter LAM möjliggör identifiering av eventuella föroreningar av provet, t ex av damm. Dessutom är det till hjälp att säkerställa att den i sigTGÄRDER fastnar på locket, som ibland avsnitt vilse under förfarandet. Typiskt många valda sektioner, t.ex., äggceller, kan ses på ett lock efter flera timmar av LAM.
Den etablerade arbetsflöde Resultat reproducerbart i Good RNA kvalitet
Från cell typspecifika LAM isoleringar från kvinnliga gametofyter totala RNA beloppen endast i låg ng området. Denna begränsande mängd av RNA gör det nödvändigt att använda en representativ kontroll isolerad från större vävnader av varje bild som en approximation för RNA kvalitetskontroll efter LAM. Detta framgår av en jämförelse av celltyp-specifik RNA från B. divaricarpa äggceller jämfört med kontroller från större vävnadsområden som isolerats från samma objektglas, vilket tyder på liknande RNA kvalitet (Figur 4A, B). Med denna metod, en bra hög RNA kvalitet med RIN nummer & #8805; 7 är reproducerbart erhållas. RNA kvalitet som uppnås var lämpligt för celltyp-specifikt RNA-Seq, vilket leder till identifiering av 236 gener som uttrycks i den apomiktiska äggcellen, men inte i den apomiktiska centrala cellen, synergid cell eller apomiktiska initiala cell, och inte heller i cellerna eller den mogna sexuellt gametophyte av Arabidopsis thaliana (Figur 5) 7.
Figur 1:. Scheme of stegen i protokollet, vilket tyder på minimal tid som krävs per steg Fixering av blommorna eller vävnader av intresse sker över en natt. Nästa dag är inbäddning startas, som löper över natten, vilket resulterar i inbäddade materialet på dag 3 i protokollet. På dagen kan genereras 3 Eggen sektioner som börjar från inbäddade prover i vax block. De band av de tunna paraffinsektioner är monterade på objektglas och fick torka över natten. Påe till flera dagar av LAM kommer att krävas för att få tillräckligt med material för en biologisk replikera. Efter RNA-isolering och kvalitetskontroll, kan utföras bibliotek förberedelse för RNA-Seq att förbereda transkriptom analys. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: äggceller är tydligt identifierbara i tunna sektioner, På grund av den karakteristisk morfologi av den kvinnliga gametofyten (A) Schematisk bild av mogna kvinnliga gametofyten (Polygonum typ) (B - C) Tunna snitt genom fröämnen hyser kvinnliga gametofyter i.. indiantravar divaricarpa. Äggceller syns tydligt. På grund av morfologin hos kvinnliga gametofyten ofta inte alla celltyper (äggcell: e, synergids: s, Centrala cellen: cc) är synliga i ett enda avsnitt. Skalstrecken = 50 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. LAM av äggceller av indiantravar divaricarpa. A och C. sektionen vid mogen gametofyten B. divaricarpa vid 7 pm innan och B och D, efter microdissection med laseranordningen (äggcell: e, synergids: s centrala cell: cc). Skalstrecken = 50 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
<strong> Figur 4. RNA kvalitet Laser Dissekerad äggceller och kontrollsträckor. (A) RNA kvalitet som analyserats från äggcell sektioner jämfört med (B) större vävnadsområden som skördats från samma objektglas som kontroller. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Identifiering av gener som uttrycks endast i apomiktiska Egg cell jämfört med cellerna av apomiktiska och Sexuella Mogna gametofyter eller apomiktiska Initial Cell. Heatmap av 236 gener som uttrycks i den apomiktiska äggcellen men varken i apomiktiska centrala cellen, synergid cell eller apomiktiska initial cell av B. gunnisoniana nor cellerna i den mogna sexuella gametofyten av A. thaliana 7 Hierarkiskklustring av prover och gener baserades på euklidiska avståndet och hierarkisk agglomerativ klustring. Red betecknar hög expression och svart låg uttryck. Färger skalas per rad. apo. apomiktiska klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet är lämpliga för olika cell- och vävnadstyper
LAM kombinerat med transkriptom analyser av mikroarrayer eller RNA-Seq är ett värdefullt verktyg för att få insikt i specifika mönster av genaktivitet reglerar utvecklings eller fysiologiska processer 7-11,13,14. Emellertid är lämpligheten av denna metod för varje given celltyp kritiskt beroende av strukturella frågor. Cellen måste vara klart synliga och otvetydigt identifierbar i de torra delarna används för LAM. I indiantravar divaricarpa, morfologi gametofyten möjliggör en enkel identifiering av äggcellen (Figur 2, Figur 3). I slutändan, hastigheten på isolering av en specifik cellpopulation beror också på frekvensen vid vilken celltyp kan hittas på en bild, som utbyta bilder och skanna nya bilderna är tidskrävande steg. Med tanke på att beroende på celltypen, åtminstone 200-250 cell sektjoner bör slås samman per prov, lämplighet metoden för en viss studiedesign beror till stor del på de tidskrav för LAM steg.
Dessutom, beroende på morfologin av vävnaden, kan det vara fördelaktigt i termer av struktur för att minska tjockleken av sektionerna till 6 ^ m. På liknande sätt tjockare sektioner av idealt ≥ 8 | am resultera typiskt i högre RNA kvantitet och RNA av något högre kvalitet från samma mängd av vävnadssnitt. Dessutom bör cellerna av intresse har minst en diameter av 8-10 | j, m för att göra isolering genom LAM genomförbart.
I princip kan det protokoll som beskrivs här anpassas till olika cell- och vävnadstyper från avlägset besläktade arter. Emellertid kan RNA kvalitet varierar även mellan olika celltyper av samma art 7,10,13. Detta protokoll har justerats baserat på små och kritiska celltyper. Det kan således nu tillämpas på ett broader olika prover utan ytterligare justeringar. Små ändringar i protokollet kan dock krävas beroende på celltyp och art under utredning. Det rekommenderas att först använda både alternativa fixativ (se protokoll 1,1) när du ställer in metoden för en ny art eller celltyp för en jämförelse mellan morfologi och RNA kvalitet.
I princip kan protokollet anpassas till och utföras med olika instrument som är lämpliga för laser microdissection 9. Emellertid måste det noteras att de instrument som varierar både i lasereffekten och den minimala bredden på laserstrålen, som kan appliceras, såväl som inom teknologin för provtagning. Särskilt för isolering av små celler och vävnadsområden, lasrar som resulterar i en smal laserbanan är bättre lämpade. Laserstrålen av instrumentet vi använder är ganska fina (~ 1 | j, m bred) och medger dissektion av små celler. Provtagnings teknik att samla in cells på en klibbig lockytan genom elektrostatisk vidhäftning är särskilt fördelaktig för små celltyper och isolering av en enda cell sektioner. Detta minimerar risken för provförlust av elektrostatiska effekter.
RNA Kvalitet Erhållen är viktiga för vidare Transkriptions Analyser
En av de mest kritiska punkterna för framgångsrik RNA-Seq bibliotek förberedelse är RNA kvalitet. Medan flera leverantörer av förstärknings kit optimerat sin teknik för RNA av ännu lägre integritet, ökar kvaliteten på de data som erhållits efter transkriptom analys av antingen mikroarrayer eller RNA-Seq typiskt med kvaliteten på ingångs RNA. Med hjälp av denna etablerade protokoll, var bra och mycket reproducerbar RNA kvalitet för olika utvecklingsstadier i de kvinnliga reproduktiva vävnader och nedärvda i Arabidopsis och indiantravar erhållits (t.ex. figur 4). Medan metoden är tillämpbarockså för mer avlägset besläktade arter (t.ex., tomat, opublicerad), måste det beaktas att små optimeringar eller modifieringar kan krävas beroende på art, vävnadstyp, och till och med laboratoriemiljön som, till exempel, en hög fuktighet kan äventyra RNA integritet under glaspreparering och LAM.
Ett kritiskt steg under protokollet är monteringen av sektionerade vax ränder innehåller prover till bilderna. Här, i synnerhet kontakten till vatten är ett kritiskt steg. Medan ersätter vatten från EtOH inte resulterar i någon väsentlig förbättring av RNA integritet efter isolering (opublicerad), gör utbyte av vatten genom metanol. Dock bör metanol endast hanteras under dragskåp och med stor omsorg. Beroende på vilken typ provet, som ett alternativ till användningen av metanol, kan torktiderna efter montering med vatten reduceras till ~ 2 h (se 3.3.3.1), vilket resulterar i lika god RNA kvalitet.Att utföra en studie för att testa RNA kvalitet uppnås genom att montera antingen på vatten eller metanol för celltyp och art av intresse rekommenderas i början av ett nytt projekt.
LAM är en kraftfull teknik för transkriptionell analyser
Sammanfattningsvis har vi framgångsrikt optimerat och tillämpat en kombination av LAM och celltyp specifik transkriptom analys av mikroarrayer och RNA-Seq till olika celler i sexuella och apomiktiska könsceller härstamning i Arabidopsis thaliana och i indiantravar spp., Vilket möjliggör jämförande transkriptions analyser (se även figur 5) 7,11,13,14. Den metod som beskrivs bär ett antal fördelar jämfört med andra tekniker som möjliggör celltyp-specifik transkriptionsanalys. Viktigare, beroende på identifierbarhet av de celltyper eller vävnader av intresse i sektionen, den kan appliceras till sällsynta celltyper av både modelloch icke-modellarter, såsom cellerna i mogna kvinnliga gametofyten i indiantravar spp., eller det kan även användas för att isolera cellulära domäner, t.ex. polära halvor av celler 19. Liknande program skulle inte vara möjligt med andra metoder som är beroende av fluorescensaktiverad sortering av celler eller kärnor (FACS / fläktar) 10.
En stor nackdel hos metoden är tidsåtgången. Medan fixering och inbäddning kräver inte förlängas hands-on tid och kan samtidigt gjorts för en stor mängd blommor, LAM som sådan är mycket tidskrävande och, för en celltyp-specifik analys, typiskt 3 dagar till 3 veckor LAM (i genomsnitt fem timmar per dag vid lasermikroskop) måste planeras. I detta avseende är det bra att göra några pre-test för hastighet av isolering av den specifika celltypen riktade skall kunna utforma studien. Dessutom, även när du använder denna optimerade protokoll, försök att testa RNA kvalitet är mycket reberömvärd.
Sammanfattningsvis är LAM ett kraftfullt verktyg för transkriptionsanalys vid upplösningen av enskilda celltyper eller ens domäner av celler, som inte skulle kunna uppnås med hjälp av befintliga alternativa metoder. I detta avseende, bär det en enorm potential för att möjliggöra analyser, till exempel av utvecklingsprocesser, med en mycket hög tids- och rumsupplösning. Detta exemplifieras av de analyser av transcriptomes av celler vid alla viktiga steg i sexuell och apomiktiska reproduktion i Arabidopsis och indiantravar 7,11,13,14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | VWR | 1,009,861,000 | absolute EMPROVE Ph Eur,BP,USP |
| 15 ml falcon centrifuge tubes | VWR | 62406-200 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2939AA | |
| Acetic Acid | Applichem | A3686,2500 | 100% Molecular biology grade |
| Ambion Nuclease free water | life technologies | AM9932 | |
| ASP200 S | Leica | 14048043624 | tissue processor |
| black cardboard | can be purchased in special paper shops | ||
| DNA- and RNAse-free Frame Slides | Micro Dissect GmbH | 1, 4 µm PET-membrane; can also be purchased from Leica | |
| Dumond Forceps | Actimed | 0208-5SPSF-PS | |
| ethanol lamp | |||
| exsiccator | Sigma-Aldrich | Z354074-1EA | Nalgene Vaccuum Dessicator or similar equipment |
| filter tips 10 µl | Axon Lab AG | AL60010 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 1,000 µl | Axon Lab AG | AL60010 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 20 µl | Axon Lab AG | AL60020 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 200 µl | Axon Lab AG | AL60200 | can be replaced by similar tips |
| forceps precision | VWE | 232-1221 | |
| glass slide holder | Huber & Co.AG | 10.0540.01 | Färbekästen nach Hellendahl |
| glass staining trough | Huber & Co.AG | 10.0570.01 | Färbekasten |
| Heated Paraffin Embedding Module Leica | Leica | Leica EG 1150 H | blocking station, similar devises are suitable |
| Heating and Drying Table | Medax | 15501 | other models and/or suppliers are suitable |
| ice bucket | VWR ice bucket with lid | 10146-184 | similar buckets equally suitable |
| light table | UVP An Analytical Jena Company | TW-26 | white light transluminator |
| microscope slide | Thermo Scientific | 10143562CE | cut edges |
| microtome blade | Thermo Scientific | FEAHS35 | S35 microtome blade disposable |
| MMI Cell Cut Plus Instrument | MMI (Molecular Machines and Industries) | ||
| Non-stick, RNAse free Microfuge tubes, 2 ml | life technologies | AM12475 | |
| Paraplast X-TRA | Roth | X882.2 | for histology |
| PicoPure RNA Isolation Kit | life technologies | KIT0204 | Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit |
| plastic balancing trays | Semadeni AG | 2513 | |
| plastic box | Semadeni AG | 2971 | Plastikdose PS |
| plastic lid for heating plate | homemade | ||
| preparation needle | VWR | 631-7159 | |
| RNA 6000 Pico Kit | Agilent | 5067-1513 | |
| RNAse free microfuge tubes | life technologies | AM12400 | |
| RNAse ZAP Decontamination Solution | life technologies | AM9780 | |
| Semi-automated Rotary Microtome | Leica | RM2245 | similar devices are equally suitable |
| Tissue Loc Histo Screen Cassettes | Thermo Scientific | C-1000_AQ | similar cassettes of other suppliers are suitable |
| Tubes with adhesive lid, without diffusor 500 µl | MMI (Molecular Machines and Industries) | 50204 | |
| Xylol (Isomere) ROTIPURAN | VWR | 4436.2 | min. 99%, p.a., ACS, ISO SP |
| process embedding cassettes | Leica | 14039440000 | Leica Jet Cassette I without lid |
| Universal Oven | Memmert | UF55 | other models and/or suppliers are suitable |
References
- Maheshwari, P. An Introduction to the Embryology of Angiosperms. , McGraw-Hill. New York. (1950).
- Willemse, M. T. M., Van Went, J. L. The female gametophyte. Embryology of Angiosperms. Johri, B. M. , Springer-Verlag. Berlin. 159-196 (1984).
- Koltunow, A. M., Bicknell, R. A., Chaudhury, A. M. Apomixis: Molecular strategies for the generation of genetically identical seeds without fertilization. Plant Physiol. 108, 1345-1352 (1995).
- Vielle-Calzada, J. P., Crane, C., Stelly, D. M. Apomixis - the asexual revolution. Science. 274, 1322-1323 (1996).
- Grossniklaus, U., Koltunow, A., van Lookeren Campagne, M. A bright future for apomixis. Trends Plant Sci. 3, 415-416 (1998).
- Schmidt, A., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. Plant germline formation: molecular insights define common concepts and illustrate developmental flexibility in apomictic and sexual reproduction. Development. 142, 229-241 (2015).
- Schmidt, A., et al. Apomictic and sexual germline development differ with respect to cell cycle, transcriptional, hormonal and epigenetic regulation. PLOS GENET. 10, e1004476 (2014).
- Okada, T., et al. Enlarging cells initiating apomixis in Hieractium praealtum transition to an embryo sac program prior to entering mitosis. Plant Physiol. 163, 216-231 (2013).
- Wuest, S. E., Grossniklaus, U. Laser-assisted microdissection applied to floral tissues. Methods Mol Biol. 1110, 329-344 (2014).
- Wuest, S. E., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. Cell-specific expression profiling of rare cell types as exemplified by its impact on our understanding of female gametophyte development. Curr Opin Plant Biol. 16 (1), 41-49 (2013).
- Wuest, S. E., et al. Arabidopsis female gametophyte gene expression map reveals similarities between plant and animal gametes. Curr Biol. 20, 1-7 (2010).
- Cai, S., Lashbrook, C. C. Laser capture microdissection of plant cells from tape-transferred paraffin sections promotes recovery of structurally intact RNA for global gene profiling. Plant J. 48 (4), 628-637 (2006).
- Schmidt, A., Wuest, S. E., Vijverberg, K., Baroux, C., Kleen, D., Grossniklaus, U. Transcriptome analysis of the Arabidopsis megaspore mother cell uncovers the importance of RNA helicases for plant germ line development. PLOS BIOL. 9, e1001155 (2011).
- Schmid, M. W., Schmidt, A., Klostermeier, U. C., Barann, M., Rosenstiel, P., Grossniklaus, U. A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA sequencing. PLOS ONE. 7, e29685 (2012).
- Mau, M., et al. Hybrid apomicts trapped in the ecological niches of their sexual ancestors. Proc Natl Acad Sci.U S A. 112 (18), 2357-2365 (2015).
- Aliyu, O. M., Seifert, M., Corral, J. M., Fuchs, J., Sharbel, T. F. Copy number variation in transcriptionally active regions of sexual and apomictic Boechera. demonstrates independently derived apomictic lineages. Plant Cell. 25 (10), 3808-3823 (2013).
- Corral, J. M., et al. A conserved apomixis-specific polymorphism is correlated with exclusive exonuclease expression in premeiotic ovules of apomictic boechera species. Plant Physiol. 163 (4), 1660-1672 (2013).
- Deeken, R., Ache, P., Kajahn, I., Klinkenberg, J., Bringmann, G., Hedrich, R. Identification of Arabidopsis thaliana. phloem RNAs provides a search criterion for phloem-based transcripts hidden in complex datasets of microarray experiments. Plant J. 55, 746-775 (2008).
- Schmid, M. W. Genome Scale Quantitative Biology in Arabidopsis thaliana. , University of Zürich. PhD Thesis 40-104 (2015).
