Abstract
Somatosensoriska nerver omvandla termisk, mekanisk, kemisk och skadliga stimuli som orsakas av både endogena och miljöfarliga ämnen. Cellkropparna hos dessa afferenta neuroner är belägna inom sensoriska ganglierna. Sensoriska ganglierna innerverar ett specifikt organ eller en del av kroppen. Till exempel är dorsalrotsganglier (DRG) ligger i ryggraden och sträcker processer i hela kroppen och benen. Trigeminal ganglia är belägna i skallen och innerverar ansiktet, och övre luftvägarna. Vagala afferenter av KNUTIG ganglier sträcker sig genom tarmen, hjärta och lungor. De KNUTIG nervceller styr en mångfald av funktioner såsom: andningsfrekvens, luftvägsirritation och hosta reflexer. Således, för att förstå och manipulera sin funktion, är det viktigt att identifiera och isolera luftvägarna specifika neuronala subpopulationer. I musen, är luftvägarna utsätts för ett fluorescerande spårämne färg, Fast Blue, för retrograd spårning av luftvägsspecifika KNUTIG neurons. De KNUTIG ganglierna är dissocierade och fluorescensaktiverad cell (FAC) sortering används för att samla färgämnes positiva celler. Därefter hög kvalitet ribonukleinsyra (RNA) extraherat från färgämnes positiva celler för nästa generations sekvensering. Med denna metod luftväg specifika neuronala genuttryck bestäms.
Introduction
Somatosensoriska nerver omvandla termisk, mekanisk, kemisk och skadliga stimuli som orsakas av både endogena och miljöfarliga ämnen. Cellkropparna hos dessa afferenta nerver är belägna i sensoriska ganglier, såsom den dorsala rot, trigeminala, eller KNUTIG ganglierna. Varje sensorisk ganglion innerverar specifika regioner av kroppen och innehåller celler som innerverar separata organ och vävnader inom den regionen. Till exempel är dorsalrotsganglier (DRG) ligger i ryggraden och sträcker processer i hela kroppen och armar och ben, medan den trigeminala ganglia ligger i skallen, som innehåller neuroner som innerverar ansikte, ögon, hjärnhinnorna eller övre luftvägarna 1, 2. Den KNUTIG ganglierna av vagusnerven ligger i halsen under skallen och innehåller cellkroppar som sträcker nervfibrerna i hela mag-tarmkanalen, hjärta och nedre luftvägarna och lungorna 3. Hos människa den KNUTIG ganglion står ensam, men i mus det är smältmed halsganglion, som också innerverar lungorna 4. Detta smält ganglion kallas ofta hals / KNUTIG komplex, vagal ganglion, eller helt enkelt KNUTIG ganglion 5. Här är det kallad KNUTIG ganglion.
Afferenta fibrerna i KNUTIG överföra information från inälvor till kärnan av den solitära vägarna (NTS) i hjärnstammen. Sinnesintryck till denna unika ganglion styr en mångfald av funktioner, såsom tarmmotilitet 6, hjärtfrekvens 7, andning 8,9, och irriterande aktiverad andningssvar 10,11. Med denna mångfald av funktioner och innerverade organ, är det viktigt att rikta och isolera organspecifika subpopulationer av KNUTIG ganglion för att studera enskilda nervbanorna. Men med tanke på den begränsade storleken på den KNUTIG och det begränsade antalet neuroner den innehåller detta inte är en trivial uppgift. Varje mus KNUTIG ganglion innehåller ungefär 5000 neuroner 12förutom en omfattande population av stödjande satellitceller. Av de 5.000 KNUTIG nervceller, bara 3-5% innerverar luftvägarna. Därför några funktionella, morfologiska eller molekylära förändringar inom luftvägarna-innerverar neuroner, på grund av andningsstimulering eller sjukdomar, kommer att förloras i den tätt packade KNUTIG ganglion.
För att lösa detta problem, utvecklades en metod för att identifiera och isolera neuroner som innerverar luftvägarna. Luftvägarna exponerades för ett fluorescerande spårämne färg för att identifiera de efterföljande innerverar KNUTIG neuroner. Fast Blue plockades upp av nervceller och färdas snabbt till sina cellkroppar där den behålls för upp till åtta veckor 13 - 15. När detta har skett, en mild men ändå effektiv, dissociation protokoll användes för att bevara färgmärkning och cellviabilitet för fluorescensaktiverad cell (FAC) sortering. Sorterade celler är avsedda att suga högkvalitativ ribonukleinsyra (RNA) för att bestämma genexpression eller feller annan nedströms molekylär analys. Detta protokoll ger en användbar och robust teknik för att isolera sensoriska neuroner som innerverar en vävnad av intresse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Förfaranden med djurförsök har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) av Duke University.
1. Intranasal administration av Fast Blue
För Fast Blue, administrera färgämnet åtminstone 2 dagar före euthanizing musen. Färgämnet kommer kvarstå i upp till åtta veckor.
- Söva musen med ljus inhalationsanestesi (2,5% sevofluran) tills andning börjar avta.
- Använda en 200 | j, l pipett med filtrerade tips för att långsamt ingjuta 40 pl färglösning (0,4 mM Fast Blue, 1% dimetylsulfoxid, DMSO, i fosfatbuffrad saltlösning, PBS) i näsborren, pausa ibland för att säkerställa musen aspirera lösningen (Figur 1A).
- Håll musen vertikalt, huvudet upp och försiktigt massera bröstet för att säkerställa färgen sprider sig lungorna.
2. Förberedelser på Dissection och analys Day
- Förbereda 10 ml0; Ganglia Dissociation Solution (GADS) genom att kombinera ingredienserna som anges i Tabell 1.
- Utför RNA-extraktion i en särskild lab område. Innan försöket, rena ytor med 70% etanol, 10% blekmedel, och RNas sanering reagens. Detta inkluderar RNA centrifugen, några rör rack, och pipetter. Se till att det finns speciella filter tip boxar för endast RNA användning. Använd inte denna utrustning och området för DNA-beredning, eftersom detta kommer att förorena proven.
- Blanda färskt 70%, och 80% etanol med RNas-fritt vatten. Förbereda 1 ml per prov som skall användas i RNA-extraktion.
| Ingrediens | Belopp |
| Advanced DMEM / f12 | 9,5 ml |
| glutamin | 100 ^ |
| HEPES (10 mM) | 100 ^ |
| N2 supplement | 100 ^ |
| B27 (ingen vitamin A) | 200 ^ |
| NGF (50 fig / ml) | 10 pl |
Tabell 1. Reagens Blandning för Ganglia Dissociation Solution (GADS).
3. Dissektion ordningen
- Fyll 1,5 ml rör med 500 | j, l GADS, en för varje experimentellt prov, en för ett positivt sorteringskontroll och en för ett negativt sorterings kontroll. Lagra rören på is under dissekering.
- Dissekera ut KNUTIG ganglion och göra två partiella snitt för att underlätta dissociation, sedan lägga det i den experimentella provröret. Se följande JUPITER protokoll för dissektion av KNUTIG ganglia 16 och DRG 17.
- Dissekera och delvis skuren omärkt ganglier, såsom den dorsala rotganglier (DRG), för sorterings kontrollerna. Använd två ganglier för den positiva kontrollen och två Ganglien för den negativa kontrollen.
- För att få tillräckligt KNUTIG neuroner för framgångsrik sortering, kombinera ganglia från 5 möss i en experimentell provröret som innehåller GADS.
4. Sensorisk Ganglia Dissociation
- Pipett ut 500 pl GADS lämnar ganglierna i röret. Tvätta ganglierna gång genom att tillsätta 1 ml PBS, vänta på ganglierna sedimentera till botten av röret och sedan pipettera ut PBS.
- Tillsätt 1 ml GADS och 22 pl matsmältningen enzym (kollagenas I / II och proteas mix, 2,5 mg / ml i H2O) till varje rör.
- Tillsätt 20 l Fast Blue (5,26 mM) till den positiva kontrollröret.
- Sätta rören i ett vattenbad eller värmeblock redan är inställd vid 37 ° C.
Obs: Tiden för ganglierna digestion beror på ålder matsmältningen enzym. Inom en månad att lösa matsmältningen enzym, smälta under 30 minuter, inom 2 - 6 månader smälta under 45 minuter. Om enzymet är över sex månader gamla, smälta ganglierna feller 60 min. - Varje 15 min skaka rören kortvarigt och flick dem att se till ganglia täcks av lösningen.
- Medan ganglierna är som rötas, förbereda densitetsgradienter med hjälp av en partikellösning (kolloidalt kiseldioxidpartiklar belagda med polyvinylpyrrolidon).
- Blanda 12% partikel lösning i GADS 500 l per prov.
- Blanda 28% partikel lösning i GADS 500 l per prov.
- Långsamt och tillsätt försiktigt 400 | j, l 12% densitetslösning ovanpå 400 | il 28% densitet lösning i en färsk 1,5 ml rör för varje prov. Låt inte de två skikten att blanda. Två distinkta skikt bör vara synlig i röret; en mörkare än den andra.
- Medan ganglierna är som rötas, märka nya 1,5 ml uppsamlingsrör för sortering (en Fast Blue positiv och en Fast Blue negativ rör per sortering prov). Beroende på sorteringsanläggning krav måste dessa rör har löstagbara lock så att inte interfere med cellsorterare.
- Efter lämplig koktiden, ta bort gads matsmältningsenzym och tvätta ganglierna två gånger med 1 ml PBS. Tillsätt 200 pl av färska GADS till varje rör.
- Använd en 200 l pipett, satt till 100 ul volym, och pipetten ganglierna upp och ned flera gånger för att bryta celler isär. Upprepa tills ingen intakt bit vävnad ses. Undvika att skapa bubblor i lösningen.
- Passera dissocierade celler genom ett 70 | im cellfilter.
- Lägg till ytterligare 100 ^ gads till den ursprungliga dissociation röret för att plocka upp eventuella återstående herrelösa celler vänster och passera ytterligare lösning genom cellen sil. Med användning av en ny pipett inhämta den kvarvarande cellinnehållande vätska som har passerat genom silen och höll fast vid nätet. Den slutliga volymen av celler suspenderade i GADS är 300 pl.
- skikt noggrant de 300 ul av celler på toppen av det tidigare gjorda densitetsgradient. Undvika bubblor och blandning av calnar med densitetsskikten.
- Centrifugera i 10 min vid 2900 xg vid RT.
- Medan cellerna är i centrifugen, blanda lyseringsbuffert (1 ml per försöksprov) enligt följande: 10 | il 2-merkaptoetanol i 1 ml buffert RLT (från RNA-extraktion kit).
- Tillsätt 300 pl lysbuffert till Fast Blue positiv provrör och 600 mikroliter till Fast Blue negativa provrör (rören märkta från steg 4,7). Denna volym är beroende av antalet celler som förväntas samlas. För <2.000 celler, tillsätt 300 pl, för> 7000 celler lägga 600 l. Detta kommer att säkerställa sorterings omslutande vätska inte signifikant späda lyseringsbuffert.
- När centrifugeringen är klar, försiktigt bort och kassera den översta 700 pl skikt. Detta skikt innehåller de flesta av cellrester, som annars kommer att störa cellsortering.
- Lägg 700 l färska gads till den återstående cellinnehållande lösningen och pipette upp och ner flera gånger för att blanda.
- Centrifugera under 15 minuter vid 2900 xg för att pelletera cellerna.
- Medan cellerna är i centrifugen, blanda sorterings GADS (500 | j, l per prov) genom att tillsätta 5 | il DNas (10 mg / ml) till 1 ml GADS.
- När centrifugeringen är klar, försiktigt bort och kassera supernatanten, lämnar cellpelleten.
- Återsuspendera cellpelleten i 200 - 300 | j, l sorterings GADS genom att pipettera upp och ner med en 1000 l pipett inställd på 200 pl flera gånger. Sätt prover på is. Cellerna är nu redo att sorteras.
5. fluorescensaktiverad cell (FAC) Sortering
Obs: Det här avsnittet kräver en operativ kunskap om en FACS sorterare eller hjälp av kompetent personal.
- Lägg ett pl propidiumjodid (PI) stamlösning (50 | j, g / ml) till varje prov för att testa för cellviabilitet. Split negativ kontroll i 2 rör, ett med PI och en utan. PI binder DNA endast i döda celler. Omefter de första slag finns det inga döda celler att märka, behövs inte användningen av PI.
- Transport celler till flödescytometri instrument, t ex., BD FACS AriaII kör Diva 8 programvara, på is.
- Eftersom cellstorleken varierar i denna population, använda en stor munstycke (100 nm) för sortering. Att minska mängden stress i celler erfarenhet och öka cellviabilitet använda lågt tryck (20 psi).
- Använd FACS sorterare programvara för att ställa in analys tomter, framåt scatter, sidospridning (SSC), Fast Blue, och PI, om det behövs.
- Att återsuspendera celler, försiktigt virvel provet kort innan du lägger det i sorterare.
- Börja med den negativa kontrollen, ingen Fast Blue eller PI, för att ställa in grinden tröskeln (Figur 2A). Detta kommer att bestämma mängden av autofluorescens i cellpopulationen. Valfritt: Kör negativt prov med PI att fastställa huruvida det finns en population av döda celler.
- Sortera positiva kontrollprovet (inklubated med Fast Blue), för att ställa in kompensationsparametrar.
- När grindarna och parametrar ställs in, börjar sortering de experimentella proverna. Prover sorteras i de preparerade uppsamlingsrören innehållande RNA lysbuffert.
- Hålla sorterade proverna på is tills cellsortering är klar.
- Börja RNA-extraktion steg omedelbart efter det att cellerna sorteras.
6. RNA-extraktion
- Virvel sorterade celler i lysisbuffert under 1 min för att homogenisera.
- Lägga en volym av 70% etanol och blanda genom att pipettera upp och ned flera gånger.
- Överför upp till 700 | il av provet till en spinnkolonn. Centrifugera i 15 s vid 8000 x g. Kassera genomströmning.
- Upprepa tills den totala volymen av provet får passera genom spinnkolonn.
- Lägg 350 l buffert RW1 och fortsätta RNA reningsprocessen, inklusive DNas behandlingssteget, enligt tillverkarens protocol för celler.
- När RNA har extraherats, testa RNA kvalitet med hjälp av en mikroflödeselektroforessystem enligt tillverkarens specifikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med hjälp av denna metod, är luftvägarna-innerverar neuroner märkta med intranasalt ingjuta Fast Blue (Figur 1A). Efter två dagar, Fast Blue märkta celler visas i KNUTIG ganglierna (Figur 1C). Dessa celler utgör 3-5% av den totala neuronala populationen av KNUTIG ganglierna. Andra retrograda färgämnen som har använts för detta ändamål inkluderar Dil (1,1'-dioktadekyl-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perklorat) och fluorguld. Lung exponering för DII etiketter KNUTIG neuroner. Men Dil tar längre tid att nå ganglion, 7 - 14 dagar efter instillation 18,19, därför ett aktivt transporteras färgämne används. Fluorogold är en aktivt transporteras färgämne som också har använts för att märka luftvägarna nervceller 14,20. I vår erfarenhet, men nådde en gång denna färg cellkropparna i KNUTIG ganglion det var snabbt plockas upp av satellitceller och inte neuroner (data ej visade). SnabbBlått är en alternativ aktivt transporteras fluorescerande färgämne som framgångsrikt och snabbt, etiketter DRG hos råttor 21 och luftvägs-innerverar KNUTIG nervceller 13,14. Fast Blue tillvägagångssätt förefaller därför mer robust och reproducerbar.
Dissektion av den KNUTIG ganglion har beskrivits tidigare 16 och dess läge i korthet visas i figur 1B. Matsmältningen börjar omedelbart efter KNUTIG ganglier har skurits ut. För att förhindra att nervceller från klumpar ihop och göra det möjligt för en renare slag, använd en mild matsmältning enzym, rensa skräp och lägga RNas till ganglierna sorterings lösning. Flera matsmältning enzymblandningar testades för effektivitet. En mild matsmältning enzymblandning 22 prövades dock för vuxna ganglion matsmältning det var inte tillräckligt starka för att bryta isär celler i tid. Alternativt kan en tidigare använt 23 kombination av papain, proteasOch kollagenas enzymblandning, visat sig vara alltför aggressiv och orsakade oönskad celldöd (data ej visade). Den beskrivs matsmältningen protokollet med den angivna enzymblandningen, visade sig vara perfekt för en snabb nedbrytning med hög cellviabilitet.
Tidigare metoder har använt manuell cell plocka med en glaspipett att separera märkta celler från omärkta celler 24. Denna teknik är bättre lämpad för enskild cell analys av ett litet antal celler. Men med en maximal hastighet av 48 celler / tim denna teknik är opraktisk när hela populationer av hundratals eller tusentals celler måste samlas in. När målet är att isolera högkvalitativt RNA, blir gång en nyckelvariabel. Det är viktigt att börja RNA-extraktion så snabbt som möjligt för att förhindra nedbrytning. FAC sortering möjliggör insamling av hela märkt befolkningen i ~ 45 min och RNA-extraktion startas omedelbart efter.
o: keep-together.within-page = "1"> När sorterings neuroner är det viktigt att rensa så mycket skräp från trasiga neuronala processer. En densitet gradient användes för att rensa skräp från de dissocierade prover. Det är viktigt att centrifugera vid en tillräckligt hög kraft för att säkerställa att C-fiber-neuroner, vilka har en liten radie, ~ 5 ^ m 24, tvingas genom gradienten.
Figur 2A och B visar de negativa och positiva kontroller som används för att ställa in sorteringsgrindarna. Såsom kan ses i figur 2C, den dissocierade Fast Blue märkta KNUTIG celler sorterar i två populationer. Cell siffror som samlats in från detta prov återfinns i figur 2D. Sorteringseffektivitet för denna metod är 73-85%. När sortering neuroner framåtspridning och sido scatter parametrar inte lägga specificitet. Eftersom neuroner inte sfäriska dessa parametrar kunde inte på ett tillförlitligt sätt rapportera cellstorlek.
ent "fo: keep-together.within-page =" 1 "> För hög kvalitet RNA avkastning, celler måste sorteras direkt i lysbuffert och RNA bör extraheras omedelbart efter sortering Ett mikroflödeselektroforessystem användes för att testa. kvalitet av RNA (figur 3). de 18S och 28S toppar bestäms via gelelektrofores används för att beräkna en RNA integritet nummer (RIN). för RNA sekvensering av provet RIN bör vara större än 7. Detta RNA-prov är nu klar som skall sekvenseras .
Figur 1. Fast Blue Märkning av Airway innerverar nervceller i KNUTIG Ganglia av vagusnerven. A) En representation av Fast Blue intranasal indrypning i lungorna. Under lätt sevoflurananestesi, pipett 40 pl Fast Blue i PBS med 1% DMSO i näsborrarna av en mus och se till att musen aspire i vätskan.
Figur 2. fluorescensaktiverad cell (FAC) Sortering Gates för Fast Blue positiva celler. För att ställa in sorteringsgrindar använder negativa (A) och positiv (B) kontrollerar att fastställa Fast Blue positiva populationen. Den negativa kontrollen (A) dissocieras DRG-celler thpå inte innerverar lungorna. Den positiva kontrollen (B) dissocieras DRG-celler som inkuberas med Fast Blue in vitro, efter att de har dissekeras. På grund av den icke-sfärisk form av dissocierade neuroner, kommer Forward Scatter och sida scatter parametrar inte att definiera cellpopulationen. C) Ett representativt sorts skiljas KNUTIG ganglier celler från möss vars luftvägarna har utsatts för Fast Blue. D) Det celltal för (C). Över 1000 Fast Blue (FB) celler samlades in. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Bedömning av RNA kvalitet och Tilldelning av RNA Integrity Number (RIN) med hjälp av en mikroflödeselektroforessystem. Använda en utvaldrophoresis systemet kvaliteten av RNA beräknas från 18S och 28S topparna på avbildad bild av gelen. Den lägre toppen representerar nedbrutet RNA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver en metod för att rikta luftvägarna-innerverar nervceller i KNUTIG ganglierna av vagusnerven. När märkt, är ganglierna försiktigt dissocierade att optimalt bevara cellantal och livskraft. Dessa nervceller är då FAC sorteras direkt i lysbuffert och RNA extraheras. Betydelsen av detta protokoll är förmågan att rikta, isolera och bevara kvaliteten på en specifik sensorisk cellpopulation. Genuttryck beskrivs i denna lilla population av nervceller, och organspecifika funktioner och neurala nätverk identifieras.
De kritiska steg i detta protokoll inkluderar snabb progression genom dissociation processen och efterföljande cellsortering. Det är viktigt att schemasorteringstiden så att den börjar omedelbart efter dissociation. Det är även kritiskt att alla RNA-extraktionsreagens är färska, de 70% och 80% etanollösningar görs färska, och alla rör och utrustning för RNA-extraktionär rena och RNas-fritt.
Detta protokoll kan modifieras så att celler sorteras individuellt i brunnsplattor för enskild cell RNA-extraktion och sekvensering. Den kan också användas för att isolera celler från andra sensoriska ganglier, såsom dorsala rotganglier (DRG). Dye injektion av olika kroppsdelar för att spåra tillbaka till DRG har varit tidigare beskrivits 17. Detta protokoll kan också modifieras för att samla upp celler för funktionell analys. I stället för att sortera celler i lysbuffert, celler sorteras i neuronal odlingsmedium, GADS. Dessa celler odlas sedan och används för funktionella studier såsom kalcium avbildning eller elektrofysiologi.
Om Fast Blue positiva populationen är mindre än det förväntade resultatet, köpa ny matsmältning enzym. En ålder av uppslutnings enzymet är korrelerad till effektiviteten i matsmältningen. Matsmältningen enzym måste användas inom ett år efter köpet. I fallet där cellantalet är hög,RNA extraheras och kvaliteten testas. Om RNA bryts ned detta är en indikation på att reagenserna är inte färska, eller har förorenats. I detta fall, vara säker på att rengöra alla RNA utvinningsområden, pipetter, ställningar, och allt som kommer i kontakt med provrören. Gör färsk RNas och DNas gratis 70% och 80% etanol. Vattnet och etanol som används för att göra dessa lösningar bör också hållas åtskilda från andra lab supplies och användas endast för RNA-extraktion.
FAC sortering är en snabb och effektiv metod för isolering av Fast Blue positiva celler, är emellertid en begränsning att celltätheten bör vara 1 till 2 miljoner celler per ml buffert. Detta protokoll skjuter gränsen för nuvarande cellsorterare modeller. Antalet celler i den KNUTIG ganglion är liten. För att få en cellutbyte tillräcklig för den cellsorterare, är celler från fem djur poolas. Sorterings volym beskrivs är 200 - 300 l och har färre än 100.000 suspenderade celler. Tsina översätts till en koncentration av cirka 450000 celler per ml, under den rekommenderade tätheten. Ett alternativ till användning av en cellsorterare är att handpick med ett fluorescensmikroskop och glaspipett 24. Denna teknik är långsammare och har använts för att samla in 30 - 100 celler åt gången. Därför erbjuder detta protokoll snabbare hög genomströmning metod jämfört med existerande metoder.
De framtida tillämpningar av detta protokoll inkluderar möjligheten att bestämma transkriptions profil av en specifik population av luftvägarna-innerverar nerver. Den höga kvaliteten RNA uppsamlades med användning av detta protokoll kan användas som en mall för cDNA-syntes och nästa generations sekvensering och andra tekniker för att karakterisera den transkriptom av de insamlade nervceller. På detta sätt kan det bestämmas vilka gener eller vägar är specifika för dessa neuroner. Denna information kommer att bidra till att belysa den funktionella rollen dessa neuroner spelar i normala fysiologiska förhållanden. gång grundläggandeuttrycksmönster har fastställts, kan systemet utmanas av fysiska och kemiska stimuli eller av patogener för att bestämma deras effekter på genreglering i lung innerverar neuron. Slutligen, genom att identifiera vilka gener som regleras vi kan identifiera nya farmakologiska mål och börja undersöka effekterna av läkemedel för att störa akuta och kroniska förändringar av nervfunktion i luftvägssjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Med stöd av NIH bevilja R01HL105635 till SEJ. Författarna vill tacka Diego V. Bohórquez för teknisk rådgivning. Vi tackar också R. Ian Cumming för tekniskt stöd och utföra flödescytometri vid Duke Human Vaccine Institute Research flödescytometri Delad Resource Facility (Durham, NC). Flödescytometri utfördes i regionala biologisk inneslutning Laboratory vid Duke som fick delvis stöd för byggande av National Institutes of Health, National Institute of Allergy och infektionssjukdomar (UC6-AI058607).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fast Blue | Polysciences, Inc. | 17740-2 | stock 2 mg/ml in water |
| NeuroTrace 530/615 red Nissle stain | Life Technologies | N21482 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Ca and Mg free | Gibco | 14190-144 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| glutamine (Glutamax) | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| N2 | Gibco | 17502-048 | |
| B27 (no vitamin A) | Gibco | 12587-010 | |
| Nerve Growth Factor (NGF) | Sigma | N6009 | stock 50 µg/ml in PBS/10% FBS |
| digestion enzyme, Liberase DH Research Grade | Roche | 5401054001 | stock 2.5 mg/ml in water |
| particle solution (Percoll) | Sigma | P1644-25ML | |
| Heating block | LabNet | ||
| 70 µm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Absolute Ethanol (200 proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| RNase free water | Fisher Scientific | BP2484-100 | |
| RNase decontamination reagent, RNase AWAY | invitrogen | 10328-011 | |
| 2-mercaptoethanol | VWR | EM-6010 | |
| RNA extraction kit, RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| DNase kit, RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| DNase | Sigma | D5025-15KU | stock 10 mg/ml in 0.15 M NaCl |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170-10MG | stock 10 µg/ml in PBS |
| Microfluidic electrophoresis system (TapeStation 2200) | Agilent |
References
- Manteniotis, S., et al. Comprehensive RNA-Seq Expression Analysis of Sensory Ganglia with a Focus on Ion Channels and GPCRs in Trigeminal Ganglia. PLoS One. 8 (11), 1-30 (2013).
- Vandewauw, I., Owsianik, G., Voets, T. Systematic and quantitative mRNA expression analysis of TRP channel genes at the single trigeminal and dorsal root ganglion level in mouse. BMC Neurosci. 14 (1), 21 (2013).
- Paintal, A. S. Vagal sensory receptors and their reflex effects. Physiol Rev. 53 (1), 159-227 (1973).
- Springall, D. R., Cadieux, A., Oliveira, H., Su, H., Royston, D., Polak, J. M. Retrograde tracing shows that CGRP-immunoreactive nerves of rat trachea and lung originate from vagal and dorsal root ganglia. J Auton Nerv Syst. 20 (2), 155-166 (1987).
- Ricco, M. M., Kummer, W., Biglari, B., Myers, A. C., Undem, B. J. Interganglionic segregation of distinct vagal afferent fibre phenotypes in guinea-pig airways. J Physiol. 496 (Pt 2), 521-530 (1996).
- Zhao, H., Sprunger, L. K., Simasko, S. M. Expression of transient receptor potential channels and two-pore potassium channels in subtypes of vagal afferent neurons in rat. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 298 (2), 212-221 (2010).
- Zhuo, H., Ichikawa, H., Helke, C. J. Neurochemistry of the nodose ganglion. Prog Neurobiol. 52 (2), 79-107 (1997).
- Chang, R. B., Strochlic, D. E., Williams, E. K., Umans, B. D., Liberles, S. D. Vagal Sensory Neuron Subtypes that Differentially Control Breathing. Cell. 161, 1-12 (2015).
- Kaczyńska, K., Szereda-Przestaszewska, M. Nodose ganglia-modulatory effects on respiration. Physiol Res. 62, 227-235 (2013).
- Taylor-Clark, T. E., Undem, B. J. Sensing pulmonary oxidative stress by lung vagal afferents. Respir Physiol Neurobiol. 178 (3), 406-413 (2011).
- Bautista, D. M., et al. TRPA1 mediates the inflammatory actions of environmental irritants and proalgesic agents. Cell. 124 (6), 1269-1282 (2006).
- Ichikawa, H., De Repentigny, Y., Kothary, R., Sugimoto, T. The survival of vagal and glossopharyngeal sensory neurons is dependent upon dystonin. Neuroscience. 137 (2), 531-536 (2006).
- Hondoh, A., et al. Distinct expression of cold receptors (TRPM8 and TRPA1) in the rat nodose-petrosal ganglion complex. Brain Res. 1319, 60-69 (2010).
- Kummer, W., Fischer, A., Kurkowski, R., Heym, C. The sensory and sympathetic innervation of guinea-pig lung and trachea as studied by retrograde neuronal tracing and double-labelling immunohistochemistry. Neuroscience. 49 (3), 715-737 (1992).
- Choi, D., Li, D., Raisman, G. Fluorescent retrograde neuronal tracers that label the rat facial nucleus: A comparison of Fast Blue, Fluoro-ruby, Fluoro-emerald, Fluoro-Gold and DiI. J Neurosci Methods. 117 (2), 167-172 (2002).
- Calik, M. W., Radulovacki, M., Carley, D. W. A Method of Nodose Ganglia Injection in Sprague-Dawley Rat. J Vis Exp. (93), e1-e5 (2014).
- Ramachandra, R., McGrew, S., Elmslie, K. Identification of specific sensory neuron populations for study of expressed ion channels. J Vis Exp. (82), e50782 (2013).
- Yu, X., Hu, Y., Ru, F., Kollarik, M., Undem, B. J., Yu, S. TRPM8 function and expression in vagal sensory neurons and afferent nerves innervating guinea pig esophagus. Am J Physiol - Gastrointest Liver Physiol. 308 (6), 489-496 (2015).
- Kwong, K., Lee, L. -Y. PGE(2) sensitizes cultured pulmonary vagal sensory neurons to chemical and electrical stimuli. J Appl Physiol. 93 (4), 1419-1428 (2002).
- Joachim, R. A., et al. Stress induces substance P in vagal sensory neurons innervating the mouse airways. Clin Exp Allergy. 36 (8), 1001-1010 (2006).
- Kaan, T. K. Y., et al. Systemic blockade of P2X3 and P2X2/3 receptors attenuates bone cancer pain behaviour in rats. Brain. 133 (9), 2549-2564 (2010).
- Nakatani, T., Minaki, Y., Kumai, M., Ono, Y. Helt determines GABAergic over glutamatergic neuronal fate by repressing Ngn genes in the developing mesencephalon. Development. 134 (15), 2783-2793 (2007).
- Lobo, M. K., Karsten, S. L., Gray, M., Geschwind, D. H., Yang, X. W. FACS-array profiling of striatal projection neuron subtypes in juvenile and adult mouse brains. Nat Neurosci. 9 (3), 443-452 (2006).
- Usoskin, D., et al. Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing. Nat Neurosci. 18, 145-153 (2015).
