Abstract
עצבים חושיים transduce תרמית, מכאני, כימי, גירוי מזיק נגרם על ידי שני סוכני אנדוגני וסביבתיים. גופי התא של הנוירונים מביאים אלה ממוקמים בתוך הגרעינים החושיים. גרעינים חושיים מעצבבי איבר או חלק מסוים של הגוף. למשל, הגרעינים השורש הגבי (DRG) ממוקמים עמוד השדרה ולהרחיב תהליכים בכל הגוף והגפיים. גרעיני trigeminal ממוקמים הגולגולת המעצבבים את הפנים, ואת דרכי נשימה עליונות. afferents מחנק של הגרעינים nodose להאריך ברחבי הבטן, הלב והריאות. הנוירונים nodose לשלוט מערך מגוון של פונקציות כגון: קצב הנשימה, גירוי בדרכי הנשימה, שיעול ורפלקסים. לכן, כדי להבין ולטפל תפקידם, חשוב לזהות ולבודד תת-אוכלוסיות עצביות ספציפיות דרך נשימה. בשנת העכבר, את דרכי הנשימה נחשפות לצבוע נותבו ניאון, מהיר כחולה, לאיתור מדרדר של נוירון nodose ספציפי דרך נשימהים. גרעיני nodose הם ניתקו ותא מופעל קרינה (FAC) מיון משמש לאיסוף תאי צבע חיוביים. לאחר מכן, חומצה ריבונוקלאית באיכות גבוהה (RNA) מופקת תאים חיוביים לצבוע עבור סידור הדור הבא. באמצעות דרכי הנשימה בשיטה זו ביטוי גנים עצבי ספציפי נקבע.
Introduction
עצבים חושיים transduce תרמית, מכאני, כימי, גירוי מזיק נגרם על ידי שני סוכני אנדוגני וסביבתיים. גופי התא של עצבים מביאים אלה ממוקמים בגרעיני חושי, כגון שורש הגבה, trigeminal, או גרעיני nodose. כל גנגליון חושי מעצבב אזורים ספציפיים בגוף ומכיל תאי מעצבבי איברים ורקמות נפרדים בתוך אזור זה. למשל, הגרעינים השורש הגבי (DRG) ממוקמים עמוד השדרה ולהרחיב תהליכים בכל הגוף והגפיים, בעוד הגרעינים trigeminal ממוקמים בגולגולת, המכיל נוירונים המעצבבים את הפנים, העיניים, קרומי המוח או העליון דרכי הנשימה 1, 2. גרעיני nodose של העצב התועה ממוקמים בצוואר מתחת הגולגולת מכילים גופי תא שמרחיבים סיבים עצב לאורך כל מערכת העיכול, הלב ודרכי נשימה תחתונה וריאות 3. אצל בני האדם גנגליון nodose עומד בפני עצמו, עם זאת, העכבר הוא התמזגעם גנגליון הצוואר, אשר גם מעצבב ריאות 4. גנגליון התמזג זה נקרא לעתים קרובות צוואר / nodose מורכב, גנגליון המחנק, או פשוט גנגליון 5 nodose. הנה, זה נקרא גנגליון nodose.
סיבים מביאים של nodose להעביר מידע מן הקרביים לגרעין של הדרך הבודדה (NTS) בגזע המוח. קלט חושי אל גנגליון ייחודי זה שולט מערך מגוון של פונקציות, כגון מעי תנועתיות 6, קצב לב 7, נשימת 8,9, ותגובות נשימה מופעלות מגרות 10,11. עם המגוון הזה של פונקציות ואיברים מעוצבבים, חשוב למקד ולבודד subpopulations איבר ספציפי של גנגליון nodose כדי ללמוד מסלולים עצביים הפרט. עם זאת, בהתחשב בגודל הקטן של nodose ואת המספר המוגבל של נוירונים הוא מכיל זו אינה משימה טריוויאלית. כל עכבר nodose גנגליון מכיל בערך 5,000 נוירונים 12בנוסף אוכלוסייה נרחבת של תאים תומכים בלוויין. של 5,000 הנוירונים nodose, רק 3 - 5% innervate את דרכי הנשימה. לכן, כל שינוי פונקציונלי, מורפולוגיים או מולקולרי בתוך הנוירונים דרכי הנשימה-innervating, עקב גירוי בדרך נשימה או פתולוגיות, יאבד גנגליון nodose הצפוף.
כדי לפתור בעיה זו, פותחה שיטה לזהות ולבודד נוירונים המעצבבים את דרכי הנשימה. דרכי האוויר נחשפו לצבוע נותב ניאון כדי לזהות את הנוירונים nodose innervating שלאחר מכן. כחול מהיר נאסף על ידי נוירונים ונוסע במהירות גופי התא שלהם איפה זה נשמר עד שמונה שבועות 13 - 15. לאחר הזיהוי, פרוטוקול עדין, אך יעיל, דיסוציאציה שימש לשמר תיוג לצבוע כדאיות התא עבור התא מופעל ניאון (FAC) מיון. תאים ממוינים משמשים כדי לחלץ חומצה ריבונוקלאית באיכות גבוהה (RNA) כדי לקבוע ביטוי גנים או fאו ניתוח מולקולרי במורד אחר. פרוטוקול זה מספק טכניקה יעילה וחזקה לבודד עצב סנסורי מעצבבי רקמה של עניין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הנהלים הקשורים בנושאים בעלי חיים אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש (IACUC) מאוניברסיטת דיוק.
1. מינהל אפי של כחול מהיר
עבור כחול מהיר, לנהל את צבען לפחות 2 ימים לפני והרדמת חסד העכבר. לצבוע יימשך עד שמונה שבועות.
- להרדים את העכבר עם הרדמה משאיפת אור (sevoflurane 2.5%) עד הנשימה מתחיל להאט.
- השתמש פיפטה 200 μl עם טיפים מסוננים להחדיר לאט 40 μl של פתרון צבע (0.4 מ"מ כחול מהיר, sulfoxide דימתיל 1%, DMSO, פוספט בופר, PBS) לתוך הנחיר, עוצר מדי פעם כדי להבטיח את העכבר aspirating הפתרון (איור 1 א).
- החזק את העכבר אנכי, בראש מורם, ובעדינות לעסות את החזה על מנת להבטיח את הצבע מתפשט ברחבי הריאות.
תכשירים 2. על פירוק וניתוח יום
- הכן 10 מ"ל0; פתרון דיסוציאציה הגרעינים (GADS) על ידי שילוב של מרכיבים כמפורט בטבלה 1.
- בצע מיצוי RNA באזור מעבדה ייעודי. לפני תחילת הניסוי, משטחים נקיים עם 70% אתנול, 10% אקונומיקה, ו מגיבים טיהור RNase. זה כולל את צנטריפוגות RNA, כל מתלי צינור, טפטפות. ודא יש תיבות הפילטר ייעודיות לשימוש RNA בלבד. אין להשתמש בציוד זה ואזור להכנת דנ"א, כמו זה יהיה לזהם את הדגימות.
- מערבבים טריים 70%, ו -80% אתנול עם מי RNase חינם. כן 1 מיליליטר לדגימה לשמש להפקת RNA.
| מַרכִּיב | כמות |
| מתקדם DMEM / F12 | 9.5 מ"ל |
| גלוטמין | 100 μl |
| HEPES (10 מ"מ) | 100 μl |
| תוספת N2 | 100 μl |
| B27 (ללא ויטמין A) | 200 μl |
| NGF (50 מיקרוגרם / מ"ל) | 10 μl |
תערובת מגיב 1. טבלת הגרעינים דיסוציאציה פתרון (GADS).
3. הליך לנתיחה
- מלאו צינורות 1.5 מ"ל עם 500 μl GADS, אחד עבור כל דגימה הניסוי, אחד עבור פקד מיון חיובי, ואחד עבור פקד מיון שלילי. צינורות חנות על הקרח ברחבי לנתיחה.
- לנתח את גנגליון nodose ולעשות שני חתכים חלקית כדי להקל דיסוציאציה, ואז לשים אותו בצינור המדגם הניסיון. עיין פרוטוקול יופיטר הבא לנתיחה של גרעיני nodose 16 DRG 17.
- לנתח באופן חלקי לחתוך גרעינים שאינם שכותרתו, כגון גרעיני שורש הגבה (DRG), עבור פקדי המיון. השתמש בשני גרעינים עבור השליטה החיובית ושני ganglia אם הביקורת השלילית.
- כדי להשיג מספיק נוירונים nodose למיון מוצלח, לשלב גרעינים מ -5 עכברים לתוך GADS המכיל צינור דגימה אחת ניסיוני.
4. חושי גרעיני דיסוציאציה
- פיפטה מתוך 500 GADS μl, עוזב הגרעינים בצינור. לשטוף הגרעינים פעם על ידי הוספת 1 מ"ל PBS, לחכות הגרעינים להתיישב אל החלק התחתון של הצינור, אז פיפטה את PBS.
- הוסף 1 מ"ל GADS ו -22 μl של אנזים עיכול (collagenase I / II ותמהיל פרוטאז, 2.5 מ"ג / מ"ל ב H 2 O) על צינור אחד.
- הוסף 20 μl Fast כחולים (5.26 מ"מ) אל צינור הבקרה החיובי.
- שים את הצינורות בתוך גוש אמבטיה או חימום מים להגדיר כבר על 37 מעלות צלזיוס.
שים לב: בפעם עיכול גרעינים תלוי בגילו של אנזים העיכול. בתוך חודש 1 של המסת אנזים עיכול, לעיכול למשך 30 דקות, תוך 2 - 6 חודשים לעכל במשך 45 דקות. אם האנזים הוא מעל 6 חודשים, לעכל גרעיני fאו 60 דקות. - כל 15 דק 'צינורות שייק בקצרה הקפיצי להם להבטיח גרעינים מכוסים על ידי הפתרון.
- בעוד גרעינים נמצאים מתעכלים, להכין הדרגתיים צפיפות באמצעות פתרון חלקיקים (חלקיקי סיליקה colloidal מצופים polyvinylpyrrolidone).
- מערבבים 12 פתרון החלקיקים% ב GADS, 500 μl לדגימה.
- מערבבים 28 פתרון החלקיקים% ב GADS, 500 μl לדגימה.
- לאט ובזהירות להוסיף פתרון צפיפות 400 μl 12% על גבי 400 μl 28 פתרון צפיפות% בתוך שפופרת 1.5 מיליליטר טרי עבור כל דגימה. אל תאפשר את שתי השכבות לערבב. שתי שכבות נפרדות צריכות להיות גלויות בצינור; אחד כהה יותר מהאחר.
- בעוד גרעינים נמצאים מתעכלים, תווית צינורות 1.5 מיליליטר אוסף חדשים למיון (אחד חיובי כחול מהיר ואחד צינור שלילי כחול מהיר לדגימת מיון). בהתאם לדרישות מתקן המיון, צינורות אלה חייבים להיות מכסים פריקים כדי לא interferדואר עם סדרן התא.
- לאחר זמן העיכול המתאים, להסיר GADS עם אנזים עיכול ולשטוף גרעינים פעמים עם 1 המ"ל PBS. הוסף 200 μl של GADS הטרי על צינור אחד.
- השתמש פיפטה 200 μl, נקבע על 100 נפח μl, ואת הגרעינים פיפטה מעלה ומטה מספר פעמים כדי לשבור תאים בנפרד. חזור על פעולה עד לא חלק שלם של רקמות נתפסת. הימנע מיצירת בועות הפתרון.
- Pass תאים ניתקו דרך מסננת תא 70 מיקרומטר.
- להוסיף עוד 100 μl GADS אל צינור דיסוציאציה המקורי להרים את כל תאים תועים נותרים עזבו ולהעביר את הפתרון הנוסף דרך מסננת התא. בעזרת קצה פיפטה חדש, לאסוף כל נוזל נותרים המכילים תאים שחלף הדרך המסננת ונצמד אל הרשת. ההיקף הסופי של תאי מרחפי GADS הוא 300 μl.
- בזהירות שכבת 300 μl של תאים על גבי שיפוע הצפיפות שנעשה בעבר. הימנע בועות ערבוב של גאמות עם שכבות הצפיפות.
- צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 2,900 XG ב RT.
- בעוד התאים הם בצנטריפוגה, לערבב חיץ תמוגה (1 מ"ל לכל מדגם ניסיוני) כדלקמן: 10 μl 2-mercaptoethanol ב 1 מ"ל הצפת RLT (מ ערכת חילוץ RNA).
- הוספת 300 חיץ תמוגה μl כדי צינור איסוף חיובי כחול מהיר 600 μl כדי צינור איסוף שלילי כחול מהיר (צינורות שכותרתו משלב 4.7). כרך זה תלוי במספר התאים צפוי להיות שנאספו. עבור <2,000 תאים, להוסיף 300 μl עבור> 7,000 תאים להוסיף 600 μl. פעולה זו תבטיח את נוזל נדן המיון לא לדלל למאגר תמוגה משמעותי.
- לאחר צנטריפוגה תושלם, להסיר בזהירות וזורקים את שכבת μl 700 העליונים. שכבה זו מכילה את רוב פסולת התא כי יפריע אחרת עם מיון התא.
- הוסף 700 GADS טריים μl אל תא הנותרים המכיל פתרון pipette מעלה פעמים למטה כמה לערבב.
- צנטריפוגה במשך 15 דקות ב 2,900 XG כדי גלולת תאים.
- בעוד התאים הם בצנטריפוגה, לערבב מיון GADS (500 μl לדגימה) על ידי הוספת 5 DNase μl (10 מ"ג / מ"ל) ל 1 מ"ל GADS.
- לאחר צנטריפוגה נעשה, להסיר בזהירות וזורקים supernatant, עוזב את התא גלולה.
- Re- להשעות תא גלולה ב 200 - 300 GADS מיון μl ידי pipetting מעלה ומטה עם טפטפת 1,000 μl מוגדר 200 μl מספר פעמים. שים דגימות קרח. תאים מוכנים כעת להיות מסודר.
5. תא הופעל קרינה (FAC) מיון
הערה: סעיף זה מחייב את הידע המבצעי של סדרן FACS או בסיוע של כוח אדם מיומן.
- הוסף 1 μl יודיד propidium (PI) פתרון המניות (50 מיקרוגרם / מ"ל) מדגם לבדוק כדאיות התא. פיצול ביקורת שלילית לתוך 2 צינורות, אחד עם PI ואחד בלי. PI נקשר DNA רק תאים מתים. אםלאחר מיני הראשונים אין תאים מתים לתייג, השימוש PI אינו נחוץ.
- תאי תחבורה לזרום cytometry מכשיר, למשל., BD FACS AriaII פועלת תוכנת דיווה 8, על קרח.
- מאז גודל התא משתנה באוכלוסייה זו, השתמש זרבובית גדולה (100 מיקרומטר) למיון. כדי להקטין את כמות הלחץ החוויה תאים ולהגדיל כדאיות התא להשתמש בלחץ נמוך (20 psi).
- השתמש בתוכנת סדרן FACS להקים המגרשים ניתוח, פיזור קדימה, פיזור צד (SSC), Fast כחול, ו PI, במידת הצורך.
- מחדש להשעות תאים, בעדינות מערבולת בקצרה המדגם לפני הטעינה אותו לתוך הסדרן.
- להתחיל עם השליטה השלילית, לא כחול מהיר או PI, כדי לקבוע את סף השער (איור 2 א). זה יקבע את כמות autofluorescence באוכלוסיית התא. אופציונאלי: הפעל את המדגם השלילי עם PI לזהות אם יש אוכלוסייה של תאים מתים.
- מיין מדגם הבקרה החיובי (incubated עם כחול מהיר), כדי להגדיר את הפרמטרים פיצוי.
- ברגע השערים ופרמטרים מוגדרים, להתחיל במיון דגימות הניסוי. דוגמאות מסודרות לתוך הצינורות המוכנים אוסף המכילים חיץ תמוגה RNA.
- שמור דגימות מיון על קרח עד מיון התא הושלם.
- בגין שלב מיצוי RNA מיד לאחר תאים מסודרים.
6. RNA מיצוי
- תאים ממוינים וורטקס במאגר תמוגה דקות 1 עד homogenize.
- הוסף 1 נפח של 70% אתנול ו לערבב ידי pipetting מעלה ומטה מספר פעמים.
- העבר עד 700 μl של המדגם לעמודה ספין. צנטריפוגה במשך 15 שניות ב g x 8,000. מחק את הזרימה דרך.
- חזור על הפעולה עד הנפח הכולל של המדגם הוא עבר דרך טור ספין.
- להוסיף 350 μl הצפת RW1 ולהמשיך את תהליך טיהור RNA, כולל שלב הטיפול DNase, על פי של protoco היצרןl עבור תאים.
- לאחר RNA חולץ, לבדוק את איכות RNA באמצעות מערכת אלקטרופורזה microfluidic על פי המפרט של היצרן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באמצעות שיטה זו, נוירונים דרכי הנשימה-innervating מסומנים intranasally ידי הקניית כחול מהיר (איור 1 א). לאחר יומיים, תאים שכותרתו כחול מהיר להופיע בגרעיני nodose (תרשים 1C). תאים אלה לפצות 3 - 5% מכלל האוכלוסייה העצבית הכולל של גרעיני nodose. צבעי מדרדר אחרים שנוצלו למטרה זו כוללים DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3 ", פרכלורט 3'-tetramethylindocarbocyanine) ו Fluorogold. חשיפת ריאות לתוויות DiI nodose נוירונים. עם זאת, DiI לוקח יותר זמן להגיע גנגליון, 7 - 14 ימים לאחר החדרת 18,19, ולכן צבען מועבר באופן פעיל היה בשימוש. Fluorogold הוא צבע מועבר באופן פעיל כי שימש גם לתייג נוירונים דרכי הנשימה 14,20. מניסיוננו, לעומת זאת, פעם לצבוע זה הגיע גופי תא גנגליון nodose זה נאסף במהירות על ידי תאי לווין ולא נוירונים (מידע לא מוצג). מָהִירכחול הוא חלופי מועבר צבע פלואורסצנטי פעיל כי בהצלחה, ומהר, תוויות DRG בחולדות 21 ונוירונים דרכי הנשימה-innervating nodose 13,14. הגישה הכחולה המהירה, ולכן, נראית חזקה יותר לשחזור.
דיסקציה של הגנגליון nodose תוארה בעבר 16 ומיקומו מודגם בקצרה באיור 1B. עיכול מתחיל מייד לאחר גרעיני nodose כבר נכרת. כדי למנוע נוירונים clumping יחד ולאפשר מעין מנקה, להשתמש אנזים עיכול עדין, לנקות את כל פסולת ולהוסיף RNase אל גרעיני מיון פתרון. תערובות אנזים עיכול מרובות נבדקו יעילות. שילוב אנזים עיכול מתון 22 נשפט, אולם לעיכול גנגליון מבוגר זה לא היה חזק מספיק כדי להפריד תאים מבעוד מועד. לחלופין, השתמשו בעבר 23 שילוב של פפאין, פרוטאז , תערובת אנזים collagenase, הוכיח להיות אגרסיבי מדי וגרמו מוות של תאים לא רצויים (מידע לא מוצג). פרוטוקול העיכול התווה, עם תמהיל האנזים שצוין, נמצאה להיות אידיאלי עבור עיכול בזמן עם כדאיות התא גבוה.
שיטות קודמות השתמשו תא ידני לקטוף עם טפטף זכוכית להפריד תאים שהכותרת מתאיות ללא תווית 24. טכניקה זו מתאימה יותר לניתוח תא בודד של מספר קטן של תאים. עם זאת, עם שיעור מקסימאלי של 48 תאים / hr טכניקה זו אינה מעשית כאשר אוכלוסיות שלמות של מאה או אלף תאים צריכות להיאסף. כאשר המטרה היא לבודד RNA באיכות גבוהה, הזמן הופך משתנה מפתח. חשוב להתחיל מיצוי RNA מהר ככל האפשר כדי למנוע השפלה. מיון FAC מאפשר איסוף של האוכלוסייה שכותרתו כולו ~ 45 דק 'ו מיצוי RNA הוא התחיל מיד אחרי.
o: keep-together.within-page = "1"> כאשר ממיינים נוירונים חשוב לנקות פסולת ככל מתהליכים עצביים שבור. שיפוע צפיפות שמש כדי לנקות את הפסולת מן הדגימות הניתקות. חשוב צנטריפוגות לעבר כוח גבוה מספיק כדי להבטיח כי נוירונים C-סיבים, אשר יש רדיוס קטן, ~ 5 מיקרומטר 24, נאלצים דרך השיפוע.
איור 2 א 'וב' להציג את הפקדים השליליים וחיוביים נהגו להגדיר את שערי מיון. כפי שניתן לראות בתרשים 2C, הכחול המהיר ניתק שכותרתו תאי nodose מעין לשתי אוכלוסיות. מספרי התא נאספים ממדגם זה מפורט באיור 2 ד. מיון יעיל בשיטה זו הוא 73 - 85%. כאשר ממיינים נוירונים פיזור פיזור וצד קדימה פרמטרים לא להוסיף סגוליות. מאז הנוירונים הם אינם כדוריים פרמטרים אלה לא יכלו לדווח גודל התא באופן מהימן.
אף אוזן גרון "FO: keep-together.within-page =" 1 "> לקבלת תשואה RNA באיכות גבוהה, תאים צריך להיות מסודר ישירות למאגר תמוגה ו- RNA צריך להיות חילוץ מיד לאחר מיון מערכת אלקטרופורזה microfluidic שימש כדי לבדוק את. איכות RNA (איור 3). פסגות 18S ו -28 נקבעות באמצעות ג'ל אלקטרופורזה המשמש לחישוב מספר שלמות RNA (רין). לקבלת RNA רצף המדגם RIN צריך להיות גדול מ 7. מדגם RNA זה עכשיו הוא מוכן להיות רצף .
באיור 1. תיוג כחול תענית Airway innervating נוירונים Nodose הגרעינים של עצב הואגוס. א) ייצוג של החדרת אפי כחול מהירה לריאות. בהרדמה sevoflurane אור, פיפטה 40 μl של כחול מהיר ב- PBS עם 1% DMSO לתוך הנחיריים של העכבר וודאו העכבר aspirating בנוזל.
קרינת איור 2. תא פעיל (FAC) מיון שעיר תאים חיוביים הכחול מהירים. כדי להגדיר מיון שערים להשתמש בשלילה (א) וחיובי (B) שולט להקים האוכלוסייה החיובית הכחולה המהירה. השליטה השלילית (א ') הוא ניתקת תאי DRG הב- אינם המעצבבים את הריאות. הביקורת החיובית (ב) הוא ניתק תאי DRG כי מודגרת עם כחול מהיר במבחנה, אחרי שהם כבר גזורים. בשל הצורה הלא-הכדורית של נוירונים ניתקו, פרמטרי הפיזור וצד פיזור קדימה לא יעזרו להגדיר את אוכלוסיית התאים. ג) מעין נציג ניתק nodose תאי גרעינים של עכברים אשר איירווייז נחשף לצום הכחול. ד) תא ספירה עבור (C). יותר מ -1,000 כחול מהיר (FB) תאים נאספו. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. הערכה של RNA איכות והמחאת RNA יושרה מספר (רין) באמצעות מערכת אלקטרופורזה microfluidic. שימוש הנבחרמערכת rophoresis איכות RNA מחושבת מפסגות 18S ו -28 על התמונה ג'ל בתמונה. השיא התחתון מייצג RNA מושפל. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מתאר שיטה למקד נוירונים דרכי הנשימה-innervating בגרעיני nodose של העצב התועה. לאחר שכותרתו, הגרעינים הם ניתקו בעדינות לשמר מספרים סלולריים באופן המיטבי את כדאיות. נוירונים אלה הם אז FAC מסודר ישירות למאגר תמוגה ו- RNA מופק. המשמעות של פרוטוקול זה היא היכולת למקד, לבודד, ולשמר את האיכות של אוכלוסיית תא חושית מסוימת. ביטוי גנים מתואר אוכלוסייה קטנה זו של נוירונים, ופונקציות ספציפי איבר ורשתות עצביות מזוהות.
השלבים הקריטיים בפרוטוקול זה כוללים התקדמות מהירה באמצעות תהליך הניתוק ומיון תאים עקב. חשוב לתזמן את זמן מיון כזאת שזה מתחיל מיד לאחר ניתוק. זה גם קריטי שכל ריאגנטים מיצוי RNA הם טריים, הפתרונות אתנול 70% ו -80% נעשים טרי, וכל צינורות וציוד להפקת RNAנקיים RNase חינם.
פרוטוקול זה יכול להיות שונה כך תאים מסודרים בנפרד לתוך צלחות גם להפקת רצף RNA תא בודד. זה יכול לשמש גם כדי לבודד תאי גרעינים חושיים אחרים, כגון גרעיני שורש הגבה (DRGs). הזרקת הצבע של חלקי גוף שונים לאיתור חזרה DRGs כבר שתוארה לעיל 17. פרוטוקול זה יכול גם להיות שונה כדי לאסוף תאים לניתוח פונקציונלי. במקום למיין תאים למאגר התפרקות תאים ממוינים בינוני תרבות העצבית, GADS. תאים אלה הם אז תרבותיים המשמשים לימודים פונקציונליים, כגון הדמית סידן, או אלקטרופיזיולוגיה.
אם האוכלוסייה החיובית הכחולה המהירה הוא קטן יותר מאשר התוצאה הצפויה, לרכוש אנזים עיכול חדש. הגיל של אנזים העיכול מתואם ליעילות של עיכול. אנזים העיכול צריך לשמש בתוך 1 בשנת הרכישה. במקרה שבו מספר תאים גבוה,RNA מופק ואת האיכות נבדקת. אם RNA הוא מושפל יש בכך כדי להצביע כי ריאגנטים אינם טריים, או כבר מזוהם. במקרה זה, הקפד לנקות ביסודיות בכל תחומי מיצוי RNA, טפטפות, מתלים, וכל דבר אשר יבוא במגע עם דוגמיות. הפוך RNase טרי 70% חינם DNase ו -80% אתנול. המים ואתנול המשמשים לייצור פתרונות אלה צריכים גם להישמר בנפרד ציוד מעבדה אחר והשתמשו אך ורק להפקת RNA.
מיון FAC הוא שיטה מהירה ויעילה לבידוד תאים חיוביים כחולים מהירים, עם זאת, מגבלה אחת היא כי צפיפות התאים צריכה להיות 1 כדי 2 מיליון תאים לכל מאגר מיליליטר. פרוטוקול זה דוחף את המגבלה של מודלי סדרן התא נוכחיים. מספר תאי גנגליון nodose הוא קטן. כדי לקבל תשואת תא מספיק עבור סדרן התא, תאי מחמישה בעלי חיים הם אספו. היקף המיון המתואר הוא 200 - 300 μl ויש לו פחות מ 100,000 תאים מושעים. Tהמתרגמת שלו לריכוז של כ 450,000 תאים לכל מיליליטר, מתחת הצפיפות המומלצת. חלופה אחת כדי באמצעות סדרן תא הוא בוחר בתלמידים עם טפטפת מיקרוסקופ זכוכית פלורסנט 24. טכניקה זו היא איטית יותר ויש בו נעשה שימוש כדי לאסוף 30 - 100 תאים בכל פעם. לכן, פרוטוקול זה מציע שיטת תפוקה גבוהה יותר מהר לעומת שיטות קיימות.
היישומים העתידיים של פרוטוקול זה כוללים את היכולת לקבוע את פרופיל תעתיק של אוכלוסייה מסוימת של עצבים דרכי הנשימה-innervating. רנ"א באיכות גבוהה שנאסף באמצעות פרוטוקול זה יכול לשמש כתבנית לסינתזת cDNA וסדר הדור הבא, וטכניקות אחרות לאפיין את transcriptome של נוירונים שנאספו. בדרך זו, ניתן לקבוע אילו גנים או מסלולים ספציפיים הנוירונים האלה. מידע זה יסייע להבהיר את התפקיד הפונקציונלי הנוירונים האלה לשחק בתנאים פיסיולוגיים. לאחר בסיסייםדפוסי הביטוי הוקמו, המערכת ניתן לערער על ידי גירויים פיזיים וכימיים או על ידי פתוגנים לקבוע והשפעתם על ויסות הגנים בנוירונים ריאות-innervating. לבסוף, על ידי זיהוי גנים מוסדרים נוכל לזהות מטרות תרופתיות חדשות ולהתחיל לחקור את ההשפעות של תרופות כדי להפריע שינויים אקוטיים וכרוניים של תפקוד עצבי במחלות דרך נשימה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים אין לי מה לחשוף.
Acknowledgments
נתמך על ידי NIH מענק R01HL105635 כדי Sej. המחברים מבקשים להודות דייגו V. Bohórquez עבור ייעוץ טכני. אנו מודים גם ר 'איאן קאמינג לקבלת סיוע טכני וביצוע cytometry הזרימה במתקן המשאב המשותף cytometry זרימת מכון מחקר אדם חיסון Duke (Durham, NC). Cytometry זרימה בוצעה במעבדת Biocontainment האזורית באוניברסיטת דיוק שקיבלה תמיכה חלקית לבנייה מן המכונים הלאומיים לבריאות, המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות (UC6-AI058607).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fast Blue | Polysciences, Inc. | 17740-2 | stock 2 mg/ml in water |
| NeuroTrace 530/615 red Nissle stain | Life Technologies | N21482 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Ca and Mg free | Gibco | 14190-144 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| glutamine (Glutamax) | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| N2 | Gibco | 17502-048 | |
| B27 (no vitamin A) | Gibco | 12587-010 | |
| Nerve Growth Factor (NGF) | Sigma | N6009 | stock 50 µg/ml in PBS/10% FBS |
| digestion enzyme, Liberase DH Research Grade | Roche | 5401054001 | stock 2.5 mg/ml in water |
| particle solution (Percoll) | Sigma | P1644-25ML | |
| Heating block | LabNet | ||
| 70 µm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Absolute Ethanol (200 proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| RNase free water | Fisher Scientific | BP2484-100 | |
| RNase decontamination reagent, RNase AWAY | invitrogen | 10328-011 | |
| 2-mercaptoethanol | VWR | EM-6010 | |
| RNA extraction kit, RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| DNase kit, RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| DNase | Sigma | D5025-15KU | stock 10 mg/ml in 0.15 M NaCl |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170-10MG | stock 10 µg/ml in PBS |
| Microfluidic electrophoresis system (TapeStation 2200) | Agilent |
References
- Manteniotis, S., et al. Comprehensive RNA-Seq Expression Analysis of Sensory Ganglia with a Focus on Ion Channels and GPCRs in Trigeminal Ganglia. PLoS One. 8 (11), 1-30 (2013).
- Vandewauw, I., Owsianik, G., Voets, T. Systematic and quantitative mRNA expression analysis of TRP channel genes at the single trigeminal and dorsal root ganglion level in mouse. BMC Neurosci. 14 (1), 21 (2013).
- Paintal, A. S. Vagal sensory receptors and their reflex effects. Physiol Rev. 53 (1), 159-227 (1973).
- Springall, D. R., Cadieux, A., Oliveira, H., Su, H., Royston, D., Polak, J. M. Retrograde tracing shows that CGRP-immunoreactive nerves of rat trachea and lung originate from vagal and dorsal root ganglia. J Auton Nerv Syst. 20 (2), 155-166 (1987).
- Ricco, M. M., Kummer, W., Biglari, B., Myers, A. C., Undem, B. J. Interganglionic segregation of distinct vagal afferent fibre phenotypes in guinea-pig airways. J Physiol. 496 (Pt 2), 521-530 (1996).
- Zhao, H., Sprunger, L. K., Simasko, S. M. Expression of transient receptor potential channels and two-pore potassium channels in subtypes of vagal afferent neurons in rat. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 298 (2), 212-221 (2010).
- Zhuo, H., Ichikawa, H., Helke, C. J. Neurochemistry of the nodose ganglion. Prog Neurobiol. 52 (2), 79-107 (1997).
- Chang, R. B., Strochlic, D. E., Williams, E. K., Umans, B. D., Liberles, S. D. Vagal Sensory Neuron Subtypes that Differentially Control Breathing. Cell. 161, 1-12 (2015).
- Kaczyńska, K., Szereda-Przestaszewska, M. Nodose ganglia-modulatory effects on respiration. Physiol Res. 62, 227-235 (2013).
- Taylor-Clark, T. E., Undem, B. J. Sensing pulmonary oxidative stress by lung vagal afferents. Respir Physiol Neurobiol. 178 (3), 406-413 (2011).
- Bautista, D. M., et al. TRPA1 mediates the inflammatory actions of environmental irritants and proalgesic agents. Cell. 124 (6), 1269-1282 (2006).
- Ichikawa, H., De Repentigny, Y., Kothary, R., Sugimoto, T. The survival of vagal and glossopharyngeal sensory neurons is dependent upon dystonin. Neuroscience. 137 (2), 531-536 (2006).
- Hondoh, A., et al. Distinct expression of cold receptors (TRPM8 and TRPA1) in the rat nodose-petrosal ganglion complex. Brain Res. 1319, 60-69 (2010).
- Kummer, W., Fischer, A., Kurkowski, R., Heym, C. The sensory and sympathetic innervation of guinea-pig lung and trachea as studied by retrograde neuronal tracing and double-labelling immunohistochemistry. Neuroscience. 49 (3), 715-737 (1992).
- Choi, D., Li, D., Raisman, G. Fluorescent retrograde neuronal tracers that label the rat facial nucleus: A comparison of Fast Blue, Fluoro-ruby, Fluoro-emerald, Fluoro-Gold and DiI. J Neurosci Methods. 117 (2), 167-172 (2002).
- Calik, M. W., Radulovacki, M., Carley, D. W. A Method of Nodose Ganglia Injection in Sprague-Dawley Rat. J Vis Exp. (93), e1-e5 (2014).
- Ramachandra, R., McGrew, S., Elmslie, K. Identification of specific sensory neuron populations for study of expressed ion channels. J Vis Exp. (82), e50782 (2013).
- Yu, X., Hu, Y., Ru, F., Kollarik, M., Undem, B. J., Yu, S. TRPM8 function and expression in vagal sensory neurons and afferent nerves innervating guinea pig esophagus. Am J Physiol - Gastrointest Liver Physiol. 308 (6), 489-496 (2015).
- Kwong, K., Lee, L. -Y. PGE(2) sensitizes cultured pulmonary vagal sensory neurons to chemical and electrical stimuli. J Appl Physiol. 93 (4), 1419-1428 (2002).
- Joachim, R. A., et al. Stress induces substance P in vagal sensory neurons innervating the mouse airways. Clin Exp Allergy. 36 (8), 1001-1010 (2006).
- Kaan, T. K. Y., et al. Systemic blockade of P2X3 and P2X2/3 receptors attenuates bone cancer pain behaviour in rats. Brain. 133 (9), 2549-2564 (2010).
- Nakatani, T., Minaki, Y., Kumai, M., Ono, Y. Helt determines GABAergic over glutamatergic neuronal fate by repressing Ngn genes in the developing mesencephalon. Development. 134 (15), 2783-2793 (2007).
- Lobo, M. K., Karsten, S. L., Gray, M., Geschwind, D. H., Yang, X. W. FACS-array profiling of striatal projection neuron subtypes in juvenile and adult mouse brains. Nat Neurosci. 9 (3), 443-452 (2006).
- Usoskin, D., et al. Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing. Nat Neurosci. 18, 145-153 (2015).
