Abstract
체성 감각 신경은 열, 기계, 화학, 모두 내생과 환경 대리인에 의한 유해 자극을 형질 도입. 이러한 구 심성 신경 세포의 세포 기관은 감각 신경절 내에 위치하고 있습니다. 감각 신경은 신체의 특정 기관 또는 부분에 분포. 예를 들어, 후근 신경절 (DRG)가 척추에있는 신체 사지에 걸쳐 프로세스를 연장한다. 삼차 신경은 두개골에있는 얼굴을 신경을 분포시키다, 상부기도한다. nodose 신경절의 미주 구 심성은 창자, 심장, 폐를 통해 확장 할 수 있습니다. 호흡,기도 자극, 기침 반사 신경 다음 nodose 뉴런과 같은 기능의 다양한 배열을 제어 할 수 있습니다. 따라서, 이해하고 기능을 조작하기 위해서는기도 특정 신경 하위 집단을 확인하고 분리하는 것이 매우 중요하다. 마우스에서,기도는기도 별 nodose 신경 세포의 역행 추적을위한 형광 추적 염료, 빠른 블루,에 노출에스. nodose 신경이 분해되고 형광 활성화 셀 (FAC) 정렬은 염료 양성 세포를 수집하는 데 사용됩니다. 다음으로, 고품질의 리보 핵산 (RNA)가 차세대 시퀀싱 염색 양성 세포로부터 추출된다. 특정 신경 세포의 유전자 발현이 결정되는이 방법의기도를 사용.
Introduction
체성 감각 신경은 열, 기계, 화학, 모두 내생과 환경 대리인에 의한 유해 자극을 형질 도입. 이러한 구 심성 신경의 세포 기관은 등 지느러미 루트, 삼차, 또는 nodose 신경절로, 감각 신경에 있습니다. 각각의 감각 신경절은 신체의 특정 지역을 innervates 및 해당 지역 내에서 별도의 기관과 조직을 신경을 분포시키다 세포가 포함되어 있습니다. 예를 들어, 후근 신경절 (DRG)가 척추에있는 및 삼차 신경은 두개골에있는 동안기도 1 위 얼굴, 눈, 수막 또는 신경을 분포시키다 뉴런을 포함, 몸과 팔다리에 걸쳐 프로세스를 확장, 2. 미주 신경의 nodose 신경 낮은기도와 폐에 3 두개골 아래 목에 위치하고 있으며, 위장관, 심장에 걸쳐 신경 섬유를 확장 세포 기관을 포함하고있다. 인간의 nodose 신경절 그러나, 마우스에이 융합 혼자 서또한 폐 (4)를 innervates 경정맥 신경절과 함께. 이 융합 된 신경절 자주 / 경정맥 nodose 복잡한, 미주 신경절이라고, 또는 단순히 nodose 신경절 5있다. 여기서,는 nodose 신경절로 지칭된다.
nodose의 구 심성 섬유는 뇌간의 고독한 기관 (NTS)의 핵에 내장 정보를 전달합니다. 이 독특한 신경절에 감각 입력은 소화관 운동성 6, 심장 박동 7, 8, 9 호흡 및 자극 활성화 호흡 응답 10, 11와 같은 기능의 다양한 배열을 제어합니다. 기능과 신경 지배 기관의 다양성, 대상과 개인의 연결 경로를 연구하기 위해 nodose 신경절의 기관 고유의 소집단을 분리하는 것이 중요합니다. 그러나 nodose의 작은 크기와이 사소한 작업이 아니다 포함 뉴런의 수가 제한을 부여. 신경절 nodose 각 마우스는 약 5,000 뉴런 (12) 포함위성 세포를지지하는 광범위한 집단에 추가한다. 5 % 정신 자극기도 - 5,000 nodose 신경 만 3. 따라서 인해 호흡기 자극 또는 병리에기도 - 근에 분포하는 신경 세포 내의 기능적인 형태 또는 분자 변화는, 조밀하게 포장 nodose 신경절에서 손실됩니다.
이 문제를 해결하기 위해 방법을 식별하고기도에 분포 뉴런을 격리하기 위해 개발되었다. 기도는 이후의 근에 분포 nodose 뉴런을 식별하는 추적 형광 염료에 노출시켰다. 빠른 블루 신경 세포에 의해 포착하고이 최대 팔주 (13)에 대해 유지됩니다 자신의 세포 기관에 신속하게 이동했다 - 15. 일단 부드러운, 아직 효율적 해리 프로토콜은 형광 활성화 셀 (FAC) 정렬 염료 라벨 및 세포 생존을 유지하는 데 사용되었다 확인했다. 정렬 세포는 유전자 발현 또는 F를 결정하기 위해 고품질의 리보 핵산 (RNA)을 추출하는 데 사용됩니다또는 다른 다운 스트림 분자 분석. 이 프로토콜은 관심의 조직을 신경을 분포시키다 감각 뉴런을 분리하기위한 유용하고 강력한 기술을 제공한다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
동물 주제와 관련된 절차는 듀크 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.
빠른 블루 1. 비강 관리
빠른 블루의 경우, 최소 2 일 마우스를 안락사 전에 염료를 관리 할 수 있습니다. 염료는 최대 8 주 동안 지속됩니다.
- 천천히 시작 호흡 할 때까지 빛 흡입 마취 (2.5 %의 세보)와 마우스를 마취.
- 마우스를 위해 때때로 일시 천천히 콧 구멍에 염료 용액 40 μL (0.4 mM의 패스트 블루, 1 % 디메틸 설폭 사이드, DMSO, 포스페이트 완충 식염수, PBS)을 심어 여과 팁 200 μL 피펫을 사용하여이 용액을 흡입한다 (도 1A).
- 수직으로 마우스를 잡고 헤드 업, 부드럽게 염료 폐 전체에 확산하기 위해 가슴을 마사지.
해부 및 분석의 날 2. 준비
- 10 ml의 준비0 표 1에 명시된 성분을 조합하여 신경절 해리 용액 (GADS).
- 전용 실험실 영역에서 RNA 추출을 수행합니다. 실험, 70 % 에탄올, 10 % 표백제와의 RNase의 오염 제거 시약과 깨끗한 표면을 시작하기 전에. 이 RNA 원심 분리기 모든 튜브 랙 및 피펫을 포함한다. RNA 사용만을위한 전용 필터 팁 박스가 있는지 확인합니다. 이 샘플을 오염 바와 같이, DNA의 준비를 위해이 장비와 영역을 사용하지 마십시오.
- 의 RNA 분해 효소가없는 물을 신선한 70 %, 80 % 에탄올을 혼합한다. 샘플 당 1 ml의 RNA 추출에 사용될 준비한다.
| 성분 | 양 |
| 고급 DMEM / F12 | 9.5 ml의 |
| 글루타민 | 100 μL |
| HEPES (10 밀리미터) | 100 μL |
| N2 보충 | 100 μL |
| B27 (NO 비타민 A) | 200 μL |
| NGF (50 μg의 / ㎖) | 10 μL |
신경절 해리 솔루션 (GADS) 표 1. 시약의 혼합물.
3. 해부 절차
- 500 μL GADS, 각 실험 샘플에 대한 하나의 긍정적 정렬 제어를위한 하나, 그리고 음의 정렬 제어를위한 하나의 1.5 ml의 튜브를 입력합니다. 해부에 걸쳐 얼음에 보관 튜브.
- nodose 신경절을 해부 및 분리를 용이하게하기 위해 두 부분 컷을 한 후 실험 샘플 튜브에 넣어. nodose 신경절 (16)와 DRG (17)의 해부에 대해 다음 조브 프로토콜을 참조하십시오.
- 정렬 컨트롤, 해부 및 부분적 지느러미 루트 신경절 (DRG)와 같은 비 표지 신경을 잘라. 양성 대조군과 두 gangli 두 신경절을 사용하여부정적인 제어를위한.
- 성공적인 정렬을위한 충분한 nodose 신경 세포를 얻으려면 하나의 실험 샘플 튜브 포함 GADS에 5 쥐에서 신경을 결합한다.
4. 감각 신경절 해리
- 관에 신경을 떠나, 500 μL의 GADS를 피펫. 신경절 후, 튜브의 바닥에 정착 PBS를 피펫을 위해 1 ml의 PBS를 추가하여 한 번에 신경을 씻어 기다립니다.
- 1 ml의 GADS과 소화 효소의 22 μL (콜라게나 제 I / II 및 단백질 분해 효소 믹스, 2.5 ㎎ / ㎖에서 H 2 O)에 각 튜브를 추가합니다.
- 양성 대조군 튜브에 20 μl의 빠른 블루 (5.26 mm)를 추가합니다.
- 이미 37 ℃에서 설정된 수욕 또는 가열 블록에 튜브를 넣고.
참고 : 신경 소화의 시간은 소화 효소의 나이에 따라 달라집니다. 6개월 45 분 동안 소화 - (2) 내에 소화 효소를 용해 1 개월 내에 30 분 동안 소화. 효소가 6 개월 이상 된 경우, 신경 f를 소화또는 60 분. - 15 분마다 흔들어 튜브 짧게 신경을 보장하기 위해 그들을 가볍게는 솔루션이 적용됩니다.
- 신경 소화되는 동안 입자 용액 (폴리 비닐 피 롤리 돈 코팅 된 콜로이드 실리카 입자)를 사용하여 농도 구배를 준비한다.
- GADS에서 12 % 입자 용액, 샘플 당 500 μl를 섞는다.
- GADS에서 28 % 입자 용액, 샘플 당 500 μl를 섞는다.
- 천천히 조심스럽게 각 샘플에 대한 신선한 1.5 ML 튜브에 400 ㎕의 28 % 농도의 용액의 상단에 400 μl의 12 % 밀도 솔루션을 추가 할 수 있습니다. 두 층이 혼합하는 것을 허용하지 않습니다. 두 가지 층은 튜브에 표시한다 다른 것보다 어두운 하나.
- 신경이 소화되는 동안, (정렬 샘플 당 하나의 빠른 긍정적 인 블루와 하나의 빠른 블루 부정적인 튜브를) 정렬 새로운 1.5 ml의 수집 튜브 라벨. INTERFER하지 않도록 정렬 기능 요구에 따라,이 튜브는 착탈 뚜껑 있어야셀 소터와 전자.
- 적절한 소화 시간 후, 소화 효소와 GADS를 제거하고 1 ml의 PBS로 두 번 신경을 씻는다. 각 튜브에 신선한 GADS 200 μl를 추가합니다.
- 떨어져 세포를 파괴하기 위해 위아래로 여러 번 100 μl의 볼륨 설정 200 μL 피펫, 피펫의 신경을 사용합니다. 조직에는 손상 조각이 볼 수없는 때까지 반복합니다. 용액에 거품을 만들지 마십시오.
- 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 해리 세포를 전달합니다.
- 남아있는 나머지 길 잃은 셀을 선택하고 셀 스트레이너를 통해 추가 솔루션을 전달하는 원래 분리 튜브에 또 다른 100 μL의 GADS를 추가합니다. 새로운 피펫 팁을 사용하여 여과기를 통과 메시에 집착 한 나머지 세포 함유 액체를 수집합니다. GADS 현탁 세포의 최종 부피는 300 μL이다.
- 조심스럽게 이전에 만든 밀도 기울기의 상단에 세포의 300 μl를 층. 거품을 피하고 C의 혼합밀도 레이어 ELL 학생.
- RT에서 2,900 XG에서 10 분 동안 원심 분리기.
- 세포를 원심 분리에있는 동안 다음, 용해 완충액 (실험 샘플 당 1 ml)에 섞어 10 ㎕의 2- 머 캅토 에탄올 (RNA 추출 키트) 1 ㎖의 완충액 RLT있다.
- 빠른 블루 긍정적 인 포집 관에 300 μL 용해 버퍼와 빠른 블루 음의 포집 관 (단계 4.7에서 표시 관) 600 μl를 추가합니다. 이 볼륨을 수집 할 예정 셀의 수에 의존한다. 7000 세포 600 μl를 추가 들어 <2,000 세포, 300 μl를 추가>가. 이것은 상당히 용해 완충 용액을 희석하지 않는 정렬 피복 유체를 보장한다.
- 원심 분리가 완료된 후, 조심스럽게 제거하고 700 ㎕의 상단 층을 버린다. 이 계층은 다른 세포 정렬을 방해 세포 파편의 대부분을 포함하고 있습니다.
- 용액을 피펫 함유 나머지 셀에 700 μL의 신선한 GADS 추가테 위아래로 여러 번 혼합한다.
- 세포 펠렛 2,900 XG에 15 분 동안 원심 분리기.
- 세포를 원심 분리기에있는 동안, 1 ML의 GADS 5 μL의 DNase의 (10 ㎎ / ㎖)을 추가하여 GADS를 (샘플 당 500 μl를) 정렬 섞는다.
- 원심 분리가 완료되면 조심스럽게 세포 펠렛을 떠나, 제거하고 상층 액을 버린다.
- 다시 일시 정지 (200)에서 세포 펠렛 - 최대 피펫 팅하여 200 ㎕를 여러 번으로 설정 1,000 μL 피펫과 아래로 300 ㎕를 정렬 GADS를. 얼음에 샘플을 넣습니다. 셀은 정렬 할 준비가 된 것입니다.
5. 형광 활성 셀 (FAC) 정렬
참고 :이 섹션은 운영 FACS 분류기의 지식이나 숙련 된 인력의 도움을 필요로한다.
- 세포 생존 능력을 테스트하기 위해 각각의 샘플 1 ㎕의 요오드화 프로피 듐 (PI) 스톡 용액 (50 μg의 / ㎖)을 추가한다. 이 튜브, PI 하나 하나없이로 음성 대조군을 분할합니다. PI는 죽은 세포에서 DNA를 결합한다. 만약처음 몇 종류 후, PI의 사용이 필요하지 않은 레이블을 할 죽은 세포가 없습니다.
- 전송 세포는 얼음에 예., BD FACS AriaII이, 디바 8 소프트웨어를 실행, 악기 유동 세포 계측법합니다.
- 셀 크기는이 모집단에서 가변하기 때문에, 정렬에 많은 노즐 (100 μm의)을 사용한다. 응력 세포 경험의 양을 감소시키고 세포 생존력은 낮은 압력 (20 PSI)을 사용하여 증가한다.
- 분석 플롯, 필요한 경우 앞으로 산란, 사이드 분산 형 (SSC), 패스트 블루, 그리고 PI를 설정하는 FACS 분류기 소프트웨어를 사용합니다.
- 세포를 다시 일시 중단하려면, 부드럽게 분류기에로드하기 전에 샘플 잠시 소용돌이.
- 게이트 임계 값 (그림 2A)를 설정, 음성 대조군, 더 빠른 블루 또는 PI로 시작합니다. 이 세포 집단의 자기 형광의 양을 결정할 것이다. 옵션 : 죽은 세포의 인구가 있는지 여부를 확인하는 PI와 음성 시료를 실행합니다.
- (INC 양성 대조군 샘플을 정렬보상 매개 변수를 설정하기 위해) 빠른 블루와 ubated.
- 문 및 매개 변수가 설정되면, 실험 샘플을 정렬 시작합니다. RNA 샘플을 용해 완충액을 포함하는 제조 수집 튜브로 정렬된다.
- 셀 정렬이 완료 될 때까지 얼음에 정렬 된 샘플을 유지합니다.
- 세포는 정렬 후 즉시 RNA 추출 단계를 시작한다.
6. RNA 추출
- 1 분 동안 용해 버퍼에 소용돌이 분류 세포를 균질화한다.
- 몇 번을 피펫 팅 아래로 70 % 에탄올과 혼합의 1 볼륨을 추가합니다.
- 스핀 컬럼에 시료 700 ㎕의 최대 전송합니다. 8,000 × g으로 15 초 동안 원심 분리기. 흐름 -을 통해 폐기하십시오.
- 시료의 총 부피가 스핀 컬럼을 통과 할 때까지 반복한다.
- 제조자 protoco에있어서, 상기 DNase를 처리 단계를 포함하는, 350 ㎕의 완충액 RW1을 추가하고 RNA 정제 과정을 계속셀 리터.
- RNA 추출 된 후에, 제조자의 명세에 따른 전기 영동 미세 유체 시스템을 사용하여 RNA의 품질을 테스트한다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
이 방법을 사용하여,기도 - 근에 분포하는 신경 세포는 비강 빠른 블루 (그림 1A)를 주입하여 표시되어 있습니다. 이일 후, 빠른 블루 라벨 세포는 nodose 신경절 (그림 1C)에 나타납니다. nodose 신경절의 총 신경 인구의 5 % -이 세포들은 3을 차지합니다. 이러한 목적을 위해 사용 된 다른 역행 염료 DII (1,1'- 디 옥타 데실 3,3,3 ', 3'- tetramethylindocarbocyanine 과염소산) 및 Fluorogold을 포함한다. 신경 nodose DII 라벨 폐 노출. 그러나, DII가 신경절에 도달하는 데 시간이 더 소요 7~14일 점안 (18, 19) 이후, 따라서 적극적으로 이송 염료를 사용 하였다. Fluorogold 또한기도 뉴런 14, 20 라벨에 사용되었습니다 적극적으로 이송 염료이다. 경험 그러나 한번 염료 (데이타 미기재)가 신속하게 위성 세포가 아닌 신경에 의해 픽업 된 nodose 신경절에서 균체 이르렀다. 빠른블루 대체 적극적으로 성공적으로 신속, 쥐 (21)과기도 - 근에 분포의 nodose 뉴런 (13, 14)에서 DRG 라벨 형광 염료를 전송합니다. 패스트 블루 접근 따라서,보다 견고하고 재생 가능한 나타난다.
nodose 신경절의 박리 이전 16 설명한 그 위치 간략도 1b에 도시되어있다. 소화는 nodose 신경절을 절제 한 후 즉시 시작됩니다. 응집에서 신경 세포를 함께 방지하고 깨끗한 정렬을 허용, 부드러운 소화 효소를 사용하려면 이물질을 취소하고 솔루션을 정렬 신경절에의 RNase를 추가합니다. 다수의 소화 효소 믹스 효과에 대해 시험 하였다. 온화한 소화 효소 믹스 (22)은 그러나, 성인 신경절 소화가 적시에 세포를 분리 깰 정도로 강한 아니었다 시도했다. 대안 적으로, 이전의 파파인 (23)의 조합을 사용하여, 프로테아제및 콜라게나 제 효소 혼합물 (데이터는 도시하지 않음)에 너무 공격적인 것으로 판명 바람직하지 않은 세포 사멸을 야기. 지정된 효소 믹스와 함께 설명 소화 프로토콜은, 높은 세포 생존에 적절한 소화를위한 이상적인 것으로 밝혀졌다.
이전 방법은 레이블이없는 세포 (24)로부터 표지 세포를 분리하는 유리 피펫 따기 설명서 셀을 사용했다. 이 기술은 세포의 적은 수의 단일 세포 분석에 더 적합하다. 수백 또는 수천 개의 세포 집단의 전부가 수집 될 필요 그러나, 48 셀 / hr의 최대 속도로이 기술은 비실용적이다. 목표는 고품질의 RNA를 분리 할 때, 시간이 중요한 변수가된다. 이 열화를 방지하기 위해 가능한 한 빨리 RNA 추출을 시작하는 것이 중요하다. FAC 정렬은 ~ 45 분 전체 레이블 인구의 수집을 허용하고 RNA 추출 후 즉시 시작됩니다.
오 : 유지-together.within 페이지 =를 "1"> 뉴런을 정렬 할 때이 고장의 연결 과정에서 많은 파편을 취소하는 것이 중요하다. 밀도 구배는 해리 샘플에서 파편을 취소하는 데 사용되었다. 작은 반경을 갖도록 C 섬유 뉴런 ~ 24 ㎛의 5 그라데이션을 통해 강제 있도록 충분히 높은 힘으로 원심 분리하는 것이 중요하다.
도 2A 및 B는 정렬 게이트를 설정하는 데 사용되는 음성 및 양성 통제를 나타낸다. 도 2c에서 알 수있는 바와 같이, 해리 패스트 블루 놓아 두 집단으로 nodose 세포를 표지. 이 샘플에서 수집 된 세포 수는 그림 2D에 나열되어 있습니다. 85 % -이 방법에 대한 효율성을 정렬하면 73이다. 신경 세포를 정렬 할 때 전방 산란 및 측면 산란 매개 변수는 특이성을 추가하지 않았다. 신경 세포는 구형 아니기 때문에 이러한 매개 변수는 안정적으로 셀 크기를보고 할 수 없습니다.
"FO : 킵 together.within 페이지를 ="ENT 고품질 RNA의 수율 1 ">에서 세포를 용해 완충액으로 직접 정렬 될 필요 RNA는 미세 전기 영동 시스템이 테스트에 사용 된 정렬 후 즉시 추출한다. RNA (그림 3)의 품질.는 18S와 28S 피크가 RNA 무결성 번호 (RIN)을 계산하는 데 사용되는 겔 전기 영동을 통해 결정된다. 샘플을 시퀀싱 RNA를 들어 RIN이 RNA 샘플은 순서가 될 준비가 지금 7보다 커야합니다 .
그림 1. 미주 신경의 Nodose 신경절에서기도 지배하는 신경 세포의 빠른 블루 라벨. A) 폐에 빠른 블루 비강 내 점적의 표현입니다. 빛 세보 마취, 피펫 마우스가 유체에 흡입되어 있는지 확인하고 마우스의 콧 구멍에 1 % DMSO와 PBS에서 빠른 블루 40 μL, 아래에서.
빠른 블루 긍정적 인 세포에 대한 게이츠 정렬 그림 2. 형광 활성 셀 (FAC). 게이트는 음의 (A)와 양 (B)를 사용하여 정렬 설정하려면 빠른 블루 긍정적 인 인구를 설정하는 제어합니다. 음성 대조군 (A)는 번째 DRG 세포 해리에 폐를 신경을 분포시키다하지 않습니다. 양성 대조군 (B)는 그들이 해부 한 후, 시험관 내에서 패스트 블루로 인큐베이션 DRG 세포를 해리한다. 때문에 해리 신경 세포의 비 구형에, 전방 산란 및 측면 산란 매개 변수는 세포 인구. C)기도 블루. D를 빨리 노출 된 쥐의 신경 세포 nodose 해리의 대표적인 종류)을 정의하는 데 도움이되지 않습니다 (C)에 대한 세포 수. 1000 빠른 블루 (FB) 세포를 수집 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 차기를 사용하여 RNA 품질과 RNA 무결성 번호 (RIN)의 할당 미세 유동 전기 영동 시스템을 사용하여 평가.rophoresis 시스템은 RNA의 품질은 겔 사진 이미지의 18S 및 28S 피크로부터 산출한다. 낮은 피크가 저하 된 RNA를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
이 프로토콜은 미주 신경의 신경절에 nodose기도 - 근에 분포하는 신경 세포를 대상으로하는 방법을 설명한다. 일단 라벨링 신경절 부드럽게 최적 세포 수 및 생존력을 유지하기 위해 분해된다. 이들 뉴런은 FAC가 용해 버퍼에 직접 정렬 및 RNA를 추출 후이다. 이 프로토콜의 의미는, 분리 대상 및 특정 감각 세포 집단의 품질을 보존하는 능력이다. 유전자 발현은 신경이 작은 집단에서 설명되고, 기관 특이 기능 및 신경망이 식별된다.
이 프로토콜의 중요한 단계는 분리 과정을 통해 빠른 진행과 이후의 세포 정렬을 포함한다. 분리 직후에 시작되도록 정렬 시간을 예약하는 것이 중요하다. 이 RNA 추출을위한 모든 튜브와 장비는 모든 RNA 추출 시약, 신선 70 %와 80 % 에탄올 솔루션은 신선한 만든, 그리고 것이 중요하다무료 깨끗하고의 RNase 있습니다.
이 프로토콜은 세포가 단일 세포 RNA 추출 및 시퀀싱 웰 플레이트에 각각 정렬되도록 변형 될 수있다. 또한 이러한 후근 신경절 (DRGs) 등의 다른 감각 신경에서 세포를 분리하기 위해 사용될 수있다. DRGs 다시 추적하는 다른 신체 부위의 색소 주입 이전하고 17 설명했다. 이 프로토콜은 또한 기능적 분석을위한 세포를 수집하기 위해 수정 될 수있다. 대신 용해 완충액으로 세포의 정렬, 신경 세포 배양 배지, GADS로 정렬된다. 이러한 세포 배양 및 칼슘 이미징 또는 전기 생리 기능성 연구에 사용된다.
패스트 블루 양 인구가 예상 결과보다 작은 경우, 새로운 소화 효소를 구매한다. 소화 효소의 세 소화의 효율과 상관된다. 소화 효소는 구입 1 년 이내에 사용해야합니다. 셀 수가 높은 경우에있어서,RNA를 추출하고, 품질 검사. RNA의이 저하되어있는 경우이 시약은 신선하지 않은, 또는 오염 된 것을 나타냅니다. 이 경우, 모든 RNA 추출 영역, 피펫은, 랙, 아무것도 샘플 튜브와 접촉 것이다 철저하게 청소해야합니다. 신선한의 RNase와 DNase의 무료 70 % 및 80 % 에탄올을 확인합니다. 이러한 솔루션을 만들기 위해 사용되는 물과 에탄올은 다른 실험실 소모품 분리 보관 및 RNA 추출 용으로 만 사용한다.
FAC 정렬 패스트 블루 양성 세포를 분리하기위한 신속하고 효율적인 방법이며, 다만, 하나의 제한은 셀 밀도 ml의 완충액 당 2 백만 세포 수 있어야한다는 것이다. 이 프로토콜은 현재의 셀 소터 모델의 한계를 푸시. nodose 신경절 세포의 수는 작다. 셀 소터에 대한 세포 수율이 충분히 얻으려면, 다섯 동물의 세포를 모으고있다. 300 μL 미만의 10 만 일시 중단 된 셀이 - 설명 정렬 부피는 200입니다. 티권장 밀도 아래 ml의 당 약 45 만 세포의 농도에 자신의 변환합니다. 셀 소터를 사용하는 하나의 대안은 형광 현미경 유리 피펫 (24) 직접 선택할 것이다. 이 기술은 느리고 (30) 수집하는데 사용 된 - 시간에 100 세포. 따라서,이 프로토콜은 기존의 방법에 비해 빠른 높은 처리량 방법을 제공한다.
이 프로토콜의 미래 응용 프로그램은기도-근에 분포하는 신경의 특정 인구의 전사 프로필을 확인 할 수있는 기능을 포함한다. 이 프로토콜을 사용하여 수집 고품질 RNA 수집 된 뉴런의 사체를 특성화하는 cDNA 합성 및 차세대 시퀀싱, 및 다른 기술에 대한 주형으로 사용될 수있다. 이러한 방식으로, 유전자 또는 경로 이러한 뉴런에 특정되는 결정될 수있다. 이 정보는 이러한 신경 세포가 정상 생리 학적 조건에서 재생 기능 역할을 규명하는 데 도움이 될 것입니다. 기본되면발현 양상은 시스템이 폐 근에 분포하는 신경 세포에서의 유전자 조절에 미치는 영향을 결정하기 위해 물리적, 화학적 자극이나 병원체에 의해 도전 할 수 있고, 확립되었다. 마지막으로, 유전자를 조절하는 식별함으로써 신규 약물 표적을 식별하고기도 질환에서 신경 기능의 급성 및 만성의 변경을 방해하는 치료법의 효과를 조사하기 시작할 수있다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
NIH에서 지원하는 SEJ에 R01HL105635을 부여합니다. 저자는 기술적 조언 디에고 V. Bohórquez에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 또한 기술 지원을 R. 이안 커밍 감사 및 공작 인간 백신 연구소 연구 유동 세포 계측법 공유 자원 시설 (더럼, NC)에 유동 세포 계측법을 수행하는 단계를 포함한다. 세포 계측법 건강의 국립 연구소, 알레르기 국립 연구소 감염증 (UC6-AI058607)에서 건설 부분 지원을받은 듀크의 지역 Biocontainment 연구소에서 수행 한 흐름.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fast Blue | Polysciences, Inc. | 17740-2 | stock 2 mg/ml in water |
| NeuroTrace 530/615 red Nissle stain | Life Technologies | N21482 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Ca and Mg free | Gibco | 14190-144 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| glutamine (Glutamax) | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| N2 | Gibco | 17502-048 | |
| B27 (no vitamin A) | Gibco | 12587-010 | |
| Nerve Growth Factor (NGF) | Sigma | N6009 | stock 50 µg/ml in PBS/10% FBS |
| digestion enzyme, Liberase DH Research Grade | Roche | 5401054001 | stock 2.5 mg/ml in water |
| particle solution (Percoll) | Sigma | P1644-25ML | |
| Heating block | LabNet | ||
| 70 µm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Absolute Ethanol (200 proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| RNase free water | Fisher Scientific | BP2484-100 | |
| RNase decontamination reagent, RNase AWAY | invitrogen | 10328-011 | |
| 2-mercaptoethanol | VWR | EM-6010 | |
| RNA extraction kit, RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| DNase kit, RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| DNase | Sigma | D5025-15KU | stock 10 mg/ml in 0.15 M NaCl |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170-10MG | stock 10 µg/ml in PBS |
| Microfluidic electrophoresis system (TapeStation 2200) | Agilent |
References
- Manteniotis, S., et al. Comprehensive RNA-Seq Expression Analysis of Sensory Ganglia with a Focus on Ion Channels and GPCRs in Trigeminal Ganglia. PLoS One. 8 (11), 1-30 (2013).
- Vandewauw, I., Owsianik, G., Voets, T. Systematic and quantitative mRNA expression analysis of TRP channel genes at the single trigeminal and dorsal root ganglion level in mouse. BMC Neurosci. 14 (1), 21 (2013).
- Paintal, A. S. Vagal sensory receptors and their reflex effects. Physiol Rev. 53 (1), 159-227 (1973).
- Springall, D. R., Cadieux, A., Oliveira, H., Su, H., Royston, D., Polak, J. M. Retrograde tracing shows that CGRP-immunoreactive nerves of rat trachea and lung originate from vagal and dorsal root ganglia. J Auton Nerv Syst. 20 (2), 155-166 (1987).
- Ricco, M. M., Kummer, W., Biglari, B., Myers, A. C., Undem, B. J. Interganglionic segregation of distinct vagal afferent fibre phenotypes in guinea-pig airways. J Physiol. 496 (Pt 2), 521-530 (1996).
- Zhao, H., Sprunger, L. K., Simasko, S. M. Expression of transient receptor potential channels and two-pore potassium channels in subtypes of vagal afferent neurons in rat. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 298 (2), 212-221 (2010).
- Zhuo, H., Ichikawa, H., Helke, C. J. Neurochemistry of the nodose ganglion. Prog Neurobiol. 52 (2), 79-107 (1997).
- Chang, R. B., Strochlic, D. E., Williams, E. K., Umans, B. D., Liberles, S. D. Vagal Sensory Neuron Subtypes that Differentially Control Breathing. Cell. 161, 1-12 (2015).
- Kaczyńska, K., Szereda-Przestaszewska, M. Nodose ganglia-modulatory effects on respiration. Physiol Res. 62, 227-235 (2013).
- Taylor-Clark, T. E., Undem, B. J. Sensing pulmonary oxidative stress by lung vagal afferents. Respir Physiol Neurobiol. 178 (3), 406-413 (2011).
- Bautista, D. M., et al. TRPA1 mediates the inflammatory actions of environmental irritants and proalgesic agents. Cell. 124 (6), 1269-1282 (2006).
- Ichikawa, H., De Repentigny, Y., Kothary, R., Sugimoto, T. The survival of vagal and glossopharyngeal sensory neurons is dependent upon dystonin. Neuroscience. 137 (2), 531-536 (2006).
- Hondoh, A., et al. Distinct expression of cold receptors (TRPM8 and TRPA1) in the rat nodose-petrosal ganglion complex. Brain Res. 1319, 60-69 (2010).
- Kummer, W., Fischer, A., Kurkowski, R., Heym, C. The sensory and sympathetic innervation of guinea-pig lung and trachea as studied by retrograde neuronal tracing and double-labelling immunohistochemistry. Neuroscience. 49 (3), 715-737 (1992).
- Choi, D., Li, D., Raisman, G. Fluorescent retrograde neuronal tracers that label the rat facial nucleus: A comparison of Fast Blue, Fluoro-ruby, Fluoro-emerald, Fluoro-Gold and DiI. J Neurosci Methods. 117 (2), 167-172 (2002).
- Calik, M. W., Radulovacki, M., Carley, D. W. A Method of Nodose Ganglia Injection in Sprague-Dawley Rat. J Vis Exp. (93), e1-e5 (2014).
- Ramachandra, R., McGrew, S., Elmslie, K. Identification of specific sensory neuron populations for study of expressed ion channels. J Vis Exp. (82), e50782 (2013).
- Yu, X., Hu, Y., Ru, F., Kollarik, M., Undem, B. J., Yu, S. TRPM8 function and expression in vagal sensory neurons and afferent nerves innervating guinea pig esophagus. Am J Physiol - Gastrointest Liver Physiol. 308 (6), 489-496 (2015).
- Kwong, K., Lee, L. -Y. PGE(2) sensitizes cultured pulmonary vagal sensory neurons to chemical and electrical stimuli. J Appl Physiol. 93 (4), 1419-1428 (2002).
- Joachim, R. A., et al. Stress induces substance P in vagal sensory neurons innervating the mouse airways. Clin Exp Allergy. 36 (8), 1001-1010 (2006).
- Kaan, T. K. Y., et al. Systemic blockade of P2X3 and P2X2/3 receptors attenuates bone cancer pain behaviour in rats. Brain. 133 (9), 2549-2564 (2010).
- Nakatani, T., Minaki, Y., Kumai, M., Ono, Y. Helt determines GABAergic over glutamatergic neuronal fate by repressing Ngn genes in the developing mesencephalon. Development. 134 (15), 2783-2793 (2007).
- Lobo, M. K., Karsten, S. L., Gray, M., Geschwind, D. H., Yang, X. W. FACS-array profiling of striatal projection neuron subtypes in juvenile and adult mouse brains. Nat Neurosci. 9 (3), 443-452 (2006).
- Usoskin, D., et al. Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing. Nat Neurosci. 18, 145-153 (2015).
