Abstract
Somatosensoriyel sinirler termal, mekanik, kimyasal, hem endojen ve çevresel faktörlerden oluşan zararlı uyaranlara transduce. Bu afferent nöronların hücre gövdeleri duyusal ganglionlar içinde yer almaktadır. Duyu ganglion vücudun belirli bir organ veya bir kısmını innerve. Örneğin, dorsal kök gangliyon (DRG) Vertebral kolon bulunan ve vücutta ve bacaklarda boyunca süreçleri uzatmak. trigeminal ganglion kafatası bulunan ve yüz innerve ve üst solunum yolları vardır. boğumlu ganglionlar vagal afferentler bağırsak, kalp, akciğerler ve boyunca uzanır. solunum hızı, solunum yolu tahrişi ve öksürük reflekslerinin: boğumlu nöronlar gibi fonksiyonların çeşitli bir dizi kontrol eder. Bu durumda, anlaşılması ve işlevini değiştirmek için, hava yolu spesifik nöronal alt popülasyonlarının belirlenmesi ve izole edilmesi için çok önemlidir. Fare, hava yolları havayolu özgü boğumlu nöronun retrograd takibi için bir floresan tracer boya, Hızlı Mavi, maruzs. nodoz gangliyon parçalanır ve flöresanla aktive edilen hücre (FAC) ayırma boyası pozitif hücrelerin toplanması için kullanılır. Daha sonra, yüksek kaliteli ribonükleik asit (RNA) yeni nesil dizileme için boya pozitif hücreler elde edilir. spesifik nöronal gen ifadesi belirlenir bu yöntem havayolunu kullanarak.
Introduction
Somatosensoriyel sinirler termal, mekanik, kimyasal, hem endojen ve çevresel faktörlerden oluşan zararlı uyaranlara transduce. Bu afferent sinirlerin hücre gövdeleri arka kök, trigeminal veya nodoz gangliyon olarak, duyusal ganglia yer almaktadır. Her duyu ganglion vücudun belirli bölgeleri innervates ve o bölgedeki ayrı organ ve dokuları innerve hücreler içerir. Örneğin, dorsal kök gangliyon (DRG) Vertebral kolon bulunan ve trigeminal ganglion kafatası yer alırken hava yolları 1 üst yüz, gözler, meninksler veya innerve nöron içeren, gövde ve uzuvların boyunca süreçleri uzatmak, 2. Vagus sinirinin boğumlu ganglion alt solunum yolları ve akciğerleri 3 kafatası altındaki boyunda bulunan ve gastrointestinal sistem, kalp boyunca sinir liflerini uzatmak hücre gövdeleri içerir ve. İnsanlarda boğumlu ganglion, ancak fare birleştirildiği, tek başına duruyorAyrıca akciğerleri 4 innervates juguler gangliyon ile. Bu erimiş ganglion genellikle / juguler boğumlu karmaşık, vagus ganglion denilen, ya da sadece boğumlu ganglion 5 edilir. Burada, boğumlu gangliyon olarak adlandırılır.
boğumlu afferent lifler beyin sapındaki yalnız yolu (NTS) çekirdeğine iç organlardan gelen bilgi aktarmak. Bu eşsiz ganglion duyusal girdi böyle gut hareketindeki 6, kalp hızı 7, solunum 8,9 ve tahriş aktive solunum tepkiler 10,11 gibi işlevleri, çeşitli bir dizi kontrol eder. fonksiyonları ve innerve organların bu çeşitliliği sayesinde, hedef ve bireysel nöronal yolları araştırmak için boğumlu ganglion organ spesifik alt popülasyonlar ayırmak için kritik öneme sahiptir. Ancak, boğumlu küçük boyutu ve bu önemsiz bir görev değildir içeren nöronların sınırlı sayıda verilen. Ganglion nodoz Her fare yaklaşık 5.000 nöronlar 12 içerirUydu hücreleri destekleyici geniş bir nüfusa ek olarak. % 5 innervate solunum yollarında - 5000 boğumlu nöronlar, sadece 3. Dolayısıyla, solunum uyarılması veya patolojilere havayolu-innerve nöronların içinde herhangi bir fonksiyonel morfolojik veya moleküler değişiklikler, yoğun dolu boğumlu ganglion kaybolur.
Bu sorunu çözmek için, bir yöntem belirlemek ve hava yollarını innerve nöronlar izole etmek için geliştirilmiştir. üst solunum yolları takip eden innerve nodoz nöronların tespit etmek, bir floresanlı işaretleyici boya maruz bırakılmıştır. Hızlı Mavi nöronlar tarafından yakalandı ve en fazla sekiz hafta 13 korunur hücre gövdeleri hızla yolculuk oldu - 15. Bir kez nazik, henüz etkili, ayrışma protokol floresan aktif hücre (FAC) sıralamak için boya etiketleme ve hücre canlılığını korumak için kullanılan belirlendi. Kriteri hücrelerinin gen ekspresyonunu veya f belirlemek için, yüksek kaliteli ribonükleik asit (RNA) elde etmek için kullanılırveya diğer alt moleküler analizi. Bu protokol, ilgi konusu bir dokuda innerve duyusal nöronlar izole etmek için kullanışlı ve güçlü bir teknik sağlamaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan denekleri Prosedürleri Duke Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
Hızlı Mavi 1. Burun İdaresi
Hızlı Blue, en az 2 gün fare ötenazi önce boya yönetmek. boya sekiz hafta boyunca devam edecektir.
- yavaş başlar nefes kadar hafif inhalasyon anestezisi (% 2.5 sevofluran) ile fare anestezisi.
- Fareyi sağlamak için zaman zaman duraklayarak, yavaş yavaş burun deliğine boya solüsyonu 40 ul (0.4 mM Hızlı Mavi,% 1 dimetil sülfoksit, DMSO, fosfat tamponlu tuz, PBS) aşılamak için filtrelenmiş ipuçları ile 200 ul pipet kullanın çözümü aspire edilir (Şekil 1A).
- Dikey fare tuşunu basılı tutun başkanlık ve yavaşça boya akciğerlere yayılır sağlamak için göğüs masaj yapın.
Diseksiyon ve Analiz gününde 2. Hazırlıklar
- 10 ml hazırlayın0, tablo 1 'de belirtildiği gibi bileşenleri karıştırarak Ganglion ayrışma çözeltisi (GADS).
- özel bir laboratuvar alanında RNA çekimini gerçekleştirebilecek. deney,% 70 etanol,% 10 çamaşır suyu ve RNaz dekontaminasyon reaktifi ile temiz yüzeyler başlamadan önce. Bu RNA santrifüj, herhangi bir tüp rafları ve pipet içermektedir. RNA kullanım için özel filtre ucu kutuları vardır emin olun. Bu örnekler kontamine olarak, DNA hazırlığı için bu ekipmanı ve bölgeyi kullanmayın.
- RNaz içermeyen su ile, taze% 70 ve% 80 etanol karıştırın. örnek başına 1 mi, RNA ekstraksiyonu kullanılmak üzere hazırlanır.
| Bileşen | miktar |
| Gelişmiş DMEM / F12 | 9.5 mi |
| glutamin | 100 ul |
| HEPES (10 mM) | 100 ul |
| N2 takviyesi | 100 ul |
| B27 (vitamin A) | 200 ul |
| NGF (50 ug / ml) | 10 ul |
Ganglion Ayrılma Çözüm (GADS'nin) Tablo 1. Reaktif Karışımı.
3. Diseksiyon Prosedürü
- 500 ul GADS, her bir deney numunesi için bir pozitif ayıklama kontrol için bir ve negatif ayıklama kontrol için bir tane olan 1.5 ml tüpler doldurun. diseksiyon boyunca buz üzerinde saklayın tüpleri.
- boğumlu ganglion inceleyin ve ayrışma kolaylaştırmak için iki kısmi kesimler yapmak, daha sonra deneysel örnek tüpüne koyun. Boğumlu ganglionlar 16 ve DRG 17 diseksiyon için aşağıdaki vallahi protokolü bakınız.
- sıralama kontrolleri için, incelemek ve kısmen böyle dorsal kök gangliyon (DRG) olarak etiketli olmayan ganliyonunu kesti. Pozitif kontrol ve iki Gangli için iki ganglionlar kullanınNegatif kontrol için, bir.
- Başarılı sıralama için yeterli boğumlu nöronlar elde etmek için, bir deney örnek tüpü içeren GADS'yi içine 5 farelerden alınan ganglionlar birleştirir.
4. Duyu Ganglion Ayrılma
- tüp içinde ganglionlar bırakarak, 500 ul GADS'yi dışarı pipetle. ganglionlar sonra, tüpün dibine yerleşmek PBS dışarı pipetle için 1 ml PBS ekleyerek bir kez ganglionlar yıkayın, bekleyin.
- 1 mi GADS ve sindirim enzimi 22 ul (kolajenaz I / II ve proteaz karışımı, 2.5 mg / ml H2O) için her bir tüp ekleme.
- Pozitif kontrol tüpüne 20 ul Hızlı Mavi (5.26 mM) eklenir.
- daha önce 37 ° C'ye ayarlanmış bir su banyosu ya da ısıtma bloğunda tüpleri koyun.
Not: ganglion sindirim zaman sindirim enzimi yaşına bağlıdır. 6 ay 45 dakika süreyle sindirmek - 2 içinde sindirim enzimi çözülmesi 1 ay içinde, 30 dakika boyunca sindirmek. Enzim 6 aydan eski ise, gangliyon f sindirmekya da 60 dakika. - Her 15 dk sallamak tüpleri kısaca ve ganglionlar sağlamak için onları fiske çözümü ile kaplıdır.
- gangliyon dijeste edilir ve bu esnada bir partikül (polivinilpirolidon ile kaplanmış koloidal silis parçacıkları) kullanılarak yoğunluk gradyanları hazırlar.
- GADS'de% 12 parçacık çözümü, numune başına 500 ul karıştırın.
- GADS'de% 28 parçacık çözümü, numune başına 500 ul karıştırın.
- Yavaş yavaş ve dikkatli bir şekilde, her bir numune için yeni bir 1.5 ml'lik bir tüp içinde 400 | il% 28 yoğunlukta çözeltisi üzerine 400 ul% 12 yoğunlukta çözeltisi ilave edilir. iki kat karıştırmak için izin vermeyin. İki farklı katmanlar tüp içinde görünür olmalıdır; Diğer daha koyu bir.
- ganglion sindirilir edilirken, (sıralama numune başına bir Hızlı pozitif Mavi ve bir Hızlı Mavi negatif tüp) sıralama için yeni 1.5 ml toplama tüpleri etiket. interfer etmeyecek şekilde sıralama tesis gereksinimlerine bağlı olarak, bu tüpler sökülebilir kapaklar olmalıdırhücre sıralayıcı ile e.
- Uygun sindirim süresinden sonra, sindirim enzimi ile GADS çıkarın ve 1 ml PBS ile iki kez ganglionlar yıkayın. Her tüpe taze GADS'nin 200 ul ekleyin.
- ayrı hücreler kırmak için yukarı ve aşağı birkaç kez 100 ul hacme ayarlanmış 200 ul pipet, ve pipet ganglion kullanın. doku bozulmamış bir parça görülmektedir kadar tekrarlayın. çözeltide kabarcıkları oluşturmaktan kaçının.
- 70 mikron hücre süzgecinden ayrışmış hücrelere geçerler.
- Sol kalan sokak hücreleri pick up ve hücre süzgecinden ek çözüm geçmek için orijinal ayrışma tüpüne başka bir 100 ul GADS'yi ekleyin. Yeni bir pipet ucu kullanarak, süzgecinden geçirildi ve örgü sarıldı herhangi bir kalan hücre ihtiva eden sıvı toplanması. GADS'de asılı hücrelerin son hacim 300 ul olduğunu.
- Dikkatle önce yapılmış yoğunluk gradyanı üstünde hücrelerinin 300 ul katman. kabarcıkları önlemek ve c karıştırmayoğunluklu tabakalar arşın.
- RT'de 2,900 x g'de 10 dakika süre ile santrifüjlenir.
- Hücreler santrifüj iken aşağıdaki gibi lizis tamponu (deneysel örnek başına 1 mi) karışımı: 10 ul 2-merkaptoetanol (RNA ekstraksiyon kiti), 1 ml tampon RLT bölgesindeki.
- Hızlı Mavi pozitif toplama tüpüne 300 ul lizis tamponu ve Hızlı Mavi negatif toplama tüpüne (adım 4.7 etiketli tüpler) 600 ul ekleyin. Bu hacim, tahsil edilmesi beklenen hücre sayısına bağlıdır. 7.000 hücreleri 600 ul için <2.000 hücreleri, 300 ul ekleyin>. Bu anlamlı lizis tamponu sulandırmak değil sıralama kılıf sıvısı sağlayacaktır.
- Santrifüj tamamlandıktan sonra, dikkatlice çıkarın ve üst 700 ul katmanı atın. Bu katman, aksi takdirde hücre sıralama engel olacak hücre enkaz çoğunluğunu içerir.
- çözümü ve pipet içeren kalan hücreye 700 ul taze GADS'yi eklete yukarı ve aşağı birkaç kez karıştırın.
- pelet hücreleri 2.900 x g'de 15 dakika boyunca santrifüj.
- Hücreler santrifüj iken, 1 mi GADS 5 ul DNase (10 mg / ml) eklenerek GADS (numune başına 500 ul) sıralama karıştırın.
- santrifüj yapıldıktan sonra, dikkatli bir şekilde hücre pelet bırakarak kaldırmak ve supernatant atın.
- Yeniden askıya 200 hücre pelletini - yukarı pipetleme ve 200 ul birkaç kez ayarlanmış bir 1000 ul pipet yardımıyla aşağı 300 ul sıralama GADS'yi. buz üzerinde örnekleri koyun. Hücreler artık sıralanması için hazırız.
5. Floresan Aktif Hücre (FAC) Sıralama
Not: Bu bölümde operasyonel FACS sıralayıcı bilgi ya da kalifiye personel yardım gerektirir.
- hücre canlılığı test etmek için her bir örnek için 1 ul propidyum iyodür (PI) stok solüsyonu (50 ug / ml) eklenir. 2 tüpler, PI ile diğeri olmadan içine negatif kontrol Böl. PI sadece ölü hücreleri DNA bağlar. Eğerİlk birkaç türlü sonra, PI kullanımı gerekli değildir etiketlemek için hiçbir ölü hücreler vardır.
- Ulaştırma hücreleri buz üzerinde örneğin., BD FACS AriaII Diva 8 yazılımını çalıştıran, enstrüman akış sitometri.
- Hücre boyutu, bu popülasyonda, değişken olduğu için, ayırma için büyük bir ağızlık (100 um) kullanın. stres hücreleri deneyimi miktarını azaltmak ve hücre canlılığı düşük basınç (20 psi) kullanmak artırmak.
- Analiz araziler, gerektiğinde ileri dağılım, yan dağılım (SSC), Hızlı Mavi ve PI, kurmak için FACS sıralayıcı yazılımını kullanın.
- hücrelerin yeniden askıya yavaşça sıralayıcı yerleştirmeden önce örnek kısaca vorteks.
- Kapı eşiği (Şekil 2A) ayarlamak için, negatif kontrol, hiçbir Hızlı Mavi veya PI ile başlayın. Bu hücre popülasyonunun otofloresan miktarını belirler. İsteğe bağlı: Ölü hücrelerden oluşan bir nüfus var olup olmadığını belirlemek için PI negatif örnek çalıştırın.
- (Inc pozitif kontrol örneği sıralamaktazminat parametrelerini ayarlamak için,) Hızlı Blue ile ubated.
- kapılar ve parametreler ayarlandıktan sonra, deneysel örnekleri sıralama başlar. Örnekler RNA lizis tampon içeren hazır toplama tüpleri içine sıralanır.
- Hücre sıralama tamamlanana kadar buz üzerinde sıralanan örnekler tutun.
- Hücreler sıralanır hemen sonra RNA ekstraksiyon adımını başlayın.
6. RNA Ekstraksiyonu
- 1 dakika süre ile liziz tamponunda Vortex kriteri hücreler homojenleştirin.
- Birkaç kez aşağı yukarı pipetleme tarafından% 70 etanol ve karışımı 1 hacim ekleyin.
- spin kolona numunenin 700 ul kadar aktarın. 8000 x g'de 15 saniye boyunca santrifüj. flow-through atın.
- Numunenin toplam hacmi eğirme kolonundan geçirildi kadar tekrar edin.
- üreticinin Protoco göre DNaz aşaması da dahil, 350 ul Tampon RW1 ekleyin ve RNA saflaştırma işlemine devamhücreler l.
- RNA ekstre edildikten sonra, üreticinin talimatlarına göre bir mikroakışkan elektroforez sistemi kullanılarak RNA kalitesini test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu yöntem kullanılarak, hava yolu innerve nöronlar intranazal Fast Blue (Şekil 1A) aşılamak ile etiketlenir. İki gün sonra, Fast Blue etiketli hücreler nodoz gangliyon (Şekil 1C) görünür. boğumlu ganglionlar toplam nöronal nüfusun% 5'i - Bu hücreler 3 oluşturuyor. Bu amaç için kullanılan diğer retrograd boyalar DII (1,1'-dioktadesil-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perklorat) ve Fluorogold bulunmaktadır. nöronlar boğumlu DII etiketlere Akciğer maruz kalma. Ancak, DII ganglion ulaşması uzun sürer, 7-14 gün damlatılması 18,19 sonra, bu nedenle aktif taşınan boya kullanılmıştır. Fluorogold aynı zamanda havayolu nöronlar 14,20 etiketlemek için kullanılan bir aktif taşınan boyadır. Bizim tecrübelerimize göre, ancak, bir kez bu boya (veriler gösterilmemiştir) hızla uydu hücreleri ve nöronlar tarafından tutuklanmıştı boğumlu ganglion hücre gövdeleri ulaştı. HızlıMavi alternatif aktif başarılı ve hızlı bir şekilde, sıçanlarda 21 ve havayolu-innerve boğumlu nöronlar 13,14 DRG etiketler floresan boya taşınan olduğunu. Hızlı Mavi bir yaklaşım, bu nedenle, daha sağlam ve tekrarlanabilir görünür.
Boğumlu ganglion diseksiyonu önce 16 tarif edilmiştir ve konumu kısaca Şekil 1B gösterilmiştir. Sindirim boğumlu ganglion eksize edilmiştir hemen sonra başlar. topaklanma nöronlar birlikte önlemek ve daha temiz bir tür için izin hafif bir sindirim enzimi kullanmak için, herhangi bir enkaz temizlemek ve çözüm sıralama ganglionlar RNaz ekleyin. Birden fazla sindirim enzim karışımları için test edilmiştir. Hafif sindirim enzim karışımı 22 ancak yetişkin ganglion sindirim için zamanında hücreleri bozmaya yeterince güçlü değildi, denendi. Alternatif olarak, önceden papain 23 kombinasyonu kullanılan proteazVe kolajenaz enzim karışımı, (veriler gösterilmemiştir) çok agresif olduğu kanıtlanmıştır ve istenmeyen hücre ölümüne neden olmuştur. Belirtilen enzim karışımı ile belirtilen sindirim protokolü, yüksek hücre canlılığı ile zamanında sindirim için doğru olduğu bulunmuştur.
Önceki yöntemler etiketsiz hücrelerden 24 etiketli hücreleri ayırmak için bir cam pipet ile toplama manuel hücre kullandık. Bu teknik, bir hücre az sayıda tek hücre analizi için daha uygundur. yüzlerce ya da binlerce hücrenin tamamı popülasyonu elde edilmesi gereken, ancak 48 hücre / sa.'lik bir maksimum oranı ile bu teknik pratik değildir. amaç, yüksek kaliteli RNA izole etmek, zaman önemli bir değişkendir olur. Bozulmasını önlemek için mümkün olduğunca çabuk RNA çıkarma başlamak önemlidir. FAC sıralama ~ 45 dakika tüm etiketli nüfusun toplanmasını sağlar ve RNA ekstraksiyon hemen sonra başlatılır.
o: keep-together.within-page = "1"> nöronları sıralama yaparken kırık nöronal süreçlerden kadar enkaz temizlemek için önemlidir. Bir yoğunluk gradyan ayrışmış örneklerinden enkaz temizlemek için kullanılmıştır. Küçük bir yarıçapına sahip C-lif nöronlar, ~ um 24 5, degrade geçmeye zorlanır sağlamak için yeterince yüksek bir kuvvette santrifüj önemlidir.
Şekil 2A ve B sıralama kapıları ayarlamak için kullanılır negatif ve pozitif kontroller göstermektedir. Şekil 2C'de görüldüğü gibi, ayrışmış Fast Blue sıralama iki popülasyon boğumlu hücreleri etiketli. Bu örnekten toplanan hücre sayıları Şekil 2D'de verilmiştir. % 85 - Bu yöntem için verimlilik sıralama 73 olduğunu. nöronlar sıralarken ileri dağılım ve yan dağılım parametreleri özgüllük eklemek vermedi. nöronlar küresel olmadıklarından bu parametreler güvenilir hücre boyutunun bildirmek için koyamadık.
"Fo: keep-together.within-page =" KBB kaliteli RNA verimi için 1 "> hücreler lizis tamponu doğrudan sıralanması gerekiyor ve RNA bir mikroakışkan elektroforez sistemi test etmek için kullanılan sıralama hemen sonra çıkarılan olmalıdır. RNA (Şekil 3) kalitesi. 18S ve 28S tepe bir RNA bütünlüğü numarası (RIN) hesaplamak için kullanılan jel elektroforez ile tespit edilir. örnek dizilenmesi RNA, RIN Bu RNA numunesi sekanslanacak hazır artık 7. daha büyük olmalıdır .
Şekil 1. Vagus Sinir boğumlu Ganglia Havayolu innerve Nöronlar Hızlı Mavi Etiketleme. A) ciğerlerine Hızlı Mavi burun damlatılması bir temsili. Işık sevofluran, pipet fare sıvısında aspire edilir emin bir fare burun delikleri içine% 1 DMSO ile PBS içinde Fast Blue 40 ul altında.
Hızlı Mavi Pozitif Hücreleri için Gates'i Sıralama Şekil 2. Floresan Aktif Hücre (FAC). Kapılar negatif (A) ve pozitif (B) kullanan sıralama kurmak için Hızlı Mavi pozitif nüfusu kurmak kontrol eder. Negatif kontrol (A) inci DRG hücreleri ayrışmışEn akciğerleri innerve yok. Pozitif kontrol (b) parçalara edildikten sonra in vitro olarak hızlı mavi ile inkübe edilir DRG hücreleri ayrıştırılır. Nedeniyle ayrışmış nöronlar olmayan küresel şekli, ileri dağılım ve yan dağılım parametreleri hücre popülasyonu. C) solunum yolları Mavi. D Hızlı maruz kalmış farelerin ganglion hücrelerinin boğumlu ayrışmış bir temsilci sıralama) tanımlanmasına yardımcı olmaz (C) hücre sayısı. 1.000 'den fazla Hızlı Mavi (FB) hücreleri toplanmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3. Bir seçecek kullanarak RNA Kalite ve RNA Bütünlük sayısı (RIN) Görevlendirilmesine mikroakışkan Elektroforez Sistemi Kullanımının Değerlendirilmesi.rophoresis sistemi RNA kalitesi betimlenen jel resmin üzerine 18S ve 28S zirveleri hesaplanır. Düşük zirve bozulmuş RNA temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, vagus sinirinin nodoz ganglionlarda hava yolu innerve nöronların hedeflemek için bir yöntemi anlatmaktadır. Bir kez etiketlenmiş, ganglionlar yavaşça optimum hücre sayıları ve canlılığı korumak için ayrışmış. Bu nöronlar FAC lizis tamponu doğrudan sıralanır ve RNA ayıklanır daha sonra. Bu protokolün önemi, hedef izole ve belirli duyusal hücre popülasyonunun kalitesini korumak için yeteneğidir. Gen ekspresyonu nöronların bu küçük nüfus anlatılan ve organa özel fonksiyonları ve sinir ağları tanımlanır.
Bu protokol kritik adımlar ayrışma sürecinde hızlı ilerlemesi ve sonraki hücre sıralama içerir. O ayrışma hemen sonra başlar, öyle ki sıralama zamanı planlamak için önemlidir. RNA ekstraksiyonu için tüm tüpler ve ekipmanları tüm RNA ekstraksiyon reaktifleri, taze% 70 ve% 80 etanol çözeltileri taze yapılır ve bu da önemlidirücretsiz, temiz ve RNaz bulunmaktadır.
Bu protokol, hücrelerin tek hücre RNA ekstraksiyonu ve sekanslama için delikli plakalara tek kriteri şekildedir değiştirilebilir. Aynı zamanda, arka kök gangliyon (DRG) ve diğer duyusal gangliyon hücreleri izole etmek için kullanılabilir. DRG'lerde geri izleme için farklı vücut parçaları boya enjeksiyonu önce yapılmış 17 nitelendirdi. Bu protokol, aynı zamanda işlevsel analiz için hücreleri toplamak için modifiye edilebilir. Bunun yerine lizis tamponu içine hücreleri sıralama, hücreler nöronal kültür ortamı, GADS'yi halinde sıralanır. Bu hücreler daha sonra kültürlenmiş ve kalsiyum görüntüleme veya elektrofizyoloji gibi fonksiyonel çalışmalar için kullanılmaktadır.
Hızlı Mavi pozitif nüfus beklenen sonucu küçükse, yeni sindirim enzimi satın. Sindirim enzimi yaşı sindirim verimliliği ile bağlantılıdır. sindirim enzimi satın alma 1 yıl içinde kullanılması gerekmektedir. hücre sayısı yüksek olması durumunda,RNA ekstre edildi ve kalite test edilmiştir. RNA bozuluyorsa bu reaktifler taze değildir, ya da kontamine olmuş olduğunun bir göstergesidir. Bu durumda, tüm RNA ekstraksiyon alanları, pipetler, raflar, ve bir şey örnek tüpleri ile temas edeceğini iyice temizleyin emin olun. Taze RNase ve DNaz ücretsiz% 70 ve% 80 etanol olun. Bu çözümleri yapmak için kullanılan su ve etanol de diğer laboratuvar malzemeleri ayrı tutulması ve RNA ekstraksiyonu için sadece kullanılmalıdır.
FAC sıralama Fast Blue pozitif hücrelerin izole edilmesi için hızlı ve etkili bir yöntemdir, ancak bir sınırlama hücre yoğunluğu ml tampon için 1 ila 2 milyon hücre olmasıdır. Bu protokol mevcut hücre sıralayıcı modellerinin sınırını iter. boğumlu ganglion hücrelerinin sayısı azdır. hücre sıralayıcı için bir hücre verimi yeterli elde etmek için, beş hayvandan alınan hücreler toplanır. 300 ul ve az 100.000 askıya hücreleri vardır - açıklanan sıralama hacmi 200. TTavsiye yoğunluğunun altında, ml başına yaklaşık 450,000 hücre, bir konsantrasyona yaptığı anlamına gelir. Bir hücre ayırıcıyla için bir seçenek, bir flüoresan mikroskop ve bir cam pipet 24 seçmenize etmektir. Bu teknik, daha yavaş ve 30 toplamak için kullanılmaktadır - her seferinde 100 hücre. Bu nedenle, bu protokol, mevcut yöntemlere kıyasla daha hızlı, yüksek verimli bir yöntem sunmaktadır.
Bu protokolün gelecekteki uygulamalar havayolu-innerve sinirlerin, belirli bir nüfusun transkripsiyonel profilini belirlemek için yeteneği vardır. Bu protokol kullanılarak toplanan, yüksek kaliteli RNA toplandı nöronların Transcriptome karakterize etmek için cDNA sentezi ve yeni nesil dizilemesi ve diğer teknikleri için bir şablon olarak kullanılabilir. Bu şekilde, genler veya yollar bu nöronların spesifik olan saptanabilir. Bu bilgi, bu nöronlar, normal fizyolojik koşullarda oynamak fonksiyonel rolünü aydınlatmak için yardımcı olacaktır. temel kezifade kalıpları sistem akciğer innerve nöronlarda gen regülasyonu üzerindeki etkilerini belirlemek için fiziksel ve kimyasal uyaranlara veya patojenler tarafından itiraz edilebilir, kurulmuştur. Son olarak, genler düzenlenir hangi belirleyerek yeni farmakolojik hedefler belirlemek ve hava yolu hastalıklarında sinir fonksiyonu akut ve kronik değişikliklere müdahale etmek terapötik etkilerini araştırmak için başlayabilirsiniz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
NIH tarafından desteklenen sej için R01HL105635 verin. Yazarlar teknik danışmanlık için Diego V. Bohórquez teşekkür etmek istiyorum. Biz de teknik yardım için R. Ian Cumming teşekkür ve Duke İnsan Aşı Enstitüsü Araştırma Sitometrisi Paylaşımlı Kaynak Tesisi (Durham, NC) flow sitometri gerçekleştirmek. sitometri Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü (adet UC6-AI058607) dan yapımı için kısmi destek aldı Duke Bölgesel biyosınırlılık Laboratuarında gerçekleştirilmiştir Akış.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fast Blue | Polysciences, Inc. | 17740-2 | stock 2 mg/ml in water |
| NeuroTrace 530/615 red Nissle stain | Life Technologies | N21482 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Ca and Mg free | Gibco | 14190-144 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| glutamine (Glutamax) | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| N2 | Gibco | 17502-048 | |
| B27 (no vitamin A) | Gibco | 12587-010 | |
| Nerve Growth Factor (NGF) | Sigma | N6009 | stock 50 µg/ml in PBS/10% FBS |
| digestion enzyme, Liberase DH Research Grade | Roche | 5401054001 | stock 2.5 mg/ml in water |
| particle solution (Percoll) | Sigma | P1644-25ML | |
| Heating block | LabNet | ||
| 70 µm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Absolute Ethanol (200 proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| RNase free water | Fisher Scientific | BP2484-100 | |
| RNase decontamination reagent, RNase AWAY | invitrogen | 10328-011 | |
| 2-mercaptoethanol | VWR | EM-6010 | |
| RNA extraction kit, RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| DNase kit, RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| DNase | Sigma | D5025-15KU | stock 10 mg/ml in 0.15 M NaCl |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170-10MG | stock 10 µg/ml in PBS |
| Microfluidic electrophoresis system (TapeStation 2200) | Agilent |
References
- Manteniotis, S., et al. Comprehensive RNA-Seq Expression Analysis of Sensory Ganglia with a Focus on Ion Channels and GPCRs in Trigeminal Ganglia. PLoS One. 8 (11), 1-30 (2013).
- Vandewauw, I., Owsianik, G., Voets, T. Systematic and quantitative mRNA expression analysis of TRP channel genes at the single trigeminal and dorsal root ganglion level in mouse. BMC Neurosci. 14 (1), 21 (2013).
- Paintal, A. S. Vagal sensory receptors and their reflex effects. Physiol Rev. 53 (1), 159-227 (1973).
- Springall, D. R., Cadieux, A., Oliveira, H., Su, H., Royston, D., Polak, J. M. Retrograde tracing shows that CGRP-immunoreactive nerves of rat trachea and lung originate from vagal and dorsal root ganglia. J Auton Nerv Syst. 20 (2), 155-166 (1987).
- Ricco, M. M., Kummer, W., Biglari, B., Myers, A. C., Undem, B. J. Interganglionic segregation of distinct vagal afferent fibre phenotypes in guinea-pig airways. J Physiol. 496 (Pt 2), 521-530 (1996).
- Zhao, H., Sprunger, L. K., Simasko, S. M. Expression of transient receptor potential channels and two-pore potassium channels in subtypes of vagal afferent neurons in rat. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 298 (2), 212-221 (2010).
- Zhuo, H., Ichikawa, H., Helke, C. J. Neurochemistry of the nodose ganglion. Prog Neurobiol. 52 (2), 79-107 (1997).
- Chang, R. B., Strochlic, D. E., Williams, E. K., Umans, B. D., Liberles, S. D. Vagal Sensory Neuron Subtypes that Differentially Control Breathing. Cell. 161, 1-12 (2015).
- Kaczyńska, K., Szereda-Przestaszewska, M. Nodose ganglia-modulatory effects on respiration. Physiol Res. 62, 227-235 (2013).
- Taylor-Clark, T. E., Undem, B. J. Sensing pulmonary oxidative stress by lung vagal afferents. Respir Physiol Neurobiol. 178 (3), 406-413 (2011).
- Bautista, D. M., et al. TRPA1 mediates the inflammatory actions of environmental irritants and proalgesic agents. Cell. 124 (6), 1269-1282 (2006).
- Ichikawa, H., De Repentigny, Y., Kothary, R., Sugimoto, T. The survival of vagal and glossopharyngeal sensory neurons is dependent upon dystonin. Neuroscience. 137 (2), 531-536 (2006).
- Hondoh, A., et al. Distinct expression of cold receptors (TRPM8 and TRPA1) in the rat nodose-petrosal ganglion complex. Brain Res. 1319, 60-69 (2010).
- Kummer, W., Fischer, A., Kurkowski, R., Heym, C. The sensory and sympathetic innervation of guinea-pig lung and trachea as studied by retrograde neuronal tracing and double-labelling immunohistochemistry. Neuroscience. 49 (3), 715-737 (1992).
- Choi, D., Li, D., Raisman, G. Fluorescent retrograde neuronal tracers that label the rat facial nucleus: A comparison of Fast Blue, Fluoro-ruby, Fluoro-emerald, Fluoro-Gold and DiI. J Neurosci Methods. 117 (2), 167-172 (2002).
- Calik, M. W., Radulovacki, M., Carley, D. W. A Method of Nodose Ganglia Injection in Sprague-Dawley Rat. J Vis Exp. (93), e1-e5 (2014).
- Ramachandra, R., McGrew, S., Elmslie, K. Identification of specific sensory neuron populations for study of expressed ion channels. J Vis Exp. (82), e50782 (2013).
- Yu, X., Hu, Y., Ru, F., Kollarik, M., Undem, B. J., Yu, S. TRPM8 function and expression in vagal sensory neurons and afferent nerves innervating guinea pig esophagus. Am J Physiol - Gastrointest Liver Physiol. 308 (6), 489-496 (2015).
- Kwong, K., Lee, L. -Y. PGE(2) sensitizes cultured pulmonary vagal sensory neurons to chemical and electrical stimuli. J Appl Physiol. 93 (4), 1419-1428 (2002).
- Joachim, R. A., et al. Stress induces substance P in vagal sensory neurons innervating the mouse airways. Clin Exp Allergy. 36 (8), 1001-1010 (2006).
- Kaan, T. K. Y., et al. Systemic blockade of P2X3 and P2X2/3 receptors attenuates bone cancer pain behaviour in rats. Brain. 133 (9), 2549-2564 (2010).
- Nakatani, T., Minaki, Y., Kumai, M., Ono, Y. Helt determines GABAergic over glutamatergic neuronal fate by repressing Ngn genes in the developing mesencephalon. Development. 134 (15), 2783-2793 (2007).
- Lobo, M. K., Karsten, S. L., Gray, M., Geschwind, D. H., Yang, X. W. FACS-array profiling of striatal projection neuron subtypes in juvenile and adult mouse brains. Nat Neurosci. 9 (3), 443-452 (2006).
- Usoskin, D., et al. Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing. Nat Neurosci. 18, 145-153 (2015).
