Summary
الطريقة الموصوفة هنا يسمح تحليل الوقت الفاصل بين تطوير الجهاز في الأجنة الزرد باستخدام مضان تشريح المجهر قادرة على أداء باجتزاء البصرية واستراتيجيات بسيطة من التعديل لتصحيح الانحراف البؤري ومستو.
Abstract
من أجل فهم توالد، والتعديلات المكانية والزمانية التي تحدث أثناء تطور الأنسجة تحتاج إلى أن تسجل. الطريقة الموصوفة هنا يسمح تحليل الوقت الفاصل بين التنمية الكلى الطبيعية وضعف في الأجنة الزرد باستخدام المجهر مضان تشريح مجهزة للإضاءة منظم واكتساب ض المكدس. لتصور تكون الكلية، الزرد المعدلة وراثيا (تيراغرام (wt1b: GFP)) استخدمت هياكل الكلى مع fluorescently المسمى. وقد أثار عيوب الكلى عن طريق الحقن من النوكليوتيد العقاقير morpholino ضد wt1a ورم ويلمز الجين، وهو عامل من المعروف أن حاسمة للتنمية الكلى.
الاستفادة من الإعداد التجريبية هي مزيج من مجهر التكبير مع استراتيجيات بسيطة لحركات إعادة ضبط في العاشر والتوجيه ذ ض أو دون معدات إضافية. للتحايل على الانحراف البؤري التي يسببها تغيرات درجة الحرارة والاهتزازات الميكانيكية، تم تطبيق استراتيجية ضبط تلقائي للصورة بدلا من استخدام غرفة البيئية المطلوبة عادة. من أجل إعادة ضبط التغييرات الموضعية بسبب س ص العائمة، كانوا يعملون غرف التصوير مع شبكات نقل مطبوع.
بالمقارنة مع الاجهزة أكثر تعقيدا لتسجيل الوقت الفاصل مع باجتزاء البصرية مثل المسح الضوئي ليزر متحد البؤر أو المجاهر ورقة الخفيفة، المجهر التكبير من السهل التعامل معها. الى جانب ذلك، فإنه يوفر تشريح الفوائد المجهر معين مثل عمق مجال والعمل لمسافات طويلة.
ويمكن أيضا أن طريقة لدراسة توالد المعروضة هنا أن تستخدم مع المجاهر مضان ستيريو غير قادرة على باجتزاء البصرية. على الرغم من أن يقتصر على الإنتاجية العالية، هذه التقنية تقدم بديلا للمعدات أكثر تعقيدا التي تستخدم عادة لتسجيل الوقت الفاصل بين أنسجة النامية، وديناميات الجهاز.
Introduction
وبعد تكون المعيدة، توالد هو المرحلة التالية من دورة حياة الفرد. أنه ينطوي على إعادة ترتيب والتفاعل وفي كثير من الأحيان هجرة الخلايا لإنتاج الأنسجة والأعضاء. عدم دقة في العمليات الأساسية في تطوير أجهزة وغالبا ما يؤدي إلى الأمراض التي يمكن أن تعبر عن نفسها إما مباشرة أو أيضا في وقت لاحق في الحياة. وهكذا، فقد كان فهم توالد جهدا كبيرا في علم الأحياء التطوري والبحوث الطبية الحيوية. من أجل أن تكون قادرة على تحقيق التنمية من عضو معين، فإنه يجب أن تكون واضحة حتى من خلال جدار الجسم من الجنين. وهذا يتيح للتسجيل للتعديلات المكانية والزمانية التي تحدث أثناء التطور. أيضا من أجل تحليل أهمية العوامل التي تدخل في توالد، فإنه يحتاج إلى أن يكون عرضة للتلاعب.
أحد الكائنات الحية التي هي مناسبة جدا للتحقيق في الجسم الحي توالد هو الزرد. transpar لهاency أثناء التطور الجنيني في تركيبة مع استخدام خطوط المعدلة وراثيا الفلورسنت تتيح رصد توطين البروتين والتعبير ديناميكية، فضلا عن التصور من أجهزة الداخلية 1. وهذا يوفر ميزة فريدة من نوعها فيما يتعلق بالتحقيق في تطوير الجهاز في الوقت الحقيقي بالمقارنة مع النماذج الثدييات التي الأجهزة لا يمكن الوصول إليها عن التحليل المجهري. وعلاوة على ذلك، تتوفر على التعامل مع التطور الجنيني من الزرد أدوات مختلفة. بجانب توليد خطوط متحولة، أليغنوكليوتيد] العقاقير morpholino (MO) يمكن استخدامها لضربة قاضية نشاط معينة الجينات التي تشارك في تطوير بعض الأجهزة. المنظمات الأعضاء إما تستهدف موقع لصق أو متعدية بداية كودون (أغسطس)، وبالتالي تتداخل مع الربط ما قبل مرنا أو الترجمة.
الكلى الجنينية الزرد، وسليفة الكلوة، هو نموذج بسيط تشريحيا ولكن قيمة لدراسة تطوير الكلى وظيفة جنرالوفاق المتعلقة أمراض الكلى 2. وهو يتألف من وحدات وظيفية اثنين فقط تسمى النيفرون. ويتكون كل كليون من الكبيبة حيث يتم ترشيح الدم مكان 3. مكونات أخرى هي منطقة الرقبة قصيرة فضلا عن أنبوب صغير مجزأة لإفراز واستيعاب المواد المذابة والقناة، التي تنتهي في مجرور 4. بغض النظر عن تكوينها بسيط، تنظيم وأنواع مختلفة من الخلايا من سليفة الكلوة الزرد هي تشبه الى حد بعيد في الكلى الثدييات 5،6.
عامل واحد، وهو المشاركة حاسمة في تطور الكلى، يتم ترميز من يلمز ورم القامع الجينات WT1 7. الزرد تمتلك اثنين paralogs دعا wt1a وwt1b يجري التعبير عنه في نمط مماثل تداخل ولكن ليس خلال تطوير سليفة الكلوة 8. باستخدام الزرد المعدلة وراثيا مع سليفة الكلوة هياكل GFP المسمى، وقد تبين أن كامل تدق إلى أسفل من wt1a </ م> أو من شكل لصق خاص يؤدي إلى تشوهات شديدة أو خفيفة في الكلى الجنينية، على التوالي 9،10.
الطريقة الموصوفة هنا يسمح تحليل الوقت الفاصل بين تكون الكلية الطبيعية وضعف في الأجنة الزرد عن طريق استخدام المجهر مضان تشريح مجهزة لباجتزاء البصرية عبر الإضاءة منظم. المقاطع البصرية بشكل عام تسمح اقتناء الصور التي تحتوي فقط على المعلومات في التركيز. خارج نطاق التركيز يمكن تجنبها المعلومات عن طريق نهج مختلفة مثل خوارزميات رياضية (على سبيل المثال. deconvolution)، التصميم البصري (على سبيل المثال متحد البؤر ليزر المسح المجهري) أو مزيج من الاثنين معا (مثل منظم الإضاءة).
للحث على عيوب في التنمية الكلى استخدمنا العقاقير MO ضد wt1a التي تم حقنها في خط الزرد المعدلة وراثيا (تيراغرام (wt1b: GFP)). ويظهر هذا الخط GFP مضان في الكبيبة والرقبة والجزء الأماميجزء من أنبوب صغير 9،10. بالمقارنة مع الاجهزة أكثر تعقيدا للتسجيلات الوقت الفاصل مع باجتزاء البصرية مثل المسح الضوئي ليزر أو المجاهر ورقة الخفيفة، المجهر التكبير من السهل التعامل معها وأقل تكلفة. وعلاوة على ذلك، معدات الإضاءة منظم يمكن بسهولة جنبا إلى جنب مع المعدات التقليدية مضان (على سبيل المثال مضان مصباح، مرشحات) والعروض تشريح المزايا مجهر محددة مثل المسافة العمل الموسعة وميدانية واسعة من الرأي. تم حل مشاكل مع الانجراف دون استخدام معدات إضافية (الغرفة البيئية، طاولة مضادة للاهتزاز) المطلوبة عادة للحصول على نتائج مستقرة. لتصحيح الانحراف البؤري تأسست استراتيجية ضبط تلقائي للصورة واستخدمت غرف التصوير مع شبكات نقل مطبوع لإعادة ضبط المواقع التالية الانجراف في اتجاه x أو ذ.
ويمكن أيضا أن تطبق الطريقة المعروضة على المجاهر بدون خيارات باجتزاء البصرية، مثل مضان ستيريو مicroscopes، ويقدم بديلا لأجهزة أكثر تعقيدا التي تستخدم عادة لتسجيل الوقت الفاصل بين أنسجة النامية، وديناميات الجهاز.
Protocol
وأجريت التجارب على الحيوانات فقط وفقا ل"مبادئ الرعاية الحيوانية المختبر وكذلك إلى الإصدار الحالي من القانون الألماني لحماية الحيوانات.
1. إعداد العقاقير-Morpholino (MO)
- لإعداد ملي MO حل الأوراق المالية 3، إضافة 100 ميكرولتر من العقيمة، والماء عالى النقاء إلى MO مجفف بالتجميد (300 نانومول في قارورة زجاجية). لحل كامل، تسخين المحلول إلى 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. اغلاق القارورة مع بارافيلم وتخزين محلول المخزون MO في درجة حرارة الغرفة (RT). لا فتور الحل الأسهم MO لأن ذلك قد يتسبب في وجود علاقة للMO مع الجدران قنينة.
- إعداد محلول العمل 1 ملم MO عن طريق تمييع الحل الأسهم MO مع معقم، الماء عالى النقاء وإضافة 0.5٪ الفينول حل الأحمر للتركيز النهائي من 0.05٪.
- للحصول على 10 ميكرولتر من محلول العمل MO، إضافة 3.3 ميكرولتر حل الأسهم MO و 1 ميكرولتر من 0.5٪ محلول الفينول الأحمر إلى 5.7 ميكرولتر المياه. يكونالصدارة إعداد دفعة جديدة من العمل الحل حرارة محلول المخزون MO إلى 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- قبل استخدامها، الطرد المركزي الحل العمل MO لمنع إبرة انسداد. على سبيل المثال، وتدور 10 ميكرولتر من MO حل السهم عند 15000 x ج لمدة 5 دقائق (RT) وإزالة 8 ميكرولتر من طاف للحقن.
ملاحظة: قد يحدث فقدان النشاط في الحلول morpholino على مر الزمن 11. استبعاد هذا، يمكن للمرء أن اختبار الحلول من خلال مطياف الأشعة فوق البنفسجية التالية المقدمة من قبل الشركة المصنعة للبروتوكول. وفي حالة wt1a تستخدم morpholino لم وحظ انخفاض فعالية على مدى فترة طويلة من التخزين (تم تخزينها 3 ملي حل العمل لمدة أطول من واحد عام).
2. إعداد أزواج التزاوج وجمع البيض أسمدة
- فترة ما بعد الظهر قبل حقن مكروي، وإنشاء خمسة أزواج من تيراغرام (wt1b: GFP) خط، كل في وعاء تربية مجهزة غربال القابلة للإزالة لفصلالذكور والإناث خلال الليل.
ملاحظة: لضمان أن البيض كافية لإجراء تجربة حقن ناجحة، الأسماك تستخدم أزواج التزاوج يجب أن يكون تم فرزهم وتقييمها بأنها "المنتجين" جيد. - في صباح اليوم التالي، بعد تشغيل أضواء، ووضع الذكور والإناث معا فوق منخل يمنع الأسماك من تلتهم بيضها.
- مشاهدة التفريخ. وبمجرد التوصل إلى كمية من وضع البيض التي يمكن حقنها قبل مرحلة 4 خلايا (حوالي 50)، منفصلة للرجال من الإناث مرة أخرى. نقل البيض مع ماصة باستور في طبق بتري مملوءة بالماء الجنين للجولة الأولى من الحقن. للحصول على جولات إضافية من البيض، ووضع الزوج التزاوج معا ومنفصلة عدة مرات.
3. العمل التحضيري ل microinjection
ملاحظة: تنفيذ الخطوات 3.1 و 3.2 مقدما.
- لإعداد الطبق الذي يحمل الأجنة في موقف خلال الحقن (طبق حقن مكروي) إدراج GLشريحة الحمار في زاوية 40-45 درجة في صحن 94 ملم بيتري مليئة السائل وشفافة، نقية، والسيليكون الغذاء الصف. إزالة الشريحة عند تصلب السيليكون. التي تنتج الأخدود في طبقة السيليكون.
ملاحظة: بدلا من ذلك، استخدم 1.5-3٪ الاغاروز بدلا من السليكون وتخزين طبق في 4 درجات مئوية. - توليد إبر الحقن من الشعيرات الدموية الزجاج مع مجتذب الإبرة.
- استخدام الشعيرات الدموية التي تحتوي على خيوط الداخلية.
ملاحظة: إن خيوط تساعد على نقل الحل MO نحو رأس الإبرة بعد الردم (انظر 3.3). - إنشاء الإعدادات المناسبة على ساحبة إبرة. يجب أن يكون الإبر جيدة للحقن في الزرد نصائح طويلة ورقيقة 12. توليد نصائح بطول حوالي 10 ملم وقطرها من 1.5-2 ميكرون في النهاية لهم. على سبيل المثال، استخدام مجتذب إبرة الأفقي مع الإعدادات التالية: الحرارة = 330، سحب = 0، السرعة = 40، الوقت = 100.
- دراسة نوعية الإبر تحتتشريح المجهر وفرز تلك مع نصائح قصيرة أو طويلة جدا.
ملاحظة: الإبر مع نصائح قصيرة تميل إلى تلف الجنين أثناء هذا مع نصائح طويلة جدا ورقيقة منعطف عندما لمس المشيمه ولا اختراقه.
- استخدام الشعيرات الدموية التي تحتوي على خيوط الداخلية.
- ردم إبرة مع 2 ميكرولتر من محلول العمل MO باستخدام طرف microloader وأدخله حامل إبرة جهاز حقن مكروي.
- كما يتم إغلاق الإبر في نهاية الحافة، توليد الافتتاح معسر الظهر النهاية من الإبرة مع ملاقط حادة تحت المجهر تشريح. وبدلا من استخدام جهاز حقن مكروي لدفع بلطف طرف على سطح صلب (مثل كتلة معدنية صغيرة أو الخلفي من ملاقط).
- معايرة حجم الحقن عن طريق حقن محلول العمل MO إلى قطرة من الزيوت المعدنية وضعت على graticule. ضبط مدة الحقن لإنتاج القطر قطرة من 75 ميكرون للحصول على حجم الحقن ما يقرب من 200 رر.
- ترتيب الأجنة مرحلة 1-الخلية على طول الأخدود من طبق حقن مكروي مع القطب النباتي في الاتجاه من حيث تأتي الإبرة (نحو زاوية 45 درجة من الأخدود).
- خرم المشيماء وصفار البيض مع الإبرة وحقن 200 رر من 1 ملم MO حل العاملة (0.2 بمول) في صفار البيض من 1- إلى الأجنة 2-الخلية.
- باستخدام ماصة باستور مع فتحة واسعة، وجمع كل من الأجنة المحقونة في طبق بيتري مملوءة بالماء الجنين واحتضان لهم في 28.5 درجة مئوية.
- في فترة ما بعد الظهر، وإزالة الأجنة الميتة باستخدام ماصة باستور مع فتحة واسعة واستبدال الماء جنين.
5. إعداد الأجنة لفي فيفو التصوير
- في صباح اليوم التالي، تحل محل المياه الجنين مع المياه التي تحتوي على الجنين 0.003٪ N-الفنيل (PTU) لمنع التصبغ. لا تنطبق PTU قبل نهاية المعيدة لأنه interfكاسيريس مع التطور الجنيني المبكر.
تنبيه: PTU غير سامة وماسخة. ارتداء قفازات في جميع الأوقات، وتجنب استنشاق والاتصال مع الجلد. - Dechorionate الأجنة مع ملاقط حادة تحت المجهر تشريح في هذه المرحلة التنموية المنشودة. الاستيلاء على المشيمه مع زوج واحد من ملاقط ومحاولة للاستيلاء على الجانب الآخر من المشيمه مع الزوج الثاني من الملقط. بعناية سحب ملاقط في اتجاهين متعاكسين دون تعطيل الجنين.
- تخدير الجنين عن طريق استبدال الماء الجنين تحتوي على PTU (0.003٪) مع الماء الجنين تحتوي على PTU (0.003٪) وبنسبة 0.02٪ الأثيل methanesulfonate 3-أمينوبنزوات (تريكين).
- تضمين الجنين في انصهار منخفضة الاغاروز على القاع ساترة μ-الطبق مع نقل شبكة 50 ميكرون. تضمين السليم يتطلب بعض الممارسة.
- إعداد 1 مل aliquots من 0.7٪ الاغاروز في 1.5 مل أنابيب رد فعل ووضعها على كتلة الحرارة مجموعة إلى 36 درجة مئوية. استخدام ماصة باستور مع فتحة واسعة لهيئة تنظيم الاتصالاتnsfer الجنين إلى μ-الطبق. إزالة المياه الجنين الزائد باستخدام ماصة باستير مع طرف رقيقة جدا وتراكب الجنين مع الاغاروز خفف.
- في حين أن الاغاروز لا يزال السائل، وتوجيه جنين مع اثنين من نصائح محمل الجل في الموضع المطلوب، فيما يتعلق بنية الفائدة وكذلك المسافة إلى شبكة النقل. وضع هيكل للاهتمام (هنا سليفة الكلوة) في أقرب وقت ممكن إلى أسفل الزجاج (هنا: الظهرية لأسفل) وفي الجوار القريب إلى الشبكة.
- للحصول على جودة الصورة المثلى تقليل طبقة الاغاروز بين الجنين وأسفل الزجاج عن طريق وضع هيكل مصلحة الجنين في أقرب وقت ممكن إلى أسفل. وبالاضافة الى ذلك، تحديد الجنين في المناطق المجاورة القريبة من الشبكة ولكن الحرص على أن الشبكة سوف لا تراكب مع هيكل الفائدة. تضمين 3-4 أجنة في مختلف μ-أطباق كل واستخدام واحد هو أن وضع أفضل.
- عندما الاغاروز من الصعب بما فيه الكفاية لعقد الانتظار الجنين لمدة 2-3 دقيقة وتراكب الجنين جزءا لا يتجزأ من بالماء الجنين تحتوي على 0.003٪ PTU و 0.02٪ تريكين. صب الماء الجنين الزائد أو إزالته باستخدام ماصة باستير مع طرف رقيقة جدا. إغلاق غطاء μ-الطبق في موقف القفل لمنع التبخر.
ملاحظة: تجنب وقوع فقاعات الهواء في μ-الطبق، لأنها تعيق تسجيل الصورة.
6. المجهري
ملاحظة: استخدام المجهر مجهزة لباجتزاء البصرية عبر الإضاءة منظم. تسجيل صور مع برنامج يحتوي على الوحدات التالية: المتعددة، Z-ستاك، السلاسل الزمنية، البرامج ضبط تلقائي للصورة والتركيز الموسعة.
- الحصول على Z-مداخن
- عكس μ-الطبق. يواجه أسفل الزجاج الآن نحو الهدف ويخدم μ-الطبق بمثابة غرفة التصوير.
- تبديل شريط التمرير في موقف الشبكة وتمكين وضع الإضاءة منظم في ضوابط البرنامج.
- عايرالتركيز شبكة لقناة (ق) من خيار مع العينة إلى أن فحص (الجنين جزءا لا يتجزأ) وذلك باتباع تعليمات معالج معايرة التركيز.
- تنشيط وضع اكتساب ض المكدس وضعه إلى وضع الوسط. التركيز في وسط العينة وتعيينه الطائرة وسط كومة Z- قبل مركز النقر. تعيين البعد ض المكدس عن طريق تحديد النطاق حول موقف وسط.
ولا ينبغي النظر إلى الهياكل كائن بشكل حاد خارج أولا والطائرة الأخيرة من ض المكدس: ملاحظة. - ضبط التباعد بين المقاطع البصرية. للحصول على أفضل ض قرار انقر على زر الأمثل. استنادا إلى عمق أهداف حقل البرنامج سوف يحدد مسافة أوصى به في أعقاب المعيار نيكويست (50٪ التداخل).
ملاحظة: إذا كان يهدف لأحجام ملف أصغر وتصاريح هيكل، رقما أكبر حجم التباعد يدويا. ووضع خطوات أصغر مما أوصى مجرد يؤدي إلى أحجام الملفات الكبيرة دون زيادة في وقت لاحقآل المعلومات.
- الوقت الفاصل بين التصوير
- فتح أداة السلاسل الزمنية وتعيين الفاصل الزمني للتجربة السلاسل الزمنية. على سبيل المثال سجل ض المكدس الصور كل 30 دقيقة على مدى 5 ساعة.
- لتصحيح الانحراف البؤري مع مرور الوقت، انشاء استراتيجية ضبط تلقائي للصورة. ضع علامة في المربع الحوار استراتيجية التركيز، حدد البرامج ضبط تلقائي للصورة من القائمة المنسدلة واختيار القناة TL-Brightfield كقناة مرجعية.
- تبدأ كل نقطة زمنية مع ضبط تلقائي للصورة. من أجل ضمان وجود نطاق البحث موثوق في إطار زمني الأمثل، وضع ثابت 200 ميكرون النسبي نطاق البحث. يتم فحص هذا النطاق بالكامل (المعلمة التغطية المدى) مع جودة الأساسية (المعلمة الجودة) في الحد الأقصى لحجم خطوة (المعلمة أخذ العينات).
- لزيادة دقة ضبط تلقائي للصورة، وتفعيل القياس داخل المنطقة محط اهتمام (التركيز ROI) والموقف وقالت التركيز العائد على الاستثمار في نافذة عرض لايف حول بنية الفائدة.
ملاحظة: إذا كانالنظام يفتقر إلى وحدة البرامج ضبط تلقائي للصورة التي بتحديث مركز ض موقف تلقائيا أثناء تسجيل مرور الزمن، وقفة التجربة في وقت معين وضبط التركيز يدويا ومواصلة التجربة. - لتعويض محتمل س ص العائمة خلال تسجيل السلاسل الزمنية، ضع نقطة معينة من الشبكة مطبوع (من غرفة التصوير) في مرمى البرنامج وحفظ المواقع عن طريق جعل لقطة.
- بدء التجربة السلاسل الزمنية. قبل سلسلة زمنية قد انتهت، وقفة التجربة، وإذا لزم الأمر، وإعادة ضبط وتحديد المواقع وفقا لقطة. تواصل مع التجربة.
تجهيز 7. صورة
- التبديل إلى علامة التبويب تجهيز وتحديد عمق الممتدة من التركيز (EDF) في مربع الحوار الطريقة. منذ يتم الحصول على المقاطع البصرية، وتطبيق خوارزمية الإسقاط القصوى لسلسلة صورة.
ملاحظة: هنا خوارزمية سوف المشروع رightest أو أحلك بكسل من كومة إلى صورة 2D المركبة في خطوة أولى، وفي نهاية المطاف استخدام واحد وفقا لأعلى التباين كصورة نتيجة لكل نقطة زمنية. - استخدام أسلوب الفيلم التصدير إلى إنشاء الفاصل الزمني فيلم (على سبيل المثال افي أو نقل الملفات) من سلسلة صورة EDF.
Representative Results
الوقت الفاصل بين المجهري هو أسلوب فعال لمشاهدة العمليات البيولوجية الحيوية على مدى فترة أطول من الزمن. مشكلة غالبا ما تحدث خلال الوقت الفاصل بين التصوير هي حركة في X، Y ض أو الاتجاه، دعا الانجراف التي تسببها تغيرات درجة الحرارة والاهتزازات الميكانيكية. الطريقة المعروضة هنا يمكن مرور الزمن تسجيل الهياكل وصفت من fluorescently في الأجنة الزرد أو اليرقات على مجهر تشريح دون غرفة البيئية والجدول مضادة للاهتزاز.
للحصول على تعويضات من س ص العائمة، وجزءا لا يتجزأ من العينة في غرفة التصوير مع شبكة نقل مطبوع (الشكل 1). تم استخدام موقع نقطة معينة من الشبكة المتصلة مرمى أداة حاسوبية للعودة العينة إلى موقف تعديل مسبقا (الشكل 2A). تم الحصول على النتائج التي قدمها باستخدام مجهر تكبيرمع المنزلق متكامل لباجتزاء البصرية عبر الإضاءة منظم (الشكل 2B). لتصحيح التنسيق المستمر، وقد تم تأسيسها استراتيجية ضبط تلقائي للصورة. في هذه الاستراتيجية، يتم استخدام ضبط تلقائي للصورة البرنامج للعثور على التركيز على أساس النقيض الأقصى قبل كل نقطة زمنية. يقع هذا المستوى البؤري المحددة لذلك في وقت لاحق كخطة مركز لاقتناء ض المكدس. من أجل تقليل الضيائية في العينة، يتم استخدام قناة brightfield الخفيفة التي تنتقل عن طريق كقناة مرجعية لأنها تتيح مرات التعرض قصيرة بما فيه الكفاية خلال خطوة ضبط تلقائي للصورة (الشكل 2C).
تم تطبيق أسلوب التحليل المقارن للتنمية الكلى في الأجنة morphant المجموعة الضابطة وwt1a من خط الزرد المعدلة وراثيا (تيراغرام (wt1b: GFP)). أثناء تكون الكلية في وقت مبكر ويظهر هذا الخط مخضر في الأديم المتوسط وسيطة، والأسلاف الكلى تنشأ من 9،10 في وقت لاحقفي الأنابيب تشكيل وبراعم كليون (الشكل 3).
يكشف الوقت الفاصل بين تسجيل الصورة التي تكون الكلية في السيطرة morpholino حقن الأجنة هي دون تغيير بالمقارنة مع تلك التي uninjected (النتائج غير معروضة) وتتبع الخطوات الموضحة في وقت مبكر من تطوير الكلى الزرد 3. في 20 HPF الأنابيب سليفة الكلوة تطوير مرئية وفي نصائح الأمامي، وتراكمات كروية من الخلايا، التي تمثل تشكيل براعم كليون يمكن الكشف عنها. خلال الساعات القادمة، الأنابيب وبراعم كليون تنمو وفي وقت لاحق على براعم تبدأ في الصمامات في خط الوسط (الشكل 4، فيديو 2). في المقابل، تعطل تكون الكلية بشدة في الأجنة wt1a morphant. على الرغم من أن الهياكل الأنبوبية GFP إيجابية واضحة في 20 HPF، يبدو أنها أكثر انتشارا وأقل نموا. وعلاوة على ذلك، تم تشكيل أي براعم كليون المناسبة. الفرق الأكثر لفتا إلى رانه التحكم الأجنة في هذه المرحلة الزمنية، ومع ذلك، هو ظهور عدد كبير من الخلايا الفلورسنت خارج سليفة الكلوة تطوير (الشكل 4، فيديو 2). وفي وقت لاحق، وهذه الخلايا تترك مجال سليفة الكلوة وتهاجر من الناحية البطنية (فيديو 2).
تطوير الكلى في الأجنة السيطرة وmorphants wt1a خط المعدلة وراثيا wt1b تم مقارنة من قبل التقاط الصور في مختلف نقاط زمنية محددة 9،10. وعلى النقيض من هذا أسلوب ثابت، وتسجيل الوقت الفاصل يسمح لمتابعة ديناميات تكون الكلية الطبيعية وmisrouting الخلايا الاصلية الكلى الناجمة عن نضوب wt1a.
الشكل 1: رسم توضيحي تخطيطي من الأجنة جزءا لا يتجزأ في الغرفة المتاحة تجاريا مع نقل شبكات. طبق لديهاأربع شبكات، ينقسم كل منها إلى مسافة تكرار 50 ميكرون، مطبوع في أسفل الزجاج ساترة. تم تضمين الجنين للتصوير رأسا على عقب، مع هيكل الكلى على مقربة من ساحة المراقبة ولكن دون تتراكب مع الشبكة. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: أحضر تعديلات للتعويض من الانجراف في الوقت الفاصل بين التصوير والشبكة إسقاط الإضاءة الهيكلية ومكانة متميزة من شبكة النقل في مركز الصورة (تميزت مرمى الصفراء) وبمثابة نقطة مرجعية لاحقة س ص الانحياز في حالة من التحولات الصغيرة. يمثل مستطيل أحمر في المنطقة ذات الاهتمام (ROI) المستخدمة في استراتيجية ضبط تلقائي للصورة (A). وا باجتزاء البصريةق حصلت عليها إضاءة منظم. صورة تظهر بنية الشبكة المتوقعة في المستوى البؤري بعد المعايرة الصحيحة (B). تم تعيين العائد على الاستثمار لاستراتيجية ضبط تلقائي للصورة (مستطيل أحمر) لتغطية الهياكل الجنينية مميزة عالية في المقابل (هنا القطع البدنية النمطية) التي تسمح autofocusing موثوق في هيكل الفوائد (C). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
وتظهر GFP الأجنة مع الأخضر الإسفار في الكلى تطوير الأغطية من الظهرية (A) أو الجانبي (ب) نقل والصور مضان مع الأمامي إلى اليسار: الشكل 3: wt1b المعدلة وراثيا. أرستها، كليون منشم. حزب العمال، أنبوبية سليفة الكلوة. تقريباسوس. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: ضربة قاضية من wt1a يعطل التنمية الكلى الجنينية الممثل، عمق ممتدة من الصور التركيز من التسجيلات مرور الزمن. في السيطرة morpholino حقن الأجنة، وتبين التطورات الحاصلة الكلى التقدم الطبيعي مع الأنابيب النمو وبراعم كليون التي تبدأ في الاندماج في خط الوسط. في المقابل، فشل morphants wt1a لتشكيل براعم كليون السليم وكمية هائلة من الخلايا GFP إيجابية هم خارج مجال سليفة الكلوة. (NP، كليون منشم، حزب العمال، أنبوبية سليفة الكلوة). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذه فايجوري.
التكميلي فيديو 1. تسجيل الوقت الفاصل بين التنمية الكلى الطبيعية في السيطرة morpholino حقن الأجنة. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل). ويظهر الفيديو كيف تنمو الأنابيب وبراعم كليون تبدأ في الصمامات. ابتداء من الساعة 20 HPF، واتخذت صورة في 30 دقيقة فترات على مدى 5 ساعة.
تكميلية الفيديو تسجيل 2. الوقت الفاصل بين تكون الكلية بالانزعاج في الأجنة wt1a morphant. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل). ويظهر شريط الفيديو هجرة الخلايا GFP إيجابية من المنطقة سليفة الكلوة. ابتداء من الساعة 20 HPF، واتخذت صورة في 30 ميلفترات ن خلال الفترة من 5 ساعة.
Discussion
أصبح الزرد كائن نموذج شعبية لدراسات التنمية الفقاريات ونماذج من الأمراض التي تصيب الإنسان. لأن الأجنة الزرد تبقى شفافة، الأجهزة النامية مثل المخ والقلب ويمكن ملاحظة باستخدام مجهر إعداد القياسية. الاستفادة من خطوط المعدلة وراثيا مع مضان محددة بالأعضاء تمكن تقييم توالد طوال مراحل التنمية المختلفة داخل الأجنة الحية بواسطة المجهر مضان. واحد الحد لتصوير التفاصيل الهيكلية للأجهزة كاملة مع المجهر epifluorescence هو معيار تأثير إشارات من كائنات فوق وتحت البؤري. على ضوء هذا خارج نطاق التركيز ليس فقط في النتائج تباين الصورة انخفضت والقرار، كما أنها قد تخفي الهياكل الهامة ذات الاهتمام 13،14. وقد تم تطوير العديد من التقنيات مثل confocal- المسح بالليزر، والغزل confocal- القرص أو المجهري multiphoton للحد من المعلومات خارج نطاق التركيز وبالتالي الزيادهتباين الصورة الإلكترونية وكذلك قرار المحوري. طريقة بديلة للحصول على المقاطع البصرية هو laser- والمسح الضوئي الحرة منظم المجهري الإضاءة، وحقل أساس تقنية الإضاءة واسعة هي وبسيطة لتنفيذ على المجهر العادي 15. النتائج المعروضة هنا توضح أن باجتزاء البصرية، من خلال الإضاءة منظم يتحقق، تنفذ على مجهر تشريح وجنبا إلى جنب مع إعادة بناء الصور التركيز الموسعة، يمكن تصور تفاصيل الهيكلية من المعتاد، واضطرب تنمية الكلى في الزرد. على وجه الخصوص، وفرقت الخلايا GFP إيجابية في morphants wt1a في أعماق الاتصال المختلفة، وسوف صورا لطائرة واحدة فقط مع التدريجي وغالبا التركيز طمس تقلل من تعقيد ثلاثي الأبعاد من النمط الظاهري.
لمتابعة ديناميات جهاز التنظيم وإعادة ترتيب أو اضطراب، والوقت الفاصل بين مضان المجهر هي قوية وإن كانت تقنية معقدة. خلال الوقت الفاصلالاهتزازات طفيفة التصوير أو التقلبات في درجة الحرارة الصغرى تسبب الانجرافات في X، Y ض أو الاتجاه. وهذا يتطلب معدات إضافية (غرفة البيئة، ومكافحة الاهتزاز الجدول) من أجل الحصول على نتائج مستقرة. يستخدم الطريقة المعروضة قدرة المجهر تشريح مع محرك التركيز الآلية لتسجيل الوقت الفاصل بين الصور من دون أجهزة إضافية. للحفاظ على التركيز مستقرة، وقد تم تأسيسها استراتيجية ضبط تلقائي للصورة، وكان يستخدم شبكة نقل مطبوع في الجزء السفلي من غرفة التصوير لتصحيح العاشر، وعدم الاستقرار Y-.
تضمين السليم للجنين هو خطوة حاسمة في البروتوكول. هناك حاجة إلى بعض الممارسات لوضع هيكل مصلحة أقرب وقت ممكن إلى أسفل الزجاج وفي الجوار القريب إلى الشبكة دون تتراكب مع ذلك.
والميزة الرئيسية للطريقة هو أنه أداة بأسعار معقولة وبسيطة للمراقبة المباشرة من العمليات التنموية مثل النمو والهجرة في المعيشةالأجنة على مدى عدة ساعات. وعلاوة على ذلك، تشريح الفوائد المجهر معين مثل حقل كبير من الرأي والعمل لمسافات طويلة تسهل فحص عينات أكبر بما في ذلك أجهزة بأكملها. ومع ذلك، بعض القيود يجب أن يوضع في الاعتبار. التوقف التجربة للتحقق وتعديل المواقع يجعل الإجراء تستغرق وقتا طويلا وغياب التحكم في درجة الحرارة قوية يتغير وقت التنموية "قياسي"، الذي يعرف بأنه آخر ساعة الإخصاب في 28.5 درجة مئوية لمدة 16 الزرد. مشكلة محتملة أخرى هي عمق محدودة من التصوير في الحيوان، وخاصة عندما يقع بنية الفائدة داخل الجنين أو اليرقات. هذا الهيكل هو الكبيبة سليفة الكلوة الزرد، والتي تقع بين و somites والكيس المحي. تم العثور على عمق الحد لتصوير الكبيبة أن يكون حوالي 200 ميكرون، والمسافة التي يتم التوصل بعد 5 أيام من التنمية. في المقابل، الهياكل الفلورسنت التي هي لأوكاتيد أقرب إلى السطح من الحيوان ولا يمكن تصوير لفترة أطول. على سبيل المثال خلايا الكبد يمكن الوصول إليها للتصوير على الأقل حتى 9 DPF. وجود قيود آخر وهو أن تجميد طويل الأمد للجنين أو اليرقات في الاغاروز والعلاج تريكين لحث تأخر النمو وذمة القلب، على التوالي. لأن هذا قد تتداخل مع التطور الطبيعي، فمن المستحسن لتقييد مدة تسجيل مرور الزمن لفترة معينة من الفائدة. للتأكد من خلال الهياكل التصوير من مصلحة تطوير وعادة ما تكون مفيدة لمقارنة (في النهاية) المظهر العام مع أن حيوان أبقى تحت الظروف التجريبية نفسها ولكن من دون تضمين والتخدير.
تسجيل ض المكدس من المقاطع البصرية كل 30 دقيقة على مدى 5 ساعة وحساب لاحق من عمق الممتدة من الصور التركيز قدمت معلومات مكانية وزمانية عن الأحداث في وقت مبكر من المعتاد، واضطراب تنمية الكلى التي يسببها بضربة قاضية من wt1a ذ morpholino بوساطة. وقد أظهرت تؤديها سابقا morpholino ضربة قاضية التجارب بالفعل أن Wt1a يحقق دورا المبكر وأساسيا في تشكيل سليفة الكلوة في الموقع التهجين مع الكلى علامة 17،18 وتوظيف wt1b المعدلة وراثيا: خط GFP للتنمية سليفة الكلوة التصوير في وقت محدد يشير 9،10 كشف أن النتائج نقص wt1a في التشكل الكبيبي تعطلت وفشلت مواصفات خلية رجلاء. وعلى النقيض من هذه الأساليب ثابتة والتسجيلات الوقت الفاصل بين تصور مباشرة ديناميات تكون الكلية الأولى في الأجنة التحكم وهجرة الخلايا GFP إيجابية بعيدا عن المنطقة سليفة الكلوة في morphants wt1a. إمكانية تعقب الخلايا misrouted يعد مرور الوقت يسمح للتحليل أكثر تفصيلا النمط الظاهري.
بشكل عام، فإن الطريقة التي يتم عرضها هنا يوفر غير مكلفة وسهلة الاستخدام بديل للمجمع، ويصعب الوصول إليها ذاتهاtups تستخدم عادة لتصوير مرور الزمن مثل مجهر المسح بالليزر (مجهزة الغرفة البيئية والجدول مضادة للاهتزاز) أو ضوء المجهر ورقة. الروتين وصفه لإصلاح مشاكل الانحراف يمكن أن تطبق أيضا على أداء الوقت الفاصل بين الصور على الاجهزة بدون خيارات باجتزاء البصرية، مثل المجاهر مضان ستيريو.
هذه التقنية ليست فقط مناسبة لتحقيق تنمية الكلى ولكن يمكن أن تطبق أيضا لمراقبة التشكل الطبيعي وعيب من الأجهزة الأخرى مثل القلب أو الكبد. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الطريقة يمكن استخدامها لمراقبة مختلف العمليات أكثر ديناميكية في الكائنات الجنينية والكبار نموذج مثل التئام الجروح أو تجديد.
Disclosures
المؤلف مايكل غراف هو موظف من كارل زايس المجهر GmbH لأن تنتج الأدوات المستخدمة في هذه المادة.
Acknowledgments
نشكر توماس بيتس لقراءة ناقدة وتحسين المخطوطة. كما نشكر كريستينا ايبرت وسابرينا Stötzer لصيانة الأسماك.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Control Morpholino | Gene tools, LLC | Standard control oligo | Prepared control oligo |
| wt1a Morpholinos | Gene tools, LLC | customized | Designted to target the first splice donor site, sequence as published in Ref. 9 |
| 0.5% Phenol red solution | Sigma | P0290 | Injection tracer |
| peqGOLD universal agarose | peqlab | 35-1020 | To prepare microinjection dish |
| Glass capillaries (GC100F-10) | Hugo Sachs Elektronik | 30-0019 | To generate injection needles |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | To load the microinjection needle |
| Dumont forceps | Fine Sience Tools | 91150-20 | To generate an opening at the needle tip |
| Embryo water (0.3x Danieaus´ solution) | 1x: 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4, 0.6 Ca(NO3)2, 5 mM HEPES, pH: 7,5; Do not add methylene blue! | ||
| Graticule 5 mm/0.05 mm | Science Services | PY68039-02 | For calculation of injection amount |
| Pasteur pipette 137 mm, 4.8 ml | Roth | E305.1 | To collect eggs, to transfer embryos and to remove dead embryos |
| Pasteur pipette with ultra-thin tip 157 mm, 3.5 ml | Roth | E304.1 | To remove excess of water |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma | P7629 | For suppression of melanization |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma | E10521 | To anethesize zebrafish |
| Low melting agarose | Biozym | 850111 | For embedding |
| µ-dish 35 mm, high Glass Bottom Grid-50 | ibidi | 81148 | Imaging chamber |
| Gel loader tips | Hartenstein | GS05 | To orient the embryo for proper embedding |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Micropipette puller (model P-97) | Sutter Instrument | To generate injection needles | |
| Micromanipulator | Saur Laborbedarf | For microinjection | |
| Thermomixer copact | Eppendorf | Thermoblock for tempering the low melting agarose | |
| SZ61 (Stereomicroscope) | Olympus | For injection control | |
| Axio Zoom. V16 | Zeiss | For embedding and imaging | |
| ApoTome.2 slider | Zeiss | For optical sectioning | |
| AxioCam MRm | Zeiss | For image acquisition | |
| ZEN 2012 | Zeiss | Imaging software |
References
- Lieschke, G. J. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Drummond, I. A. Kidney development and disease in the zebrafish. J Am Soc Nephrol. 16 (2), 299-304 (2005).
- Drummond, I. A., et al. Early development of the zebrafish pronephros and analysis of mutations affecting pronephric function. Development. 125 (23), 4655-4667 (1998).
- Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3 (10), 1922-1938 (2007).
- Kramer-Zucker, A. G., Wiessner, S., Jensen, A. M., Drummond, I. A. Organization of the pronephric filtration apparatus in zebrafish requires Nephrin, Podocin and the FERM domain protein Mosaic eyes. Dev Biol. 285 (2), 316-329 (2005).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation. Kidney Int. 73 (10), 1120-1127 (2008).
- Kreidberg, J. A., et al. Wt-1 Is Required for Early Kidney Development. Cell. 74 (4), 679-691 (1993).
- Bollig, F., et al. Identification and comparative expression analysis of a second wt1 gene in zebrafish. Dev Dyn. 235 (2), 554-561 (2006).
- Perner, B., Englert, C., Bollig, F. The Wilms tumor genes wt1a and wt1b control different steps during formation of the zebrafish pronephros. Dev Biol. 309 (1), 87-96 (2007).
- Schnerwitzki, D., et al. Alternative splicing of Wilms tumor suppressor 1 (Wt1) exon 4 results in protein isoforms with different functions. Dev Biol. 393 (1), 24-32 (2014).
- Bedell, V. M., Westcot, S. E., Ekker, S. C. Lessons from morpholino-based screening in zebrafish. Brief Funct Genomics. 10 (4), 181-188 (2011).
- Rembold, M., Lahiri, K., Foulkes, N. S., Wittbrodt, J. Transgenesis in fish: efficient selection of transgenic fish by co-injection with a fluorescent reporter construct. Nat Protoc. 1 (3), 1133-1139 (2006).
- Conchello, J. A., Lichtman, J. W. Optical sectioning microscopy. Nat Methods. 2 (12), 920-931 (2005).
- Jensen, E. C. Types of imaging, Part 2: an overview of fluorescence microscopy. Anat Rec (Hoboken). 295 (10), 1621-1627 (2012).
- Chasles, F., Dubertret, B., Boccara, A. C. Optimization and characterization of a structured illumination microscope. Opt Express. 15 (24), 16130-16140 (2007).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Hsu, H. J., Lin, G., Chung, B. C. Parallel early development of zebrafish interrenal glands and pronephros: differential control by wt1 and ff1b. Development. 130 (10), 2107-2116 (2003).
- O'Brien, L. L., et al. Wt1a, Foxc1a, and the Notch mediator Rbpj physically interact and regulate the formation of podocytes in zebrafish. Dev Biol. 358 (2), 318-330 (2011).
