Summary
Описанный здесь метод позволяет покадровой анализ развития органа у эмбрионов данио с помощью флуоресценции рассекает микроскопа, способные выполнять оптические секционирования и простые стратегии переналадки для коррекции фокусного и плоскостную дрейф.
Abstract
Для того, чтобы понять органогенез, пространственные и временные изменения, которые происходят в процессе развития тканей должны быть записаны. Описанный здесь метод позволяет покадровой анализ нормального и нарушенного развития почек у эмбрионов данио с помощью флуоресцентного рассекает микроскопа, оборудованного для структурированного освещения и приобретения Z-стека. Для визуализации нефрогенеза, трансгенная данио (Tg (wt1b: GFP)) были использованы с флуоресцентно меченных структуры почек. Почечная дефекты были вызваны инъекции антисмысловой морфолино олигонуклеотида против гена опухоли Вильмса, wt1a фактор как известно, имеет решающее значение для развития почек.
Преимущество экспериментальной установки является сочетание зум-микроскопа с помощью простых стратегий Переустановка движений в х, у, г направлении без дополнительного оборудования. Чтобы обойти фокусного дрейф, который индуцируется изменением температуры и механических колебаний, Стратегия автоматической фокусировки была применена вместо того, чтобы с использованием обычно требуется климатическую камеру. Для того, чтобы заново настроить позиционные изменения из-за ху дрейфа, использовались камеры формирования изображений с впечатывается переездом сеток.
По сравнению с более сложных установок для покадровой записи с оптическим секционирования, таких как конфокальной лазерной сканирующей или световыми микроскопами листа, зум микроскоп прост в обращении. Кроме того, он предлагает рассекает микроскопом специфические преимущества, такие как высокая глубина резкости и продолжительного рабочего расстояния.
Метод для изучения органогенеза, представленный здесь, также может быть использован с флуоресцентной стереомикроскопов не способных к оптической секционирования. Несмотря на то, ограничивается для высокой пропускной способностью, этот метод предлагает альтернативу более сложного оборудования, которое обычно используется для покадровой записи развивающихся тканей и органов динамики.
Introduction
После гаструляции, органогенеза является очередным этапом жизненного цикла человека. Она включает в себя перегруппировки, взаимодействие и очень часто миграцию клеток для производства тканей и органов. Неточности в процессах, лежащих в основе развития органов часто приводит к болезням, которые могут проявляться немедленно или же в более позднем возрасте. Таким образом, понимание органогенез является одним из основных усилий в области биологии развития и медико-биологических исследований. Для того, чтобы иметь возможность исследовать развитие того или иного органа, он должен быть виден даже через стенку тела эмбриона. Это позволяет запись пространственных и временных изменений, которые происходят в процессе развития. Кроме того, чтобы проанализировать важность факторов, участвующих в органогенеза, он должен быть восприимчив к манипулированию.
Один организм , который чрезвычайно подходит для исследования органогенеза в естественных условиях является данио. Его transparобразность во время эмбрионального развития в сочетании с использованием флуоресцирующих трансгенных линий позволяет наблюдать локализации белка и динамики экспрессии, а также визуализацию внутренних органов 1. Это обеспечивает уникальное преимущество, касающееся исследования развития органов в реальном масштабе времени по сравнению с моделями млекопитающих, чьи органы недоступны для микроскопического анализа. Кроме того, различные инструменты доступны для управления эмбрионального развития данио. Кроме генерации мутантных линий, антисмысловой морфолино олигонуклеотиды (MO) могут быть использованы для нокдаун активности определенных генов, которые участвуют в развитии некоторых органов. MOs либо настроить таргетинг на сайт сплайсинга или трансляционный стартовый кодон (AUG), и тем самым мешают сплайсинга пре-мРНК или трансляции.
Данио эмбриональной почки, Предпочка, является анатомически простой, но ценной моделью для изучения развития почек и функции генэс , связанных с заболеваниями почек 2. Он состоит только из двух функциональных блоков, называемых нефронов. Каждый нефрон состоит из клубочка , где фильтрация крови происходит 3. Другими компонентами являются короткой области шеи, а также сегментированные трубочки для секреции и реабсорбции растворенных веществ и каналом, который заканчивается в клоаки 4. Независимо от своей простой композиции, организация и различные типы клеток данио предпочки очень похожи на почки млекопитающих 5,6.
Одним из факторов, который критически участвует в развитии почек, кодируется опухолевый супрессор гена Вильмса Wt1 7. Данио обладают двумя паралоги называемые wt1a и wt1b выражается в перекрывающийся , но не идентичной картины в процессе разработки предпочки 8. Используя трансгенного данио с GFP-меченых пронефрос структур, было показано , что полный нокдаун из wt1a </ EM> или определенной формы сплайсинга приводит к тяжелым или мягких пороков развития зародышевого почки соответственно 9,10.
Описанный здесь метод позволяет покадровой анализ нормальной и нарушенной нефрогенеза в данио эмбрионов с использованием флуоресцентного рассекает микроскопа, оборудованного для оптического секционирования с помощью структурированного освещения. Оптические секции в целом позволяют приобретение изображений, которые содержат только в фокусе информации. Из фокуса информации можно избежать с помощью различных подходов , таких как математические алгоритмы (например. Деконволюции), оптической конструкции (например , конфокальной лазерной сканирующей микроскопии) или комбинацией обоих (например , структурированное освещение).
Для того, чтобы вызвать дефекты развития почек мы использовали антисмыслового MO против wt1a , который был введен в трансгенное данио линии (Tg (wt1b: GFP)). Эта линия показывает GFP-флуоресценцию в клубочек, шеи и переднейчасть трубочки 9,10. По сравнению с более сложных установок для покадровой записи с оптическим секционирования, таких как лазерное сканирование или легких листовых микроскопов, зум-микроскоп прост в обращении и дешевле. Кроме того, оборудование для структурированной подсветки легко можно комбинировать с обычным флуоресцентным оборудованием (например , флуоресцентной лампы, фильтры) и предлагает микроскопом рассекает специфические преимущества , такие как расширенное рабочее расстояние и большим полем зрения. Проблемы, связанные с дрейфом были решены без использования дополнительного оборудования (климатическую камеру, настольный антивибрационные), как правило, необходимое для стабильных результатов. Для коррекции фокусного дрейфа была создана стратегия автоматической фокусировки и камеры формирования изображений с отпечатками переездом сетки были использованы для подрегулировать позиционирование следующий дрейф в х или у направлении.
Предложенный метод может быть также применен к микроскопам без оптических вариантов секционирования, таких как флуоресценция стерео мicroscopes и предлагает альтернативу более сложного оборудования, которое обычно используется для покадровой записи развивающихся тканей и органов динамики.
Protocol
Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с «Принципы лабораторного ухода за животными», а также к текущей версии Закона о немецкой защите животных.
1. Приготовление антисмысловых-морфолино (MO)
- Для получения 3 мМ MO исходного раствора, добавляют 100 мкл стерильной, сверхчистой воды к лиофилизированной МО (300 нмоль в стеклянной ампуле). Для полного растворения, нагрева исходного раствора до 65 ° С в течение 5 мин. Уплотнение флакон парапленкой и хранить маточного раствора MO при комнатной температуре (RT). Не охлаждать маточный раствор MO потому что это может вызвать ассоциацию МО с флаконах стенами.
- Приготовить рабочий раствор 1 мМ MO путем разбавления исходного раствора, MO стерильной, сверхчистой воды и добавляют 0,5% фенола красного раствора до конечной концентрации 0,05%.
- Для того, чтобы получить 10 мкл рабочего раствора MO, добавьте 3,3 мкл MO исходного раствора и 1 мкл 0,5% фенола красного раствора до 5,7 мкл воды. Бытьносовой подготовке новой партии рабочего раствора нагрева МО маточного раствора до 65 ° С в течение 5 мин.
- Перед использованием отцентрифугировать рабочего раствора MO, чтобы предотвратить засорение иглы. Например, вращение по 10 мкл М.О. маточного раствора при 15000 х г в течение 5 мин (RT) и удалить 8 мкл надосадочной жидкости для инъекций.
Примечание: Потеря активности может произойти в морфолино растворах с течением времени 11. Чтобы исключить это, можно протестировать решения от УФ - спектрометрии в соответствии с протоколом от изготовителя. В случае используемых wt1a морфолино снижение эффективности не наблюдалось в течение длительного срока хранения (3 рабочего раствора мМ хранилось дольше , чем один год).
2. Настройка Спаривание пар и сбор оплодотворенных яиц
- Во второй половине дня до микроинъекции, установить пять пар Т.Г. (wt1b: GFP) линии, каждая из которых в селекционной контейнер , снабженный съемным ситом для отделениямужчины и женщины в ночное время.
Примечание: Для того, чтобы обеспечить достаточное количество яиц доступны для успешного эксперимента инъекции, рыба используется в качестве пары сопрягаемых должны быть предварительно просеивают и оценены как хорошие "производителей". - На следующее утро, после того, как загорятся световые индикаторы, поставить мужчины и женщины вместе над ситом, которое предотвращает рыбы от употребления в пищу свои яйца.
- Смотрите на нерест. После того, как количество яйца откладываются, которые могут быть введены до 4-клеточной стадии снова достигается (около 50), отдельный мужчина от женщины. Передача яйца с пипеткой Пастера в чашке Петри заполнены эмбрион водой в течение первого цикла впрыска. Чтобы получить дополнительные раунды яиц, положите пару ответная вместе и отдельно несколько раз.
3. Подготовительные работы для микроинъекции
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаги 3.1 и 3.2 заранее.
- Чтобы приготовить блюдо, которое держит эмбрионов в положении во время инъекции (микроинъекции блюдо) вставить ГЛзадницу скольжения под углом 40-45 ° в 94 мм чашке Петри заполнены жидкостью, прозрачной, чистой, пищевой сорт кремния. Удалить слайд, когда силикон затвердел. Это создает канавку в слое кремния.
Примечание: В качестве альтернативы, использовать 1,5-3% агарозном вместо кремния и хранить блюдо при температуре 4 ° С. - Сформировать иглы для инъекций из стеклянных капилляров с помощью иглы съемника.
- Используйте капилляры, которые содержат внутренние нити.
Примечание: Нить поможет транспортировать решение MO к острию иглы после засыпки (см 3.3). - Установите соответствующие настройки на иглы съемника. Хорошие иглы для инъекций в данио должны иметь длинные и тонкие советы 12. Сформировать наконечники с длиной около 10 мм и диаметром 1,5-2 мкм при самом их конце. Например, можно использовать горизонтальную иглы съемник со следующими параметрами: Heat = 330, Pull = 0, скорость = 40, Время = 100.
- Проверьте качество игл в соответствии срассекает микроскоп и разобраться в тех, с короткими или слишком длинными концами.
Примечание: Иглы с короткими наконечниками, как правило, повреждение эмбриона в то время как такие очень длинные и тонкие советы изгиба при прикосновении к хориона и не проникают его.
- Используйте капилляры, которые содержат внутренние нити.
- Засыпка иглу с 2 мкл рабочего раствора MO, используя наконечник microloader и вставьте его в держатель иглы микроинъекции аппарата.
- Поскольку иглы закрыты в конце наконечника, сформировать отверстие зажимая назад самый конец иглы с острыми пинцетом под микроскопом рассечение. В качестве альтернативы использовать аппарат микроинъекции , чтобы аккуратно вставьте кончик к жесткой поверхности (например, блок небольшой металлический или задней пинцетов).
- Откалибруйте объем впрыска путем введения рабочего раствора MO в каплю минерального масла, помещенного на сетке. Регулировка длительности впрыска для получения диаметр капель 75 мкм, чтобы получить объем впрыска приблизительно 200 мкл.
- Расположить эмбрионов стадии 1-клеток вдоль канавки микроинъекции Петри с вегетативный полюс к направлению, откуда игла приходит (к 45 ° угол канавки).
- Проколите хориона и желток с иглой и вводят 200 мкл на 1 мМ МО рабочего раствора (0,2 пмоль) в желток от 1 до 2-клеточных эмбрионов.
- С помощью пипетки Пастера с широким отверстием, собрать все инжектированных эмбрионов в чашке Петри заполнены эмбрион водой и инкубировать их при 28,5 ° С.
- Во второй половине дня, удалить мертвые эмбрионы с помощью пипетки Пастера с широким отверстием и замените воду эмбриона.
5. Приготовление зародыши для In Vivo изображений
- На следующее утро, замените воду эмбриона с эмбрионом воды, содержащей 0,003% N-фенилтиомочевину (PTU) ингибировать меланизации. Не применять PTU до конца гаструляции потому, что он INTERFEres с раннего эмбрионального развития.
ВНИМАНИЕ: PTU является токсичным и тератогенным. Надевайте перчатки во все времена и избегать вдыхания и контакта с кожей. - Dechorionate эмбрионов с острыми пинцетом под микроскопом рассечение на нужной стадии развития. Возьмите хориона с одной парой пинцетом и попытаться захватить другую сторону хориона со второй парой пинцетов. Осторожно потяните пинцет в противоположных направлениях, не нарушая эмбриона.
- Обезболить эмбриона путем замены эмбриона воды, содержащей PTU (0,003%) с эмбрионом водой, содержащей PTU (0,003%) и 0,02% -ного раствора 3-аминобензойной кислоты метансульфонат (Tricaine).
- Встраивание эмбриона в низкой температурой плавления агарозы на покровного стекла дном мю-блюдо с переселении сеткой 50 мкм. Правильное вложение требует некоторой практики.
- Подготовить 1 мл аликвоты 0,7% агарозы в 1,5 мл реакционных труб и поместить их на блок термофиксации до 36 ° C. Используйте пипетку Пастера с широким отверстием для TRAnsfer эмбриона к мю-Петри. Удалите излишки воды эмбриона с помощью пипетки Пастера с ультра-тонким кончиком и наложения эмбриона с закаленным агарозы.
- В то время как в агарозном все еще жидкость, ориентируют эмбриона с двумя гелевые загрузчиком в нужное положение, в отношении интересующей структуры, а также от расстояния до перемещения сетки. Поместите интересующую структуру (здесь Предпочка) как можно ближе к стеклянным дном (здесь: дорсальную вниз) и в непосредственной близости к сетке.
- Для получения оптимального качества изображения минимизировать агарозном слой между эмбрионом и стеклянным дном, помещая интересующую структуру эмбриона, как можно ближе к основанию. Кроме того, местонахождение эмбриона в непосредственной близости от сетки, но позаботиться о том, что сетка не будет накладывать со структурой, представляющей интерес. Встраивание 3-4 эмбрионов в разных мю-блюд каждый и использовать тот, который позиционируется лучше всего.
- Когда агарозном трудно достаточно, чтобы держать эмбриона ждать 2-3 Мин и наложение встроенного эмбриона с эмбрионом воды, содержащей 0,003% PTU и 0,02% Tricaine. Слейте лишнюю воду эмбриона или удалить его с помощью пипетки Пастера с ультра-тонким кончиком. Закройте крышку мю-блюдо в положении блокировки, чтобы предотвратить испарение.
Примечание: Во избежание появления пузырьков воздуха в мю-блюдо, так как они ухудшают запись изображения.
6. Микроскопия
Примечание: С помощью микроскопа, оборудованного для оптического секционирования с помощью структурированного освещения. Запись изображений с программным обеспечением, содержащим следующие модули: Многоканальный, Z-стек, временные ряды, Программное обеспечение автофокусировкой и сосредоточенно.
- Приобретение Z-стеки
- Обратить мю-блюдо. Дно стекло теперь смотрит в сторону цели и μ-блюдо служит в качестве изображения камеры.
- Переключите ползунок в положение сетки и включить режим структурированного освещения в режиме программного управления.
- калиброватьфокус сетки для канала (ов) выбора с образцом, чтобы изучить (встроенный эмбриона), следуя указаниям мастера калибровки фокусировки.
- Активация режима захвата г-стека и установить его в центр режиме. Фокус в середину образца и установить его в качестве центральной плоскости z- стека, нажав Center. Установить размер Z-стека, определив диапазон вокруг центральной позиции.
Примечание: структуры объекта не должно быть резко проявлялось вне первой и последней плоскости Z-стека. - Регулировка расстояния между оптическими секциями. Для достижения наилучшего г-разрешением нажмите кнопку оптимальной. На основе глубины резкости целей программное обеспечение будет установлен рекомендуемый расстояние следуя критериум Найквиста (50% перекрытием).
Примечание: Если целью для меньшего размера файла и разрешений структуры, установить больший размер Разнос вручную. Установка небольших шагов, чем рекомендуется будет просто привести в больших размерах файлов без увеличения позжеаль информация.
- Время покадровой обработки изображений
- Откройте инструмент временных рядов и установить интервал эксперимента временных рядов. К примеру записывать изображения Z-стек каждые 30 мин в течение 5 часов.
- Для коррекции фокусного дрейфа с течением времени, создать стратегию автоматической фокусировки. Проверьте диалоговое окно Фокус стратегии, выберите Software Автофокус из раскрывающегося списка и выберите канал TL-Светлое в качестве опорного канала.
- Начните каждый момент времени с автофокусом. Для того, чтобы обеспечить надежный диапазон поиска в пределах оптимизированного периода времени, установите фиксированный 200 мкм относительный диапазон поиска. Этот диапазон полностью сканируется (параметр Диапазон охвата) с основным качеством (параметр качества) в максимальном размере шага (параметр выборки).
- Для повышения точности автоматической фокусировки, активировать измерение в фокусе представляющей интерес области (фокус ROI) и положение сказал фокус ROI в окне просмотра в реальном времени вокруг структуры, представляющей интерес.
Примечание: Еслив системе отсутствует программный модуль автоматической фокусировки, которая автоматически обновляет центральную Z-позицию во время записи в заданный промежуток времени, приостановить эксперимент в данный момент времени и настроить фокусировку вручную и продолжить эксперимент. - Для компенсации потенциального ху дрейфа во время записи временных рядов, установите конкретную точку импринтированного сетки (камеры формирования изображения) в перекрестье программного обеспечения и сохранить позиционирование, сделав скриншот.
- Начало эксперимента временных рядов. Перед тем как интервал времени серии закончился, приостановить эксперимент и, при необходимости, подрегулировать позиционирование в соответствии с экрана. Продолжить с экспериментом.
Обработка 7. Изображение
- Перейдите на вкладку обработки и выберите расширенной глубины фокуса (EDF) в диалоговом окне Method. Поскольку оптические участки приобретаются, применить алгоритм максимального проецирования для серии изображений.
Примечание: Здесь алгоритм будет проецировать брightest или темный пиксель из стека к композитному 2D-изображения в качестве первого шага и в конечном итоге использовать один с самой высокой дисперсией в результате изображение для каждого момента времени. - Используйте метод Movie экспорта , чтобы создать Промежуток времени фильма (например , AVI или переместить файл) из серии изображений EDF.
Representative Results
Покадровый микроскопия является мощным средством, чтобы наблюдать динамические биологические процессы, в течение более длительного периода времени. Часто встречающиеся проблемы во время съемки в заданный промежуток времени происходит движение в х, у, г направлении, называемый дрейф, который индуцируется изменением температуры и механических колебаний. Изложенный здесь метод позволяет Замедленная съемка флуоресцентно меченых структур у эмбрионов данио рерио или личинок на рассекает микроскопом без экологической камеры и таблицы антивибрационные.
Для компенсации Оху дрейфа, образец был встроен в камеру формирования изображения с тисненой перемещения сетки (рисунок 1). Расположение определенной точки сетки , связанной с перекрестье программного инструмента был использован для возврата образца в предварительно отрегулированном положении (рис 2А). Представленные результаты были получены при использовании трансфокатора микроскопас интегрированным ползуна для оптического секционирования посредством структурированного освещения (Фигура 2В). Для непрерывного фокальной коррекции, была создана стратегия автоматической фокусировки. В рамках этой стратегии, программа автоматической фокусировки используется для поиска фокусировки на основе максимального контраста перед каждой временной точки. Это определенная таким образом фокальной плоскости затем установить в качестве плана центра для приобретения г-стека. Для того чтобы минимизировать фототоксичности в образце, проходящий свет канал светлого используется в качестве опорного канала , поскольку это позволяет достаточно короткое время выдержки в течение стадии автоматической фокусировки (фиг.2с).
Метод был применен для сравнительного анализа развития почек у wt1a должного обеспечения morphant эмбрионов трансгенных данио линии (Tg (wt1b: GFP)). Во время раннего нефрогенеза эта линия показывает зеленую флуоресценцию в промежуточном мезодермы, были прародителями почек возникают из 9,10 и более поздних версийв формировании канальцев и нефрона зачатков (рисунок 3).
Время покадровой записи изображения показывает , что нефрогенеза в контрольных морфолино вводят эмбрионов неизменна по сравнению с неинъецированных единиц (результаты не показаны) , и следует описанные этапы раннего развития данио почки 3. В 20 HPF развивающихся pronephric канальцев видны и на их передних кончиках, могут быть обнаружены сферические скопления клеток, представляющие собой формирующуюся нефроне зачатки. В течение последующих часов, канальцы и нефрон зачатки растут , а затем на зачатков начинают плавиться по срединной линии (рисунок 4, видео 2). В противоположность этому , нефрогенеза сильно нарушается у wt1a morphant эмбрионов. Хотя GFP-позитивные трубчатые структуры открыты в 20 часов после оплодотворения, они кажутся более размытыми и менее развиты. Кроме того, не было сформировано никакого надлежащего зачатки нефрон. Самое поразительное различие в тон контролировать эмбрионы в этот момент времени, тем не менее, является появление большого числа флуоресцирующих клеток вне развивающихся предпочки (рисунок 4, видео - 2). Впоследствии эти клетки покидают поле pronephric и мигрируют вентрально (видео 2).
Развитие почек у контрольных эмбрионов и wt1a морфантов в wt1b трансгенной линии были ранее чем принимая изображения в различных точках фиксированного времени 9,10. В отличие от этого статического метода записи в заданный промежуток времени позволяет проследить динамику нормальной нефрогенеза и misrouting клеток - предшественников в почках , вызванных истощением wt1a.
Рисунок 1: Схематическое изображение вложенном Эмбрион в коммерчески доступных палате с Переселения сетках. Блюдо имеетчетыре сетки, каждая разделена на повтор расстоянии 50 мкм, запечатленного в стекло покровное дном. Эмбриона в образ вложен с ног на голову, со структурой почек в непосредственной близости к площади наблюдения , но без накладывания с сеткой. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2:. Корректировки для компенсации дрейфа во времени покадровой обработки изображений и Сетка Проекция Structured Illumination Четкое положение перемещения сетки была принесена в центре изображения (отмечены желтыми перекрестия) и служит в качестве опорной точки для последующего ху выравнивания в случае малых сдвигов. Красный прямоугольник представляет область интереса (ROI) , используемых в стратегии автоматической фокусировки (A). Оптические ва секционированияы получают путем структурированного освещения. На рисунке показана структура сетки проецируется в фокальной плоскости после правильной калибровки (B). ROI для стратегии автоматической фокусировки (красный прямоугольник) установлен , чтобы покрыть отличительные эмбриональные структуры высоко в отличие от (здесь сомитов) , которые позволяют надежную автофокусировку в структуру интересов (C). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Трансгенные wt1b:. GFP Эмбрионы с зеленой флуоресценцией в развивающейся почке наложений спинного (А) или боковой передачи (B) и флуоресцентные изображения показаны с передней слева. нп, нефрона зачаток; пт, pronephric канальцев; так себеклещ. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: Нокдаун wt1a Бросается эмбрионального развития почек, представителя увеличенной глубины фокусировки изображения с покадровой записи.. В контрольном морфолино инъецированных эмбрионов, развитие почек показывает нормальный ход с растущими канальцев и нефрона зачатков, которые начинают сливаться в средней линии. В противоположность этому , wt1a морфанты не способны формировать правильную нефроне зачатков и огромное количество GFP - положительных клеток находятся вне поля pronephric. (нп, нефрона зачаток; пт, pronephric трубочка). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этого фифигура.
Справочная Видео 1. Покадровый запись нормального развития почек у управления морфолино инъецированных эмбрионов. (Щелкните правой кнопкой мыши , чтобы загрузить). На видео показано , как канальцы растут и нефрон зачатки начинают сливаться. Начиная с 20 часов после оплодотворения, снимки были сделаны с интервалом 30 мин в течение 5 часов.
Справочная Видео 2. Время покадровой записи нарушенного нефрогенеза в wt1a morphant эмбрионов. (Щелкните правой кнопкой мыши , чтобы скачать). Видео показывает миграцию GFP-позитивных клеток из pronephric в регионе. Начиная с 20 часов после оплодотворения, снимки были сделаны в 30-мип интервалов в течение периода 5 часов.
Discussion
Данио стал популярным модельным организмом для изучения развития позвоночных и моделирования заболеваний человека. Поскольку данио эмбрионов остаются прозрачными, развивающиеся органы, как мозг и сердце можно наблюдать с помощью стандартного препарата микроскопа. Воспользовавшись трансгенных линий с органной специфической флуоресценции позволяет оценки органогенеза на протяжении разных этапах развития внутри живых эмбрионов с помощью флуоресцентной микроскопии. Одно ограничение для визуализации структурных деталей целых органов со стандартной эпифлуоресцентной микроскопии является влияние сигналов от объектов, расположенных выше и ниже фокальной плоскости. Это вне фокуса света не только приводит к снижению контрастности и разрешения изображения, она также может скрывать важные структуры , представляющие интерес 13,14. Некоторые методы, такие как лазерного сканирования confocal-, вращающийся диск confocal- или многофотонной микроскопии были разработаны, чтобы свести к минимуму информацию вне фокуса и тем самым повые контрастность изображения, а также осевое разрешение. Альтернативный метод получения оптических срезов является лазерно и сканирование бесплатно структурированы освещение микроскопии, на основе широкого поля техника освещения , которая является и просто реализовать на регулярной микроскопом 15. Представленные здесь результаты показывают, что оптический секционирования, достигается за счет структурированного освещения, реализованный на рассекает микроскопом и в сочетании с реконструкцией сосредоточенно изображений, позволяет визуализировать структурные детали нормального и нарушения развития почек в данио. В частности, GFP-положительных клеток в wt1a морфантов рассредоточены на различных глубинах фокальных, а также изображения только в одной плоскости с не в фокусе размытый недооценить трехмерную сложность фенотипа.
Для того, чтобы проследить динамику органа организации, перегруппировки или нарушения, замедленная флуоресцентная микроскопия является мощным хотя и сложной техникой. Во время покадровойвизуализации незначительные колебания или незначительные колебания температуры вызывают дрейфует в х, у, г направлении. Это требует дополнительного оборудования (климатическую камеру, антивибрационные таблицу) для получения стабильных результатов. Представленный метод использует способность рассекает микроскоп с моторизованным фокусом привода для записи покадровой изображения без дополнительных устройств. Для поддержания устойчивого фокуса, была создана стратегия автофокусировкой и перемещение сетки отпечатаны в нижней части изображения камеры была использована для коррекции х, y- нестабильности.
Правильное вложение эмбриона является важным шагом в рамках протокола. Некоторые практики необходимо, чтобы поместить интересующую структуру, как можно ближе к стеклянным дном и в непосредственной близости к сетке без накладывания с ним.
Основное преимущество метода заключается в том, что он является доступным и простым инструментом для непосредственного наблюдения процессов развития, таких как рост и миграция в жизниЭмбрионы в течение нескольких часов. Кроме того, рассечение микроскоп специфические преимущества, такие как большое поле зрения и расширенного рабочего расстояния облегчить изучение больших образцов, включая целые органы. Тем не менее, некоторые ограничения должны иметь в виду. Приостановка эксперимента , чтобы проверить и скорректировать позиционирование делает процедуру отнимает много времени и отсутствие надежного контроля температуры изменяет "стандартное" времени развития, который определяется как ч после оплодотворения при 28,5 ° С в течение данио 16. Другой потенциальной проблемой является ограниченная глубина изображения в животное, в частности, когда структура интерес находится внутри зародыша или личинки. Такая структура является данио pronephric клубочек, который расположен между сомитов и желтка. Было установлено, что предельная глубина для получения изображения клубочках составляет около 200 мкм, расстояние, которое достигается через 5 дней развития. В отличие от этого, флуоресцентные структуры, которые являются лocated ближе к поверхности животного могут быть отображены в течение более длительного времени. Например клетки печени не доступны для работы с изображениями, по крайней мере до 9 денье. Еще одним ограничением является то, что длительное обездвиживание эмбриона или личинок в агарозы и лечения Tricaine вызывают замедление роста и сердечный отек, соответственно. Так как это может мешать нормальному развитию, рекомендуется ограничить продолжительность записи в заданный промежуток времени в течение определенного периода, представляющего интерес. Для того, чтобы гарантировать, что во время визуализации структур, представляющих интерес, развиваются нормально, полезно сравнить (в конце) общий вид с этим животного выдерживают при тех же экспериментальных условиях, но без вложения и обезболивание.
Запись Z-стек оптических срезов через каждые 30 минут в течение в течение 5 ч и последующего расчета расширенной глубины резкости изображений при условии, пространственную и временную информацию о ранних событиях нормального и нарушается развитие почек, которое было вызвано бу морфолино-опосредованной нокдаун wt1a. Ранее проведенные морфолино нокдаун эксперименты уже показали , что Wt1a выполняет раннее и существенную роль в формировании Предпочка В гибридизация с маркером почечной 17,18 и занятости трансгенного wt1b:. GFP линия для развития Предпочка изображений в установленное время указывает 9,10 выявили что дефицит приводит к wt1a в нарушенного клубочковой формообразования и неудачные попытки спецификации подоцита. В отличие от этих статических подходов, время покадровой записи непосредственно визуализировать динамику ранней нефрогенеза в контрольных эмбрионов и миграции GFP-позитивных клеток вдали от pronephric области в wt1a морфантов. Возможность отслеживать клетки с ошибочно доставленными с течением времени позволяет более детальный анализ фенотипа.
В общем, метод, который представлен здесь обеспечивает недорогой и простой в использовании альтернативу к сложному, и менее доступными себеtups обычно используется для покадровой обработки изображений, таких как лазерный сканирующий микроскоп (оснащенного камерой и экологической таблицей антивибрационные) или легкого листового микроскопа. Описанная подпрограмма для устранения проблем дрейфа может также применяться для выполнения покадровой изображения на установках без оптических вариантов секционирования, таких как флуоресценция стереомикроскопов.
Метод подходит не только для исследования развития почек, но может быть также применен для контроля нормального и дефектного морфогенеза других органов, таких как сердце или печень. Кроме того, способ может быть использован для наблюдения различные более динамические процессы в эмбриональных и взрослых модельных организмов, таких как заживление ран или регенерации.
Disclosures
Автор Michael Graf является сотрудником компании Carl Zeiss Микроскопия GmbH, которая производит инструменты, используемые в настоящей статье.
Acknowledgments
Мы благодарим Томас Бейтс за критическое чтение и улучшение рукописи. Мы также благодарим Кристина Эберта и Сабрина Stötzer для поддержания рыбы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Control Morpholino | Gene tools, LLC | Standard control oligo | Prepared control oligo |
| wt1a Morpholinos | Gene tools, LLC | customized | Designted to target the first splice donor site, sequence as published in Ref. 9 |
| 0.5% Phenol red solution | Sigma | P0290 | Injection tracer |
| peqGOLD universal agarose | peqlab | 35-1020 | To prepare microinjection dish |
| Glass capillaries (GC100F-10) | Hugo Sachs Elektronik | 30-0019 | To generate injection needles |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | To load the microinjection needle |
| Dumont forceps | Fine Sience Tools | 91150-20 | To generate an opening at the needle tip |
| Embryo water (0.3x Danieaus´ solution) | 1x: 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4, 0.6 Ca(NO3)2, 5 mM HEPES, pH: 7,5; Do not add methylene blue! | ||
| Graticule 5 mm/0.05 mm | Science Services | PY68039-02 | For calculation of injection amount |
| Pasteur pipette 137 mm, 4.8 ml | Roth | E305.1 | To collect eggs, to transfer embryos and to remove dead embryos |
| Pasteur pipette with ultra-thin tip 157 mm, 3.5 ml | Roth | E304.1 | To remove excess of water |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma | P7629 | For suppression of melanization |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma | E10521 | To anethesize zebrafish |
| Low melting agarose | Biozym | 850111 | For embedding |
| µ-dish 35 mm, high Glass Bottom Grid-50 | ibidi | 81148 | Imaging chamber |
| Gel loader tips | Hartenstein | GS05 | To orient the embryo for proper embedding |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Micropipette puller (model P-97) | Sutter Instrument | To generate injection needles | |
| Micromanipulator | Saur Laborbedarf | For microinjection | |
| Thermomixer copact | Eppendorf | Thermoblock for tempering the low melting agarose | |
| SZ61 (Stereomicroscope) | Olympus | For injection control | |
| Axio Zoom. V16 | Zeiss | For embedding and imaging | |
| ApoTome.2 slider | Zeiss | For optical sectioning | |
| AxioCam MRm | Zeiss | For image acquisition | |
| ZEN 2012 | Zeiss | Imaging software |
References
- Lieschke, G. J. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Drummond, I. A. Kidney development and disease in the zebrafish. J Am Soc Nephrol. 16 (2), 299-304 (2005).
- Drummond, I. A., et al. Early development of the zebrafish pronephros and analysis of mutations affecting pronephric function. Development. 125 (23), 4655-4667 (1998).
- Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3 (10), 1922-1938 (2007).
- Kramer-Zucker, A. G., Wiessner, S., Jensen, A. M., Drummond, I. A. Organization of the pronephric filtration apparatus in zebrafish requires Nephrin, Podocin and the FERM domain protein Mosaic eyes. Dev Biol. 285 (2), 316-329 (2005).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation. Kidney Int. 73 (10), 1120-1127 (2008).
- Kreidberg, J. A., et al. Wt-1 Is Required for Early Kidney Development. Cell. 74 (4), 679-691 (1993).
- Bollig, F., et al. Identification and comparative expression analysis of a second wt1 gene in zebrafish. Dev Dyn. 235 (2), 554-561 (2006).
- Perner, B., Englert, C., Bollig, F. The Wilms tumor genes wt1a and wt1b control different steps during formation of the zebrafish pronephros. Dev Biol. 309 (1), 87-96 (2007).
- Schnerwitzki, D., et al. Alternative splicing of Wilms tumor suppressor 1 (Wt1) exon 4 results in protein isoforms with different functions. Dev Biol. 393 (1), 24-32 (2014).
- Bedell, V. M., Westcot, S. E., Ekker, S. C. Lessons from morpholino-based screening in zebrafish. Brief Funct Genomics. 10 (4), 181-188 (2011).
- Rembold, M., Lahiri, K., Foulkes, N. S., Wittbrodt, J. Transgenesis in fish: efficient selection of transgenic fish by co-injection with a fluorescent reporter construct. Nat Protoc. 1 (3), 1133-1139 (2006).
- Conchello, J. A., Lichtman, J. W. Optical sectioning microscopy. Nat Methods. 2 (12), 920-931 (2005).
- Jensen, E. C. Types of imaging, Part 2: an overview of fluorescence microscopy. Anat Rec (Hoboken). 295 (10), 1621-1627 (2012).
- Chasles, F., Dubertret, B., Boccara, A. C. Optimization and characterization of a structured illumination microscope. Opt Express. 15 (24), 16130-16140 (2007).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Hsu, H. J., Lin, G., Chung, B. C. Parallel early development of zebrafish interrenal glands and pronephros: differential control by wt1 and ff1b. Development. 130 (10), 2107-2116 (2003).
- O'Brien, L. L., et al. Wt1a, Foxc1a, and the Notch mediator Rbpj physically interact and regulate the formation of podocytes in zebrafish. Dev Biol. 358 (2), 318-330 (2011).
