Summary
विधि यहाँ वर्णित एक प्रतिदीप्ति फोकल और तलीय बहाव सही करने के लिए ऑप्टिकल सेक्शनिंग और पुनः समायोजन की सरल रणनीति प्रदर्शन करने में सक्षम विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग करके zebrafish भ्रूण में अंग विकास के समय चूक विश्लेषण की अनुमति देता है।
Abstract
आदेश जीवोत्पत्ति समझने के लिए, स्थानिक और लौकिक परिवर्तन है कि ऊतकों के विकास के दौरान होने दर्ज होने की जरूरत है। विधि यहाँ वर्णित एक प्रतिदीप्ति विदारक संरचित रोशनी और z ढेर अधिग्रहण के लिए सुसज्जित माइक्रोस्कोप का उपयोग करके zebrafish भ्रूण में सामान्य और ख़राब गुर्दे विकास के समय चूक विश्लेषण की अनुमति देता है। कल्पना करने के लिए nephrogenesis, ट्रांसजेनिक zebrafish (टीजी (wt1b: GFP)) के साथ fluorescently लेबल गुर्दे की संरचनाओं इस्तेमाल किया गया। गुर्दे दोष Wilms ट्यूमर जीन wt1a, एक कारक गुर्दे के विकास के लिए महत्वपूर्ण होने के लिए जाना जाता है के खिलाफ एक antisense morpholino oligonucleotide के इंजेक्शन से शुरू हो गया था।
प्रयोगात्मक स्थापना का लाभ अतिरिक्त उपकरणों के बिना एक्स, वाई या जेड दिशा में फिर से समायोजित करने के आंदोलनों के लिए सरल रणनीति के साथ एक ज़ूम माइक्रोस्कोप का संयोजन है। कि तापमान विविधताओं और यांत्रिक कंपन से प्रेरित है फोकल बहाव नाकाम करने के लिए, एक ऑटोफोकस रणनीति के बजाय एक आम तौर पर आवश्यक पर्यावरण कक्ष के उपयोग के लिए लागू किया गया था। आदेश में एक XY-बहाव के कारण स्थितीय परिवर्तन फिर से समायोजित करने के लिए, अंकित स्थानांतरण ग्रिड के साथ इमेजिंग कक्षों कार्यरत थे।
ऐसे confocal लेजर स्कैनिंग या प्रकाश चादर सूक्ष्मदर्शी के रूप में ऑप्टिकल सेक्शनिंग के साथ समय चूक रिकॉर्डिंग के लिए और अधिक जटिल setups की तुलना में, एक ज़ूम माइक्रोस्कोप संभालना आसान है। इसके अलावा, यह इस तरह के क्षेत्र के उच्च गहराई और एक विस्तारित काम दूरी के रूप में माइक्रोस्कोप-विशेष लाभ विदारक प्रदान करता है।
यहाँ प्रस्तुत जीवोत्पत्ति अध्ययन करने के लिए विधि भी प्रतिदीप्ति स्टीरियो माइक्रोस्कोप ऑप्टिकल सेक्शनिंग करने में सक्षम नहीं के साथ प्रयोग किया जा सकता है। हालांकि उच्च throughput के लिए सीमित है, इस तकनीक को और अधिक जटिल उपकरण है कि सामान्य रूप से विकसित ऊतकों और अंग गतिशीलता के समय चूक रिकॉर्डिंग के लिए प्रयोग किया जाता है के लिए एक विकल्प प्रदान करता है।
Introduction
gastrulation के बाद, जीवोत्पत्ति के एक व्यक्ति के जीवन चक्र के अगले चरण में है। यह विपर्यय, बातचीत और बहुत बार कोशिकाओं के प्रवास के ऊतकों और अंगों का उत्पादन करने के लिए शामिल है। प्रक्रियाओं अंगों के विकास अंतर्निहित में अशुद्धि अक्सर बीमारियों कि जीवन में बाद में या तो तुरंत या भी स्वयं को प्रकट कर सकते हैं की ओर जाता है। इस प्रकार, जीवोत्पत्ति को समझने के विकास जीव विज्ञान और जैव चिकित्सा अनुसंधान के क्षेत्र में एक प्रमुख प्रयास किया गया है। आदेश में एक विशेष अंग के विकास की जांच करने में सक्षम होने के लिए, यह भी भ्रूण के शरीर की दीवार के माध्यम से दिखाई हो गया है। इस स्थानिक और लौकिक परिवर्तन है कि विकास के दौरान होने की रिकॉर्डिंग में सक्षम बनाता है। इसके अलावा आदेश जीवोत्पत्ति में शामिल घटकों के महत्व का विश्लेषण करने के लिए, यह हेरफेर करने के लिए अतिसंवेदनशील होने की जरूरत है।
एक जीव इन विवो जीवोत्पत्ति की जांच के लिए बेहद उपयुक्त है कि zebrafish है। इसके Transparफ्लोरोसेंट ट्रांसजेनिक लाइनों के उपयोग के साथ संयोजन में भ्रूण के विकास के दौरान ency प्रोटीन स्थानीयकरण और अभिव्यक्ति की गतिशीलता का अवलोकन, साथ ही आंतरिक अंगों 1 के दृश्य के लिए अनुमति देता है। यह स्तनधारी मॉडल जिसका अंगों सूक्ष्म विश्लेषण के लिए दुर्गम हैं की तुलना में वास्तविक समय में अंग विकास की जांच से संबंधित एक अनूठा लाभ प्रदान करता है। इसके अलावा, विभिन्न उपकरणों zebrafish भ्रूण के विकास में हेरफेर करने के लिए उपलब्ध हैं। उत्परिवर्ती लाइनों की पीढ़ी के अलावा, antisense morpholino oligonucleotides (एमओ) विशेष जीन है कि कुछ अंगों के विकास में शामिल कर रहे हैं की गतिविधि को पछाड़ना के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। राज्यमंत्री या तो एक ब्याह साइट या translational शुरुआत कोडोन (अगस्त) को लक्षित, और इस तरह पूर्व mRNA या अनुवाद के splicing के साथ हस्तक्षेप।
zebrafish भ्रूण गुर्दे, pronephros, गुर्दे विकास और जनरल के समारोह में अध्ययन करने के लिए एक anatomically सरल लेकिन मूल्यवान मॉडल हैगुर्दे की बीमारियों से संबंधित 2 तों। यह केवल दो कार्यात्मक नेफ्रॉन बुलाया इकाइयों के होते हैं। प्रत्येक नेफ्रॉन एक glomerulus जहां रक्त निस्पंदन जगह 3 लेता है के होते हैं। इसके अलावा घटकों छोटी गर्दन क्षेत्र के रूप में अच्छी तरह से स्राव और विलेय की पुनःअवशोषण और डक्ट के लिए खंडों छोटी नली, जो गंदा नाला 4 में समाप्त होता है। अपनी सरल संरचना के बावजूद, संगठन और zebrafish pronephros की विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं बहुत स्तनधारी गुर्दे 5,6 के समान हैं।
एक पहलू है, जो गंभीर रूप से गुर्दा विकास में शामिल है, Wilms ट्यूमर शमन जीन WT1 7 से इनकोडिंग है। Zebrafish दो paralogs wt1a बुलाया अधिकारी और pronephros 8 के विकास के दौरान एक अतिव्यापी नहीं बल्कि समान पैटर्न में व्यक्त की जा रही wt1b। GFP लेबल pronephros संरचनाओं के साथ ट्रांसजेनिक zebrafish का उपयोग करके, यह दिखाया गया है wt1a <की है कि पूरा तोड़े नीचे/ em> या एक विशेष ब्याह फार्म की भ्रूण गुर्दे की गंभीर या हल्के विकृतियों क्रमश: 9,10 की ओर जाता है।
विधि यहाँ वर्णित एक प्रतिदीप्ति विदारक संरचित रोशनी के माध्यम से ऑप्टिकल सेक्शनिंग के लिए सुसज्जित खुर्दबीन को रोजगार से zebrafish भ्रूण में सामान्य और बिगड़ा nephrogenesis का समय व्यतीत हो जाने के विश्लेषण की अनुमति देता है। सामान्य तौर पर ऑप्टिकल वर्गों छवियों जो केवल में फोकस जानकारी होती है के अधिग्रहण की अनुमति है। बाहर का ध्यान केंद्रित जानकारी जैसे गणितीय एल्गोरिदम (जैसे। Deconvolution), ऑप्टिकल डिजाइन (जैसे लेजर confocal माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग) या दोनों के संयोजन (जैसे संरचित रोशनी) के रूप में विभिन्न तरीकों से बचा जा सकता है।
गुर्दे विकास में दोष के लिए प्रेरित करने के लिए हम एक antisense wt1a कि एक ट्रांसजेनिक zebrafish लाइन में इंजेक्ट किया गया था के खिलाफ एमओ (: GFP) टीजी (wt1b) का इस्तेमाल किया। इस लाइन glomerulus, गर्दन और पूर्वकाल में GFP प्रतिदीप्ति पता चलता हैछोटी नली 9,10 का हिस्सा है। ऐसी लेजर स्कैनिंग या प्रकाश शीट सूक्ष्मदर्शी के रूप में ऑप्टिकल सेक्शनिंग के साथ समय व्यतीत रिकॉर्डिंग के लिए और अधिक जटिल setups की तुलना में, एक ज़ूम माइक्रोस्कोप संभालना आसान और कम खर्चीला है। इसके अलावा, संरचित रोशनी के लिए उपकरण आसानी से इस तरह एक विस्तारित काम दूरी और देखने के बड़े क्षेत्र के रूप में पारंपरिक प्रतिदीप्ति उपकरण (जैसे प्रतिदीप्ति दीपक, फिल्टर) और माइक्रोस्कोप-विशिष्ट लाभ विदारक की पेशकश के साथ जोड़ा जा सकता है। बहाव के साथ कोई समस्या अतिरिक्त उपकरणों (पर्यावरण कक्ष, विरोधी कंपन तालिका) आम तौर पर स्थिर परिणामों के लिए आवश्यक का उपयोग किए बिना हल कर रहे थे। फोकल बहाव एक ऑटोफोकस रणनीति स्थापित किया गया था और अंकित स्थानांतरण ग्रिड के साथ इमेजिंग कक्षों एक्स या वाई दिशा में एक बहाव के बाद स्थिति फिर से समायोजित करने के लिए उपयोग किया गया के लिए सही है।
प्रस्तुत विधि भी इस तरह के प्रतिदीप्ति स्टीरियो मी के रूप में ऑप्टिकल सेक्शनिंग विकल्प, बिना माइक्रोस्कोप के लिए लागू किया जा सकता हैicroscopes और अधिक जटिल उपकरण है कि सामान्य रूप से विकसित ऊतकों और अंग गतिशीलता के समय चूक रिकॉर्डिंग के लिए प्रयोग किया जाता है के लिए एक विकल्प प्रदान करता है।
Protocol
सभी पशु प्रयोगों 'प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल के सिद्धांतों' के रूप में अच्छी तरह से करने के लिए पशु के संरक्षण पर कानून जर्मन के वर्तमान संस्करण के अनुसार प्रदर्शन किया गया।
1. Antisense-morpholino की तैयारी (एमओ)
- एक 3 मिमी एमओ शेयर समाधान तैयार करने के लिए, lyophilized एमओ (300 कांच की शीशी में nmol) बाँझ, ultrapure पानी के 100 μl जोड़ें। पूरा विघटन के लिए, 5 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस के लिए शेयर समाधान गर्मी। Parafilm के साथ शीशी को सील करने और कमरे के तापमान (आर टी) में एमओ शेयर समाधान की दुकान। एमओ शेयर समाधान ठंडा क्योंकि उस शीशी दीवारों के साथ फाग का एक संघ का कारण बन सकता है मत करो।
- बाँझ, ultrapure पानी के साथ एमओ शेयर समाधान गिराए द्वारा एक 1 मिमी एमओ काम कर समाधान तैयार है और 0.05% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए 0.5% फिनोल लाल समाधान जोड़ें।
- एक मो काम कर समाधान के 10 μl प्राप्त करने के लिए, 3.3 μl एमओ शेयर समाधान और 5.7 μl पानी के लिए 0.5% फिनोल लाल समाधान के 1 μl जोड़ें। होनासामने समाधान काम करने का एक नया बैच की तैयारी कर 5 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस के लिए एमओ शेयर समाधान गर्मी।
- का उपयोग करने के लिए, सेंट्रीफ्यूज एमओ काम समाधान सुई clogging रोकने के लिए पहले। उदाहरण के लिए, 5 मिनट (आरटी) के लिए 15,000 XG पर एमओ शेयर समाधान के 10 μl स्पिन और इंजेक्शन के लिए सतह पर तैरनेवाला के 8 μl हटा दें।
नोट: गतिविधि के नुकसान का समय 11 से अधिक morpholino समाधान में हो सकता है। इस निकालने के लिए, एक प्रोटोकॉल निर्माता द्वारा आपूर्ति निम्नलिखित यूवी स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा समाधान का परीक्षण कर सकते हैं। इस्तेमाल किया wt1a morpholino एक कम प्रभावशीलता भंडारण की एक लंबी अवधि में मनाया नहीं किया गया है के मामले में (3 मिमी काम समाधान एक से अधिक समय संग्रहीत किया गया था साल)।
2. निषेचित अंडे का संग्रह संभोग जोड़े की स्थापना और
- एक प्रजनन एक हटाये चलनी को अलग करने के साथ सुसज्जित कंटेनर में लाइन, प्रत्येक: (GFP wt1b) से पहले microinjection को दोपहर, टीजी के पांच जोड़े की स्थापनापुरुषों और महिलाओं के लिए रात के दौरान।
नोट:, संभोग जोड़े के रूप में इस्तेमाल मछली की गई पूर्व जांच किया जाना चाहिए था और अच्छा "निर्माता" के रूप में मूल्यांकन सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त है कि अंडे एक सफल इंजेक्शन के प्रयोग के लिए उपलब्ध हैं। - अगली सुबह, के बाद रोशनी पर बारी, पुरुष और महिला एक साथ चलनी है कि उनके अंडे खाने से मछली रोकता ऊपर डाल दिया।
- स्पॉन देखो। एक बार अंडे रखी हैं कि 4 सेल चरण से पहले इंजेक्शन जा सकता है की राशि फिर से (लगभग 50), महिला से अलग नर पहुँच जाता है। एक पेट्री इंजेक्शन के पहले दौर के लिए भ्रूण पानी से भरे डिश में एक पाश्चर विंदुक के साथ अंडे स्थानांतरण। अंडे के अतिरिक्त फेरे पाने के लिए, एक साथ और अलग कई बार एक संभोग जोड़ी जगह है।
3. microinjection के लिए प्रारंभिक कार्य
नोट: अग्रिम में कदम 3.1 और 3.2 प्रदर्शन करना।
- एक जीएल डालने के एक डिश है कि इंजेक्शन (microinjection पकवान) के दौरान स्थिति में भ्रूण धारण तैयार करने के लिएएक 94 मिमी पेट्री तरल, पारदर्शी, शुद्ध, खाना ग्रेड सिलिकॉन के साथ भरा डिश में एक 40-45 डिग्री कोण पर गधा स्लाइड। स्लाइड निकालें जब सिलिकॉन कठोर है। यही कारण है कि सिलिकॉन परत में एक नाली पैदा करता है।
नोट: वैकल्पिक रूप से, सिलिकॉन के agarose बजाय 1.5-3% का उपयोग करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर पकवान की दुकान। - एक सुई खींचने के साथ कांच केशिकाओं से इंजेक्शन सुई उत्पन्न करता है।
- केशिकाओं कि आंतरिक तंतु होते हैं, का प्रयोग करें।
ध्यान दें: रेशा backfilling (3.3 देखें) के बाद सुई की नोक की ओर एमओ समाधान के परिवहन के लिए मदद मिलेगी। - सुई खींचने पर उपयुक्त सेटिंग्स स्थापित करना। Zebrafish में इंजेक्शन के लिए अच्छा सुइयों लंबी और पतली सुझावों के 12 होनी चाहिए। लगभग 10 मिमी की लंबाई और उनके बहुत अंत में 1.5-2 माइक्रोन की एक व्यास के साथ सुझाव उत्पन्न करता है। उदाहरण के लिए, निम्न सेटिंग्स के साथ एक क्षैतिज सुई खींचने का उपयोग करें: हीट = 330, खींचो = 0, वेग = 40, समय = 100।
- ए के तहत सुई की गुणवत्ता की जांचविदारक माइक्रोस्कोप और कम या बहुत लंबे समय सुझावों के साथ उन लोगों को सुलझा।
नोट: छोटे सुझावों के साथ सुई, जबकि जब जरायु छू बहुत लंबी और पतली सुझावों के मोड़ के साथ इस तरह के भ्रूण को नुकसान करने के लिए करते हैं और यह घुसना नहीं है।
- केशिकाओं कि आंतरिक तंतु होते हैं, का प्रयोग करें।
- एक microloader टिप का उपयोग करके एमओ काम कर समाधान के 2 μl के साथ सुई backfill और microinjection तंत्र की सुई धारक में डालें।
- जैसा कि सुई टिप अंत में बंद हो जाती हैं, विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे तेज चिमटी के साथ सुई के बहुत अंत वापस pinching द्वारा एक खोलने उत्पन्न करते हैं। वैकल्पिक रूप से microinjection तंत्र का उपयोग धीरे एक कठोर सतह (जैसे। छोटे धातु ब्लॉक या चिमटी के पीछे) को टिप धक्का।
- एक रेखाजाल पर रखा खनिज तेल की एक बूंद में एमओ काम कर समाधान इंजेक्शन द्वारा इंजेक्शन की मात्रा जांचना। लगभग 200 पी एल का एक इंजेक्शन की मात्रा प्राप्त करने के लिए 75 माइक्रोन की एक बूंद व्यास के उत्पादन के लिए इंजेक्शन की अवधि को समायोजित करें।
- जहां सुई (नाली का 45 डिग्री कोण की ओर) से आता दिशा की ओर वनस्पति पोल के साथ microinjection पकवान की नाली के साथ 1-सेल चरण भ्रूण की व्यवस्था।
- जरायु और सुई के साथ की जर्दी छेदना और 2-सेल भ्रूण के लिए 1- की जर्दी में 1 मिमी एमओ काम समाधान (0.2 pmol) के 200 PL इंजेक्षन।
- एक विस्तृत खोलने के साथ एक पाश्चर विंदुक का प्रयोग, भ्रूण पानी से भरा एक पेट्री डिश में इंजेक्शन भ्रूण के सभी इकट्ठा करने और उन्हें 28.5 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
- दोपहर में, एक व्यापक खोलने के साथ एक पाश्चर विंदुक का उपयोग करके मृत भ्रूण को हटा दें और भ्रूण पानी की जगह।
Vivo इमेजिंग के लिए भ्रूण की तैयारी 5.
- अगली सुबह, युक्त 0.003% एन phenylthiourea (पीटीयू) melanization को बाधित करने के लिए भ्रूण पानी के साथ भ्रूण पानी की जगह। gastrulation के अंत क्योंकि यह interf पहले पीटीयू लागू नहीं हैजल्दी भ्रूण के विकास के साथ Eres।
चेतावनी: पीटीयू विषैले और टेराटोजेनिक है। हर समय दस्ताने पहनें और साँस लेना से बचने और त्वचा के साथ संपर्क करें। - वांछित विकास के चरण में एक विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे तेज चिमटी के साथ भ्रूण Dechorionate। चिमटी की एक जोड़ी के साथ जरायु ले लो और चिमटी की एक दूसरी जोड़ी के साथ जरायु के दूसरे पक्ष को हड़पने के लिए प्रयास करें। ध्यान से भ्रूण में खलल न डालें बिना विपरीत दिशाओं में चिमटी खींच।
- पीटीयू (0.003%) और 0.02% इथाइल 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) युक्त भ्रूण पानी के साथ भ्रूण पीटीयू युक्त पानी (0.003%) की जगह से भ्रूण anesthetize।
- agarose एक 50 माइक्रोन स्थानांतरण ग्रिड के साथ एक coverglass तली μ-पकवान पर कम पिघलने में भ्रूण शामिल करें। उचित एम्बेडिंग कुछ अभ्यास की आवश्यकता है।
- 1.5 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूबों में 0.7% agarose के 1 मिलीलीटर aliquots तैयार है और एक गर्मी ब्लॉक 36 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट पर डाल दिया। टीआरए के लिए विस्तृत खोलने के साथ एक पाश्चर विंदुक का प्रयोग करेंμ-डिश के लिए भ्रूण nsfer। अति पतली टिप के साथ एक पाश्चर विंदुक का उपयोग अतिरिक्त भ्रूण पानी निकालें और टेम्पर्ड agarose के साथ भ्रूण उपरिशायी।
- जबकि agarose अभी भी तरल है, ब्याज की संरचना के साथ ही स्थानांतरण ग्रिड से दूरी के संबंध में, इच्छित स्थिति में दो जेल लोडर सुझावों के साथ भ्रूण उन्मुख। और ग्रिड के लिए पास के इलाके में: ब्याज की संरचना (यहाँ pronephros) गिलास नीचे (नीचे पृष्ठीय यहाँ) के लिए संभव के रूप में बंद रखें।
- इष्टतम छवि गुणवत्ता के लिए भ्रूण संभव के रूप में बंद नीचे तक के ब्याज की संरचना रखकर भ्रूण और कांच के नीचे के बीच agarose परत कम से कम। कि इसके अलावा, ग्रिड से पास के इलाके में भ्रूण का पता लगाने, लेकिन ध्यान रखना है कि ग्रिड ब्याज की संरचना से मढ़ना नहीं करेगा ले। अलग-μ व्यंजनों में 3-4 भ्रूण प्रत्येक एम्बेड और एक है कि सबसे अच्छा तैनात है का उपयोग करें।
- जब agarose कठिन है पर्याप्त 2 के लिए भ्रूण इंतजार धारण करने के लिए-3 मिनट और 0.003% पीटीयू और 0.02% Tricaine युक्त भ्रूण पानी के साथ एम्बेडेड भ्रूण उपरिशायी। अतिरिक्त भ्रूण पानी छानना या अति पतली टिप के साथ एक पाश्चर विंदुक का उपयोग करके इसे हटा दें। वाष्पीकरण को रोकने के लिए ताला स्थिति पर μ-डिश के ढक्कन को बंद करें।
नोट: के रूप में वे छवि रिकॉर्डिंग ख़राब होता है, μ-पकवान में हवा के बुलबुले की घटना से बचने।
6. माइक्रोस्कोपी
नोट: संरचित रोशनी के माध्यम से ऑप्टिकल सेक्शनिंग के लिए सुसज्जित एक माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। मल्टीचैनल, जेड-पोट, समय श्रृंखला, सॉफ्टवेयर ऑटोफोकस और विस्तारित फोकस: निम्नलिखित मॉड्यूल से युक्त एक सॉफ्टवेयर के साथ रिकॉर्ड छवियों।
- जेड के ढेर का अधिग्रहण
- μ-पकवान पलटना। गिलास नीचे अब उद्देश्य की ओर चेहरे और μ-पकवान एक इमेजिंग कक्ष के रूप में कार्य करता है।
- ग्रिड की स्थिति में स्लाइडर टॉगल और सॉफ्टवेयर नियंत्रण में संरचित रोशनी मोड सक्षम।
- जांचनानमूना के साथ अपनी पसंद के चैनल (एस) के लिए ग्रिड फोकस फोकस कैलिब्रेशन विज़ार्ड के निर्देशों का पालन करके जांच की जानी (एम्बेडेड भ्रूण)।
- Z ढेर अधिग्रहण मोड को सक्रिय करने और केंद्र मोड के लिए यह निर्धारित किया है। नमूना के बीच में ध्यान केंद्रित करने और केंद्र पर क्लिक करके z- ढेर के केंद्र विमान के रूप में यह निर्धारित किया है। केंद्र की स्थिति के चारों ओर सीमा को परिभाषित करने से Z ढेर के आयाम निर्धारित करें।
नोट: ऑब्जेक्ट संरचनाओं पहले और जेड ढेर के अंतिम विमान के बाहर तेजी से नहीं देखा जाना चाहिए। - ऑप्टिकल वर्गों के बीच अंतर को समायोजित करें। सबसे अच्छा Z संकल्प के लिए इष्टतम बटन पर क्लिक करें। उद्देश्यों को गहराई क्षेत्र के सॉफ्टवेयर Nyquist criterium (50% ओवरलैप) के बाद एक सिफारिश की दूरी तय होगा पर आधारित है।
नोट: छोटे फ़ाइल आकार और संरचना परमिट के लिए लक्ष्य है, तो स्वयं एक बड़ा अंतर आकार निर्धारित किया है। की सिफारिश की तुलना में छोटे कदम की स्थापना महज बाद में वृद्धि के बिना बड़ा फ़ाइल आकार में परिणाम होगाअल जानकारी।
- समय चूक इमेजिंग
- समय श्रृंखला उपकरण को खोलें और समय की श्रृंखला प्रयोग के अंतराल निर्धारित किया है। उदाहरण के रिकॉर्ड Z ढेर छवियों 5 घंटा की अवधि में हर 30 मिनट के लिए।
- समय के साथ फोकल बहाव के लिए सही करने के लिए, एक ऑटो फोकस रणनीति की स्थापना की। फोकस रणनीति संवाद बॉक्स को चेक करें, ड्रॉप-डाउन सूची से सॉफ्टवेयर ऑटोफोकस चयन और संदर्भ चैनल के रूप में एल-Brightfield चैनल चुनें।
- ऑटो फोकस के साथ हर समय बिंदु शुरू करो। आदेश में एक अनुकूलित समय सीमा के भीतर एक विश्वसनीय खोज रेंज आश्वस्त करने के लिए, एक निश्चित 200 माइक्रोन रिश्तेदार खोज सीमा निर्धारित किया है। यह श्रृंखला पूरी तरह से जांच होती है एक अधिकतम कदम आकार (नमूना पैरामीटर) में बुनियादी गुणवत्ता (क्वालिटी पैरामीटर) के साथ (रेंज कवरेज पैरामीटर)।
- ऑटोफोकस की परिशुद्धता बढ़ाने के लिए, ब्याज (फोकस आरओआई) और स्थिति का ध्यान केंद्रित क्षेत्र के भीतर पैमाइश सक्रिय ब्याज की संरचना के आसपास लाइव देखें विंडो में फोकस रॉय ने कहा।
नोट: यदिसिस्टम सॉफ्टवेयर ऑटोफोकस मॉड्यूल जो समय चूक रिकॉर्डिंग के दौरान स्वचालित रूप से केंद्र जेड स्थिति अद्यतन का अभाव है, एक निश्चित समय पर प्रयोग रोक और मैन्युअल ध्यान समायोजित और प्रयोग जारी है। - समय श्रृंखला रिकॉर्डिंग के दौरान एक संभावित XY-बहाव के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए, सॉफ्टवेयर की क्रॉसहेयर में अंकित ग्रिड (इमेजिंग चैम्बर के) की एक खास बिंदु की स्थिति और एक स्क्रीनशॉट बनाकर स्थिति को बचा लो।
- समय श्रृंखला प्रयोग शुरू करें। इससे पहले कि समय श्रृंखला अंतराल खत्म हो गया है, प्रयोग रोक और, यदि आवश्यक हो तो फिर से समायोजित स्क्रीनशॉट के अनुसार स्थिति। प्रयोग के साथ आगे बढ़ें।
7. इमेज प्रोसेसिंग
- प्रसंस्करण टैब में स्विच करें और विधि संवाद बॉक्स में फोकस (EDF) की विस्तारित गहराई का चयन करें। चूंकि ऑप्टिकल वर्गों अर्जित कर रहे हैं, छवि श्रृंखला के लिए अधिकतम प्रक्षेपण एल्गोरिथ्म लागू होते हैं।
नोट: यहाँ एल्गोरिथ्म बीआर परियोजना होगीightest या अंधेरी पहले कदम में एक समग्र 2 डी छवि के ढेर से पिक्सेल और अंत में हर समय बिंदु के लिए एक परिणाम छवि के रूप में उच्चतम विचरण के साथ एक का उपयोग करें। - EDF छवि श्रृंखला से बाहर एक समय व्यतीत फिल्म (जैसे AVI या चाल फ़ाइल) बनाने के लिए फिल्म निर्यात विधि का प्रयोग करें।
Representative Results
समय चूक माइक्रोस्कोपी समय की एक लंबी अवधि में गतिशील जैविक प्रक्रियाओं देखने के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है। समय चूक इमेजिंग के दौरान एक बार होने वाली समस्या एक्स, वाई या जेड दिशा में एक आंदोलन, बहाव कहा जाता है, जो तापमान विविधताओं और यांत्रिक कंपन से प्रेरित है है। यहाँ प्रस्तुत विधि समय चूक पर्यावरण कक्ष और विरोधी कंपन तालिका के बिना zebrafish भ्रूण या एक विदारक माइक्रोस्कोप पर लार्वा में fluorescently लेबल संरचनाओं की रिकॉर्डिंग में सक्षम बनाता है।
XY-बहाव के मुआवजे के लिए, नमूना एक अंकित स्थानांतरण ग्रिड (चित्रा 1) के साथ एक इमेजिंग कक्ष में एम्बेडेड था। सॉफ्टवेयर उपकरण की क्रॉसहेयर से संबंधित ग्रिड के एक खास बिंदु के स्थान पूर्व समायोजित स्थिति (2A चित्रा) के लिए नमूना वापस करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। परिणाम प्रस्तुत एक ज़ूम माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्राप्त किया गयासंरचित रोशनी (चित्रा 2 बी) के माध्यम से ऑप्टिकल सेक्शनिंग के लिए एक एकीकृत स्लाइडर के साथ। निरंतर फोकल सुधार के लिए, एक ऑटो फोकस रणनीति स्थापित किया गया था। इस रणनीति में, सॉफ्टवेयर ऑटोफोकस हर समय बिंदु से पहले अधिकतम विपरीत आधार पर फोकस लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है। यह तो परिभाषित फोकल हवाई जहाज़ बाद में जेड ढेर अधिग्रहण के लिए केंद्र की योजना के रूप में सेट किया गया है। आदेश नमूने में phototoxicity कम करने के लिए, प्रेषित प्रकाश brightfield चैनल के रूप में यह ऑटोफोकस कदम (चित्रा 2 सी) के दौरान पर्याप्त रूप से कम जोखिम बार की अनुमति देता संदर्भ चैनल के रूप में प्रयोग किया जाता है।
विधि एक ट्रांसजेनिक zebrafish लाइन के नियंत्रण और wt1a morphant भ्रूण (: GFP) टीजी (wt1b) में गुर्दे विकास के तुलनात्मक विश्लेषण के लिए लागू किया गया था। जल्दी nephrogenesis के दौरान इस लाइन, मध्यवर्ती mesoderm में हरे रंग की रोशनी से पता चलता गुर्दे पूर्वज 9,10 और बाद से उठता थेबनाने नलिकाओं और नेफ्रॉन primordia (चित्रा 3) में।
समय चूक छवि रिकॉर्डिंग से पता चलता है कि नियंत्रण morpholino इंजेक्शन भ्रूण में nephrogenesis uninjected लोगों की तुलना में अनछुए है (परिणाम) नहीं दिखाया है और जल्दी zebrafish गुर्दे का विकास 3 से वर्णित चरणों निम्नानुसार है। 20 विकासशील pronephric नलिकाओं HPF दिखाई और उनके पूर्वकाल सुझावों पर कर रहे हैं, कोशिकाओं की गोलाकार राशि, बनाने नेफ्रॉन primordia का प्रतिनिधित्व करने का पता लगाया जा सकता है। अगले घंटे के दौरान, नलिकाओं और नेफ्रॉन primordia बढ़ने और बाद में primordia पर midline (चित्रा 4, वीडियो 2) में फ्यूज करने के लिए शुरू करते हैं। इसके विपरीत, nephrogenesis गंभीर रूप से wt1a morphant भ्रूण में बाधित है। हालांकि GFP पॉजिटिव ट्यूबलर संरचना 20 HPF पर दिखाई दे रहे हैं, वे और अधिक फैलाना और कम विकसित होना दिखाई देते हैं। इसके अलावा, कोई उचित नेफ्रॉन primordia गठन किया गया है। टी करने के लिए सबसे हड़ताली अंतरवह इस समय बिंदु पर भ्रूण नियंत्रित करते हैं, हालांकि, विकासशील pronephros (चित्रा 4, वीडियो 2) के बाहर फ्लोरोसेंट कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या की उपस्थिति है। बाद में, इन कोशिकाओं pronephric क्षेत्र छोड़ दो और पेट के बल विस्थापित (वीडियो 2)।
नियंत्रण भ्रूण और wt1b ट्रांसजेनिक लाइन के wt1a morphants में गुर्दे का विकास पहले से अलग-अलग निर्धारित समय अंक 9,10 पर छवियों को लेने से तुलना की गई है। इस स्थैतिक विधि के विपरीत, समय चूक रिकॉर्डिंग सामान्य nephrogenesis और गुर्दे पूर्वज wt1a कमी की वजह से कोशिकाओं के misrouting की गतिशीलता का पालन करने की अनुमति देता है।
चित्रा 1: पुनर्वास ग्रिड के साथ एक वाणिज्यिक उपलब्ध चैंबर में एक एम्बेडेड भ्रूण की योजनाबद्ध चित्रण। डिश हैचार ग्रिड, प्रत्येक 50 माइक्रोन के एक दोहराने की दूरी, एक गिलास coverslip तल में अंकित में उप-विभाजित। भ्रूण imaged किया जा करने के लिए एक अवलोकन वर्ग के करीब निकटता में गुर्दे की संरचना के साथ उल्टा एम्बेडेड है, लेकिन ग्रिड के साथ overlaying के बिना। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
(पीला क्रॉसहेयर द्वारा चिह्नित) समय चूक इमेजिंग और संरचित रोशनी की ग्रिड प्रोजेक्शन में बहाव के मुआवजे के लिए समायोजन स्थानांतरण ग्रिड की एक विशिष्ट स्थिति छवि केन्द्र में लाया गया था और बाद में XY-संरेखण के लिए एक संदर्भ बिंदु के रूप में कार्य करता है: चित्रा 2। छोटे बदलाव के मामले में। लाल आयत ब्याज (आरओआई) के क्षेत्र ऑटोफोकस रणनीति (ए) में प्रयोग किया जाता प्रतिनिधित्व करता है। ऑप्टिकल सेक्शनिंग वासंरचित रोशनी द्वारा प्राप्त रहा है। छवि एक ग्रिड संरचना सही अंशांकन (बी) के बाद फोकल हवाई जहाज़ में अनुमान से पता चलता है। ऑटोफोकस रणनीति (लाल आयत) के लिए रॉय कि ब्याज (सी) की संरचना में विश्वसनीय autofocusing की अनुमति देने के लिए इसके विपरीत में उच्च (यहाँ somites) विशिष्ट भ्रूण संरचनाओं को कवर करने के लिए निर्धारित है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: ट्रांसजेनिक wt1b:। हरी प्रतिदीप्ति के साथ GFP भ्रूण का विकास गुर्दे में पृष्ठीय (ए) या पार्श्व (बी) पारेषण और प्रतिदीप्ति छवियों के ओवरले बाईं ओर पूर्वकाल के साथ दिखाया गया है। एनपी, नेफ्रॉन उत्स; पीटी, pronephric छोटी नली; ठीक ठाकघुन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4: wt1a की पछाड़ना भ्रूण गुर्दे विकास बाधित प्रतिनिधि, समय चूक रिकॉर्डिंग से ध्यान केंद्रित छवियों की विस्तारित गहराई।। नियंत्रण morpholino इंजेक्शन भ्रूण में गुर्दे के विकास से बढ़ नलिकाओं और नेफ्रॉन primordia जो midline पर फ्यूज करने के लिए शुरू के साथ सामान्य प्रगति को दर्शाता है। इसके विपरीत, wt1a morphants उचित नेफ्रॉन primordia फार्म के लिए विफल रहता है और GFP सकारात्मक कोशिकाओं का एक विशाल राशि pronephric क्षेत्र के बाहर हैं। (एनपी, नेफ्रॉन उत्स, पीटी, pronephric छोटी नली)। इस फाई का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंgure।
पूरक 1 वीडियो नियंत्रण morpholino इंजेक्शन भ्रूण में सामान्य गुर्दे के विकास के समय चूक रिकॉर्डिंग। (राइट डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें)। कैसे नलिकाओं को आगे बढ़ने और नेफ्रॉन primordia फ्यूज करने के लिए शुरू वीडियो दिखाता है। 20 HPF पर शुरू, छवियों 5 घंटा की अवधि में 30 मिनट के अंतराल में ले जाया गया।
Wt1a morphant भ्रूण में परेशान nephrogenesis के पूरक वीडियो 2 समय चूक रिकॉर्डिंग। (राइट डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें)। वीडियो pronephric क्षेत्र से बाहर GFP पॉजिटिव कोशिकाओं के प्रवास से पता चलता है। 20 HPF पर शुरू, छवियों 30 मील में ले जाया गया5 घंटा की अवधि में n अंतराल।
Discussion
zebrafish हड्डीवाला विकास और मानव रोगों की मॉडलिंग के अध्ययन के लिए एक लोकप्रिय मॉडल जीव बन गया है। क्योंकि zebrafish भ्रूण पारदर्शी बने हुए हैं, मस्तिष्क और हृदय जैसे विकासशील अंगों एक मानक तैयार करने माइक्रोस्कोप का उपयोग कर देखा जा सकता है। अंग विशेष प्रतिदीप्ति साथ ट्रांसजेनिक लाइनों का लाभ उठाते हुए प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा रहने वाले भ्रूण के भीतर विकास के विभिन्न चरणों के दौरान जीवोत्पत्ति के आकलन के लिए सक्षम बनाता है। मानक epifluorescence माइक्रोस्कोपी के साथ पूरे अंगों के संरचनात्मक विवरण इमेजिंग के लिए एक सीमा के ऊपर और नीचे फोकल हवाई जहाज़ वस्तुओं से संकेत का प्रभाव है। यह बाहर का ध्यान केंद्रित प्रकाश नहीं की कमी हुई छवि के विपरीत और संकल्प में ही परिणाम है, यह भी ब्याज 13,14 के महत्वपूर्ण संरचनाओं को अस्पष्ट कर सकते हैं। इस तरह के लेजर स्कैनिंग confocal- के रूप में कई तकनीकों, डिस्क confocal- या multiphoton माइक्रोस्कोपी कताई बाहर का ध्यान केंद्रित जानकारी और इस तरह बढ़ाने को कम से कम करने के लिए विकसित किया गया हैई छवि के विपरीत है और साथ ही अक्षीय संकल्प। ऑप्टिकल वर्गों प्राप्त करने के लिए एक वैकल्पिक तरीका लेजर स्कैनिंग और मुक्त संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी, एक व्यापक क्षेत्र आधारित रोशनी तकनीक है जो है और एक नियमित माइक्रोस्कोप 15 पर लागू करने के लिए सरल है। यहाँ प्रस्तुत परिणाम यह दर्शाते हैं कि ऑप्टिकल सेक्शनिंग, संरचित रोशनी से हासिल की है, एक विदारक माइक्रोस्कोप पर लागू किया है और बढ़ाया ध्यान केंद्रित छवियों के पुनर्निर्माण के साथ संयुक्त, सामान्य के संरचनात्मक विवरण के दृश्य के लिए सक्षम बनाता है और zebrafish में गुर्दे की विकास परेशान किया। विशेष रूप से, wt1a morphants में GFP पॉजिटिव कोशिकाओं विभिन्न फोकल गहराई में बिखरे हैं, और बाहर के- फोकस कलंक के साथ केवल एक ही विमान की छवियों phenotype के तीन आयामी जटिलता मूल्यवान समझना होगा।
अंग संगठन, पुनर्व्यवस्था या विघटन की गतिशीलता का पालन करने के लिए, समय चूक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी जटिल तकनीक यद्यपि एक शक्तिशाली है। समय चूक के दौरानइमेजिंग मामूली कंपन या मामूली तापमान के उतार चढ़ाव एक्स, वाई या जेड दिशा में drifts कारण। इस क्रम में स्थिर परिणाम प्राप्त करने के लिए अतिरिक्त उपकरण (पर्यावरण कक्ष, विरोधी कंपन तालिका) की मांग है। प्रस्तुत विधि अतिरिक्त उपकरणों के बिना समय चूक छवियों की रिकॉर्डिंग के लिए एक मोटर चालित फोकस ड्राइव के साथ एक विदारक माइक्रोस्कोप की क्षमता का उपयोग करता है। एक स्थिर ध्यान बनाए रखने के लिए, एक ऑटो फोकस रणनीति स्थापित किया गया था और एक पुनर्वास इमेजिंग कक्ष के तल में अंकित ग्रिड एक्स के सुधार, वाई अस्थिरता के लिए इस्तेमाल किया गया था।
भ्रूण के समुचित एम्बेडिंग प्रोटोकॉल के भीतर एक महत्वपूर्ण कदम है। कुछ अभ्यास इसके साथ overlaying बिना ब्याज गिलास नीचे करने के लिए संभव के रूप में बंद है और ग्रिड के लिए पास के इलाके में की संरचना करने के लिए जगह की जरूरत है।
विधि का मुख्य लाभ यह है कि यह इस तरह के जीवन में विकास और पलायन के रूप में विकास की प्रक्रिया के प्रत्यक्ष अवलोकन के लिए एक किफायती और सरल उपकरण हैकई घंटे से अधिक भ्रूण। इसके अलावा, इस तरह के दृश्य और विस्तारित काम दूरी के बड़े क्षेत्र के रूप में विच्छेदन माइक्रोस्कोप-विशेष लाभ पूरे अंगों सहित बड़े नमूनों की परीक्षा की सुविधा। हालांकि, कुछ सीमाओं को ध्यान में रखा जाना है। प्रयोग की जाँच रोकना और स्थिति बदल डालना प्रक्रिया समय लेने वाली और एक मजबूत तापमान नियंत्रण के अभाव 'मानक' विकासात्मक समय है, जो zebrafish 16 के लिए 28.5 डिग्री सेल्सियस पर मानव संसाधन के बाद निषेचन के रूप में परिभाषित किया गया है परिवर्तन करता है। एक अन्य संभावित समस्या, जानवर में इमेजिंग के प्रतिबंधित गहराई है, खासकर जब ब्याज की संरचना भ्रूण या लार्वा अंदर स्थित है। इस तरह की एक संरचना zebrafish pronephric glomerulus, somites और जर्दी थैली के बीच स्थित है। glomerulus इमेजिंग के लिए सीमित गहराई के बारे में 200 माइक्रोन, एक दूरी है कि विकास के 5 दिनों के बाद तक पहुँच जाता है हो पाया था। इसके विपरीत, फ्लोरोसेंट संरचनाओं कि कर रहे हैं lजानवर की सतह के करीब एक लंबे समय के लिए imaged किया जा सकता ocated। उदाहरण के लिए जिगर की कोशिकाओं में कम से कम 9 DPF तक इमेजिंग के लिए पहुंच रहे हैं। एक और सीमा यह है कि भ्रूण या agarose और Tricaine उपचार में लार्वा की लंबी अवधि के स्थिरीकरण क्रमश: विकास मंदता और हृदय शोफ प्रेरित है। क्योंकि यह सामान्य विकास के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं, यह ब्याज की एक निश्चित अवधि के लिए समय चूक रिकॉर्डिंग की अवधि को सीमित करने की सिफारिश की है। ब्याज की इमेजिंग संरचनाओं के दौरान कहा कि यह सुनिश्चित करने के लिए सामान्य रूप से विकसित यह (अंत में) की तुलना करने के लिए एक जानवर के साथ कि समग्र रूप में एक ही प्रयोगात्मक शर्तों के अधीन लेकिन embedding और anesthetization बिना रखा उपयोगी है।
ऑप्टिकल वर्गों की एक z ढेर रिकॉर्डिंग 5 घंटा और ध्यान केंद्रित छवियों की विस्तारित गहराई के बाद गणना की अवधि में हर 30 मिनट में सामान्य के प्रारंभिक घटनाओं के बारे में स्थानिक और लौकिक जानकारी प्रदान की है और जो ख प्रेरित किया गया था गुर्दे विकास परेशानY morpholino की मध्यस्थता wt1a की पछाड़ना। इससे पहले प्रदर्शन किया morpholino पछाड़ना प्रयोगों को पहले से ही पता चला है कि Wt1a pronephros गठन में एक प्रारंभिक और आवश्यक भूमिका को पूरा गुर्दा मार्कर 17,18 और ट्रांसजेनिक wt1b के रोजगार के साथ सीटू संकरण में:। निश्चित समय पर इमेजिंग pronephros विकास के लिए GFP लाइन 9,10 अंक से पता चला बाधित glomerular morphogenesis में है कि wt1a कमी के परिणाम और podocyte विनिर्देश विफल रहा है। इन स्थिर दृष्टिकोण के विपरीत, समय चूक रिकॉर्डिंग सीधे नियंत्रण भ्रूण में जल्दी nephrogenesis और wt1a morphants में GFP पॉजिटिव कोशिकाओं के प्रवास pronephric क्षेत्र से दूर की गतिशीलता कल्पना। समय के साथ misrouted कोशिकाओं को ट्रैक करने की संभावना अधिक विस्तृत phenotype विश्लेषण की अनुमति देता है।
सामान्य तौर पर, तरीका है कि यहां प्रस्तुत किया है प्रदान करता है एक सस्ता और जटिल करने के लिए विकल्प का उपयोग करने के लिए आसान है, और कम से सुलभ setups सामान्य रूप से इस तरह के लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप (एक पर्यावरण कक्ष और विरोधी कंपन तालिका के साथ सुसज्जित) या प्रकाश चादर खुर्दबीन के रूप में समय चूक इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया। बहाव समस्याओं को ठीक करने के लिए वर्णित दिनचर्या भी इस तरह के प्रतिदीप्ति स्टीरियो माइक्रोस्कोप के रूप में ऑप्टिकल सेक्शनिंग विकल्प, बिना setups पर समय चूक छवियों प्रदर्शन करने के लिए लागू किया जा सकता है।
तकनीक न केवल गुर्दे की विकास की जांच करने के लिए उपयुक्त है, लेकिन यह भी इस तरह के दिल या जिगर के रूप में अन्य अंगों के सामान्य और दोषपूर्ण morphogenesis पर नजर रखने के लिए लागू किया जा सकता है। इसके अलावा, विधि इस तरह के घाव भरने या उत्थान के रूप में भ्रूण और वयस्क मॉडल जीवों में विभिन्न अधिक गतिशील प्रक्रियाओं का पालन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
Disclosures
लेखक माइकल ग्रेफ कार्ल जीस माइक्रोस्कोपी जीएमबीएच है कि इस लेख में प्रयुक्त उपकरणों का उत्पादन का एक कर्मचारी है।
Acknowledgments
हम गंभीर रूप से पढ़ने और पांडुलिपि में सुधार के लिए थॉमस बेट्स धन्यवाद। हम यह भी मछली के रखरखाव के लिए क्रिस्टीना एबर्ट और सबरीना Stötzer धन्यवाद।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Control Morpholino | Gene tools, LLC | Standard control oligo | Prepared control oligo |
| wt1a Morpholinos | Gene tools, LLC | customized | Designted to target the first splice donor site, sequence as published in Ref. 9 |
| 0.5% Phenol red solution | Sigma | P0290 | Injection tracer |
| peqGOLD universal agarose | peqlab | 35-1020 | To prepare microinjection dish |
| Glass capillaries (GC100F-10) | Hugo Sachs Elektronik | 30-0019 | To generate injection needles |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | To load the microinjection needle |
| Dumont forceps | Fine Sience Tools | 91150-20 | To generate an opening at the needle tip |
| Embryo water (0.3x Danieaus´ solution) | 1x: 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4, 0.6 Ca(NO3)2, 5 mM HEPES, pH: 7,5; Do not add methylene blue! | ||
| Graticule 5 mm/0.05 mm | Science Services | PY68039-02 | For calculation of injection amount |
| Pasteur pipette 137 mm, 4.8 ml | Roth | E305.1 | To collect eggs, to transfer embryos and to remove dead embryos |
| Pasteur pipette with ultra-thin tip 157 mm, 3.5 ml | Roth | E304.1 | To remove excess of water |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma | P7629 | For suppression of melanization |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma | E10521 | To anethesize zebrafish |
| Low melting agarose | Biozym | 850111 | For embedding |
| µ-dish 35 mm, high Glass Bottom Grid-50 | ibidi | 81148 | Imaging chamber |
| Gel loader tips | Hartenstein | GS05 | To orient the embryo for proper embedding |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Micropipette puller (model P-97) | Sutter Instrument | To generate injection needles | |
| Micromanipulator | Saur Laborbedarf | For microinjection | |
| Thermomixer copact | Eppendorf | Thermoblock for tempering the low melting agarose | |
| SZ61 (Stereomicroscope) | Olympus | For injection control | |
| Axio Zoom. V16 | Zeiss | For embedding and imaging | |
| ApoTome.2 slider | Zeiss | For optical sectioning | |
| AxioCam MRm | Zeiss | For image acquisition | |
| ZEN 2012 | Zeiss | Imaging software |
References
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