Summary
Den metod som beskrivs här tillåter time-lapse analys av organutveckling i zebrafisk embryon genom att använda en fluorescens dissekera mikroskop kan utföra optisk sektionering och enkla strategier för justering för att korrigera fokus och plana drift.
Abstract
För att förstå organogenes, de rumsliga och tidsmässiga förändringar som inträffar under utvecklingen av vävnader måste registreras. Den metod som beskrivs här tillåter time-lapse analys av normal och nedsatt njur- utveckling i zebrafisk embryon genom att använda en fluorescens dissekera mikroskop utrustat för strukturerad belysning och z-stack förvärvet. Att visualisera nephrogenesis, transgena zebrafisk (Tg (wt1b: GFP)) med fluorescerande njurstrukturer användes. Njur fel utlöstes genom injektion av en antisens-morfolino oligonukleotid mot Wilms tumör genen wt1a, en faktor kända för att vara avgörande för njurutveckling.
Fördelen med den experimentella uppställningen är kombinationen av en zoommikroskop med enkla strategier för återjuste rörelser i x, y eller z-riktningen utan extra utrustning. Att kringgå fokus avdrift som induceras av temperaturvariationer och mekaniska vibrationerVar en autofokus strategi tillämpas i stället för att använda en vanligtvis krävs klimatkammare. För att åter justera lägesförändringar på grund av en xy-drift, var avbildning kammare med präglade omlokalisering nät som används.
I jämförelse med mer komplicerade inställningar för inspelning med tidsluckor med optisk sektionering såsom konfokal laserscanning eller ljusmikroskop ark, är en zoom mikroskop lätt att hantera. Dessutom erbjuder det dissekera mikroskop specifika fördelar såsom hög skärpedjup och en utökad arbetsavstånd.
Metoden för att studera organogenes presenteras här kan också användas med fluorescens stereoluppar inte kapabla att optisk sektionering. Även begränsade för hög genomströmning, erbjuder denna teknik ett alternativ till mer komplicerad utrustning som normalt används för inspelning med tidsluckor i utvecklings vävnader och dynamik organ.
Introduction
Efter gastrulation är organ nästa steg i en persons livscykel. Det handlar om omlagring, interaktion och mycket ofta migrering av celler för att producera vävnader och organ. Felaktighet i de processer som ligger till grund för utvecklingen av organ leder ofta till sjukdomar som kan manifestera sig antingen omedelbart eller också senare i livet. Således förstå organogenesen har varit en viktig insats i utvecklingsbiologi och biomedicinsk forskning. För att kunna undersöka utvecklingen av ett särskilt organ, måste det vara synlig även genom kroppsväggen av embryot. Detta gör det möjligt att spela in de rumsliga och tidsmässiga förändringar som inträffar under utveckling. Också för att analysera betydelsen av faktorer som är involverade i organogenes, måste den vara känslig för manipulation.
En organism som är synnerligen lämpad för undersökning av in vivo organogenes är zebrafisk. dess transparensency under embryonal utveckling i kombination med användningen av fluorescerande transgena linjerna tillåter observation av protein lokalisering och expressions dynamik, samt visualisering av de inre organen 1. Detta ger en unik fördel när det gäller utredning av organutveckling i realtid jämfört med däggdjurs modeller vars organ är otillgänglig för mikroskopisk analys. Dessutom olika verktyg finns tillgängliga för att manipulera embryonal utveckling av zebrafisk. Bredvid generering av muterade linjer, kan antisens-morpholino oligonukleotider (MO) kan användas för att knockdown aktiviteten av vissa gener som är inblandade i utvecklingen av vissa organ. MO: antingen rikta ett splitsningsställe eller translationsstartkodonet (AUG), och därigenom störa splitsning av pre-mRNA eller translation.
Zebrafisk embryonala njurarna, pronephros, är en anatomiskt enkel men värdefull modell för att studera njur utveckling och funktion av genes i samband med njursjukdomar 2. Den består av endast två funktionella enheter som kallas nefroner. Varje nefronet består av en glomerulus där blodfiltrering sker tre. Ytterligare komponenter är de kort hals regionen samt den segmente tubuli för utsöndring och återabsorption av lösta ämnen och kanalen, som slutar i kloaken 4. Oavsett sin enkla sammansättning, organisationen och de olika celltyper i zebrafisk pronephros är mycket lik den hos däggdjur njuren 5,6.
En faktor, som är kritiskt involverade i njurutveckling, kodas av Wilms tumör suppressor gen WT1 7. Zebrafisk besitter två paraloger kallas wt1a och wt1b att uttryckas i ett överlappande men inte identiska mönster under utvecklingen av de pronephros 8. Genom att använda transgena zebrafisk med GFP-märkta pronephros strukturer, har det visat sig att fullständig knock-down av wt1a </ em> eller av en viss splitsform leder till svåra eller milda missbildningar av embryonala njure, respektive 9,10.
Den metod som beskrivs här tillåter time-lapse analys av normal och nedsatt nephrogenesis i zebrafisk embryon genom att använda en fluorescens dissekera mikroskop utrustat för optisk sektionering via strukturerad belysning. Optiska sektioner i allmänhet tillåta förvärv av bilder som bara innehåller fokusinformation. Out-of-fokusinformation kan undvikas genom olika metoder såsom matematiska algoritmer (t.ex.. Avfaltning), optisk design (t.ex. konfokala laserskanning mikroskopi) eller en kombination av båda (t.ex. strukturerad belysning).
För att inducera defekter i njure utveckling vi använt en antisens-MO mot wt1a som injicerades i en transgen zebrafisk linje (Tg (wt1b: GFP)). Denna linje visar GFP-fluorescens i glomeruli, hals och främredel av tubuli 9,10. I jämförelse med mer komplicerade inställningar för tidsförlopp inspelningar med optisk sektionering såsom laserscanning eller ljusmikroskop ark, är en zoom mikroskop lätt att hantera och billigare. Dessutom kan utrustning för strukturerad belysning enkelt kombineras med konventionell fluorescens utrustning (t.ex. fluorescens lampa, filter) och erbjuder dissektionsmikroskop specifika fördelar såsom en utökad arbetsavstånd och stort synfält. Problem med drift löstes utan att använda extra utrustning (klimatkammare, anti-vibrationsbord) vanligtvis krävs för stabila resultat. För att korrigera för fokal drift en autofokus strategi bildades och avbildnings kammare med präglade omlokalisering galler användes för att åter justera positioneringen efter en drift i x- eller y-led.
Denna metod kan också tillämpas på mikroskop utan optiska sektione alternativ, såsom fluorescensstereo microscopes och erbjuder ett alternativ till mer komplicerad utrustning som normalt används för inspelning med tidsluckor i utvecklings vävnader och dynamik organ.
Protocol
Alla djurförsök utfördes i enlighet med "Principles of försöksdjurs vård" samt att den nuvarande versionen av den tyska lagen om skydd av djur.
1. Framställning av Antisens-morfolino (MO)
- För att framställa en 3 mM MO förrådslösning, tillsätt 100 | il av sterilt, ultrarent vatten till det lyofiliserade MO (300 nmol i glaskärl). För fullständig upplösning, värm stamlösningen till 65 ° C under 5 min. Förslut flaskan med Parafilm och lagra MO förrådslösning vid rumstemperatur (RT). Inte kyla MO stamlösning eftersom det kan leda till en sammanslutning av MO med flaskväggarna.
- Bered en 1 mM MO arbetslösning genom spädning av MO stamlösning med sterilt, ultrarent vatten och tillsätt 0,5% fenolrött-lösning till en slutlig koncentration av 0,05%.
- Att få 10 pl av en MO arbetslösning, tillsätt 3,3 l MO stamlösning och 1 pl 0,5% fenol-röd lösning till 5,7 l vatten. Varadärför förbereder en ny omgång av arbetslösning värma MO stamlösningen till 65 ° C under 5 min.
- Före användning, centrifugera MO arbetslösning för att förhindra kanylen täpps igen. Till exempel, snurra 10 pl MO stamlösning vid 15.000 xg under 5 min (RT) och ta bort 8 | il av supernatanten för injektion.
OBS: Förlust av aktivitet kan förekomma i morpholino lösningar över tiden 11. För att utesluta detta, kan man testa lösningar genom UV-spektrometri enligt protokollet från tillverkaren. Vid de använda wt1a morfolino en minskad effektivitet inte har observerats under en lång lagringsperiod (3 mM arbetslösning lagrades längre än en år).
2. Installera parning par och Insamling av befruktade ägg
- Eftermiddagen före mikroinjektion, inrättat fem par av Tg (wt1b: GFP) linjen, var och en i en avels behållare utrustad med en löstagbar sil för att separerahannar och honor under natten.
OBS: För att säkerställa att tillräckligt med ägg är tillgängliga för en lyckad injektion experiment, fisk som används som passande par borde ha förhandsgranskas och utvärderas som bra "producenter". - Nästa morgon, efter att lamporna tänds, placera den manliga och kvinnliga ovanför sikten som hindrar fisken från att äta upp sina ägg.
- Titta på lek. När en mängd ägg som som kan injiceras innan 4-cellstadiet uppnåtts (cirka 50), separat male kvinnliga igen. Överför ägg med en pasteurpipett i en petriskål fylld med embryo vatten för en första omgång av injektionen. För att få ytterligare omgångar av ägg, placera en parning par tillsammans och separat flera gånger.
3. Förberedande arbete för mikroinjektion
OBS: Utför steg 3,1 och 3,2 i förväg.
- För att förbereda en maträtt som håller embryona på plats under injektionen (mikroinjektion maträtt) infoga en glass bild i 40-45 ° vinkel i en 94 mm petriskål fylld med vätska, transparent, ren, livsmedelskvalitet kisel. Ta bilden när kisel är härdad. Som producerar ett spår i kiselskiktet.
OBS: Alternativt kan du använda 1,5-3% agaros i stället för kisel och lagra skålen vid 4 ° C. - Generera injektionsnålar från glas kapillärer med en nål avdragare.
- Använda kapillärer som innehåller interna filament.
OBS: Glödtråden kommer att hjälpa att transportera MO lösning mot nålspetsen efter återfyllning (se 3.3). - Fastställa lämpliga inställningar på nålen avdragare. Bra nålar för injektion i zebrafisk bör ha långa och smala tips 12. Generera tips med en längd av ca 10 mm och en diameter av 1,5-2 pm vid sin ände. Använd till exempel en horisontell nål avdragare med följande inställningar: Värme = 330, Pull = 0, Velocity = 40, Time = 100.
- Undersöka kvaliteten på de nålar under ettdissekera mikroskop och sortera ut de med kort eller för lång tips.
OBS: Needles med korta tips tenderar att skada embryot medan sådana med mycket långa och tunna tips böja när man rör chorion och inte tränga in i den.
- Använda kapillärer som innehåller interna filament.
- Återfyllning nålen med 2 pl MO arbetslösning genom att använda en micro spets och för in den i nålen innehavaren av mikroinjektion apparaten.
- Eftersom nålarna är stängda vid spetsänden, generera en öppning genom att klämma tillbaka i slutet av nålen med vassa pincett under dissektion mikroskop. Alternativt kan du använda mikroinjektion apparaten att försiktigt trycka spetsen till en stel yta (t.ex.. Liten metallblock eller baksidan av pincett).
- Kalibrera injektionsvolym genom att injicera MO arbetslösning in i en droppe mineralolja placeras på ett gradnät. Justera varaktigheten för injektion för att producera en droppe diameter av 75 ^ m för att erhålla en injektionsvolym av ungefär 200 pl.
- Ordna en-cellstadiet embryon längs spåret på mikroinjektion skålen med den vegetativa polen mot den riktning från där nålen kommer (i riktning mot 45 ° vinkel av spåret).
- Perforera chorion och äggulan med nålen och injicera 200 ul av 1 mM MO arbetslösning (0,2 pmol) i gulan av 1- embryon 2-cell.
- Med hjälp av en pasteurpipett med en bred öppning, samla alla de injicerade embryon i en petriskål fylld med embryo vatten och inkubera dem vid 28,5 ° C.
- På eftermiddagen, avlägsna döda embryon genom användning av en Pasteur-pipett med en bred öppning och ersätta embryot vatten.
5. Beredning av embryon för in vivo imaging
- Nästa morgon, ersätta embryot vatten med embryo vatten innehållande 0,003% N-fenyltiourea (PTU) att hämma melanin. Applicera inte PTU före utgången av gastrulation eftersom det interferes med tidig fosterutveckling.
VARNING: PTU är giftig och teratogent. Använd handskar vid alla tidpunkter och undvika inandning och kontakt med huden. - Dechorionate embryon med vassa pincett under ett dissektionsmikroskop på den önskade utvecklingsstadiet. Greppa chorion med en pincett och försöka greppa den andra sidan av chorion med ett andra par av pincett. Dra försiktigt pincetten i motsatta riktningar utan att störa embryot.
- Söva embryot genom att ersätta embryot vatten innehållande PTU (0,003%) med embryo vatten innehållande PTU (0,003%) och 0,02% etyl 3-aminobensoat-metansulfonat (Tricaine).
- Bädda embryot i lågsmältande agaros på en coverglass bottnad μ-skålen med en 50 um omlokalisering rutnät. Korrekt inbäddning kräver lite övning.
- Förbered 1 ml alikvoter av 0,7% agaros i 1,5 ml reaktionsrör och sätta dem på ett värmeblock satt till 36 ° C. Använd en pasteurpipett med bred öppning för att transfer embryot till μ-skålen. Avlägsna överskotts embryo vatten med hjälp av en pasteurpipett med ultratunn spets och overlay embryot med härdat agaros.
- Medan agarosen är fortfarande flytande, orientera embryot med två gel last tips i önskad position, med avseende på strukturen av intresse, liksom avståndet till flytten nätet. Placera strukturen av intresse (här pronephros) så nära som möjligt till glas botten (här: bröst- ned) och i omedelbar närhet till nätet.
- För optimal bildkvalitet minimera agaros skiktet mellan embryot och glas längst ned genom att placera strukturen av intresse av embryot så nära som möjligt till botten. Förutom att lokalisera embryot i omedelbar närhet till nätet men se till att nätet inte kommer att överlagra med strukturen av intresse. Bädda 3-4 embryon i olika | j-rätter varje och använda en som är placerad bäst.
- När agarosen är svårt nog att hålla embryot vänta 2-3 Min och överlagra den inbäddade embryo med embryo vatten innehållande 0,003% PTU och 0,02% Tricaine. Häll av överskotts embryot vatten eller ta bort den med hjälp av en pasteurpipett med ultratunn spets. Stäng locket på μ-skålen på det låsta läget för att förhindra avdunstning.
OBS: Undvik uppkomst av luftbubblor i μ-skålen, eftersom de skulle försämra bildinspelning.
6. Mikroskopi
OBS: Använd ett mikroskop utrustat för optisk sektionering via strukturerad belysning. Spela in bilder med en programvara som innehåller följande moduler: Multichannel, Z-stack, tidsserier Software autofokus och Extended Focus.
- Förvärv av Z-stackar
- Vänd μ-skålen. Glas längst ned står nu mot målet och μ-skålen fungerar som en avbildning kammare.
- Växla reglaget i nätet läge och aktivera den strukturerade belysningen läget i kontrollerna programvara.
- Kalibreragaller fokus för kanalen (s) val med provet som skall undersökas (inbäddad embryo) genom att följa instruktionerna i kalibreringsguiden Focus.
- Aktivera z-stack förvärvet läge och ställ in den till centerläge. Fokus i mitten av provet och ange den som mittplan z stacken genom att klicka på Center. Sätta dimensionen av z-stack genom att definiera intervallet runt mittläget.
OBS: Object strukturer bör inte ses skarpt utanför den första och den sista planet för z-stack. - Justera avståndet mellan optiska sektioner. För bästa z-upplösning klicka på Optimal-knappen. Baserat på mål skärpedjup programmet kommer att sätta en rekommenderade avståndet efter Nyquist kriteriet (50% överlappning).
OBS: Om siktar på mindre filstorlekar och strukturen tillåter, ställa in en större avstånd storlek manuellt. Inställning mindre steg än rekommenderat kommer bara att resultera i större filstorlekar utan att öka senareal information.
- Time-lapse avbildning
- Öppna Time Series verktyget och ställa in intervallet av tidsserierna experimentet. Till exempel spela in z-stack bilder var 30 min under en period av 5 timmar.
- För att korrigera för fokal drift över tiden, inrätta ett autofokus strategi. Kontrollera dialogrutan Focus strategi väljer Software Autofokus från listrutan och välj TL-Bright kanal som referenskanal.
- Börja varje tidpunkt med autofokus. För att säkerställa en tillförlitlig sökområde inom en optimerad tidsram, ställa in en fast 200 pm relativt sökområde. Detta område är helt scannas (Range Täckning parameter) med grundläggande kvalitet (kvalitetsparameter) i en maximal steglängd (Provtagning parameter).
- För att öka precisionen av autofokus, aktivera doserings inom fokusområdet av intresse (fokus ROI) och position fokus ROI i live view fönster runt strukturen av intresse.
OBS: Omsystemet saknar programvaran autofokus modul som uppdaterar mitt z-läge automatiskt under inspelning med tidsluckor, pausa experimentet vid en given tidpunkt och justera fokus manuellt och fortsätta försöket. - För att kompensera för en eventuell xy-drift under tidsserier inspelning, placera en viss punkt i den tryckta rutnät (av avbildning kammaren) i hårkorset av programvaran och spara positioneringen genom att göra en skärmdump.
- Starta tidsserier experimentet. Innan tidsserierna intervallet är över, pausa experimentet och vid behov kan du justera positionering enligt skärmdumpen. Fortsätta med experimentet.
7. Bildbehandling
- Växla till fliken bearbetning och välj Extended skärpedjup (EDF) i dialogrutan metoden. Eftersom optiska sektioner förvärvas, tillämpa den största projektionen algoritm för bildserien.
OBS: Här algoritmen kommer projicera brightest eller den mörkaste pixel från stapeln till en komposit 2D-bild i ett första steg och så småningom använda en med den högsta varians som en följd bilder för varje tidpunkt. - Använd film Export metod för att skapa en time lapse film (t.ex. avi eller flytta fil) ur EUF bildserie.
Representative Results
Time-lapse mikroskopi är en kraftfull teknik för att titta på dynamiska biologiska processer under en längre tidsperiod. En ofta förekommande problem under tidsförlopp imaging är en rörelse i x, y eller z-riktningen, som kallas drift, som induceras av temperaturvariationer och mekaniska vibrationer. Den metod som presenteras här gör time-lapse inspelning av fluorescerande strukturer i zebrafisk embryon eller larver på en dissekera mikroskop utan kammare miljö- och anti-vibrationsbord.
För ersättning av xy-drift, var provet inbäddad i en avbildning kammare med en påtryckt omlokalisering rutnät (Figur 1). Placeringen av en viss punkt i rutnätet i samband med hårkorset i programvaruverktyg användes för att återsända exemplaret till den inställda positionen (Figur 2A). De presenterade resultaten erhölls genom att använda en zoommikroskopmed en integrerad skjutreglaget för optisk sektionering via strukturerad belysning (Figur 2B). För kontinuerlig fokus korrigering, var en autofokus strategi etablerat. I denna strategi, är programvaran autofokus används för att hitta fokus baserat på maximal kontrast innan varje tidpunkt. Detta så definierade fokalplanet därefter in som mittplan för z-stack förvärvet. I syfte att minimera fototoxicitet i provet, är det transmitterade ljuset brightkanal som används som referenskanal eftersom den tillåter tillräckligt korta exponeringstider under autofokussteget (figur 2C).
Metoden tillämpades för jämförande analys av njur utveckling i styr- och wt1a morphant embryon av en transgen zebrafisk linje (Tg (wt1b: GFP)). Under tidigt nephrogenesis denna linje visar grön fluorescens i mellan mesoderm ades njur stamceller uppstår från 9,10 och senarei formnings tubuli och nephron primordia (Figur 3).
Time-lapse bildinspelning visar att nephrogenesis i kontroll morfolino injicerade embryon är oförändrat i jämförelse med icke-injicerade dem (resultaten visas inte) och följer de beskrivna stegen i början av zebrafisk njure utveckling 3. Vid 20 HPF utvecklings pronephric tubuli är synliga och vid sina främre tips, kan sfäriska anhopningar av celler, som representerar formnings nephron primordia detekteras. Under de följande timmarna, tubuli och nephron primordia växa och senare på primordia börjar att smälta vid mittlinjen (Figur 4, video 2). Däremot är nephrogenesis allvarligt störd i wt1a morphant embryon. Även om GFP-positiva rörformiga strukturer är synliga på 20 HPF, de verkar vara mer diffus och mindre utvecklade. Dessutom har ingen riktig nephron primordia bildats. Den mest slående skillnaden till than styra embryon vid denna tidpunkt, emellertid är uppkomsten av ett stort antal fluorescerande celler utanför utvecklings pronephros (Figur 4, video 2). Därefter dessa celler lämnar pronephric fältet och migrera ventralt (video 2).
Njure utveckling i kontroll embryon och wt1a morphants av wt1b transgen linje har tidigare jämfört genom att ta bilder med olika fasta tidpunkter 9,10. I motsats till detta statisk metod tillåter inspelning med tidsluckor för att följa dynamiken i normal nephrogenesis och feldirigering av njur progenitorceller som orsakas av wt1a utarmning.
Figur 1: Schematisk illustration av en Embedded embryo i en kommersiellt tillgänglig kammare med Relocation Galler. Skålen harfyra galler, var indelad i en upprepning avstånd av 50 um, präglade i ett täckglas botten. Embryot som skall avbildas är inbäddad upp och ned, med njurstrukturen i nära anslutning till en observation kvadrat utan överlagring med nätet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. Justeringar för Kompensation för Drift i Time-lapse avbildning och Grid Projection av Structured belysning En tydlig position omlokalisering nätet togs i bildens centrum (markerade med gula hårkors) och fungerar som en referenspunkt för senare xy-linje i händelse av små förskjutningar. Den röda rektangeln representerar regionen av intresse (ROI) som används i autofokus strategi (A). Optiska sektione was erhålls genom strukturerad belysning. Bilden visar en gallerstruktur som förutses i fokalplanet efter riktig kalibrering (B). ROI för autofokusstrategi (röd rektangel) är inställd för att täcka distinkta embryonala strukturer med hög kontrast (här somites) som tillåter tillförlitlig autofokusering i strukturen av intresse (C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Transgenic wt1b. GFP Embryon med grön fluorescens i utvecklings Njure överlägg av rygg (A) eller i sidled (B) överföring och fluorescens bilder visas med främre till vänster. np, nephron primordium; pt, pronephric tubuli; så såkvalster. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Knockdown av wt1a stör embryonjur Development representant utökad skärpedjup bilder från tidsförlopp inspelningar.. I kontroll morfolino injicerade embryon, visar normal utveckling med växande tubuli och nephron primordia som börjar att smälta vid mittlinjen njure utveckling. Däremot wt1a morphants misslyckas att bilda en korrekt nefronet primordia och en massiv mängd GFP positiva celler är utanför pronephric fältet. (np, nephron primordium, pt, pronephric tubuli). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande Video 1. Time-lapse inspelning av normal njure utveckling kontroll morfolino injicerade embryon. (Högerklicka för att ladda ner). Videon visar hur tubuli växer och nephron primordia börjar smälta. Med början vid 20 HPF, var bilder som tas i 30 min intervaller under en period av 5 timmar.
Kompletterande Video 2. Time-lapse inspelning av störd nephrogenesis i wt1a morphant embryon. (Högerklicka för att ladda ner). Videon visar migreringen av GFP-positiva celler från pronephric regionen. Börjar vid 20 HPF, var bilder tagna i 30 min intervall över en period av 5 h.
Discussion
Zebrafisk har blivit en populär modell organism för studier av ryggradsdjur utveckling och modellering av sjukdomar hos människan. Eftersom zebrafisk embryon förbli öppen, kan observeras utvecklings organ som hjärna och hjärta med en vanlig beredning mikroskop. Med utnyttjande av transgena linjer med organspecifik fluorescens gör bedömningar av organ hela olika utvecklingsstadier i levande embryon genom fluorescensmikroskopi. En begränsning för avbildning av strukturella detaljer av hela organ med standard epifluorescensmikroskopi är effekten av signaler från objekt ovanför och under fokalplanet. Denna out-of-fokus ljus inte bara resulterar i minskad bildkontrast och upplösning, det kan också dölja viktiga strukturer av intresse 13,14. Flera tekniker såsom laserskanning confocal-, spinning disk confocal- eller multifotonmikroskop har utvecklats för att minimera out-of-fokus information och därmed increase bildkontrasten liksom axiell upplösning. En alternativ metod för att erhålla optiska sektioner är laser- och skanning fri strukturerad belysning mikroskopi, ett brett fält baserad belysningsteknik som är och enkel att genomföra på ett vanligt mikroskop 15. Resultaten som presenteras här visar att optisk sektionering, uppnås genom strukturerad belysning, genomförs på ett dissektionsmikroskop och i kombination med återuppbyggnaden av utökade Bilderna oskarpa möjliggör visualisering av strukturella detaljer av normal och störd njure utveckling i zebrafisk. I synnerhet är de GFP-positiva celler i wt1a morphants dispergerades vid olika fokala djup, och bilder av endast ett plan med oskarp oskärpa underskattning av den tredimensionella komplexiteten av fenotypen.
För att följa dynamiken i organ organisation, ombildning eller avbrott, är tidsförlopp fluorescensmikroskopi en kraftfull än komplex teknik. Under time-lapseimaging små vibrationer eller mindre temperaturvariationer orsakar drift i x, y eller z-led. Detta kräver extra utrustning (klimatkammare, anti-vibrationsbord) för att få stabila resultat. Denna metod använder förmågan hos ett dissektionsmikroskop med en motoriserad fokus enhet för inspelning av tidsförlopp bilder utan extra enheter. Att bibehålla en stabil fokus, var en autofokus strategi upprättas och en omlokalisering rutnät imprinted in i botten av avbildningskammaren användes för korrigering av x, y- instabilitet.
Korrekt inbäddning av embryot är ett kritiskt steg i protokollet. Det behövs lite övning för att placera strukturen av intresse så nära som möjligt till glasbotten och i omedelbar närhet till nätet utan att överlagra med det.
Den största fördelen med metoden är att det är ett prisvärt och enkelt verktyg för direkt observation av utvecklingsprocesser såsom tillväxt och migration i vardagsembryon över flera timmar. Dessutom dissektionsmikroskop specifika fördelar såsom stort synfält och utökad arbetsavstånd underlätta undersökning av större prov inklusive hela organ. Emellertid vissa begränsningar måste hållas i åtanke. Pausning av experiment för att kontrollera och justera placeringen gör proceduren tidsödande och frånvaron av en robust temperaturkontroll ändrar "standard" utvecklande tid, som definieras som h efter befruktning vid 28,5 ° C i zebrafisk 16. Ett annat potentiellt problem är det selektiva djupet av avbildning i djuret, i synnerhet när strukturen av intresse ligger på insidan av embryo eller larver. En sådan struktur är den zebrafisk pronephric glomerulus, som är belägen mellan de somiter och gulesäcken. Den begränsande djupet för avbildning glomerulus befanns vara ca 200 ^ m, ett avstånd som uppnås efter 5 dagar av utveckling. I kontrast, fluorescerande strukturer som är located närmare ytan av djuret kan avbildas under en längre tid. Till exempel leverceller är tillgängliga för avbildning åtminstone fram till 9 dpf. En ytterligare begränsning är att långsiktigt immobilisering av embryot eller larver i agaros och Tricaine behandling inducerar tillväxthämning och hjärtödem, respektive. Eftersom detta kan störa normal utveckling, är det rekommenderat att begränsa varaktigheten av inspelning med tidsluckor till en viss ränta. För att säkerställa att under avbildnings strukturer av intresse utvecklas normalt är det bra att jämföra (i slutet) helhetsintrycket med den hos ett djur hålls under samma experimentella betingelser men utan att bädda och bedövning.
Inspelning av ett z-stack av optiska sektioner var 30 minuter under en period av 5 timmar och efterföljande beräkning av utökad djup Bilderna oskarpa tillhandahålls rumsliga och tidsmässiga information om tidiga händelser av normal och störd njure utveckling som framkallades by morfolino-medierad knockdown av wt1a. Tidigare utförda morfolino knockdown försök har redan visat att Wt1a fyller en tidig och viktig roll i pronephros bildning in situ hybridisering med njur markör 17,18 och anställning av transgena wt1b. GFP linje för avbildning pronephros utveckling vid fasta tidpunkter 9,10 avslöjade att wt1a brist resulterar i avbruten glomerulär morfogenes och misslyckades podocyte specifikation. I motsats till dessa statiska metoder, time-lapse inspelningar direkt visualisera dynamiken i början nephrogenesis i embryon kontroll och migration av GFP-positiva celler bort från pronephric regionen wt1a morphants. Möjligheten att spåra misrouted celler över tid tillåter en mer detaljerad fenotyp analys.
I allmänhet ger den metod som presenteras här en billig och lätt att använda alternativ till den komplexa, och mindre tillgängliga och för sigtups som normalt används för time-lapse avbildning såsom laserscanning mikroskop (utrustad med en miljökammare och anti-vibrationsbord) eller ljus ark mikroskop. Den beskrivna rutinen att åtgärda driftproblem kan också användas för att utföra tidsförlopp bilder på uppställningar utan optiska sektione alternativ, såsom fluorescens stereoluppar.
Tekniken är inte bara lämpligt att undersöka njur utveckling, men kan också tillämpas för att övervaka normal och defekt morfogenes av andra organ såsom hjärta eller lever. Vidare kan förfarandet användas för att observera olika mer dynamiska processer i embryonala och vuxna modellorganismer såsom sårläkning eller regenerering.
Disclosures
Författaren Michael Graf är anställd av Carl Zeiss Microscopy GmbH som producerar instrument som används i denna artikel.
Acknowledgments
Vi tackar Thomas Bates för kritiskt läsa och förbättra manuskriptet. Vi vill också tacka Christina Ebert och Sabrina Stötzer för fisk underhåll.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Control Morpholino | Gene tools, LLC | Standard control oligo | Prepared control oligo |
| wt1a Morpholinos | Gene tools, LLC | customized | Designted to target the first splice donor site, sequence as published in Ref. 9 |
| 0.5% Phenol red solution | Sigma | P0290 | Injection tracer |
| peqGOLD universal agarose | peqlab | 35-1020 | To prepare microinjection dish |
| Glass capillaries (GC100F-10) | Hugo Sachs Elektronik | 30-0019 | To generate injection needles |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | To load the microinjection needle |
| Dumont forceps | Fine Sience Tools | 91150-20 | To generate an opening at the needle tip |
| Embryo water (0.3x Danieaus´ solution) | 1x: 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4, 0.6 Ca(NO3)2, 5 mM HEPES, pH: 7,5; Do not add methylene blue! | ||
| Graticule 5 mm/0.05 mm | Science Services | PY68039-02 | For calculation of injection amount |
| Pasteur pipette 137 mm, 4.8 ml | Roth | E305.1 | To collect eggs, to transfer embryos and to remove dead embryos |
| Pasteur pipette with ultra-thin tip 157 mm, 3.5 ml | Roth | E304.1 | To remove excess of water |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma | P7629 | For suppression of melanization |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma | E10521 | To anethesize zebrafish |
| Low melting agarose | Biozym | 850111 | For embedding |
| µ-dish 35 mm, high Glass Bottom Grid-50 | ibidi | 81148 | Imaging chamber |
| Gel loader tips | Hartenstein | GS05 | To orient the embryo for proper embedding |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Micropipette puller (model P-97) | Sutter Instrument | To generate injection needles | |
| Micromanipulator | Saur Laborbedarf | For microinjection | |
| Thermomixer copact | Eppendorf | Thermoblock for tempering the low melting agarose | |
| SZ61 (Stereomicroscope) | Olympus | For injection control | |
| Axio Zoom. V16 | Zeiss | For embedding and imaging | |
| ApoTome.2 slider | Zeiss | For optical sectioning | |
| AxioCam MRm | Zeiss | For image acquisition | |
| ZEN 2012 | Zeiss | Imaging software |
References
- Lieschke, G. J. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Drummond, I. A. Kidney development and disease in the zebrafish. J Am Soc Nephrol. 16 (2), 299-304 (2005).
- Drummond, I. A., et al. Early development of the zebrafish pronephros and analysis of mutations affecting pronephric function. Development. 125 (23), 4655-4667 (1998).
- Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3 (10), 1922-1938 (2007).
- Kramer-Zucker, A. G., Wiessner, S., Jensen, A. M., Drummond, I. A. Organization of the pronephric filtration apparatus in zebrafish requires Nephrin, Podocin and the FERM domain protein Mosaic eyes. Dev Biol. 285 (2), 316-329 (2005).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation. Kidney Int. 73 (10), 1120-1127 (2008).
- Kreidberg, J. A., et al. Wt-1 Is Required for Early Kidney Development. Cell. 74 (4), 679-691 (1993).
- Bollig, F., et al. Identification and comparative expression analysis of a second wt1 gene in zebrafish. Dev Dyn. 235 (2), 554-561 (2006).
- Perner, B., Englert, C., Bollig, F. The Wilms tumor genes wt1a and wt1b control different steps during formation of the zebrafish pronephros. Dev Biol. 309 (1), 87-96 (2007).
- Schnerwitzki, D., et al. Alternative splicing of Wilms tumor suppressor 1 (Wt1) exon 4 results in protein isoforms with different functions. Dev Biol. 393 (1), 24-32 (2014).
- Bedell, V. M., Westcot, S. E., Ekker, S. C. Lessons from morpholino-based screening in zebrafish. Brief Funct Genomics. 10 (4), 181-188 (2011).
- Rembold, M., Lahiri, K., Foulkes, N. S., Wittbrodt, J. Transgenesis in fish: efficient selection of transgenic fish by co-injection with a fluorescent reporter construct. Nat Protoc. 1 (3), 1133-1139 (2006).
- Conchello, J. A., Lichtman, J. W. Optical sectioning microscopy. Nat Methods. 2 (12), 920-931 (2005).
- Jensen, E. C. Types of imaging, Part 2: an overview of fluorescence microscopy. Anat Rec (Hoboken). 295 (10), 1621-1627 (2012).
- Chasles, F., Dubertret, B., Boccara, A. C. Optimization and characterization of a structured illumination microscope. Opt Express. 15 (24), 16130-16140 (2007).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Hsu, H. J., Lin, G., Chung, B. C. Parallel early development of zebrafish interrenal glands and pronephros: differential control by wt1 and ff1b. Development. 130 (10), 2107-2116 (2003).
- O'Brien, L. L., et al. Wt1a, Foxc1a, and the Notch mediator Rbpj physically interact and regulate the formation of podocytes in zebrafish. Dev Biol. 358 (2), 318-330 (2011).
