Summary
La méthode décrite ici permet une analyse time-lapse du développement des organes dans des embryons de poisson zèbre en utilisant une fluorescence microscope de dissection capables d'effectuer le sectionnement optique et des stratégies simples de réadaptation pour corriger la dérive focale et plane.
Abstract
Afin de comprendre l'organogenèse, les modifications spatiales et temporelles qui se produisent au cours du développement des tissus doivent être enregistrées. La méthode décrite ici permet une analyse time-lapse du développement normal du rein et des troubles dans les embryons de poisson zèbre en utilisant un microscope à fluorescence dissection équipé pour l'éclairage structuré et l'acquisition z-stack. Pour visualiser néphrogenèse, zebrafish transgénique (Tg (wt1b: GFP)) structures rénales avec marqués par fluorescence ont été utilisés. Malformations rénales ont été déclenchées par injection d'un oligonucléotide anti - sens contre le morpholino wt1a du gène de la tumeur de Wilms, un facteur connu pour être essentiel pour le développement du rein.
L'avantage du dispositif expérimental est la combinaison d'un microscope à zoom avec des stratégies simples pour les mouvements de ré-ajustement dans x, y ou z direction sans équipement supplémentaire. Afin de contourner la dérive focale qui est induit par des variations de température et aux vibrations mécaniquesUne stratégie de mise au point automatique est appliqué au lieu d'utiliser une chambre environnementale habituellement nécessaire. Afin de réajuster les changements de position en raison d'une xy-dérive, chambres d'imagerie avec des grilles de réinstallation imprimés ont été employés.
En comparaison avec des configurations plus complexes pour l'enregistrement time-lapse avec sectionnement optique tels que confocal à balayage laser ou microscopes de feuille de lumière, un microscope à zoom est facile à manipuler. En outre, il offre des avantages spécifiques à la dissection au microscope comme une forte profondeur de champ et une distance de travail prolongée.
La méthode pour étudier l'organogenèse présenté ici peut également être utilisé avec des microscopes de fluorescence stéréo pas capables de sectionnement optique. Bien que limité pour haut débit, cette technique offre une alternative à l'équipement plus complexe qui est normalement utilisé pour l'enregistrement time-lapse des tissus en développement et de la dynamique d'organes.
Introduction
Après gastrulation, organogenèse est la prochaine étape du cycle de vie d'un individu. Elle implique le réarrangement, l'interaction et très souvent, la migration des cellules pour produire des tissus et des organes. Imprécision dans les processus sous-jacents du développement des organes conduit souvent à des maladies qui peuvent se manifester soit immédiatement, soit aussi plus tard dans la vie. Ainsi, la compréhension de l'organogenèse a été un effort majeur dans la biologie du développement et de la recherche biomédicale. Afin de pouvoir étudier le développement d'un organe particulier, il doit être visible même à travers la paroi du corps de l'embryon. Ceci permet à l'enregistrement des modifications spatiales et temporelles qui se produisent au cours du développement. Toujours dans le but d'analyser l'importance des facteurs impliqués dans l'organogenèse, il doit être sensible à la manipulation.
Un organisme qui est très approprié pour l'enquête de l' organogenèse in vivo est zebrafish. Son transpaence pendant le développement embryonnaire , en combinaison avec l'utilisation de lignées transgéniques fluorescents permet d' observer la localisation de la protéine et l' expression dynamique, ainsi que la visualisation des organes internes 1. Cela donne un avantage unique en ce qui concerne l'enquête sur le développement des organes en temps réel par rapport aux modèles de mammifères dont les organes sont inaccessibles pour l'analyse microscopique. En outre, différents outils sont disponibles pour manipuler le développement embryonnaire du poisson zèbre. A côté de la génération de lignées mutantes, des oligonucléotides antisens morpholino (MO) peut être utilisé pour knockdown l'activité de certains gènes qui sont impliqués dans le développement de certains organes. OM soit cibler un site d'épissage ou le codon d'initiation de traduction (AUG), et ainsi interférer avec l'épissage de pré-ARNm ou de traduction.
Le rein embryonnaire zebrafish, les pronéphros, est un modèle anatomique simple mais utile pour étudier le développement du rein et la fonction de genes liés aux maladies rénales 2. Il se compose de seulement deux unités fonctionnelles appelées néphrons. Chaque néphron est constitué d'un glomérule où la filtration du sang a lieu 3. D' autres composants sont la région du cou court, ainsi que le tubule segmenté pour la sécrétion et la réabsorption des solutés et le conduit, qui se termine dans le cloaque 4. Quelle que soit sa composition simple, l'organisation et les différents types de pronéphros de poisson zèbre de cellules sont très similaires au rein de mammifère 5,6.
Un facteur qui joue un rôle critique dans le développement du rein, est codé par le gène suppresseur de tumeur de Wilms de Wt1 7. Zebrafish possèdent deux paralogues appelés wt1a et wt1b étant exprimé dans un motif identique de chevauchement , mais pas au cours du développement des pronéphros 8. En utilisant le poisson - zèbre transgénique avec des structures pronéphros GFP marquée, il a été démontré que knock-down complète de wt1a </ em> ou d'une forme d'épissage particulier conduit à des malformations sévères ou modérées du rein embryonnaire, respectivement 9,10.
La méthode décrite ici permet une analyse time-lapse de néphrogenèse normale et altérée dans les embryons de poisson zèbre en utilisant un microscope à fluorescence dissection équipé pour le sectionnement optique via un éclairage structuré. sections optiques en général permettent l'acquisition d'images qui ne contiennent que des informations de mise au point. Out-of-focus information peut être évité par diverses approches telles que des algorithmes mathématiques (par exemple. Déconvolution), conception optique (par exemple , microscopie confocale à balayage laser) ou une combinaison des deux (éclairage par exemple structuré).
Pour induire des défauts dans le développement du rein , nous avons utilisé un antisens MO contre wt1a qui a été injecté dans une lignée transgénique zebrafish (Tg (wt1b: GFP)). Cette ligne montre GFP-fluorescence dans le glomérule, le cou et la partie antérieurepartie du tubule 9,10. En comparaison avec des configurations plus complexes pour les enregistrements time-lapse avec sectionnement optique telles que le balayage laser ou microscopes de feuille de lumière, un microscope à zoom est facile à manipuler et moins coûteux. De plus, l' équipement pour l' éclairage structuré peut facilement être combiné avec un équipement conventionnel de fluorescence (par exemple fluorescence lampe, filtres) et des offres de dissection avantages spécifiques au microscope, comme une distance de travail prolongée et un grand champ de vision. Problèmes avec la dérive ont été résolus sans utiliser des équipements supplémentaires (chambre environnementale, table anti-vibration) habituellement requis pour obtenir des résultats stables. Pour corriger la dérive focale d'une stratégie de mise au point automatique a été mis en place et des chambres d'imagerie avec des grilles de réinstallation imprimées ont été utilisées pour ré-ajuster le positionnement suite à une dérive de direction x ou y.
La méthode présentée peut également être appliquée à des microscopes sans options de coupes optiques, telles que la fluorescence stéréo microscopes et offre une alternative à l'équipement plus complexe qui est normalement utilisé pour l'enregistrement time-lapse des tissus en développement et de la dynamique d'organes.
Protocol
Toutes les expériences animales ont été effectuées selon les «Principes de soins des animaux de laboratoire», ainsi que la version actuelle de la loi allemande sur la protection des animaux.
1. Préparation du morpholino antisens (MO)
- Pour préparer une solution stock mM MO 3, ajouter 100 ul d'eau ultrapure stérile au MO lyophilisé (300 nmol en flacon de verre). Pour une dissolution complète, chauffer la solution mère à 65 ° C pendant 5 min. Sceller le flacon avec Parafilm et stocker la solution mère MO à la température ambiante (RT). Ne pas refroidir la solution mère MO parce que cela pourrait provoquer une association de MO avec les parois du flacon.
- Préparer une solution de travail 1 mM MO en diluant la solution mère MO avec de l'eau ultrapure stérile et ajouter la solution rouge 0,5% de phénol à une concentration finale de 0,05%.
- Pour obtenir 10 pi d'une solution de travail MO, ajouter 3,3 ul solution MO stock et 1 pl de solution de rouge de phénol 0,5% à 5,7 pi d'eau. Êtreavant la préparation d'un nouveau lot de solution de travail chauffer la solution MO stock à 65 ° C pendant 5 min.
- Avant utilisation, centrifuger la solution de travail MO pour empêcher l'aiguille colmatage. Par exemple, tourner 10 pl de solution mère MO à 15.000 xg pendant 5 min (RT) et de supprimer 8 pi du surnageant pour l'injection.
NOTE: La perte de l' activité peut se produire dans des solutions morpholino au fil du temps 11. Pour exclure cela, on peut tester les solutions par spectrométrie UV en suivant le protocole fourni par le fabricant. Dans le cas des wt1a utilisés morpholino une efficacité réduite n'a pas été observé au cours d' une longue période de stockage (solution de travail 3 mM a été stocké plus d'un an).
2. Configuration de paires d'accouplement et la collecte des œufs fécondés
- L'après - midi avant la microinjection, la mise en place de cinq paires de la Tg (wt1b: GFP) de ligne, chacun dans un conteneur de reproduction équipé d'un tamis pour séparer amoviblemâles et femelles pendant la nuit.
NOTE: Pour veiller à ce que suffisamment d'œufs sont disponibles pour une expérience d'injection réussie, le poisson utilisé comme paires d'accouplement doit avoir été pré-sélectionnés et évalués comme "producteurs" bons. - Le lendemain matin, après que les lumières allument, mettre le mâle et la femelle ensemble au-dessus du tamis qui empêche les poissons de manger leurs oeufs.
- Regardez le frai. Une fois qu'une quantité d'oeufs sont prévues qui peuvent être injectés avant le stade 4 cellules est atteint à nouveau (environ 50), séparés pour les hommes de la femelle. Transférer les oeufs avec une pipette Pasteur dans une boîte de Pétri remplie d'eau de l'embryon pour un premier tour d'injection. Pour obtenir des tours supplémentaires d'œufs, placer une paire d'accouplement ensemble et séparés à plusieurs reprises.
3. Les travaux préparatoires pour microinjection
REMARQUE: Effectuer les étapes 3.1 et 3.2 à l'avance.
- Pour préparer un plat qui contient les embryons en position pendant l'injection (plat de microinjection) insérer un gltoboggan cul à un angle de 40-45 ° dans un plat de 94 mm de Pétri remplie de liquide, transparent, pur, qualité alimentaire silicium. Retirer la lame lorsque le silicium est durci. Cela produit un sillon dans la couche de silicium.
REMARQUE: Vous pouvez également utiliser 1,5-3% d'agarose au lieu de silicium et stocker le plat à 4 ° C. - Générer des aiguilles d'injection de capillaires en verre avec un extracteur d'aiguille.
- Utiliser des capillaires qui contiennent des filaments internes.
NOTE: Le filament aidera à transporter la solution MO vers la pointe de l'aiguille après le remblayage (voir 3.3). - Mettre en place les paramètres appropriés sur l'extracteur d'aiguille. De bonnes aiguilles pour injection dans zebrafish devraient avoir de longues et minces conseils 12. Générer des conseils avec une longueur d'environ 10 mm et un diamètre de 1,5-2 um à leur fin. Par exemple, utiliser un extracteur d'aiguille horizontale avec les paramètres suivants: Heat = 330, Pull = 0, vitesse = 40, Temps = 100.
- Examiner la qualité des aiguilles sous unedissection microscope et trier ceux qui ont des conseils courts ou trop longs.
NOTE: Les aiguilles avec des pointes courtes ont tendance à endommager l'embryon tout comme avec des conseils très longs et minces bend en touchant le chorion et ne pénétrer.
- Utiliser des capillaires qui contiennent des filaments internes.
- Remblayer l'aiguille avec 2 pi de solution de travail MO en utilisant une pointe de microloader et l'insérer dans le porte-aiguille de l'appareil de microinjection.
- Comme les aiguilles sont fermées à l'extrémité de pointe, de générer une ouverture en pinçant retour la fin de l'aiguille avec des pincettes pointues sous le microscope de dissection. Vous pouvez également utiliser l'appareil de microinjection pour pousser doucement la pointe sur une surface rigide (par exemple. Bloc petit métal ou arrière de pincettes).
- Étalonner le volume d'injection en injectant la solution de travail MO dans une goutte d'huile minérale placée sur un réticule. Ajuster la durée d'injection pour la production d'un diamètre de goutte de 75 pm pour obtenir un volume d'injection d'environ 200 pl.
- Agencer les embryons au stade 1 de cellules le long de la gorge de la coupelle de micro-injection avec le pôle végétal vers la direction d'où vient l'aiguille (vers l'angle de 45 ° de la rainure).
- Perfore le chorion, et le jaune d'oeuf avec l'aiguille et l'injection de 200 pl de la solution de travail 1 mM MO (0,2 pmol) dans le jaune de 1- aux embryons de 2 cellules.
- En utilisant une pipette Pasteur avec une large ouverture, rassembler tous les embryons injectés dans une boîte de Pétri remplie d'eau de l'embryon et les incuber à 28,5 ° C.
- Dans l'après-midi, retirer les embryons morts à l'aide d'une pipette Pasteur avec une large ouverture et remplacer l'eau de l'embryon.
5. Préparation d'embryons pour In Vivo Imaging
- Le lendemain matin, remplacer l'eau des embryons avec de l'eau de l'embryon contenant 0,003% de N-phénylthiourée (PTU) pour inhiber la mélanisation. Ne pas appliquer PTU avant la fin de la gastrulation parce qu'il interferes avec le développement embryonnaire précoce.
ATTENTION: PTU est toxique et tératogène. Porter des gants en tout temps et éviter l'inhalation et le contact avec la peau. - Dechorionate les embryons avec des pinces acérées sous un microscope de dissection au stade de développement souhaité. Prenez le chorion avec une paire de pinces et d'essayer de saisir l'autre côté du chorion avec une deuxième paire de pinces. Retirez délicatement les pinces dans des directions opposées, sans perturber l'embryon.
- Anesthetize l'embryon en remplaçant l'eau d'embryons contenant PTU (0,003%) avec de l'eau de l'embryon contenant PTU (0,003%) et 0,02% Ethyl méthanesulfonate 3-aminobenzoate (Tricaine).
- Incluez l'embryon dans bas point de fusion d'agarose sur un μ-plat de lamelle à fond avec une grille de relocalisation de 50 um. intégration appropriée exige une certaine pratique.
- Préparer 1 ml aliquotes de 0,7% d'agarose dans 1,5 ml tubes de réaction et de les mettre sur un bloc chauffant à 36 ° C. Utiliser une pipette Pasteur avec une large ouverture à transfer l'embryon du μ-plat. Enlever l'eau de l'embryon en excès à l'aide d'une pipette Pasteur à pointe ultra-mince et superposer l'embryon avec agarose trempé.
- Alors que l'agarose est encore liquide, orienter l'embryon avec deux embouts gel chargeur dans la position souhaitée, à l'égard de la structure d'intérêt, ainsi que la distance à la grille de relocalisation. Placez la structure d'intérêt (ici les pronéphros) aussi près que possible du fond de verre (ici: dorsale vers le bas) et à proximité immédiate de la grille.
- Pour obtenir une qualité d'image optimale minimiser la couche d'agarose entre l'embryon et le fond de verre en plaçant la structure d'intérêt de l'embryon aussi près que possible du fond. En outre, localiser l'embryon à proximité immédiate de la grille, mais veillez à ce que la grille ne sera pas superposer avec la structure d'intérêt. Incluez 3-4 embryons dans différents u-plats chacun et utiliser celui qui est positionné le mieux.
- Lorsque l'agarose est assez dur pour maintenir l'attente d'embryons pour 2-3 Min et superposer l'embryon embarqué avec l'eau d'embryons contenant 0,003% PTU et 0,02% Tricaine. Décanter l'eau d'embryons excédentaires ou l'enlever à l'aide d'une pipette Pasteur à pointe ultra-mince. Fermez le couvercle du μ-plat à la position de verrouillage pour empêcher l'évaporation.
NOTE: Eviter l'apparition de bulles d'air dans le μ-plat, car ils compromettraient l'enregistrement de l'image.
6. Microscopie
REMARQUE: Utiliser un microscope équipé pour le sectionnement optique via un éclairage structuré. Enregistrement des images avec un logiciel contenant les modules suivants: multicanal, Z-Stack, séries chronologiques, Software Autofocus et focus Extended.
- Acquisition de Z-piles
- Inversez le μ-plat. Le fond de verre fait maintenant face vers l'objectif et le μ-plat sert de chambre d'imagerie.
- Basculer le curseur dans la position de grille et activer le mode d'éclairage structuré dans les commandes du logiciel.
- Étalonnerla mise au point de la grille pour la chaîne (s) de choix avec l'échantillon à examiner (embryon intégré) en suivant les instructions de l'assistant d'étalonnage Focus.
- Activer le mode d'acquisition z-Stack et mettez-le en mode centre. Concentrez dans le milieu de l'échantillon et le définir comme le plan central de la pile z- en cliquant Center. Régler la dimension de la pile en Z définissant la plage autour de la position centrale.
REMARQUE: les structures de l'objet ne doivent pas être vus nettement à l'extérieur du premier et le dernier plan de la z-stack. - Ajuster l'espacement entre les sections optiques. Pour une meilleure résolution z cliquez sur le bouton Optimal. Sur la base de la profondeur des objectifs de champ le logiciel établira une distance recommandée suivant le critère de Nyquist (50% de chevauchement).
NOTE: Si le but pour les petites tailles de fichiers et les permis de structure, définir une taille d'espacement plus large manuellement. Réglage de petites étapes que recommandée ne fera que conduire à des fichiers plus volumineux sans augmenter plus tardinformations al.
- Time-lapse Imaging
- Ouvrez l'outil Time Series et régler l'intervalle de l'expérience des séries chronologiques. Par exemple enregistrer des images z-stack toutes les 30 min sur une période de 5 heures.
- Pour corriger la dérive focale au fil du temps, mettre en place une stratégie de mise au point automatique. Cochez la case de dialogue Stratégie Focus, sélectionnez Software Autofocus dans la liste déroulante et choisissez le canal TL-Brightfield comme canal de référence.
- Commencez chaque point de temps avec la mise au point automatique. Afin d'assurer une plage de recherche fiable dans un laps de temps optimisé, définir un fixe de 200 um par rapport plage de recherche. Cette gamme est entièrement numérisé (paramètre couverture Range) avec une qualité de base (paramètre de qualité) dans une taille maximale de l'étape (paramètre d'échantillonnage).
- Pour augmenter la précision de la mise au point automatique, activer le dosage dans une région de centre d'intérêt (focus ROI) et la position dudit foyer ROI dans la fenêtre de vue en direct autour de la structure d'intérêt.
NOTE: Sile système n'a pas le module logiciel Autofocus qui met à jour automatiquement le z-position centrale pendant l'enregistrement time-lapse, mettre en pause l'expérience à un moment donné et d'ajuster la mise au point manuellement et continuer l'expérience. - Pour compenser une xy-dérive potentielle lors de l'enregistrement des séries chronologiques, la position d'un point de la grille imprimée (de la chambre d'imagerie) notamment dans le collimateur du logiciel et enregistrer le positionnement en faisant une capture d'écran.
- Commencez l'expérience des séries chronologiques. Avant l'intervalle de séries temporelles est terminée, mettre en pause l'expérience et, si nécessaire, ré-ajuster le positionnement en fonction de la capture d'écran. Continuer avec l'expérience.
Traitement 7. Image
- Passez à l'onglet de traitement et sélectionnez la Profondeur étendue de mise au point (EDF) dans la boîte de dialogue Méthode. Depuis sections optiques sont acquises, appliquer l'algorithme de projection maximale de la série d'images.
NOTE: Voici l'algorithme va projeter le brightest ou le pixel le plus sombre de la pile à une image composite 2D dans une première étape et, éventuellement, utiliser l'une avec la plus haute variance comme une image de résultat pour chaque point de temps. - Utilisez la méthode Film Export pour créer un film laps de temps (par exemple , avi ou déplacer le fichier) de la série d'images EDF.
Representative Results
La microscopie time-lapse est une technique puissante pour regarder les processus biologiques dynamiques sur une période de temps plus longue. Un problème qui se pose souvent lors de l'imagerie time-lapse est un mouvement dans le sens x, y ou z, appelé la dérive, qui est induite par des variations de température et les vibrations mécaniques. La méthode présentée ici permet l'enregistrement des structures de marquées par fluorescence dans des embryons de poisson zèbre ou de larves sur un microscope à dissection sans chambre environnementale et table anti-vibration time-lapse.
Pour la compensation de xy-dérive, le spécimen a été incorporé dans une chambre d'imagerie avec une grille de relocalisation impressionStylos (Figure 1). L'emplacement d'un point de la grille liée à la ligne de mire de l'outil de logiciel particulier a été utilisé pour renvoyer le spécimen à la position pré-réglée (figure 2A). Les résultats présentés ont été obtenus en utilisant un microscope à zoomavec un coulisseau intégré pour le sectionnement optique par l' intermédiaire d'un éclairage structuré (figure 2B). Pour la correction focale continue, une stratégie de mise au point a été établi. Dans cette stratégie, la mise au point automatique du logiciel est utilisé pour trouver la mise au point sur la base de contraste maximum avant chaque point de temps. Ce plan focal ainsi défini est ensuite défini comme plan de centre pour l'acquisition z-stack. Afin de minimiser la phototoxicité de l'échantillon, le canal de fond clair de lumière transmise est utilisée comme voie de référence , car elle permet suffisamment courts temps d'exposition au cours de l'étape de mise au point automatique (figure 2C).
La méthode a été appliquée pour l' analyse comparative du développement du rein chez les embryons de morphant et contrôleurs wt1a d'une ligne zebrafish transgénique (Tg (wt1b: GFP)). Pendant néphrogenèse au début de cette ligne montre la fluorescence verte dans le mésoderme intermédiaire, ont été les progéniteurs rénaux proviennent de 9,10 et plus tarddans les tubes de formage et néphron primordiums (figure 3).
Time-lapse enregistrement d'images révèle que néphrogenèse en morpholino injecté embryons de contrôle est inchangé par rapport à ceux non - injecté (résultats non montrés) et suit les étapes décrites du développement précoce du rein zebrafish 3. A 20 HPF les tubules pronephrique en développement sont visibles et à leurs extrémités antérieures, les accumulations sphériques de cellules, ce qui représente le néphron primordia formant peuvent être détectés. Au cours des prochaines heures, tubules et primordia néphron grandissent et plus tard sur les primordia commencent à fondre sur la ligne médiane (Figure 4, vidéo 2). En revanche, néphrogenèse est fortement perturbé dans les embryons de wt1a morphant. Bien que les structures tubulaires GFP-positives sont visibles à 20 HPF, ils semblent être plus diffus et moins développés. En outre, aucun primordia néphron appropriés ont été formés. La différence la plus frappante à til contrôle les embryons à ce point de temps, cependant, est l'apparition d'un grand nombre de cellules fluorescentes en dehors des pronéphros en développement (Figure 4, vidéo 2). Par la suite, ces cellules quittent le champ pronephrique et migrent ventralement (vidéo 2).
Le développement du rein chez les embryons de contrôle et morphants wt1a de la lignée transgénique wt1b ont déjà été comparés en prenant des images à différents points de temps fixe 9,10. Contrairement à cette méthode statique, l' enregistrement time-lapse permet de suivre la dynamique de néphrogenèse normale et misrouting des cellules progénitrices rénaux causés par wt1a épuisement.
Figure 1: Illustration schématique d'un Embryon embarqué dans une chambre disponible dans le commerce avec Relocation Grids. Le plat aquatre grilles, chacune subdivisée en une distance de répétition de 50 pm, imprimé dans un fond de lamelle de verre. L'embryon à imager est intégré à l' envers, avec la structure du rein à proximité d' une place d'observation mais sans superposant avec la grille. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2:. Ajustements pour Rémunération des Drift in Time-lapse Imaging and Grid Projection d'éclairage structuré Une position distincte de la grille de relocalisation a été amené dans le centre de l' image (marqués par réticule jaune) et sert de point de départ pour xy-alignement plus tard référence en cas de petits déplacements. Le rectangle rouge représente la région d'intérêt (ROI) utilisé dans la stratégie de mise au point (A). wa sectionnement optiques obtenus par un éclairage structuré. L'image montre une structure de grille projetée dans le plan focal après un étalonnage approprié (B). Le retour sur investissement pour la stratégie de mise au point automatique (rectangle rouge) est réglé pour couvrir les structures embryonnaires distinctifs riches en contraste (ici somites) qui permettent une mise au point fiable dans la structure d'intérêt (C). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: wt1b Transgénique:. GFP Embryons avec Green Fluorescence dans le rein en développement Superpositions de dorsale (A) ou latéral (B) et la transmission des images de fluorescence sont présentés avec antérieure à gauche. np, néphron primordium; pt, tubule pronephrique; Comme ci comme çaacarien. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Knockdown de wt1a Perturbe Embryonic Kidney Development Représentant, Profondeur étendue des images de mise au point à partir d' enregistrements time-lapse.. Dans le contrôle morpholino embryons injectés, le développement du rein montre des progrès normale avec tubules croissance et néphron primordia qui commencent à fondre sur la ligne médiane. En revanche, morphants wt1a ne parviennent pas à former primordia néphronique appropriée et une quantité massive de cellules GFP - positives sont en dehors du champ pronephrique. (np, primordium néphron; pt, tubule pronephrique). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figurer.
Supplemental vidéo 1. enregistrement Time-lapse du développement normal du rein dans le contrôle morpholino embryons injectés. (Clic droit pour télécharger). La vidéo montre comment tubules croître et primordia néphron commencent à fusionner. À partir de 20 HPF, les images ont été prises à intervalles de 30 minutes pendant une période de 5 heures.
Supplemental Enregistrement vidéo 2. Time-lapse de néphrogenèse perturbé dans les embryons wt1a de morphant. (Clic droit pour télécharger). La vidéo montre la migration des cellules GFP-positives sur la région pronephrique. À partir de 20 HPF, des images ont été prises dans 30 min intervalles sur une période de 5 h.
Discussion
Le poisson zèbre est devenu un organisme modèle populaire pour les études sur le développement des vertébrés et la modélisation des maladies humaines. Parce que les embryons de poisson zèbre restent transparentes, les organes en développement comme le cerveau et le coeur peuvent être observées à l'aide d'un microscope de préparation standard. Profitant de lignées transgéniques avec fluorescence spécifique organe permet l'évaluation de l'organogenèse à travers différents stades de développement dans les embryons vivants par microscopie à fluorescence. Une limitation pour l'imagerie des détails de structure des organes entiers avec la microscopie à épifluorescence norme est l'impact des signaux à partir d'objets ci-dessus et en dessous du plan focal. Cette lumière hors-focus entraîne non seulement une diminution du contraste et la résolution d' image, il peut également masquer des structures importantes d'intérêt 13,14. Plusieurs techniques telles que la numérisation laser confocal-, filature confocal- de disque ou la microscopie multiphotonique ont été développés pour réduire au minimum les informations hors-focus et de ce fait de plus ene contraste de l'image ainsi que la résolution axiale. Une autre méthode pour obtenir des coupes optiques est la libre microscopie éclairage structuré au laser et la numérisation, une technique d'éclairage de champ à base large qui est et simple à mettre en œuvre sur un microscope ordinaire 15. Les résultats présentés ici montrent que le sectionnement optique, réalisé par l'éclairage structuré, mis en œuvre sur un microscope à dissection et combiné avec la reconstruction des images de mise au point étendue, permet de visualiser des détails structurels de normal et perturbé le développement du rein chez le poisson zèbre. En particulier, les cellules GFP-positives dans morphants wt1a sont dispersés à différentes profondeurs focales, et des images d'un seul plan avec extrascolaire accent flou serait sous - estimer la complexité trois dimensions du phénotype.
Pour suivre la dynamique de l'organe organisation, réarrangement ou de perturbation, la microscopie de fluorescence en temps de défaillance est un puissant mais technique complexe. Pendant time-lapseimagerie légères vibrations ou mineures fluctuations de température provoquent des dérives dans la direction x, y ou z. Cela exige un équipement supplémentaire (chambre environnementale, table anti-vibration) afin d'obtenir des résultats stables. La méthode présentée utilise la capacité d'un microscope à dissection avec un entraînement de mise au point motorisé pour l'enregistrement d'images en accéléré sans dispositifs supplémentaires. Afin de maintenir une concentration stable d'une stratégie de mise au point a été établie et une grille de relocalisation imprimé dans le fond de la chambre d'imagerie a été utilisée pour la correction de x, l'instabilité y-.
plongement propre de l'embryon est une étape critique dans le protocole. Une certaine pratique est nécessaire de placer la structure d'intérêt aussi proche que possible du fond du verre et à proximité immédiate de la grille sans superposition avec elle.
Le principal avantage de la méthode est qu'il est un outil simple et abordable pour l'observation directe des processus de développement tels que la croissance et la migration dans la vieles embryons pendant plusieurs heures. En outre, les avantages spécifiques au microscope dissection tels que grand champ de vision et la distance de travail prolongée facilitent l'examen des échantillons plus importants, y compris des organes entiers. Cependant, certaines limitations doivent être gardés à l'esprit. Interruption de l'expérience pour vérifier et réajuster le positionnement rend la procédure de temps et l'absence d'un contrôle de la température robuste change le temps de développement "standard", qui est défini comme heures après la fécondation à 28,5 ° C pour zebrafish 16. Un autre problème potentiel est la profondeur restreinte d'imagerie dans l'animal, en particulier lorsque la structure d'intérêt se trouve à l'intérieur de l'embryon ou les larves. Une telle structure est le glomérule pronephrique poisson zèbre, qui est située entre les somites et la vésicule ombilicale. La profondeur de limitation pour imager le glomérule a été trouvée être d'environ 200 um, d'une distance qui est atteint au bout de 5 jours de développement. En revanche, les structures fluorescentes qui sont litué plus proche de la surface de l'animal peut être imagé pendant un temps plus long. Par exemple les cellules du foie sont accessibles pour l'imagerie au moins jusqu'au 9 dpf. Une autre limitation est que l'immobilisation de longue durée de l'embryon ou les larves dans de l'agarose et le traitement Tricaine induisent un retard de croissance et de l'oedème cardiaque, respectivement. Parce que cela peut interférer avec le développement normal, il est recommandé de limiter la durée de l'enregistrement time-lapse à une certaine période d'intérêt. Pour veiller à ce que lors de structures d'imagerie d'intérêt se développer normalement, il est utile de comparer (à la fin) l'apparence générale à celle d'un animal gardé dans les mêmes conditions expérimentales, mais sans intégrer et anesthetization.
Enregistrement d'un z-pile de sections optiques toutes les 30 minutes sur une période de 5 h et calcul ultérieur de la profondeur des images de mise au point étendue fourni des informations spatiales et temporelles sur les événements précoces de la normale et perturbée développement du rein qui a été induit bknockdown de wt1a y morpholino- médiation. Expériences morpholino knockdown Auparavant effectuées ont déjà montré que Wt1a joue un rôle précoce et essentiel dans la formation de pronéphros hybridation in situ avec le rein marqueur 17,18 et de l' emploi de l'wt1b transgénique:. Ligne GFP pour le développement des pronéphros d'imagerie à heure fixe pointe 9,10 révélé que les résultats de la carence en wt1a dans la morphogenèse glomérulaire perturbé et échoué spécification podocytes. Contrairement à ces approches statiques, enregistrements time-lapse visualiser directement la dynamique de néphrogenèse précoce dans les embryons de contrôle et de la migration des cellules GFP-positives loin de la région pronephrique dans morphants wt1a. La possibilité de suivre les cellules mal acheminées au fil du temps permet une analyse phénotypique plus détaillée.
D'une manière générale, le procédé qui est présenté ici un soi peu coûteux et facile à utiliser alternative au complexe et moins accessiblestups normalement utilisés pour l'imagerie time-lapse, comme microscope à balayage laser (équipé d'une chambre environnementale et table anti-vibration) ou feuille microscope optique. La routine décrite pour résoudre les problèmes de dérive peut également être appliquée pour réaliser des images en accéléré sur les configurations sans options de sectionnement optiques, tels que les microscopes de fluorescence stéréo.
La technique est non seulement approprié pour étudier le développement du rein, mais peut également être appliquée pour surveiller la morphogenèse normale et défectueuse d'autres organes tels que le cœur ou le foie. En outre, le procédé peut être utilisé pour observer les divers procédés plus dynamiques dans des organismes modèles embryonnaires et adultes telles que la cicatrisation ou la régénération des plaies.
Disclosures
L'auteur Michael Graf est un employé de Carl Zeiss Microscopie GmbH qui produit des instruments utilisés dans le présent article.
Acknowledgments
Nous remercions Thomas Bates pour la lecture critique et d'améliorer le manuscrit. Nous remercions également Christina Ebert et Sabrina Stötzer pour l'entretien des poissons.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Control Morpholino | Gene tools, LLC | Standard control oligo | Prepared control oligo |
| wt1a Morpholinos | Gene tools, LLC | customized | Designted to target the first splice donor site, sequence as published in Ref. 9 |
| 0.5% Phenol red solution | Sigma | P0290 | Injection tracer |
| peqGOLD universal agarose | peqlab | 35-1020 | To prepare microinjection dish |
| Glass capillaries (GC100F-10) | Hugo Sachs Elektronik | 30-0019 | To generate injection needles |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | To load the microinjection needle |
| Dumont forceps | Fine Sience Tools | 91150-20 | To generate an opening at the needle tip |
| Embryo water (0.3x Danieaus´ solution) | 1x: 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4, 0.6 Ca(NO3)2, 5 mM HEPES, pH: 7,5; Do not add methylene blue! | ||
| Graticule 5 mm/0.05 mm | Science Services | PY68039-02 | For calculation of injection amount |
| Pasteur pipette 137 mm, 4.8 ml | Roth | E305.1 | To collect eggs, to transfer embryos and to remove dead embryos |
| Pasteur pipette with ultra-thin tip 157 mm, 3.5 ml | Roth | E304.1 | To remove excess of water |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma | P7629 | For suppression of melanization |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma | E10521 | To anethesize zebrafish |
| Low melting agarose | Biozym | 850111 | For embedding |
| µ-dish 35 mm, high Glass Bottom Grid-50 | ibidi | 81148 | Imaging chamber |
| Gel loader tips | Hartenstein | GS05 | To orient the embryo for proper embedding |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Micropipette puller (model P-97) | Sutter Instrument | To generate injection needles | |
| Micromanipulator | Saur Laborbedarf | For microinjection | |
| Thermomixer copact | Eppendorf | Thermoblock for tempering the low melting agarose | |
| SZ61 (Stereomicroscope) | Olympus | For injection control | |
| Axio Zoom. V16 | Zeiss | For embedding and imaging | |
| ApoTome.2 slider | Zeiss | For optical sectioning | |
| AxioCam MRm | Zeiss | For image acquisition | |
| ZEN 2012 | Zeiss | Imaging software |
References
- Lieschke, G. J. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Drummond, I. A. Kidney development and disease in the zebrafish. J Am Soc Nephrol. 16 (2), 299-304 (2005).
- Drummond, I. A., et al. Early development of the zebrafish pronephros and analysis of mutations affecting pronephric function. Development. 125 (23), 4655-4667 (1998).
- Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3 (10), 1922-1938 (2007).
- Kramer-Zucker, A. G., Wiessner, S., Jensen, A. M., Drummond, I. A. Organization of the pronephric filtration apparatus in zebrafish requires Nephrin, Podocin and the FERM domain protein Mosaic eyes. Dev Biol. 285 (2), 316-329 (2005).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation. Kidney Int. 73 (10), 1120-1127 (2008).
- Kreidberg, J. A., et al. Wt-1 Is Required for Early Kidney Development. Cell. 74 (4), 679-691 (1993).
- Bollig, F., et al. Identification and comparative expression analysis of a second wt1 gene in zebrafish. Dev Dyn. 235 (2), 554-561 (2006).
- Perner, B., Englert, C., Bollig, F. The Wilms tumor genes wt1a and wt1b control different steps during formation of the zebrafish pronephros. Dev Biol. 309 (1), 87-96 (2007).
- Schnerwitzki, D., et al. Alternative splicing of Wilms tumor suppressor 1 (Wt1) exon 4 results in protein isoforms with different functions. Dev Biol. 393 (1), 24-32 (2014).
- Bedell, V. M., Westcot, S. E., Ekker, S. C. Lessons from morpholino-based screening in zebrafish. Brief Funct Genomics. 10 (4), 181-188 (2011).
- Rembold, M., Lahiri, K., Foulkes, N. S., Wittbrodt, J. Transgenesis in fish: efficient selection of transgenic fish by co-injection with a fluorescent reporter construct. Nat Protoc. 1 (3), 1133-1139 (2006).
- Conchello, J. A., Lichtman, J. W. Optical sectioning microscopy. Nat Methods. 2 (12), 920-931 (2005).
- Jensen, E. C. Types of imaging, Part 2: an overview of fluorescence microscopy. Anat Rec (Hoboken). 295 (10), 1621-1627 (2012).
- Chasles, F., Dubertret, B., Boccara, A. C. Optimization and characterization of a structured illumination microscope. Opt Express. 15 (24), 16130-16140 (2007).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Hsu, H. J., Lin, G., Chung, B. C. Parallel early development of zebrafish interrenal glands and pronephros: differential control by wt1 and ff1b. Development. 130 (10), 2107-2116 (2003).
- O'Brien, L. L., et al. Wt1a, Foxc1a, and the Notch mediator Rbpj physically interact and regulate the formation of podocytes in zebrafish. Dev Biol. 358 (2), 318-330 (2011).
