Summary
De hier beschreven methode maakt time-lapse analyse van orgaanontwikkeling in zebravisembryo's met behulp van een fluorescentie microscoop ontleden kan uitvoeren optische sectie en simpele strategieën afstelling van focale vlak drift corrigeren.
Abstract
Om organogenese begrijpen, de ruimtelijke en temporele veranderingen die optreden tijdens de ontwikkeling van weefsels moeten worden opgenomen. De hier beschreven methode maakt time-lapse analyse van normale en gestoorde nierontwikkeling in zebravisembryo's met behulp van een fluorescentie microscoop ontleden uitgerust voor gestructureerde verlichting en z-stack acquisitie. Te visualiseren nefrogenese, transgene zebravis (Tg (wt1b: GFP)) met fluorescent gelabelde nier structuren werden gebruikt. Renale gebreken werden veroorzaakt door injectie van een antisense oligonucleotide morfolino tegen de Wilms tumor gen wt1a, een factor bekend is van cruciaal belang voor de ontwikkeling van de nieren te zijn.
Het voordeel van de experimentele opstelling is de combinatie van een zoom microscoop met eenvoudige strategieën voor hergebruik verstelbewegingen in x, y of z-richting zonder extra apparatuur. Om focale drift die wordt veroorzaakt door temperatuurschommelingen en mechanische trillingen te omzeilenEen autofocus strategie werd toegepast in plaats van het gebruik van een gewoonlijk vereist klimaatkamer. Om opnieuw aan te passen aan de positionele veranderingen als gevolg van een xy-drift, imaging kamers met ingedrukt verhuizing roosters werden gebruikt.
In vergelijking met de meer complexe instellingen voor time-lapse-opname met optische sectie zoals confocale laser scanning of lichte blad microscopen, een zoom-microscoop is gemakkelijk te hanteren. Bovendien biedt deze ontleden microscoop-specifieke voordelen zoals een hoge scherptediepte en een langere werkafstand.
De werkwijze in organogenese hier gepresenteerde onderzoek kan ook worden gebruikt met fluorescentie stereomicroscoop niet kunnen optische sectie. Hoewel beperkt voor high-throughput, deze techniek biedt een alternatief voor de meer complexe apparatuur die normaal gesproken wordt gebruikt voor de time-lapse-opname van het ontwikkelen van weefsels en organen dynamiek.
Introduction
Naar aanleiding van de gastrulatie, organogenese is de volgende fase van de levenscyclus van een individu. Het gaat om de omlegging, interactie en vaak migratie van cellen naar weefsels en organen veroorzaken. Onjuistheid in de processen die de ontwikkeling van organen leidt vaak tot ziekten die zich direct of ook later manifesteren in het leven. Zo, het begrijpen van de organogenese heeft een grote inspanning in de ontwikkelingsbiologie en biomedisch onderzoek. Om te kunnen de ontwikkeling van een bepaald orgaan te onderzoeken, moet toegankelijk zijn zelfs door de lichaamswand van het embryo. Dit maakt de registratie van de ruimtelijke en temporele veranderingen die optreden tijdens de ontwikkeling. Ook om het belang van factoren betrokken bij organogenese analyseren, moet kunnen worden gemanipuleerd is.
Een organisme dat is uitermate geschikt voor het onderzoek in vivo organogenese zebravis is. zijn tranrantie tijdens de embryonale ontwikkeling in combinatie met het gebruik van fluorescente transgene lijnen maakt waarneming van eiwit lokalisatie en expressie dynamiek en de visualisatie van de inwendige organen 1. Dit levert een uniek voordeel betreffende het onderzoek van orgaanontwikkeling realtime opzichte van zoogdierlijke modellen waarvan organen toegankelijk voor microscopische analyse. Bovendien zijn verschillende gereedschappen zijn beschikbaar om de embryonale ontwikkeling van de zebravis te manipuleren. Naast het genereren van mutante lijnen, kunnen antisense morfolino- oligonucleotiden (MO) worden gebruikt om de activiteit van bepaalde genen die betrokken zijn bij de ontwikkeling van organen knockdown. MO targeten een splitsingsplaats of translationele startcodon (augustus), en interfereren met splitsing van pre-mRNA of translatie.
De zebravis embryonale nier, de pronephros, een anatomisch eenvoudig maar nuttig model voor nier ontwikkeling en functie van gen bestuderenes verband met nierziekten 2. Het bestaat uit twee functionele eenheden genaamd nefronen. Elk nefron bestaat uit een glomerulus waar het bloed filtratie plaatsvindt 3. Verdere onderdelen zijn de korte nek en de gesegmenteerde tubuli voor secretie en reabsorptie van opgeloste stoffen en de leiding, die eindigt in de cloaca 4. Ongeacht de eenvoudige samenstelling, de organisatie en de verschillende celtypen van de zebravis pronephros lijken sterk op het zoogdier nier 5,6.
Een factor, die een cruciale rol speelt in nierontwikkeling wordt gecodeerd door het Wilms-tumorsuppressorgen WT1 7. Zebravis bezitten twee paralogen genoemd wt1a en wt1b in een overlappende, maar niet identiek patroon wordt uitgedrukt tijdens de ontwikkeling van de pronephros 8. Door het gebruik van transgene zebravis met GFP-gelabelde pronephros structuren, is aangetoond dat volledige omverwerpen van wt1a </ em> of van een bepaalde splice vorm leidt tot ernstige of milde misvormingen van de embryonale nier, respectievelijk 9,10.
De hier beschreven methode maakt time-lapse analyse van normale en verminderde nefrogenese in zebravis embryo door toepassing van een fluorescentie microscoop ontleden ingericht voor optische sectie via gestructureerde verlichting. Optische secties in het algemeen kan de beeldopname die op scherpgestelde gegevens bevatten. Out-of-focus informatie kan worden voorkomen door verschillende benaderingen als wiskundige algoritmen (bijv. Deconvolutie), optisch ontwerp (bijv confocale laser scanning microscopie) of een combinatie van beide (bijv gestructureerde verlichting).
Defecten in de ontwikkeling van de nieren veroorzaken we gebruik gemaakt van een antisense MO tegen wt1a dat werd geïnjecteerd in een transgene zebravis lijn (Tg (wt1b: GFP)). Deze lijn toont GFP-fluorescentie in de glomerulus, de hals en de voorsteeen deel van de tubulus 9,10. In vergelijking met complexere opstellingen voor time-lapse opnamen met optische sectie zoals laser scanning of lichtwaaier microscopen, een zoom microscoop is gemakkelijk te hanteren en goedkoper. Bovendien, uitrusting voor gestructureerde verlichting kan eenvoudig worden gecombineerd met conventionele fluorescentie-apparatuur (bijvoorbeeld fluorescentie lamp, filters) en biedt ontleden microscoop-specifieke voordelen, zoals een langere werkafstand en groot gezichtsveld. Problemen met drift werden opgelost zonder het gebruik van extra apparatuur (klimaatkamer, anti-vibratie tabel) meestal nodig voor stabiele resultaten. Om te corrigeren voor focal drift een autofocus strategie werd opgericht en imaging kamers met opdruk verhuizing roosters werden gebruikt om opnieuw aan te passen aan de positionering na een drift in de X- of Y-richting.
De onderhavige methode kan ook worden toegepast op microscopen zonder optische sectie opties, zoals fluorescentie stereo microscopes en biedt een alternatief voor de meer complexe apparatuur die normaal gesproken wordt gebruikt voor de time-lapse-opname van het ontwikkelen van weefsels en organen dynamiek.
Protocol
Alle dierlijke experimenten werden uitgevoerd volgens de 'Principles of proefdier zorg' alsook aan de huidige versie van de Duitse wet op de bescherming van dieren.
1. Bereiding van antisense-morfolino (MO)
- Om een 3 mM MO voorraad oplossing te bereiden, voeg 100 ul van steriel, ultrapuur water om de gevriesdroogde MO (300 nmol in glazen flacon). Voor volledige oplossing Verwarm de voorraadoplossing tot 65 ° C gedurende 5 minuten. Verzegel de flacon met Parafilm en bewaar de MO voorraadoplossing bij kamertemperatuur (RT). Niet chill het MO voorraad oplossing, omdat dat een vereniging van de MO met de flacon muren konden veroorzaken.
- Bereid een 1 mM MO werkoplossing door verdunning van de voorraadoplossing MO met steriel, ultrapuur water en voeg 0,5% fenolrood oplossing tot een eindconcentratie van 0,05%.
- Aan 10 ul van een MO werkende oplossing te krijgen, voeg 3,3 pl MO voorraad-oplossing en 1 pl van 0,5% fenol-rode oplossing tot 5,7 ul water. Wordenvoor- bereiden van een nieuwe partij werkoplossing Verwarm de MO stockoplossing aan 65 ° C gedurende 5 minuten.
- Voor gebruik gecentrifugeerd MO werkoplossing naald verstopping te voorkomen. Bijvoorbeeld draaien 10 pl MO voorraadoplossing bij 15.000 xg gedurende 5 min (RT) en verwijder 8 pl van het supernatant voor injectie.
LET OP: Verlies van activiteit kan zich voordoen in morfolino oplossingen in de tijd 11. Deze sluiten, kan men de oplossingen met UV spectrometrie testen volgens de door de fabrikant geleverde protocol. Bij de gebruikte wt1a morfolino verlaagde effectiviteit niet gedurende een lange opslagperiode waargenomen (3 mM werkoplossing werd langer dan één opgeslagen jaar).
2. instellen Mating paren en verzamelen van bevruchte eieren
- De middag voorafgaand aan microinjectie, maximaal vijf paren van de Tg (wt1b: GFP) lijn, elk in een kweekreservoir voorzien van een verwijderbare zeef te scheidenmannetjes en vrouwtjes s nachts.
OPMERKING: Om ervoor te zorgen dat er genoeg eieren beschikbaar zijn voor een succesvolle injectie experiment, vis gebruikt als paring paren moeten zijn vooraf gescreend en geëvalueerd als goed "producenten". - De volgende ochtend, na de lichten aan, zet de man en vrouw samen boven de zeef dat de vis voorkomt het eten van hun eieren.
- Let op de paai. Zodra een aantal eieren gelegd dat vóór de 4-cellig stadium kan worden geïnjecteerd wordt bereikt (ongeveer 50), gescheiden male female weer. Breng de eieren met een Pasteur pipet in een petrischaal gevuld met embryo water voor een eerste ronde van injectie. Om extra rondes van de eieren te krijgen, plaatst u een parende samen en apart meerdere malen.
3. De voorbereidende werkzaamheden voor de micro-injectie
OPMERKING: Voer de stappen 3.1 en 3.2 op voorhand.
- Om een gerecht dat de embryo's in de positie tijdens de injectie (micro-injectie gerecht) houdt steek een gl bereidenkont dia bij een 40-45 ° hoek in een 94 mm petrischaal gevuld met vloeistof, transparant, puur, food grade silicium. Verwijder de schuif wanneer de silicium gehard. Dat levert een groef in de siliciumlaag.
LET OP: U kunt ook gebruik maken van 1,5-3% agarose in plaats van silicium en bewaar het gerecht bij 4 ° C. - Genereer injectienaalden van glas capillairen met een naald trekker.
- Gebruik haarvaten dat de interne filamenten bevatten.
NB: De gloeidraad zal helpen om de MO-oplossing in de richting van de punt van de naald te vervoeren na opvullen (zie 3.3). - Vast te stellen de juiste instellingen op de naald trekker. Goed naalden voor injectie in zebravis moet lang en dun tips 12 hebben. Genereer tips met een lengte van ongeveer 10 mm en een diameter van 1,5-2 urn hun einde. Gebruik bijvoorbeeld een horizontale naald trekker met de volgende instellingen: Warmte = 330, Pull = 0, Velocity = 40, Time = 100.
- Onderzoek de kwaliteit van de naalden onder eenontleden microscoop en uitzoeken mensen met een kort of te lang tips.
LET OP: Naalden met korte tips hebben de neiging om het embryo beschadigen terwijl dergelijke met een zeer lange en dunne tips bocht bij het aanraken van het chorion en dringen niet door het.
- Gebruik haarvaten dat de interne filamenten bevatten.
- Opvulling van de naald met 2 pl MO werkende oplossing met behulp van een microloader tip en plaats deze in de naald houder van de micro-injectie apparaat.
- Als de naalden aan het uiteinde zijn gesloten, wordt een opening door knijpen back het einde van de naald met scherpe pincet onder de dissectie microscoop. U kunt ook gebruik maken van de micro-injectie apparaat om duw de tip om een stevig oppervlak (bijv. Kleine metalen blok of achterkant van een pincet).
- Kalibreer het injectievolume door het injecteren van de MO werkoplossing in een druppel minerale olie aangebracht op een raster. Stel de duur van de injectie ter bereiding van een druppel diameter van 75 urn tot een injectievolume van ongeveer 200 pl verkrijgen.
- Regelen van de 1-cel embryo's langs de groef van de micro-injectie schaal met de vegetatieve pool in de richting van waaruit de naald komt (richting de 45 ° hoek van de groef).
- Perforeren chorion en de dooier van de naald en injecteer 200 pl van de 1 mM MO werkoplossing (0,2 pmol) in de dooier van 1- tot 2-cellige embryo.
- Met een Pasteur-pipet met een brede opening, verzamelen alle van de geïnjecteerde embryo's in een petrischaal gevuld met embryo water en incubeer ze op 28,5 ° C.
- In de namiddag, het verwijderen van dode embryo's met behulp van een Pasteur pipet met een brede opening en het embryo water te vervangen.
5. Voorbereiding van embryo's voor in vivo beeldvorming
- De volgende ochtend, de plaats van de embryo water met embryo water met 0,003% N-fenylthioureum (PTU) aan melanisatie remmen. Niet van toepassing zijn PTU voor het einde van de gastrulatie, omdat het interferes met vroege embryonale ontwikkeling.
LET OP: PTU is giftig en teratogeen. Draag handschoenen te allen tijde en inademing vermijden en contact met de huid. - Dechorionate de embryo's met scherpe pincet onder een dissectie microscoop op de gewenste ontwikkelingsstadium. Pak de chorion met een pincet en probeer de andere kant van de chorion te grijpen met een tweede pincet. Trek de pincet in tegengestelde richting zonder verstoring van het embryo.
- Verdoven het embryo door het embryo water met PTU (0,003%) te vervangen door embryo water met PTU (0,003%) en 0,02% ethyl-3-aminobenzoaat methaansulfonaat (tricaïne).
- Insluiten de embryo in laagsmeltende agarose op een dekglaasje bodem μ-schotel met een 50 urn verhuizing net. Een goede inbedding vereist enige oefening.
- Bereid 1 ml hoeveelheden van 0,7% agarose in 1,5 ml reageerbuizen en leg ze op een warmte-blok ingesteld op 36 ° C. Gebruik een Pasteur pipet met brede opening naar transfer het embryo aan de μ-schotel. Verwijder overtollige embryo water met behulp van een Pasteur pipet met ultra-dunne tip en overlay het embryo met gehard agarose.
- Terwijl de agarose nog vloeibaar, oriënteren de embryo met twee gel loader tips in de gewenste positie met betrekking tot de structuur van belang en de afstand tot de verplaatsing raster. Plaats de structuur van belang (hier de pronephros) zo dicht mogelijk bij de glazen bodem (hier: dorsaal beneden) en in dichte nabijheid aan het net.
- Voor een optimaal beeld te minimaliseren de agarose laag tussen het embryo en de glazen bodem door het plaatsen van de structuur plaats van het embryo zo dicht mogelijk bij de bodem. Daarnaast zoekt het embryo in de onmiddellijke nabijheid van de grid, maar zorg ervoor dat het net niet overlappen met de structuur van belang. Insluiten 3-4 embryo's in verschillende μ-gerechten elk en gebruik maken van degene die wordt gepositioneerd best.
- Wanneer de agarose hard genoeg is om de embryo wachten 2 houden-3 Min en overlay de embedded embryo met embryo water met 0,003% PTU en 0,02% tricaïne. Giet het overtollige embryo water of te verwijderen met behulp van een Pasteur pipet met ultradunne tip. Sluit het deksel van de μ-schaal in de vergrendelingspositie om verdamping te voorkomen.
LET OP: Vermijd het ontstaan van luchtbellen in de μ-gerecht, omdat ze beeldopname zouden aantasten.
6. Microscopie
LET OP: Gebruik een microscoop uitgerust voor optische sectie via gestructureerde verlichting. Record beelden met een software die de volgende modules: Multichannel, Z-Stack, Time Series, Software Autofocus en Extended Focus.
- Overname van Z-stacks
- Keren de μ-schotel. De glazen bodem staat nu in de richting van het doel en de μ-schotel fungeert als een imaging kamer.
- Zet de schuifknop in de startpositie en schakel de gestructureerde verlichting modus in de software controles.
- Kalibrerenhet rooster focus voor het kanaal (s) naar keuze met het monster te onderzoeken (embedded embryo) door de instructies van de Calibration Wizard Focus.
- Activeer de z-stack acquisitie mode en zet deze op het centrum van mode. Focus in het midden van het monster en instellen als het middenvlak van de z-stack door te klikken Center. Stel de afmeting van de z-stack door het definiëren van het gebied rond het midden.
OPMERKING: Object structuren moeten niet scherp worden gezien buiten de eerste en de laatste vlak van de z-stack. - Stel de afstand tussen optische secties. Voor de beste z-resolutie klikt u op de knop Optimal. Op basis van de doelstellingen scherptediepte de software een aanbevolen afstand na de Nyquist criterium (50% overlap) zal instellen.
LET OP: Als het streven naar kleinere bestanden en de structuur het toelaat, moet een grotere afstand formaat handmatig. Instellen van kleinere stappen dan aanbevolen zal alleen maar leiden tot grotere bestanden, zonder later steeds meeral informatie.
- Time-lapse Imaging
- Open de functie Time-serie en stel het interval van de tijdreeks experiment. Bijvoorbeeld opnemen z-stack beelden elke 30 min gedurende 5 uur.
- Om te corrigeren voor focal drift na verloop van tijd, het opzetten van een autofocus-strategie. Controleer de Focus-strategie dialoogvenster, selecteert u Software Autofocus uit de keuzelijst en kies de TL-Helderveld kanaal als referentie-kanaal.
- Begin elk tijdstip met de autofocus. Met het oog op een betrouwbare zoekbereik binnen een geoptimaliseerde termijn te verzekeren, stelt u een vaste 200 urn ten opzichte zoekbereik. Deze serie is volledig gescand (Bereik Coverage parameter) met basiskwaliteit (Quality parameter) in een maximum stap grootte (Sampling parameter).
- Om nauwkeurigheid van de autofocus te verhogen, het activeren van de meting binnen een focus regio van belang (focus ROI) en standpunt zei de focus ROI in het live-venster rond de structuur van belang.
LET OP: Alshet systeem niet over de Software Autofocus module die z in het midden-stand automatisch wordt bijgewerkt tijdens de time-lapse opnemen, pauzeren het experiment op een gegeven moment en de scherpstelling handmatig aan te passen en verder het experiment. - Om te compenseren voor een mogelijke xy-drift tijdens tijdreeksen opnemen, plaatst u een bepaald punt van de opdruk rooster (van de imaging kamer) in het vizier van de software en sla de positionering door het maken van een screenshot.
- Start de tijdreeksen experiment. Voordat de tijdreeks interval voorbij is, onderbreekt het experiment en, eventueel, past positioneren volgens de screenshot. Ga verder met het experiment.
7. Beeldverwerking
- Schakel over naar het tabblad verwerking en selecteer de Extended Diepte van Focus (EOF) in de methode dialoogvenster. Aangezien optische secties worden verworven, gelden de maximale projectie algoritme om de afbeelding serie.
LET OP: Hier het algoritme zal de br projecterenightest of de donkerste pixel van stapel een composiet 2D naar in een eerste stap en uiteindelijk gebruik maken van degene met de hoogste variantie beeld een resultaat voor elk tijdstip zo. - Gebruik de Movie Export methode om een time lapse film (zoals avi of verplaatsen bestand) uit het EOF afbeelding serie te creëren.
Representative Results
Time-lapse microscopie is een krachtige techniek om dynamische biologische processen waken over een langere periode. Een veel voorkomend probleem bij time-lapse imaging is een beweging in x, y of z-richting, de zogenaamde afwijking die wordt veroorzaakt door temperatuurschommelingen en mechanische trillingen. De hier gepresenteerde methode maakt het mogelijk time-lapse opname van fluorescent gelabelde structuren in de zebravis embryo's of larven op een dissectie microscoop zonder klimaatkamer en anti-vibratie tafel.
Voor vergoeding van xy-drift, werd het model ingebed in een imaging kamer met een bedrukte verplaatsing rooster (figuur 1). De locatie van een bepaald punt van het raster in verband met het vizier van het computerprogramma werd gebruikt om het specimen naar de vooraf ingestelde positie (figuur 2A). De gepresenteerde resultaten werden verkregen door toepassing van een microscoop zoommet een geïntegreerde slider voor optische sectie via gestructureerde verlichting (Figuur 2B). Voor continue focal correctie werd een autofocus-strategie vastgesteld. Bij deze strategie wordt de software autofocus gebruikt om scherp te stellen op basis van maximale contrast voor elke tijdstip. Deze aldus omschreven focal plane wordt vervolgens ingesteld als centrum plan voor z-stack acquisitie. Om fototoxiciteit in het monster te minimaliseren, wordt het uitgezonden licht helderveld kanaal gebruikt als referentie kanaal als het laat voldoende korte blootstelling keer tijdens de autofocus stap (figuur 2C).
De methode werd toegepast voor een vergelijkende analyse van de ontwikkeling van de nieren in controle- en wt1a morphant embryo's van een transgene zebravis lijn (Tg (wt1b: GFP)). Tijdens de vroege nefrogenese deze lijn toont groene fluorescentie in de tussenliggende mesoderm, werden de nieren voorouders voort uit 9,10 en laterin het vormen tubuli en nefron primordia (figuur 3).
Time-lapse beeldopname blijkt dat nefrogenese controle morfolino geïnjecteerde embryo's ongewijzigd in vergelijking met niet-geïnjecteerde die (resultaten niet getoond) en volgt de beschreven stappen van de vroege zebravis nier ontwikkeling 3. Op 20 HPF ontwikkelingslanden pronephric tubuli zichtbaar en bij hun voorste uiteinden, kunnen bolvormige ophopingen van cellen, die de vorming nefron primordia worden gedetecteerd. Gedurende de volgende uren, buisjes en nefron primordia groeien en later de primordia beginnen te smelten op de middellijn (figuur 4, video 2). Daarentegen wordt nefrogenese ernstig verstoord wt1a morphant embryo. Hoewel de GFP-positieve buisvormige structuren zichtbaar zijn op 20 HPF, ze lijken meer diffuus en minder ontwikkeld zijn. Bovendien zijn geen goede nefron primordia gevormd. Het meest opvallende verschil in thij controle embryo's op dit tijdstip is echter de verschijning van een groot aantal fluorescerende cellen buiten de ontwikkeling pronephros (Figuur 4, video 2). Vervolgens worden deze cellen laat het pronephric veld en migreren ventraal (video 2).
Nier ontwikkeling in de controle embryo's en wt1a morphants van de wt1b transgene lijn zijn eerder vergeleken door het nemen van foto's op verschillende vaste tijdstippen 9,10. In tegenstelling tot deze statische methode, time-lapse-opname maakt het mogelijk om de dynamiek van de normale nefrogenese en misrouting van de nieren stamcellen veroorzaakt door wt1a uitputting te volgen.
Figuur 1: Schematische weergave van een Embedded Embryo in een los verkrijgbare Kamer met Relocation Grids. Het gerecht heeftvier rasters, elk onderverdeeld in een herhaling afstand van 50 micrometer, bedrukt in een glas dekglaasje bodem. Het embryo in beeld te brengen op zijn kop ingebed, met nier-structuur in de nabijheid van een waarneming vierkant, maar zonder overlappen met het rooster. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2:. Aanpassingen voor vergoeding van de Drift in Time-lapse Imaging en Grid projectie van Structured Verlichting Een aparte positie van de verhuizing rooster werd in het beeld centrum gebracht (gemarkeerd door gele crosshairs) en dient als referentiepunt voor later xy-alignment bij kleine verschuivingen. De rode rechthoek geeft het gebied van belang (ROI) van de autofocus strategie (A). Optische snijden was verkregen door gestructureerde verlichting. Het beeld toont een rooster structuur geprojecteerd in het brandpunt van vlak na de juiste ijking (B). De ROI voor de autofocus-strategie (rode rechthoek) is ingesteld op onderscheidende embryonale structuren hoog contrast (hier somieten), die betrouwbaar autofocus in de structuur van belang (C) laten dekken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Transgenic wt1b. GFP Embryo groen fluoresceren in de ontwikkelingslanden Kidney Bedekkingen dorsale (A) of zijwaartse (B) transmissie en fluorescentie afbeelding getoond met anterior naar links. np, nephron primordium; pt, pronephric buisje; middelmatigmijt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Knockdown van wt1a verstoort embryonale nier Development Representative, uitgebreide scherptediepte beelden van time-lapse-opnamen.. In control morfolino geïnjecteerd embryo's, nier ontwikkeling toont normale voortgang met het kweken van buisjes en nefron primordia die beginnen te smelten bij de middellijn. Daarentegen wt1a morphants niet de juiste nefron primordia vormen en een enorme hoeveelheid GFP positieve cellen buiten het pronephric veld. (np, nephron primordium, pt, pronephric buisje). Klik hier om een grotere versie van deze fi bekijkenguur.
Aanvullende Video 1. Time-lapse-opname van de normale ontwikkeling van de nieren in de controle morfolino geïnjecteerde embryo's. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden). De video laat zien hoe buisjes groeien en nephron primordia beginnen te smelten. Vanaf 20 HPF, werden beelden genomen in 30 minuten intervallen gedurende 5 uur.
Aanvullende Video 2. Time-lapse-opname van verstoorde nefrogenese in wt1a morphant embryo's. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden). De video toont de migratie van GFP-positieve cellen uit de pronephric regio. Vanaf 20 HPF, werden foto's genomen in 30 min intervallen gedurende 5 uur.
Discussion
De zebravis is een populaire modelorganisme voor studies van ontwikkeling van vertebraten en modellering van menselijke ziekten. Omdat de zebravis embryo's transparant blijven, kan de ontwikkeling van organen zoals de hersenen en het hart worden waargenomen door het gebruik van een standaard voorbereiding microscoop. Maken van transgene lijnen met orgaanspecifieke fluorescentie maakt evaluaties van organogenese over verschillende ontwikkelingsstadia in levende embryo's door fluorescentiemicroscopie. Een beperking voor het afbeelden structurele details van hele organen met conventionele epifluorescentie microscopie wordt de invloed van de signalen van voorwerpen boven en onder het brandpuntsvlak. Deze out-of-focus licht resulteert niet alleen in een vermindering van het contrast en de resolutie, het kan ook belangrijke structuren van belang 13,14 verduisteren. Verschillende technieken zoals laser scanning confocal-, draaiende schijf confocal- of multifoton microscopie zijn ontwikkeld om de out-of-focus informatie en daardoor increas minimaliserene beeldcontrast evenals axiale resolutie. Een alternatieve methode voor optische verkrijg de laser- en scannen vrije gestructureerde verlichting microscopie, een breed verlichtingsbesturing techniek die is en eenvoudig te implementeren op een gewone microscoop 15. De hier gepresenteerde resultaten illustreren dat optische sectie, gerealiseerd door gestructureerde verlichting, uitgevoerd op een dissectie microscoop en gecombineerd met de wederopbouw van de uitgebreide aandacht beelden, maakt visualisatie van structurele details van de normale en verstoorde ontwikkeling van de nieren in de zebravis. In het bijzonder worden de GFP-positieve cellen in wt1a morfants gedispergeerd op verschillende focale diepte, en afbeeldingen van slechts één vlak met uit onscherpe blur zou de driedimensionale complexiteit van het fenotype onderschatten.
Om de dynamiek van orgel organisatie, omlegging of verstoring te volgen, time-lapse fluorescentie microscopie is een krachtige, zij complexe techniek. Tijdens de time-lapseimaging lichte trillingen of kleine temperatuurschommelingen leiden tot afwijkingen in x, y of z-richting. Dit vereist extra apparatuur (omgevingskamer, antivibratietafel) om stabiele resultaten te verkrijgen. De gepresenteerde methode maakt gebruik van de mogelijkheid van een dissectie microscoop met een gemotoriseerde nadruk schijf voor time-lapse opnemen van beelden zonder extra apparatuur. Om een stabiele scherpstelling behouden, werd een autofocus strategie vastgesteld en een verplaatsing raster afgedrukt in de bodem van de beeldvorming kamer werd gebruikt voor correctie van x, y instabiliteit.
Een goede inbedding van het embryo is een cruciale stap in het protocol. Even oefenen is nodig om de structuur van belang zo dicht mogelijk bij de glazen bodem en in dichte nabijheid tot het netwerk plaatsen zonder ermee bedekken.
Het belangrijkste voordeel van de werkwijze is dat het een betaalbare en eenvoudig hulpmiddel voor directe waarneming van ontwikkelingsprocessen zoals groei en migratie in levendeembryo's gedurende een aantal uren. Bovendien is de dissectie microscoop specifieke voordelen zoals grote beeldveld en lange werkafstand vergemakkelijken onderzoek van grotere monsters waaronder hele organen. Echter, een aantal beperkingen in gedachten worden gehouden. Pauzeren van het experiment te controleren en stel de positionering maakt de procedure tijdrovend en het ontbreken van een solide regeltemperatuur verandert de "standaard" ontwikkelingstijd, gedefinieerd als h na bevruchting bij 28,5 ° C gedurende 16 zebravis. Een ander potentieel probleem is de beperkte diepte van de beeldvorming in het dier, met name wanneer de structuur van belang zich in het embryo of larven. Een dergelijke structuur is de zebravis pronephric glomerulus, gelegen tussen de somieten en de dooierzak. De beperkende diepte voor het afbeelden van de glomerulus bleek ongeveer 200 urn, een afstand die wordt bereikt na 5 dagen van ontwikkeling. Daarentegen fluorescerende structuren die located dichter bij het oppervlak van het dier kan worden afgebeeld langer. Bijvoorbeeld levercellen toegankelijk zijn voor de beeldvorming ten minste tot 9 DPF. Een andere beperking is dat langdurige immobilisatie van het embryo of larven in agarose en behandeling tricaïne induceren groeivertraging en cardiale oedeem, respectievelijk. Omdat dit kan interfereren met de normale ontwikkeling, is het raadzaam om de duur van de time-lapse-opname te beperken tot een bepaalde periode van belang. Om ervoor te zorgen dat tijdens de beeldvorming structuren van belang te ontwikkelen normaal gesproken is het nuttig om te vergelijken (aan het eind) de totale uitstraling met die van een dier gehouden onder dezelfde experimentele omstandigheden, maar zonder inbedding en verdoving.
Het opnemen van een z-stapel optische secties elke 30 minuten gedurende 5 uur en vervolgens berekenen van uitgebreide scherptediepte beelden ontvangen ruimtelijke en temporele informaties vroege gebeurtenissen van normale en nierstoornissen ontwikkeling die werd geïnduceerd by morfolino-gemedieerde knockdown van wt1a. Eerder uitgevoerde morfolino knockdown experimenten hebben al aangetoond dat Wt1a vervult een vroege en essentiële rol in de vorming van pronephros In situ hybridisatie met nier marker 17,18 en de werkgelegenheid van de transgene wt1b:. GFP lijn voor de ontwikkeling van imaging pronephros op vaste tijdstippen 9,10 onthuld dat wt1a deficiëntie resulteert in verstoorde glomerulaire morfogenese en mislukte podocyte specificatie. In tegenstelling tot deze statische benadering, time-lapse-opnamen direct dynamiek van vroege nefrogenese controle embryo's en de migratie van GFP-positieve cellen weg van de pronephric regio wt1a morphants visualiseren. De mogelijkheid om ze verkeerd verzonden cellen te volgen in de tijd maakt een meer gedetailleerde analyse fenotype.
In het algemeen is de methode die hier wordt voorgesteld verschaft een goedkoop en gemakkelijk te gebruiken alternatief voor de complexe en minder toegankelijk setups normaal gebruikt voor time-lapse imaging zoals laser scanning microscoop (uitgerust met een klimaatkamer en anti-vibratie tabel) of lichte plaat microscoop. De beschreven routine om drift problemen op te lossen kan ook worden toegepast op time-lapse beelden op setups uit te voeren zonder optische sectie opties, zoals fluorescentie stereo microscopen.
De techniek is niet alleen geschikt voor nierontwikkeling onderzoeken, maar kan ook worden toegepast op normale en defecte morfogenese van andere organen zoals hart en lever te controleren. Bovendien kan de werkwijze worden gebruikt om verschillende dynamische processen in embryonale en volwassen modelorganismen zoals wondheling of regeneratie observeren.
Disclosures
De auteur Michael Graf is een werknemer van Carl Zeiss Microscopy GmbH dat de instrumenten die in dit artikel produceert.
Acknowledgments
Wij danken Thomas Bates voor het kritisch lezen en het verbeteren van het manuscript. We danken ook Christina Ebert en Sabrina Stötzer voor vissen onderhoud.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Control Morpholino | Gene tools, LLC | Standard control oligo | Prepared control oligo |
| wt1a Morpholinos | Gene tools, LLC | customized | Designted to target the first splice donor site, sequence as published in Ref. 9 |
| 0.5% Phenol red solution | Sigma | P0290 | Injection tracer |
| peqGOLD universal agarose | peqlab | 35-1020 | To prepare microinjection dish |
| Glass capillaries (GC100F-10) | Hugo Sachs Elektronik | 30-0019 | To generate injection needles |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | To load the microinjection needle |
| Dumont forceps | Fine Sience Tools | 91150-20 | To generate an opening at the needle tip |
| Embryo water (0.3x Danieaus´ solution) | 1x: 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4, 0.6 Ca(NO3)2, 5 mM HEPES, pH: 7,5; Do not add methylene blue! | ||
| Graticule 5 mm/0.05 mm | Science Services | PY68039-02 | For calculation of injection amount |
| Pasteur pipette 137 mm, 4.8 ml | Roth | E305.1 | To collect eggs, to transfer embryos and to remove dead embryos |
| Pasteur pipette with ultra-thin tip 157 mm, 3.5 ml | Roth | E304.1 | To remove excess of water |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma | P7629 | For suppression of melanization |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma | E10521 | To anethesize zebrafish |
| Low melting agarose | Biozym | 850111 | For embedding |
| µ-dish 35 mm, high Glass Bottom Grid-50 | ibidi | 81148 | Imaging chamber |
| Gel loader tips | Hartenstein | GS05 | To orient the embryo for proper embedding |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Micropipette puller (model P-97) | Sutter Instrument | To generate injection needles | |
| Micromanipulator | Saur Laborbedarf | For microinjection | |
| Thermomixer copact | Eppendorf | Thermoblock for tempering the low melting agarose | |
| SZ61 (Stereomicroscope) | Olympus | For injection control | |
| Axio Zoom. V16 | Zeiss | For embedding and imaging | |
| ApoTome.2 slider | Zeiss | For optical sectioning | |
| AxioCam MRm | Zeiss | For image acquisition | |
| ZEN 2012 | Zeiss | Imaging software |
References
- Lieschke, G. J. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Drummond, I. A. Kidney development and disease in the zebrafish. J Am Soc Nephrol. 16 (2), 299-304 (2005).
- Drummond, I. A., et al. Early development of the zebrafish pronephros and analysis of mutations affecting pronephric function. Development. 125 (23), 4655-4667 (1998).
- Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3 (10), 1922-1938 (2007).
- Kramer-Zucker, A. G., Wiessner, S., Jensen, A. M., Drummond, I. A. Organization of the pronephric filtration apparatus in zebrafish requires Nephrin, Podocin and the FERM domain protein Mosaic eyes. Dev Biol. 285 (2), 316-329 (2005).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation. Kidney Int. 73 (10), 1120-1127 (2008).
- Kreidberg, J. A., et al. Wt-1 Is Required for Early Kidney Development. Cell. 74 (4), 679-691 (1993).
- Bollig, F., et al. Identification and comparative expression analysis of a second wt1 gene in zebrafish. Dev Dyn. 235 (2), 554-561 (2006).
- Perner, B., Englert, C., Bollig, F. The Wilms tumor genes wt1a and wt1b control different steps during formation of the zebrafish pronephros. Dev Biol. 309 (1), 87-96 (2007).
- Schnerwitzki, D., et al. Alternative splicing of Wilms tumor suppressor 1 (Wt1) exon 4 results in protein isoforms with different functions. Dev Biol. 393 (1), 24-32 (2014).
- Bedell, V. M., Westcot, S. E., Ekker, S. C. Lessons from morpholino-based screening in zebrafish. Brief Funct Genomics. 10 (4), 181-188 (2011).
- Rembold, M., Lahiri, K., Foulkes, N. S., Wittbrodt, J. Transgenesis in fish: efficient selection of transgenic fish by co-injection with a fluorescent reporter construct. Nat Protoc. 1 (3), 1133-1139 (2006).
- Conchello, J. A., Lichtman, J. W. Optical sectioning microscopy. Nat Methods. 2 (12), 920-931 (2005).
- Jensen, E. C. Types of imaging, Part 2: an overview of fluorescence microscopy. Anat Rec (Hoboken). 295 (10), 1621-1627 (2012).
- Chasles, F., Dubertret, B., Boccara, A. C. Optimization and characterization of a structured illumination microscope. Opt Express. 15 (24), 16130-16140 (2007).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Hsu, H. J., Lin, G., Chung, B. C. Parallel early development of zebrafish interrenal glands and pronephros: differential control by wt1 and ff1b. Development. 130 (10), 2107-2116 (2003).
- O'Brien, L. L., et al. Wt1a, Foxc1a, and the Notch mediator Rbpj physically interact and regulate the formation of podocytes in zebrafish. Dev Biol. 358 (2), 318-330 (2011).
