Analyse von Zebrabärbling Nierenentwicklung mit Zeitraffer-Imaging einem Binokular Mit Ausgerüstet für Optische Schnitte

Summary

Das hier beschriebene Verfahren ermöglicht Zeitraffer-Analyse der Organentwicklung in Genaktivität durch ein Fluoreszenzmikroskop mit Lage ist, eine optische Schnitte und einfache Strategien der Neueinstellung Sezieren fokale und planaren Drift zu korrigieren.

Abstract

Um Organogenese, die räumlichen und zeitlichen Veränderungen zu verstehen, die während der Entwicklung von Geweben auftreten müssen aufgezeichnet werden. Das hier beschriebene Verfahren ermöglicht Zeitraffer Analyse von normaler und eingeschränkter Nierenentwicklung in Genaktivität durch ein Fluoreszenz Binokular zur strukturierten Beleuchtung und z-Stapelerfassung ausgestattet ist. Mit fluoreszenzmarkierten Nierenstrukturen wurden verwendet: Um Nephrogenese, transgene Zebrabärbling (GFP) Tg (wt1b) zu visualisieren. Renal Defekte wurden durch Injektion eines Antisense - Morpholino - Oligonukleotid gegen das Wilms - Tumor - Gen wt1a ein Faktor bekannt ausgelöst für Nierenentwicklung von entscheidender Bedeutung.

Der Vorteil des experimentellen Aufbaus ist die Kombination eines Zoom-Mikroskop mit einfachen Strategien zur Wiederstellbewegungen in x-, y- oder z-Richtung ohne zusätzliche Ausrüstung. Zur Umgehung Fokusdrift, die durch Temperaturschwankungen und mechanischen Schwingungen induziert wirdWurde eine Autofokus-Strategie statt der Verwendung einer in der Regel erforderlich Umweltkammer angelegt. Eingesetzt, um die Positionsänderungen aufgrund einer xy-Drift, Imaging Kammern mit aufgedrucktem Verlagerung Gitter wurden neu zu justieren.

Im Vergleich zu komplexeren Einstellungen für Zeitrafferaufnahme mit optischen Schneidens wie konfokalen Laser-Scanning oder Lichtbogen-Mikroskope, ist ein Zoom-Mikroskop leicht zu handhaben. Außerdem bietet es Binokular spezifische Vorteile wie hohe Schärfentiefe und einem erweiterten Arbeitsabstand.

Die Methode zum Studium der Organogenese hier präsentiert werden, können auch mit Fluoreszenz-Stereomikroskope nicht in der Lage des optischen Schneidens verwendet werden. Obwohl begrenzt für hohen Durchsatz, bietet diese Technik eine Alternative zu komplexeren Geräten, die normalerweise für Zeitrafferaufnahme der Entwicklung von Geweben und Organ Dynamik verwendet wird.

Introduction

Nach der Gastrulation ist organogenesis die nächste Stufe der Lebenszyklus eines Individuums. Es beinhaltet die Umlagerung, Interaktion und sehr oft Migration von Zellen Gewebe und Organe zu erzeugen. Unrichtigkeit in den Prozessen zugrunde liegenden führt die Entwicklung von Organen oft zu Krankheiten, die sich manifestieren kann entweder sofort oder auch später im Leben. So wurde in der Entwicklungsbiologie und der biomedizinischen Forschung eine große Anstrengung der Organogenese zu verstehen. Hat, um in der Lage, die Entwicklung eines bestimmten Organs zu untersuchen, ist es auch durch die Körperwand des Embryos sichtbar. Dies ermöglicht die Aufzeichnung der räumlichen und zeitlichen Veränderungen, die während der Entwicklung auftreten. Auch, um die Bedeutung der Faktoren in der Organogenese beteiligt zu analysieren, muss sie manipulierbar sein.

Einen Organismus, der für die Untersuchung der in vivo Organogenese überaus geeignet ist , ist Zebrabärbling. seine durchsichrenz während der Embryonalentwicklung in Kombination mit der Verwendung von Fluoreszenz - transgenen Linien ermöglicht die Beobachtung der Proteinlokalisierung und Expression Dynamik sowie die Visualisierung der inneren Organe ^1. Dies bietet einen einzigartigen Vorteil in Bezug auf die Untersuchung der Organentwicklung in Echtzeit im Vergleich zu Säugetieren Modelle, deren Organe sind nicht zugänglich für die mikroskopische Analyse. Darüber hinaus sind verschiedene Werkzeuge Embryonalentwicklung von Zebrabärbling zu manipulieren, zur Verfügung. Neben der Erzeugung von Mutantenlinien, Antisense-Morpholino-Oligonukleotide (MO) kann verwendet werden, um die Aktivität bestimmter Gene Knockdown, die in der Entwicklung bestimmter Organe beteiligt sind. MOs entweder zielen auf eine Spleißstelle oder das Translationsstartcodon (AUG) und dadurch mit Spleißen von prä-mRNA oder Translation stören.

Der Zebrabärbling embryonale Niere, die pronephros, ist ein anatomisch einfache, aber wertvolle Modell der Nierenentwicklung und die Funktion der Gen zu studierenes im Zusammenhang mit Nierenerkrankungen ^2. Es besteht aus nur zwei Funktionseinheiten genannt Nephronen. Jedes Nephron besteht aus einem Glomerulus , wo die Blutfiltration stattfindet ^3. Weitere Komponenten sind die Kurzhalsbereich sowie das segmentierte Tubulus für die Sekretion und Resorption von gelösten Stoffen und der Leitung, die ⁴ in der Kloake endet. Unabhängig von seiner einfachen Zusammensetzung, die Organisation und die verschiedenen Zelltypen der Zebrabärbling pronephros sind sehr ähnlich zu der Säugetierniere ^5,6.

Ein Faktor, der in der Nierenentwicklung kritisch beteiligt ist, kodiert durch das Wilms Tumor - Suppressor - Gen Wt1 ^7. Zebrabärbling besitzen zwei Paraloge genannt wt1a und wt1b in einer überlappenden , aber nicht identischen Muster bei der Entwicklung der pronephros ⁸ ausgedrückt werden. Durch die Verwendung von transgenen Zebrafisch mit GFP-markierten pronephros Strukturen, es hat sich gezeigt , dass komplette Knock-down von wt1a gezeigt </ em> oder eines bestimmten Splice Form führt zu schweren oder leichten Fehlbildungen der embryonalen Nieren bzw. ^9,10.

Das hier beschriebene Verfahren ermöglicht Zeitraffer Analyse normaler und gestörter Nephrogenese in Genaktivität durch eine Fluoreszenz unter Verwendung von Binokular über strukturierte Beleuchtung für optische Schnitte ausgestattet. Optische Schnitte in der Regel möglich, den Erwerb von Bildern, die nur im Fokus befindlichen Informationen enthalten. Out-of-focus Informationen kann durch verschiedene Ansätze wie mathematischer Algorithmen (zB. Dekonvolution), optische Gestaltung (zB konfokalen Laser - Scanning - Mikroskopie) oder eine Kombination von beiden (zB strukturierte Beleuchtung) vermieden werden.

Um induzieren Defekte in der Nierenentwicklung verwendeten wir ein Antisense - MO gegen wt1a, die in einer transgenen Zebrabärbling Linie (Tg (wt1b: GFP)) injiziert wurde. Diese Linie zeigt GFP-Fluoreszenz in den Glomeruli, Hals und der vorderenTeil des Röhrchens ^9,10. Im Vergleich zu komplexeren Einstellungen für Zeitrafferaufnahmen mit optischen Schneidens wie Laser-Scanning oder Lichtbogen-Mikroskope, ist ein Zoom-Mikroskop leicht zu handhaben und kostengünstiger. Darüber hinaus leicht für strukturierte Beleuchtungseinrichtung mit herkömmlichen Fluoreszenzausrüstung kombiniert werden (zB Fluoreszenzlampe, Filter) und bietet Mikroskop spezifische Vorteile , wie beispielsweise einen erweiterten Arbeitsabstand und großes Sehfeld sezieren. Probleme mit Drift wurden ohne Verwendung zusätzlicher Ausrüstung (Klimakammer, Anti-Vibrationstisch) erfordert in der Regel stabile Ergebnisse gelöst. Zur Korrektur wurde für Fokusdrift eine Autofokus-Strategie festgelegt und Imaging-Kammern mit aufgedruckten Verlagerung Gitter wurden verwendet, um neu zu justieren die Positionierung nach einer Drift in x oder y-Richtung.

Das vorgestellte Verfahren kann auch auf Mikroskope ohne optische Sektionierung Optionen angewendet werden, wie Fluoreszenz-Stereo microscopes und bietet eine Alternative zu komplexeren Geräten, die normalerweise für Zeitrafferaufnahme der Entwicklung von Geweben und Organ Dynamik verwendet wird.

Protocol

Alle Tierversuche wurden nach den "Prinzipien der Labortierhaltung" durchgeführt sowie auf die aktuelle Version des deutschen Gesetzes über den Schutz der Tiere.

1. Herstellung von Antisense-Morpholino (MO)

1. Um eine 3 mM MO-Stammlösung herzustellen, werden 100 ul sterilem Reinstwasser auf die gefriergetrocknete MO (300 nmol in Glasfläschchen). Für eine vollständige Auflösung, erwärmen die Stammlösung auf 65 ° C für 5 min. Verschließen Sie die Fläschchen mit Parafilm und speichern Sie die MO-Stammlösung bei Raumtemperatur (RT). Sie nicht die MO-Stammlösung kühlen, weil das eine Vereinigung der MO mit den Fläschchen Wände verursachen könnte.
2. Bereiten Sie eine 1 mM MO Arbeitslösung durch die MO-Stammlösung mit sterilem Reinstwasser verdünnt und 0,5% Phenolrot-Lösung bis zu einer Endkonzentration von 0,05% ergeben.
   1. Um 10 ul einer MO-Arbeitslösung, fügen 3,3 ul MO-Stammlösung und 1 & mgr; l von 0,5% Phenolrot-Lösung auf 5,7 & mgr; l Wasser. SeinVordergrund eine neue Charge von Arbeitslösung vorbereitet erwärmen, um die MO-Stammlösung für 5 min auf 65 ° C.
3. Vor der MO-Arbeitslösung zu verwenden, Zentrifuge ein Verstopfen der Nadel zu verhindern. Beispielsweise spin 10 ul MO Stammlösung bei 15.000 xg für 5 min (RT) und entfernen 8 & mgr; l des Überstands zur Injektion.
   HINWEIS: Der Verlust der Aktivität in Morpholin Lösungen im Laufe der Zeit ¹¹ auftreten können. Um diesen Fall auszuschließen, kann man die Lösungen durch UV - Spektrometrie testen das Protokoll folgenden vom Hersteller geliefert. Bei den verwendeten wt1a morpholino eine verringerte Wirksamkeit über einen langen Zeitraum der Lagerung (3 mM Arbeitslösung nicht beobachtet wurde länger gespeichert als ein Jahr).

2. Einrichten des Mating-Paare und Sammlung von befruchteten Eiern

1. Am Nachmittag vor der Mikroinjektion eingerichtet fünf Paare der Tg (wt1b: GFP) Linie, die jeweils in einem Zuchtbehälter mit einem abnehmbaren Sieb ausgestattet zu trennenMännchen und Weibchen während der Nacht.
   HINWEIS: Um sicherzustellen, dass genügend Eier für eine erfolgreiche Injektion Experiment zur Verfügung stehen, Fisch als Gegenpaare verwendet wird, sollte so gut "Produzenten" vorgeprüft und ausgewertet wurden.
2. Am nächsten Morgen, nachdem die Lichter einschalten, setzen die männlichen und weiblichen zusammen über dem Sieb, das vom Essen bis ihre Eier der Fische verhindert.
3. Sehen Sie sich das Laichen. Sobald eine Menge Eier gelegt werden, die vor dem 4-Zellen-Stadium injiziert werden kann erreicht ist (ca. 50), getrennt für Männer von wieder weiblich. Übertragen Sie die Eier mit einer Pasteur-Pipette in eine Petrischale gefüllt mit Embryo Wasser für eine erste Runde der Injektion. Um zusätzliche Runden von Eiern zu bekommen, stellen ein passendes Paar zusammen und getrennt mehrmals.

3. Vorbereitende Arbeiten für Mikroinjektions

HINWEIS: Führen Sie die Schritte 3.1 und 3.2 im Voraus.

1. Zur Herstellung einer Schale, die die Embryonen in Position während der Injektion (Mikroinjektions Schale) hält legen Sie eine glass Rutsche in einem 40-45 ° -Winkel in eine 94 mm Petrischale mit Flüssigkeit gefüllt ist, transparent, rein, Lebensmittelqualität Silikon. Entfernen Sie die Folie, wenn die Silizium ausgehärtet wird. Das erzeugt eine Nut in der Siliziumschicht.
   HINWEIS: Alternativ können 1,5-3% Agarose anstelle von Silizium und speichern die Schale bei 4 ° C.
2. Generieren Injektionsnadeln aus Glaskapillaren mit einer Nadel Abzieher.
   1. Verwenden Sie Kapillaren, die inneren Filamente enthalten.
      HINWEIS: Das Filament wird dazu beitragen, die MO-Lösung in Richtung der Spitze der Nadel zu transportieren nach Verfüllung (siehe 3.3).
   2. Stellen Sie die entsprechenden Einstellungen auf der Nadel Abzieher. Gute Nadeln für die Injektion in Zebrabärbling sollten lange und dünne Spitzen ^12. Erzeugen Spitzen mit einer Länge von ca. 10 mm und einem Durchmesser von 1,5-2 & mgr; m an ihrem Ende. Um zum Beispiel eine horizontale Nadel Abzieher mit folgenden Einstellungen: Wärme = 330, Pull = 0, Geschwindigkeit = 40, Time = 100.
   3. Prüfen Sie die Qualität der Nadeln unter aBinokular und sortieren die mit kurzen oder zu langen Spitzen aus.
      HINWEIS: Nadeln mit kurzen Spitzen neigen dazu, den Embryo während solche mit sehr langen und dünnen Spitzen Biegung zu beschädigen, wenn die Chorion zu berühren und durchdringen Sie es nicht.
3. Verfüllen die Nadel mit 2 ul MO Arbeitslösung durch eine Microspitze verwendet und in den Nadelhalter der Mikroinjektionsvorrichtung einzufügen.
4. Da die Nadeln an der Spitze Ende geschlossen sind, erzeugen eine Öffnung durch Einklemmen des Ende der Nadel mit scharfen Pinzette unter dem Präpariermikroskop zurück. Alternativ können Sie die Mikroinjektionsgerät vorsichtig auf die Spitze an einer starren Oberfläche drücken (z. B. kleine Metallblock oder Rückseite der Pinzette).
5. Kalibrieren der Einspritzvolumen durch die MO-Arbeitslösung in einem Tropfen Mineralöl auf einer Strichplatte platziert einzuspritzen. Die Dauer der Einspritzung für einen Tropfendurchmesser von 75 & mgr; m produzieren einem Injektionsvolumen von etwa 200 pl zu erhalten.

1. Anordnen der 1-Zellen-Stadium Embryonen entlang der Nut der Mikroinjektions Schale mit dem vegetativen Pol in Richtung auf die Richtung, aus der die Nadel kommt (in Richtung der 45 ° -Winkel der Nut).
2. Perforieren der Chorion und das Eigelb mit der Nadel und injizieren 200 pl der 1 mM MO-Arbeitslösung (0,2 pmol) in den Dotter von 1- bis 2-Zell-Embryonen.
3. Mit Hilfe einer Pasteur-Pipette mit einer breiten Öffnung, sammeln alle der injizierten Embryonen in einer Petrischale mit Embryo Wasser gefüllt und brüten sie bei 28,5 ° C.
4. Am Nachmittag entfernen abgestorbene Embryonen, die durch eine Pasteur-Pipette mit einer breiten Öffnung mit und den Embryo Wasser ersetzen.

5. Herstellung von Embryonen für die In - vivo - Bildgebung

1. Am nächsten Morgen, ersetzen Sie den Embryo Wasser mit Embryo Wasser mit 0,003% N-Phenylthioharnstoff (PTU) melanization zu hemmen. Sie PTU nicht gelten vor dem Ende der Gastrulation, weil es interferes mit der frühen Embryonalentwicklung.
   ACHTUNG: PTU ist giftig und teratogen. Handschuhe tragen zu jeder Zeit und vermeiden Einatmen und Kontakt mit der Haut.
2. Dechorionate die Embryonen mit scharfen Pinzette unter einem Präpariermikroskop bei der gewünschten Entwicklungsstadium. Besorgen Sie sich die Chorion mit einer Pinzette und versuchen auf die andere Seite des Chorion mit einer zweiten Pinzette zu greifen. Ziehen Sie vorsichtig mit der Pinzette in entgegengesetzte Richtungen, ohne den Embryo zu stören.
3. Anesthetize den Embryo durch den Embryo Wasser ersetzt PTU enthält (0,003%) mit Embryo Wasser mit PTU (0,003%) und 0,02% Ethyl-3-aminobenzoat methansulfonat (Tricaine).
4. Einbetten des Embryos in niedrigschmelzender Agarose auf einem Deckglas Boden μ-Schale mit einem 50 & mgr; m Verlagerung Gitter. Die richtige Einbettung erfordert einige Übung.
   1. Bereiten Sie 1 ml Aliquots von 0,7% Agarose in 1,5 ml Reaktionsgefäße und legte sie auf einem Heizblock auf 36 ° C eingestellt. Verwenden Sie eine Pasteur-Pipette mit breiter Öffnung TRAnsfer der Embryo in die μ-Schale. Entfernen Sie überschüssiges Embryo Wasser unter Verwendung einer Pasteur-Pipette mit ultradünnen Spitze und überlagern den Embryo mit ausgeglichenem Agarose.
   2. Während die Agarose noch flüssig ist, richten den Embryo mit zwei Gel-Loader-Tipps in der gewünschten Position in Bezug auf die Struktur von Interesse sowie die Entfernung zum Umzug Gitter. Legen Sie die Struktur von Interesse (hier die pronephros) so nahe wie möglich an den Glasboden (hier: dorsale nach unten) und in der Nähe des Gitters.
   3. Für eine optimale Bildqualität der Agarose-Schicht zwischen dem Embryo zu minimieren und den Glasboden durch die interessierende Struktur des Embryos so nah wie möglich zum Boden platzieren. Abgesehen davon, suchen Sie den Embryo in der Nähe des Gitters aber darauf achten, dass das Netz nicht mit der Struktur von Interesse überlagern. Einbetten von 3-4 Embryonen in verschiedenen μ-Gerichte und dadurch ist der eine, die am besten positioniert ist.
   4. Wenn die Agarose hart genug ist, um den Embryo Warten auf 2 zu halten,-3 Min und überlagern die eingebettete Embryo mit Embryo Wasser mit 0,003% PTU und 0,02% Tricaine. Dekantieren Sie das überschüssige Wasser Embryo oder entfernen Sie sie durch eine Pasteur-Pipette mit ultra-dünner Spitze. Schließen des Deckels der μ-Schale in der Verriegelungsposition die Verdampfung zu verhindern.
      HINWEIS: Vermeiden Sie das Auftreten von Luftblasen in der μ-Gericht, da sie Bildaufnahme beeinträchtigen.

6. Mikroskopie

HINWEIS: Verwenden Sie ein Mikroskop zur optischen Schneidens ausgestattet über strukturierte Beleuchtung. Nehmen Sie Bilder mit einer Software die folgenden Module enthält: Multichannel, Z-Stapel, Zeitreihen, Software-Autofokus und Erweiterte Tiefenschärfe.

1. Erwerb von Z-Stapeln
   1. Kehren Sie die μ-Schale. Der Glasboden steht nun in Richtung des Ziels und die μ-Schale dient als Abbildungskammer.
   2. Schalten Sie den Regler in die Startposition und ermöglichen die strukturierte Beleuchtung Modus in der Software-Steuerung.
   3. Kalibrierendas Raster Fokus für den Kanal (n) der Wahl mit der Probe gemäß den Anweisungen des Focus Calibration Wizard untersucht (eingebettete Embryo) werden.
   4. Aktivieren Sie die z-Stack-Erfassungsmodus und setzen Sie ihn auf Mitte-Modus. Fokus in der Mitte der Probe und legen Sie es als die Mittelebene des z- Stapel von Center klicken. Stellen Sie die Dimension des z-Stapel durch den Bereich um die Mittelstellung zu definieren.
      HINWEIS: Objektstrukturen sollten nicht scharf außerhalb des ersten zu sehen ist und die letzte Ebene des Z-Stapel.
   5. Stellen Sie den Abstand zwischen den optischen Schnitten. Für beste z-Auflösung klicken Sie auf die Schaltfläche Optimal. Auf der Grundlage der Ziele Tiefe des Feldes wird die Software einen empfohlenen Abstand nach dem Nyquist-Kriterium eingestellt (50% Überlappung).
      HINWEIS: Wenn für kleinere Dateigrößen Ziel und die Struktur zulässt, stellen Sie einen größeren manuell Abstand Größe. Einstellen kleineren Schritten als empfohlen führt lediglich zu größeren Dateien ohne später zu erhöhenal Informationen.
2. Zeitraffer-Imaging
   1. Öffnen Sie die Zeitreihen Werkzeug und das Intervall der Zeitreihe Experiment. Zum Beispiel Rekord Z-Stapel Bilder alle 30 Minuten über einen Zeitraum von 5 Stunden.
   2. Um Fokusdrift über die Zeit zu beheben, legen eine Autofokus-Strategie auf. Überprüfen Sie die Dialogbox Fokus-Strategie, wählen Sie Software Autofokus aus der Dropdown-Liste und wählen Sie den TL-Hellfeldkanal als Referenzkanal.
   3. Beginnen Sie jeden Zeitpunkt mit dem Autofokus. Um eine zuverlässige Suchbereich innerhalb einer optimierten Zeitrahmen zu gewährleisten, stellen Sie eine feste 200 & mgr; m relativ Suchbereich. Dieser Bereich wird vollständig gescannt (Bereich Coverage-Parameter) mit Grundqualität (Quality-Parameter) in einer maximalen Schrittgröße (Sampling-Parameter).
   4. Zur Erhöhung der Genauigkeit des Autofokus, aktivieren Sie die Dosierung in einem Fokusbereich von Interesse (Fokus ROI) und die Position der Fokus ROI in der Live-View-Fenster um die Struktur von Interesse.
      HINWEIS: Wenndas System die Software Modul Autofokus fehlt, die die Mitte z-Position automatisch während der Zeitrafferaufnahme aktualisiert, Pause, das Experiment zu einem bestimmten Zeitpunkt und den Fokus manuell einstellen und das Experiment fortzusetzen.
   5. Um für eine mögliche xy-Drift während der Zeitserienaufnahme zu kompensieren, stellen Sie einen bestimmten Punkt des geprägten Gitters (der Abbildungskammer) in das Fadenkreuz der Software und die Positionierung sparen, indem Sie einen Screenshot zu machen.
   6. Starten Sie die Zeitreihe Experiment. Bevor die Zeit über Serie Intervall ist, halten Sie das Experiment und, falls erforderlich, neu zu justieren die Positionierung entsprechend dem Screenshot. Fahren Sie mit dem Experiment.

7. Bildverarbeitung

1. Wechseln Sie auf die Registerkarte Verarbeitung und wählen Sie die mit erweiterter Tiefenschärfe (EDF) im Methodendialogfeld. Da optische Abschnitte erfasst werden, die maximale Projektionsalgorithmus auf die Bildserien anwenden.
   HINWEIS: Hier wird der Algorithmus projizieren das brightest oder das dunkelste Pixel aus dem Stapel zu einem zusammengesetzten 2D-Bild in einem ersten Schritt und schließlich verwenden, um die mit der höchsten Varianz als Ergebnis für jeden Zeitpunkt.
2. Verwenden Sie den Film exportieren Methode Zeitraffer - Aufnahmen (zB avi oder verschieben Datei) aus dem EDF Bilderserie zu erstellen.

Representative Results

Zeitraffer-Mikroskopie ist eine leistungsstarke Technik dynamische biologische Prozesse über einen längeren Zeitraum zu beobachten. Ein häufig während Zeitraffer-Bildgebung ist eine Bewegung in x, y oder z-Richtung, die so genannte Drift, die von Temperaturschwankungen und mechanischen Schwingungen auftretende Problem induziert wird. Die hier vorgestellte Methode ermöglicht Zeitraffer von fluoreszenzmarkierten Strukturen in Zebrabärbling-Embryonen oder Larven auf einem Binokular ohne Klimakammer und Anti-Vibrationstisch der Aufnahme.

Zur Kompensation der xy-Drift, wurde die Probe in einem Abbildungskammer eingebettet mit einem aufgedrucktem Verlagerung Gitter (Abbildung 1). Die Lage von einem bestimmten Punkt des am Fadenkreuz des Software - Tools im Zusammenhang mit Gitter wurde verwendet , um die Probe in die voreingestellte Position (2A) zurückzukehren. Die vorgestellten Ergebnisse wurden unter Verwendung eines Zoom-Mikroskop erhaltenmit integriertem Schieber für optische Schnitte durch strukturierte Beleuchtung (2B). Für eine kontinuierliche Fokuskorrektur wurde eine Autofokus-Strategie festgelegt. Bei dieser Strategie wird die Software-Autofokus verwendet, um den Fokus zu finden basierend auf maximalen Kontrast vor jedem Zeitpunkt. Diese so definierten Fokusebene wird anschließend als Zentrum Plan für Z-Stapel Erfassungseinricht. Um Phototoxizität in der Probe, das Sendelicht - Hellfeld- Kanal wird als Referenzkanal verwendet zu minimieren , wie es ausreichend kurze Belichtungszeiten während der Autofokus Schritt (Abbildung 2C) ermöglicht.

Die Methode wurde in Steuer- und wt1a morphant Embryonen einer transgenen Zebrabärbling Linie (: GFP) Tg (wt1b) für eine vergleichende Analyse der Nierenentwicklung angewendet. Während der frühen Nephrogenese zeigt diese Linie grüne Fluoreszenz im intermediären Mesoderm wurden entstehen die Niere Vorläufern von ^9,10 und späterin den Form tubules und nephron primordia (Abbildung 3).

Zeitraffer-Bildaufnahme zeigt , dass Nephrogenese in Steuer Morpholino injizierten Embryonen im Vergleich zu nicht - injizierten diejenigen unverändert ist (Ergebnisse nicht gezeigt) und folgt den beschriebenen Schritten der frühen Zebrabärbling Nierenentwicklung ^3. Bei 20 HPF die Entwicklung pronephric Tubuli sichtbar sind und an ihren vorderen Spitzen, kugelförmige Ansammlungen von Zellen, können die Bildung nephron primordia darstellt nachgewiesen werden. In den nächsten Stunden, wachsen Tubuli und nephron primordia und später auf den primordia beginnen an der Mittellinie zu verschmelzen (Bild 4, Video 2). Im Gegensatz dazu wird Nephrogenese stark in wt1a morphant Embryonen gestört. Obwohl GFP-positive röhrenförmige Strukturen bei 20 HPF sichtbar sind, erscheinen sie diffuser und weniger entwickelt zu sein. Darüber hinaus haben keine richtigen nephron primordia gebildet worden ist. Der auffälligste Unterschied zu ter die Kontrolle Embryonen zu diesem Zeitpunkt ist jedoch das Auftreten einer großen Anzahl von fluoreszierenden Zellen außerhalb der Entwicklungs pronephros (Abbildung 4, Video 2). Anschließend lassen sich diese Zellen die pronephric Feld und wandern ventral (Video 2).

Nieren - Entwicklung in Kontrolle Embryonen und wt1a morphants der wt1b transgenen Linie wurden bisher im Vergleich mit ^9,10 Bilder mit verschiedenen festen Zeitpunkten nehmen. Im Gegensatz zu dieser statischen Methode, Zeitrafferaufnahme ermöglicht durch wt1a Erschöpfung verursachte Dynamik der normalen Nephrogenese und Fehlleitung von Nierenvorläuferzellen zu folgen.

Abbildung 1: Schematische Darstellung eines Embedded Embryo in einem im Handel erhältlichen Kammer mit Relocation Grids. Das Gericht hatvier Gitter, die jeweils in einem Wiederholungsabstand von 50 unterteilt um, in einem Deckglas Boden eingeprägt. Der Embryo abgebildet werden soll , den Kopf eingebettet, mit Nierenstruktur in unmittelbarer Nähe zu einem Beobachtungs Platz , aber ohne mit dem Gitter überlagern. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2:. Anpassungen für Kompensation von Drift in Zeitraffer-Imaging und Grid - Projektion von Structured Illumination Eine deutliche Position des Umzugs Gitter in der Bildmitte gebracht wurde (markiert durch gelbe Fadenkreuz) und dient als Bezugspunkt für die spätere xy-Ausrichtung bei kleinen Verschiebungen. Das rote Rechteck repräsentiert die Region of Interest (ROI) , die in der Autofokus - Strategie (A). Optischen Schneidens was durch strukturierte Beleuchtung erhalten. Das Bild zeigt eine Gitterstruktur in der Brennebene projiziert , nachdem eine korrekte Kalibrierung (B). Der ROI für den Autofokus - Strategie (rotes Rechteck) wird unverwechselbare embryonale Strukturen hoch im Gegensatz zu decken (hier Somiten) , die zuverlässige automatische Scharfeinstellung in die Struktur von Interesse (C) ermöglichen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3: Transgene wt1b. GFP Embryos mit Grüne Fluoreszenz in der Entwicklung von Nieren Overlays von dorsalen (A) oder seitlich (B) Übertragung und Fluoreszenzbilder werden mit anterior der linken Seite gezeigt. np, nephron primordium; pt, pronephric Röhrchens; so, soMilbe. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4: Preissturz von wt1a Stört Embryonale Nierenentwicklung Vertreter, erweiterter Tiefenschärfe Bilder von Zeitraffer-Aufnahmen.. In Kontroll Morpholino injizierten Embryonen, zeigt der Nierenentwicklung normalen Fortschritt mit wachsender Tubuli und nephron primordia, die an der Mittellinie zu verschmelzen beginnen. Im Gegensatz dazu scheitern wt1a morphants richtige nephron primordia und eine enorme Menge an GFP - positiven Zellen außerhalb des pronephric Feld sind zu bilden. (np, nephron primordium; pt, pronephric Tubuli). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieses fi anzuzeigenAbbildung.

Supplemental Video 1. Zeitrafferaufnahme der normalen Nierenentwicklung in Kontrolle Morpholino injizierten Embryonen. (Rechtsklick zum Download). Das Video zeigt , wie Tubuli wachsen und nephron primordia beginnen zu verschmelzen. Beginnend bei 20 hpf, Bilder wurden in 30 min-Intervallen über einen Zeitraum von 5 Stunden entnommen.

Supplemental Video 2. Zeitrafferaufnahme von gestört Nephrogenese in wt1a morphant Embryonen. (Rechtsklick zum Download). Das Video zeigt die Migration von GFP-positiven Zellen aus dem pronephric Region. Beginnend bei 20 HPF, Bilder wurden in 30 mi genommenn Intervallen über einen Zeitraum von 5 Stunden.

Discussion

Der Zebrabärbling hat für die Untersuchung der Entwicklung von Wirbeltieren und Modellierung menschlicher Krankheiten ein beliebter Modellorganismus geworden. Da Genaktivität transparent bleiben, die Entwicklung von Organen wie Gehirn und Herz kann mit einem Standardpräparat Mikroskop beobachtet werden. Unter Ausnutzung der transgenen Linien mit organspezifischen Fluoreszenz ermöglicht Einschätzungen der Organogenese in ganz unterschiedlichen Stadien der Entwicklung in lebenden Embryonen, die durch Fluoreszenzmikroskopie. Eine Einschränkung für die Abbildung strukturellen Details ganzer Organe mit Standard-Epifluoreszenzmikroskopie ist die Auswirkung von Signalen von Objekten oberhalb und unterhalb der Brennebene. Diese Out-of-Fokus Licht nicht nur zu einer verminderten Bildkontrast und die Auflösung kann es auch wichtig , die Strukturen von Interessen ^13,14 verschleiern. Verschiedene Techniken, wie beispielsweise Laser-Scanning Konfokal- wurden Spinnscheibe Konfokal- oder Multiphotonenmikroskopie entwickelt, um die out-of-focus Informationen zu minimieren und dadurch increase Bildkontrast sowie axiale Auflösung. Ein alternatives Verfahren , optische Schnitte zu erhalten , ist die laser- und Scannen frei strukturierten Beleuchtung Mikroskopie, ein weites Feld basierte Beleuchtungstechnik , die ist und einfach auf einem normalen Mikroskop ¹⁵ zu implementieren. Die hier vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass optische Schnitte durch strukturierte Beleuchtung erreicht, auf einem Binokular umgesetzt und mit dem Wiederaufbau der erweiterten Fokus Bilder kombiniert, Visualisierung von strukturellen Details der normalen ermöglicht und gestörte Nierenentwicklung in Zebrabärbling. Insbesondere werden die GFP-positiven Zellen in wt1a morphants bei verschiedenen Fokustiefen dispergiert und Bilder von nur einer Ebene mit Out-of - Fokus verwischen würde unterschätzen die dreidimensionale Komplexität des Phänotyps.

Um die Dynamik von Organ Organisation, Umlagerung oder Störung, Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie ist ein leistungsfähiges, wenn auch komplexe Technik folgen. Während im ZeitrafferBildgebung leichte Vibrationen oder geringfügige Temperaturschwankungen verursachen Drifts in x, y oder z-Richtung. Dies erfordert zusätzliche Ausrüstung (Klimakammer, Anti-Vibrations-Tabelle), um stabile Ergebnisse zu erzielen. Die vorgestellte Methode nutzt die Fähigkeit eines Binokular mit einem motorisierten Fokustrieb für Zeitraffer-Bilder ohne zusätzliche Geräte aufnehmen. Um einen stabilen Fokus halten, wurde eine Autofokus-Strategie festgelegt und eine Verlagerung Gitter in den Boden der Abbildungskammer eingeprägt wurde zur Korrektur der x, y- Instabilität verwendet.

Proper Einbettung des Embryos ist ein kritischer Schritt im Protokoll. Einige der Praxis ist notwendig, um das Netz der Struktur von Interesse so nah wie möglich an den Glasboden und in unmittelbarer Nähe zu platzieren, ohne mit ihm überlagert.

Der wesentliche Vorteil des Verfahrens besteht darin, dass es eine kostengünstige und einfaches Werkzeug für die direkte Beobachtung von Entwicklungsprozessen wie Wachstum und Migration in Lebens istEmbryonen über mehrere Stunden. Darüber hinaus erleichtern die Präpariermikroskop spezifische Vorteile wie große Sichtfeld und erweiterten Arbeitsabstand Prüfung von größeren Proben einschließlich ganzer Organe. Allerdings haben einige Einschränkungen im Auge behalten werden. Pausieren des Experiments zu überprüfen und die Positionierung nachstellen macht das Verfahren zeitaufwendig und das Fehlen einer robusten Temperaturregelung ändert sich die "Standard" Entwicklungszeit, die als h nach der Befruchtung bei 28,5 ° C für Zebrabärbling ¹⁶ definiert ist. Ein weiteres mögliches Problem ist die beschränkte Tiefe der Bildgebung in das Tier, insbesondere wenn der interessierende Struktur innerhalb des Embryos oder Larven entfernt. Eine solche Struktur ist der Zebrabärbling pronephric Glomerulus, die zwischen den Somiten und des Dottersacks befindet. Die Grenztiefe Glomerulus zur Bebilderung wurde mit etwa 200 um, eine Entfernung zu sein, die nach 5 Tagen der Entwicklung erreicht ist. Im Gegensatz dazu fluoreszierende Strukturen, die located an der Oberfläche des Tieres näher kann für eine längere Zeit abgebildet werden. Zum Beispiel sind Leberzellen für die Abbildung mindestens bis 9 dpf zugänglich. Eine weitere Einschränkung ist, dass langfristige Immobilisierung des Embryos oder Larven in Agarose und Tricaine Behandlung Wachstumsverzögerung und kardialen Ödemen induzieren, beziehungsweise. Da dies mit der normalen Entwicklung beeinträchtigen können, wird empfohlen, die Dauer der Zeitrafferaufnahme auf einen bestimmten Zeitraum von Interesse zu beschränken. Um das zu entwickeln, während der Bildgebung Strukturen von Interesse sicherzustellen, normalerweise ist es hilfreich zu vergleichen (am Ende) das Gesamtbild mit der eines Tieres unter gleichen Versuchsbedingungen gehalten, aber ohne Einbettung und anesthetization.

Aufnahme eines z-Stapel von optischen Schnitten alle 30 Minuten über einen Zeitraum von 5 Stunden und die anschließende Berechnung der erweiterten Tiefenschärfe Bilder räumliche und zeitliche Informationen über die frühen Ereignisse der normalen zur Verfügung gestellt und gestörte Nierenentwicklung, die b induziert wurdey morpholino-vermittelten Knockdown von wt1a. Zuvor durchgeführt Morpholino Knockdown Versuche haben bereits gezeigt , dass Wt1a eine frühe und wichtige Rolle bei der Bildung pronephros erfüllt In - situ - Hybridisierung mit Nieren Marker ^17,18 und Beschäftigung des transgenen wt1b. GFP Linie für die Bildgebung pronephros Entwicklung zu festen Zeitpunkten ^9,10 ergab , dass wt1a Mangel führt zu einer gestörten glomerulären Morphogenese und gescheiterte podocyte Spezifikation. Im Gegensatz zu diesen statischen Ansätze, Zeitraffer-Aufnahmen direkt Dynamik der frühen Nephrogenese Kontrolle Embryonen zu visualisieren und die Migration von GFP-positiven Zellen entfernt von der pronephric Region wt1a morphants. Die Möglichkeit misrouted Zellen im Laufe der Zeit zu verfolgen, ermöglicht eine detailliertere Analyse Phänotyp.

Im Allgemeinen, dass das hier vorgestellte Verfahren wird ermöglicht eine preiswerte und einfache Alternative zu dem Komplex zu verwenden, und weniger zugänglich setups normalerweise für Zeitraffer-Bildgebung wie Laser-Scanning-Mikroskop (ausgestattet mit einer Klimakammer und Anti-Vibrationstisch) oder Lichtblatt-Mikroskop verwendet. Die beschriebene Routine Driftprobleme zu beheben, kann auch angewendet werden Zeitraffer-Bilder auf Setups ohne optische Schnitte Optionen, wie Fluoreszenz-Stereomikroskope auszuführen.

Die Technik eignet sich nicht nur Nierenentwicklung zu untersuchen, sondern auch normale und defekte Morphogenese von anderen Organen wie Herz oder Leber zur Überwachung angewendet werden. verschiedene dynamischer Prozesse in embryonalen und adulten Modellorganismen zu beobachten, wie der Wundheilung oder der Regeneration Des Weiteren kann das Verfahren verwendet werden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material
Control Morpholino	Gene tools, LLC	Standard control oligo	Prepared control oligo
wt1a Morpholinos	Gene tools, LLC	customized	Designted to target the first splice donor site, sequence as published in Ref. 9
0.5% Phenol red solution	Sigma	P0290	Injection tracer
peqGOLD universal agarose	peqlab	35-1020	To prepare microinjection dish
Glass capillaries  (GC100F-10)	Hugo Sachs Elektronik	30-0019	To generate injection needles
Microloader tips	Eppendorf	5242956003	To load the microinjection needle
Dumont forceps	Fine Sience Tools	91150-20	To generate an opening at the needle tip
Embryo water (0.3x Danieaus´ solution)			1x: 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4,  0.6 Ca(NO3)2, 5 mM HEPES, pH: 7,5; Do not add methylene blue!
Graticule 5 mm/0.05 mm	Science Services	PY68039-02	For calculation of injection amount
Pasteur pipette 137 mm, 4.8 ml	Roth	E305.1	To collect eggs, to transfer embryos and to remove dead embryos
Pasteur pipette with ultra-thin tip 157 mm, 3.5 ml	Roth	E304.1	To remove excess of water
N-Phenylthiourea (PTU)	Sigma	P7629	For suppression of melanization
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)	Sigma	E10521	To anethesize zebrafish
Low melting agarose	Biozym	850111	For embedding
µ-dish 35 mm, high Glass Bottom Grid-50	ibidi	81148	Imaging chamber
Gel loader tips	Hartenstein	GS05	To orient the embryo for proper embedding
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Micropipette puller (model P-97)	Sutter Instrument		To generate injection needles
Micromanipulator	Saur Laborbedarf		For microinjection
Thermomixer copact	Eppendorf		Thermoblock for tempering the low melting agarose
SZ61 (Stereomicroscope)	Olympus		For injection control
Axio Zoom. V16	Zeiss		For embedding and imaging
ApoTome.2 slider	Zeiss		For optical sectioning
AxioCam MRm	Zeiss		For image acquisition
ZEN 2012	Zeiss		Imaging software