Summary
Den her beskrevne metode tillader time-lapse-analyse af organudvikling i zebrafisk embryoer ved hjælp af en fluorescens dissektionsmikroskop der kan udføre optisk sektionering og enkle strategier for omstilling til at korrigere fokal og plane afdrift.
Abstract
For at forstå organogenese, de rumlige og tidsmæssige ændringer, der opstår under udviklingen af væv skal registreres. Den her beskrevne metode tillader time-lapse-analyse af normal og nedsat nyre udvikling i zebrafisk embryoer ved hjælp af en fluorescens dissektionsmikroskop udstyret til struktureret belysning og erhvervelse z-stak. For at visualisere nephrogenesis, transgene zebrafisk (Tg (wt1b: GFP)) med fluorescens-mærkede nyre strukturer blev anvendt. Nyrer fejl blev udløst af injektion af en antisense morpholino oligonukleotid mod Wilms tumor genet wt1a, en faktor, der vides at være afgørende for nyre udvikling.
Fordelen ved forsøgsopstillingen er kombinationen af en zoom mikroskop med simple strategier for omfordeling af justering bevægelser i x, y eller z-retningen uden yderligere udstyr. For at omgå omdrejningspunkt afdrift, der er fremkaldt af temperatursvingninger og mekaniske vibrationer, En autofokus strategi blev anvendt i stedet for anvendelse af en normalt kræves klimakammer. For at re-justere positionelle ændringer som følge af en xy-drift, blev billeddannelse kamre med påtrykt udflytning gitre ansat.
I forhold til mere komplekse opsætninger for tidsforskudt optagelse med optisk sektionering såsom konfokal laserscanning eller lys ark mikroskoper, en zoom-mikroskop er let at håndtere. Desuden tilbyder det dissektionsmikroskop-specifikke fordele, såsom høj dybdeskarphed og en udvidet arbejdsafstand.
Fremgangsmåden til at studere organogenese præsenteres her kan også anvendes med fluorescens stereo mikroskoper ikke i stand til optisk sektionering. Selvom begrænset til high-throughput, denne teknik tilbyder et alternativ til mere komplekse udstyr, der normalt bruges til tidsforskudt optagelse af udviklingslandene væv og organsystemer dynamik.
Introduction
Efter gastrulation, organogenesen er den næste fase af en persons levetid. Det involverer omlejringen, interaktion og meget ofte migration af celler til at producere væv og organer. Usikkerhed i de processer der ligger til grund for udviklingen af organer fører ofte til sygdomme, der kan manifestere sig enten med det samme eller også senere i livet. Således at forstå organogenesen har været en stor indsats i udviklingsmæssige biologi og biomedicinsk forskning. For at kunne undersøge udviklingen af et bestemt organ, det skal være synlig, selv gennem kroppen væg af embryoet. Dette muliggør optagelsen af de rumlige og tidsmæssige ændringer, der opstår under udvikling. Også for at analysere betydningen af faktorer involveret i organogenese, skal det være modtagelige for manipulation.
En organisme, der er overordentlig velegnet til undersøgelse af in vivo organogenese er zebrafisk. Dens gennetighed under fosterudviklingen i kombination med anvendelse af fluorescerende transgene linier tillader observation af protein lokaliserings- og udtryk dynamik, samt visualisering af de indre organer 1. Dette giver en unik fordel vedrørende undersøgelsen af organudvikling i realtid i forhold til pattedyr modeller, hvis organer er utilgængelige for mikroskopisk analyse. Desuden er forskellige værktøjer til rådighed til at manipulere fosterudviklingen af zebrafisk. Udover generering af mutante linjer, kan antisense morpholino oligonukleotider (MO) anvendes til knockdown aktiviteten af bestemte gener, som er involveret i udviklingen af visse organer. MOS enten målrette en splejsningssted eller den translationelle startkodon (AUG), og derved interferere med splejsning af præ-mRNA eller translation.
Zebrafisk embryoniske nyre, de pronephros, er en anatomisk simpelt, men værdifuldt model til at studere nyre udvikling og funktion af genes forbindelse med nyresygdomme 2. Den består af kun to funktionelle enheder kaldet nefroner. Hver nephron består af en glomerulus, hvor blod filtrering finder sted 3. Andre komponenter er den korte hals regionen samt den segmenterede tubulus for sekretion og reabsorption af opløste stoffer og kanalen, der ender i kloakken 4. Uanset dens enkle sammensætning, organisation og de forskellige celletyper af zebrafisk pronephros er meget lig den mammale nyre 5,6.
En faktor, der er kritisk involveret i nyre udvikling, kodes af Wilms tumorsuppressorgen WT1 7. Zebrafisk besidder to paraloger kaldet wt1a og wt1b udtrykkes i en overlappende, men ikke identiske mønstre under udviklingen af pronephros 8. Ved at anvende transgene zebrafisk med GFP-mærkede pronephros strukturer, er det blevet vist, at fuldstændig knock-down af wt1a </ em> eller af en splejset form fører til svære og milde misdannelser af embryoniske nyre, henholdsvis 9,10.
Den her beskrevne metode tillader time-lapse-analyse af normal og nedsat nephrogenesis i zebrafisk embryoner ved at ansætte en fluorescens dissektionsmikroskop udstyret til optisk sektionering via struktureret belysning. Optiske sektioner generelt tilladelse til erhvervelse af billeder, som kun indeholder i fokus oplysninger. Out-of-fokus oplysninger kan undgås ved forskellige tilgange såsom matematiske algoritmer (f.eks. Udfoldning), optisk design (f.eks konfokal laser scanning mikroskopi) eller en kombination af begge (f.eks struktureret belysning).
For at inducere defekter i nyre udvikling anvendte vi en antisense MO mod wt1a der blev injiceret i en transgen zebrafisk linje (Tg (wt1b: GFP)). Denne linje viser GFP-fluorescens i glomerulus, hals og den forrestedel af tubulus 9,10. I forhold til mere komplekse opsætninger til tidsforskudte optagelser med optisk sektionering såsom laserscanning eller lys ark mikroskoper, en zoom-mikroskop er let at håndtere og billigere. Desuden kan udstyr til struktureret belysning nemt kombineres med konventionelt fluorescens udstyr (f.eks fluorescens lampe, filtre) og tilbyder dissektionsmikroskop-specifikke fordele, såsom en længere arbejdsafstand og stort synsfelt. Problemer med afdrift blev løst uden brug af ekstra udstyr (klimakammer, anti-vibration tabel) normalt kræves for stabile resultater. For at korrigere for fokal drift en autofokus strategi blev etableret og billedbehandling kamre med præget flytning gitre blev udnyttet til at re-justere placeringen efter et skred i x eller y retning.
I denne procedure kan også anvendes til mikroskoper uden optiske sektionsopdelingen muligheder, såsom fluorescens stereo microscopes og tilbyder et alternativ til mere komplekse udstyr, der normalt bruges til tidsforskudt optagelse af udviklingslandene væv og orgel dynamik.
Protocol
Alle eksperimenter dyr blev udført i overensstemmelse med de »Principper for laboratoriedyr pleje" samt til den aktuelle version af den tyske lov om beskyttelse af dyr.
1. Fremstilling af antisense-morpholino (MO)
- Til fremstilling af en 3 mM MO stamopløsning tilsættes 100 pi sterilt, ultrarent vand til den frysetørrede MO (300 nmol i hætteglas). For fuldstændig opløsning opvarmes stamopløsningen til 65 ° C i 5 min. Forsegle hætteglasset med Parafilm og opbevar MO stamopløsning ved stuetemperatur (RT). Må ikke chill MO stamopløsningen, fordi det kan medføre en forening af MO med hætteglasset vægge.
- Der fremstilles en 1 mM MO arbejdsopløsning ved at fortynde MO stamopløsningen med sterilt, ultrarent vand og tilsæt 0,5% phenolrødt opløsning til en slutkoncentration på 0,05%.
- For at få 10 pi af en MO arbejder løsning, tilsættes 3,3 pi MO stamopløsning og 1 pi 0,5% phenol-rød opløsning til 5,7 pi vand. Værederfor fremstilling af en ny batch af arbejdsopløsning opvarme MO stamopløsningen til 65 ° C i 5 min.
- Før anvendelse centrifugeres MO arbejder løsning for at forhindre tilstopning af nålen. For eksempel dreje 10 pi MO stamopløsning ved 15.000 xg i 5 min (RT) og fjern 8 pi af supernatanten til injektion.
BEMÆRK: Tab af aktivitet kan forekomme i morpholino løsninger over tid 11. For at udelukke dette, kan man teste løsninger ved UV spektrometri følge protokollen leveret af producenten. I tilfælde af de anvendte wt1a morpholino en reduceret virkning ikke er blevet observeret over en lang periode med opbevaring (3 mM arbejder opløsning blev opbevaret længere end en år).
2. Opsætning Parring Par og Indsamling af befrugtede æg
- Eftermiddagen før mikroinjektion, oprettet fem par Tg (wt1b: GFP) linje, hver i en avl beholder udstyret med en aftagelig si at adskillehanner og hunner i løbet natten.
BEMÆRK: For at sikre, at der nok æg er tilgængelige for en vellykket injektion eksperiment, fisk, der anvendes som parring par skulle have været præ-screenet og vurderet som gode "producenter". - Den næste morgen, efter lysene tændes, sætte den mandlige og kvindelige sammen over sigten, der forhindrer fisken i at spise deres æg.
- Se gydning. Når en mængde af æg lægges der kan injiceres før 4-celle stadiet er nået (ca. 50), separat mand fra kvindelig igen. Overfør æggene med en Pasteur-pipette i en petriskål fyldt med embryo vand til en første runde af injektion. For at få yderligere runder af æg, placere en parring par sammen og separat flere gange.
3. forberedende arbejde for Mikroinjektion
BEMÆRK: Udfør trin 3.1 og 3.2 på forhånd.
- For at forberede en skål, der holder embryoner i position under injektionen (mikroinjektion parabol) indsætte en glass objektglas ved en 40-45 ° vinkel ind i en 94 mm petriskål fyldt med væske, transparent, ren, fødevarekvalitet silicium. Fjern slæden når silicium er hærdet. Som frembringer en rille i siliciumlag.
BEMÆRK: Alternativt kan du bruge 1,5-3% agarose i stedet for silicium og gemme fadet ved 4 ° C. - Generere injektionsnåle fra glaskapillarer med en nål aftrækker.
- Brug kapillærer, der indeholder interne filamenter.
BEMÆRK: Filamentet vil bidrage til at transportere MO opløsning mod spidsen af nålen efter opfyldning (se 3.3). - Etablere passende indstillinger på nålen aftrækker. Gode nåle til injektion i zebrafisk skal have lange og tynde tips 12. Generer tips med en længde på ca. 10 mm og en diameter på 1,5-2 um ved meget deres ende. For eksempel bruger en vandret nål aftrækker med følgende indstillinger: Varme = 330, Pull = 0, Velocity = 40, Time = 100.
- Undersøge kvaliteten af nålene under endissektionsmikroskop og ordne dem med korte eller for lange tip.
BEMÆRK: Nåle med korte tips tendens til at beskadige embryoet mens sådan med meget lange og tynde tips bøje ved berøring af chorion og ikke trænge ind i det.
- Brug kapillærer, der indeholder interne filamenter.
- Efterfylde nålen med 2 pi MO arbejdsopløsning ved at anvende en microloader spids og indsætte det i nålen indehaveren af mikroinjektion apparat.
- Da nåle er lukket på spidsen ende, generere en åbning ved at knibe tilbage i slutningen af nålen med skarpe pincet under dissektion mikroskop. Alternativt kan den mikroinjektion apparat til forsigtigt at skubbe spidsen til en stiv overflade (f.eks. Lille metal blok eller bagsiden af en pincet).
- Kalibrere injektionsvolumen ved injektion af MO arbejdsopløsning i en dråbe mineralolie anbringes på en gradnet. Justere varigheden af injektionen til fremstilling af en dråbe diameter på 75 um til opnåelse af et injektionsvolumen på ca. 200 pl.
- Arrangere 1-celle embryoer langs rillen på mikroinjektion skål med vegetabilske pol mod retningen, hvorfra nålen kommer (mod 45 ° vinkel af rillen).
- Perforere chorion og blommen med nålen og injicere 200 pl af 1 mM MO arbejdsopløsning (0,2 pmol) i blommen af 1- til 2-celle embryoer.
- Ved hjælp af en Pasteur-pipette med en bred åbning, samle alle de injicerede embryoner i en petriskål fyldt med embryo vand og inkubere dem ved 28,5 ° C.
- Om eftermiddagen, fjerne døde embryoer ved hjælp af en Pasteur-pipette med en bred åbning og erstatte embryo vand.
5. Fremstilling af embryoer til in vivo-afbildning
- Den næste morgen, udskifte embryo vand med embryo vand indeholdende 0,003% N-phenylthiourinstof (PTU) til at hæmme melanin. Påfør ikke PTU inden udgangen af gastrulation fordi det Interferes med tidlig fosterudvikling.
ADVARSEL: PTU er giftigt og teratogent. Brug handsker på alle tidspunkter og undgå indånding og kontakt med huden. - Dechorionate embryoner med skarpe pincet under et dissektion mikroskop på det ønskede udviklingsstadiet. Grab chorion med én pincet og forsøge at fange den anden side af chorion med en anden pincet. Træk forsigtigt pincetten i modsatte retninger uden at forstyrre embryoet.
- Bedøver embryoet ved at erstatte embryo vand indeholdende PTU (0,003%) med embryo vand indeholdende PTU (0,003%) og 0,02% ethyl-3-aminobenzoat-methansulfonat (tricaine).
- Integrer embryo i lavt smeltende agarose på en dækglas-bund μ-skål med en 50 um udflytning gitter. Korrekt indlejring kræver lidt øvelse.
- Forbered 1 ml portioner af 0,7% agarose i 1,5 ml reagensglas og læg dem på en varme blok indstillet til 36 ° C. Brug en Pasteur-pipette med bred åbning til transfer embryonet til μ-fad. Fjern overskydende embryo vand med en Pasteur-pipette med ultra-tynde spids og overlay embryo med hærdet agarose.
- Mens agarose er stadig flydende, orientere embryo med to gel loader tips i den ønskede position med hensyn til strukturen af interesse samt afstanden til udflytning nettet. Placer strukturen af interesse (her de pronephros) så tæt som muligt på glasbund (her: dorsal ned) og i tæt nærhed til nettet.
- For optimal billedkvalitet minimere agarose lag mellem embryonet og glas bunden ved at placere strukturen af interesse af embryoet så tæt som muligt på bunden. Ud over, at lokalisere embryo i tæt nærhed til nettet, men passe på, at gitteret ikke overlay med strukturen af interesse. Integrer 3-4 embryoner i forskellige u--retter hver og bruge den, der er placeret bedst.
- Når agarosen er hårdt nok til at holde embryo vente 2-3 Min og overlay den integrerede foster med embryo vand indeholdende 0,003% PTU og 0,02% tricaine. Dekanteres overskydende embryo vand eller fjerne det ved hjælp af en Pasteur-pipette med ultra-tynde spids. Luk låget af μ-fad ved låst position for at forhindre fordampning.
BEMÆRK: Undgå forekomsten af luftbobler i μ-fad, som de ville forringe billedet optagelse.
6. Microscopy
BEMÆRK: Brug et mikroskop udstyret til optisk sektionering via struktureret belysning. Optag billeder med en software, som indeholder følgende moduler: Multikanal, Z-Stack, Time Series, Software autofokus og udvidet fokus.
- Erhvervelse af Z-stakke
- Vend μ-fad. Den glasbund nu vender mod målet og μ-fad tjener som en imaging kammer.
- Slå skyderen i nettet position og aktivere struktureret belysning mode i software kontrol.
- Kalibrergitteret fokus for kanal (er) af valg med prøven, der skal undersøges (indlejret embryo) ved at følge anvisningerne i Calibration Wizard Focus.
- Aktiver z-Stack dataopsamling og sæt den til midten tilstand. Fokus ind i midten af prøven og angive det som midterplan z- stakken ved at klikke Center. Sætte dimensionen af Z-stakken ved at definere området omkring midterstillingen.
BEMÆRK: objektstruktur skal ikke ses skarpt uden for den første og den sidste plan z-stakken. - Justere afstanden mellem de optiske sektioner. For bedst z-opløsning ved at klikke på Optimal knappen. Baseret på mål dybdeskarpheden softwaren vil sætte en anbefalet afstand efter Nyquist kriterium (50% overlap).
BEMÆRK: Hvis sigter efter mindre filstørrelser og strukturen tillader det, sætte en større afstand størrelse manuelt. Indstilling mindre trin end anbefalet, vil blot resultere i større filstørrelser uden at øge senereal information.
- Time-lapse Imaging
- Åbn Time Series værktøj og indstille intervallet af tidsserien eksperimentet. For eksempel optage z-stack billeder hver 30 min over et tidsrum på 5 timer.
- For at korrigere for fokal afdrift over tid, oprette en autofokus-strategi. Tjek dialogboksen Focus strategi, vælg Software Autofokus fra drop-down listen og vælg TL-Lysfelt kanal som reference kanal.
- Start hvert tidspunkt med autofokus. For at sikre en pålidelig søgeområde inden en optimeret tidsramme, indstilles en fast 200 um relativ søgeområde. Denne serie er fuldt scannet (Range Dækning parameter) med grundlæggende kvalitet (Quality parameter) i en maksimal trin størrelse (Sampling parameter).
- For at øge præcisionen af autofokus, aktivere måling inden for et fokus område af interesse (fokus ROI) og position sagde fokus ROI i live view vindue omkring strukturen af interesse.
BEMÆRK: Hvissystemet mangler Software autofokus modul, der opdaterer center z-position automatisk under tidsforskudt optagelse, pause eksperimentet på et givet tidspunkt og justere fokus manuelt og fortsætte eksperimentet. - For at kompensere for en potentiel xy-drift i løbet af tidsserier optagelse, placere et bestemt punkt i påtrykt nettet (af imaging kammer) i sigtekornet af softwaren og gemme positionering ved at lave et skærmbillede.
- Start tidsserien eksperimentet. Før tidsserien interval er ovre, pause eksperimentet og om nødvendigt, re-justere positionering efter skærmbilledet. Fortsæt med eksperimentet.
7. Billedbehandling
- Skift til fanen behandling og vælg den udvidede dybdeskarphed (EDF) i dialogboksen Method. Da optiske sektioner er erhvervet, anvende den maksimale projektion algoritme til billedet serien.
BEMÆRK: Her vil algoritmen projicere brightest eller den mørkeste pixel fra stakken til en sammensat 2D-billede i et første trin og til sidst bruge den med den højeste varians som følge billede for hvert tidspunkt. - Brug Movie Export metode til at skabe en tidsforskydning film (f.eks avi eller flytte fil) ud af EUF billedserier.
Representative Results
Time-lapse mikroskopi er en kraftfuld teknik til at se dynamiske biologiske processer over en længere periode. En ofte forekommende problem under tidsforskudt imaging er en bevægelse i x, y eller z-retningen, kaldet afdrift, som er fremkaldt af temperatursvingninger og mekaniske vibrationer. Metoden præsenteres her muliggør tidsforskudt optagelse af fluorescens-mærkede strukturer i zebrafisk embryoner eller larver på et dissektionsmikroskop uden klimakammer og anti-vibration bord.
For kompensation af xy-drift, blev prøven indlejret i en imaging kammer med et påtrykt udflytning gitter (figur 1). Placeringen af et bestemt punkt af nettet i forbindelse med sigtekornet af softwaren værktøjet blev brugt til at returnere enheden til pre-justeret position (figur 2A). De præsenterede resultater blev opnået ved anvendelse af en zoom mikroskopmed en integreret skyderen til optisk sektionering via struktureret belysning (figur 2B). Til kontinuerlig omdrejningspunkt korrektion blev en autofokus strategi etableret. I denne strategi, er softwaren autofokus bruges til at finde fokus baseret på maksimal kontrast før hver tidspunkt. Dette således defineret brændplanet efterfølgende sat som center plan for z-stak erhvervelse. For at minimere fototoksicitet i prøven, er det lysfeltmikroskopi kanal, der anvendes som reference kanal som den tillader tilstrækkelig kort eksponeringstider under autofokus trin (figur 2C).
Metoden blev anvendt til sammenlignende analyse af nyre udvikling i kontrol- og wt1a morphant embryoner af en transgen zebrafisk linje (Tg (wt1b: GFP)). I den tidlige nephrogenesis denne linje viser grøn fluorescens i den mellemliggende mesoderm blev nyre stamfædre skyldes 9,10 og senerei de formende tubuli og nephron primordier (figur 3).
Time-lapse billedoptagelse afslører, at nephrogenesis i kontrol morpholino injicerede embryoner er uændret i forhold til ikke-injicerede dem (resultater ikke vist) og følger de beskrevne trin i tidlig zebrafisk nyre udvikling 3. Ved 20 HPF udviklingslandene pronephric tubuli er synlige og ved deres forreste tips, kan påvises sfæriske ophobninger af celler, der repræsenterer de danner nephron primordier. I løbet af de næste timer, tubuli og nephron primordier vokse og senere på primordier begynder at smelte på midterlinjen (figur 4, video 2). I modsætning hertil er nephrogenesis alvorligt forstyrret i wt1a morphant embryoer. Selvom GFP-positive rørformede strukturer er synlig ved 20 HPF, de synes at være mere diffuse og mindre udviklet. Desuden har ingen ordentlig nephron primordier blevet dannet. Den mest slående forskel til than styre embryoner på dette tidspunkt imidlertid er fremkomsten af et stort antal fluorescerende celler uden udviklingslandene pronephros (Figur 4, video 2). Efterfølgende disse celler forlader pronephric felt og migrere ventralt (video 2).
Nyre udvikling i kontrol embryoner og wt1a morphants af wt1b transgene linje er tidligere blevet sammenlignet ved at tage billeder på forskellige faste tidspunkter 9,10. I modsætning til denne statiske metode, tidsforskudt optagelse gør det muligt at følge dynamikken i normal nephrogenesis og misrouting af nyre stamceller forårsaget af wt1a udtynding.
Figur 1: Skematisk illustration af en Embedded Embryo i en kommercielt tilgængelig Chamber med Relocation Grids. Fadet harfire gitre, hver underopdelt i en gentagelse afstand på 50 um, præget ind i et dækglas bund. Den embryo, der skal afbildes er indlejret på hovedet, med nyre struktur i umiddelbar nærhed af en observation firkantet men uden overlejring med gitteret. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2:. Regulering for Aflønning af Drift i Time-lapse Imaging og Grid Fremskrivning af Struktureret Illumination En særskilt stilling flytningen gitteret blev bragt ind i billedet centrum (markeret med gule sigtekornet) og tjener som et referencepunkt for senere xy-tilpasning i tilfælde af små forskydninger. Den røde rektangel repræsenterer regionen af interesse (ROI), der anvendes i autofokus strategi (A). Optiske sektionsopdelingen waS opnået ved struktureret belysning. Billedet viser et gitter struktur projiceret i fokusplanet efter korrekt kalibrering (B). Den ROI for autofokus strategi (rød rektangel) er indstillet til at dække markante embryonale strukturer højt kontrast (her somitter), der tillader pålidelig autofokusering i strukturen af interesse (C). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Transgene wt1b:. GFP Embryoner med grøn fluorescens i Udvikling Nyre Overlays af dorsal (A) eller lateral (B) transmission og fluorescens billeder vises med forreste til venstre. np, nephron primordium; pt, pronephric tubulus; så såmide. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Knockdown af wt1a forstyrrer Embryonale Nyre Development repræsentant udvidet dybdeskarphed billeder fra tidsforskudte optagelser.. I kontrol morpholino injicerede embryoner, viser nyre udvikling normal fremskridt med voksende tubuli og nephron primordier som begynder at smelte ved midterlinjen. I modsætning hertil wt1a morphants undlader at danne ordentlig nephron primordier og en massiv mængde af GFP-positive celler er uden for pronephric felt. (np, nephron primordium, pt, pronephric tubulus). Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplemental Video 1. Time-lapse optagelse af normal nyre udvikling i kontrol morpholino injicerede embryoner. (Højreklik for at downloade). Videoen viser, hvordan tubuli vokse og nephron primordier begynder at smelte. Starter ved 20 HPF blev billeder taget i 30 minutters intervaller over en periode på 5 timer.
Supplerende Video 2. Time-lapse optagelse af forstyrret nephrogenesis i wt1a morphant embryoer. (Højreklik for at downloade). Videoen viser migreringen af GFP-positive celler ud af pronephric region. Starter ved 20 HPF blev billeder taget i 30 min intervaller over en periode på 5 timer.
Discussion
Zebrafisken er blevet en populær model organisme til studier af hvirveldyr udvikling og modellering af sygdomme hos mennesker. Fordi zebrafisk embryoner forbliver transparente, kan udvikle organer som hjerne og hjerte observeres ved anvendelse af en standard præparat mikroskop. Drage fordel af transgene linjer med orgel specifik fluorescens giver vurderinger af organogenese hele forskellige udviklingsstadier i levende embryoner ved fluorescens mikroskopi. En begrænsning til billeddannelse strukturelle detaljer i hele organer med standard epifluorescens mikroskopi er virkningen af signaler fra objekter over og under fokusplanet. Denne ude-af-fokus lys ikke kun resulterer i nedsat billede kontrast og opløsning, det også kan skjule vigtige strukturer af interesse 13,14. Adskillige teknikker såsom laserscanning confocal-, spinning disk confocal- eller multifoton mikroskopi er blevet udviklet til at minimere ude af fokus information og dermed i stigendee billedets kontrast samt aksial opløsning. En alternativ metode til at opnå optiske sektioner er laser- og scanning fri struktureret belysning mikroskopi, et bredt felt baseret belysning teknik, der er og enkel at gennemføre på en regelmæssig mikroskop 15. Resultaterne præsenteres her illustrerer, at optisk sektionering, opnås ved struktureret belysning, gennemføres på et dissektionsmikroskop og kombineret med rekonstruktion af udvidede fokus billeder, muliggør visualisering af strukturelle detaljer i normal og forstyrret nyre udvikling i zebrafisk. Især er de GFP-positive celler i wt1a morphants dispergeret ved forskellige fokale dybder, og billeder af kun et plan med fokus sløre out-of-undervurdering af den tredimensionelle kompleksitet fænotype.
For at følge dynamikken i orgel organisation, omlejring eller forstyrrelser, tidsforskudt fluorescensmikroskopi er en kraftfuld omend kompleks teknik. Under time-lapsebilledbehandling små vibrationer eller temperatursvingninger mindre forårsager driver i x, y eller z retning. Dette kræver ekstra udstyr (klimakammer, anti-vibration tabel) for at opnå stabile resultater. Den præsenterede metode bruger evne et dissektionsmikroskop med en motoriseret fokus drev til optagelse time-lapse billeder uden ekstra enheder. For at opretholde en stabil fokus, blev en autofokus strategi etableret og en flytning gitter præget ind i bunden af afbildningskammeret blev anvendt til korrektion af x, y-ustabilitet.
Korrekt indlejring af embryo er et afgørende skridt i protokollen. Der er behov for nogle praksis at placere strukturen af interesse så tæt som muligt på glasbund og i tæt nærhed til nettet uden overlejring med det.
Den største fordel ved metoden er, at det er en overkommelig og simpelt værktøj til direkte observation af udviklingsmæssige processer såsom vækst og migration i levendeembryoner over flere timer. Desuden dissektion mikroskop-specifikke fordele såsom stort synsfelt og udvidet arbejdsafstand lette undersøgelse af større prøver, herunder hele organer. har dog nogle begrænsninger, der skal holdes for øje. Pause af eksperimentet for at kontrollere og justere positioneringen gør proceduren tidskrævende og fraværet af en robust styring temperaturændringer "standard" udviklingsmæssige tidspunkt, der er defineret som timer efter befrugtning ved 28,5 ° C i zebrafisk 16. Et andet potentielt problem er den begrænsede dybde af billeddannelse i dyr, især når strukturen af interesse er placeret inde i embryoner eller larver. En sådan struktur er den zebrafisk pronephric glomerulus, som ligger mellem de somitter og blommesækken. Den begrænsende dybde til afbildning glomerulus viste sig at være omkring 200 um, en afstand, der nås efter 5 dages udvikling. Derimod fluorescerende strukturer, der er located tættere på overfladen af dyret kan afbildes i længere tid. For eksempel leverceller er tilgængelige for billedbehandling i hvert fald indtil 9 dpf. En yderligere begrænsning er, at langsigtet immobilisering af embryo eller larver i agarose og tricaine behandling fremkalde vækst retardering og hjerte-ødem, hhv. Da dette kan forstyrre normal udvikling, anbefales det at begrænse varigheden af tidsforskudt optagelse til en bestemt periode af interesse. At sikre, at der under billeddannelse strukturer af interesse udvikle sig normalt er det nyttigt at sammenligne (i slutningen) det generelle udseende med den af et dyr holdes under samme forsøgsbetingelser men uden indlejring og bedøvelse.
Optagelse af en z-stak af optiske sektioner hver 30 minutter over en periode på 5 timer og efterfølgende beregning af udvidet dybdeskarphed billeder leveres rumlige og tidsmæssige oplysninger om tidlige begivenheder i normal og forstyrret nyre udvikling, der blev induceret by morpholino-medieret knockdown af wt1a. Tidligere udførte morpholino knockdown forsøg har allerede vist, at Wt1a opfylder en tidlig og væsentlig rolle i pronephros dannelse In situ hybridisering med nyre markør 17,18 og beskæftigelse af transgene wt1b:. GFP linje for billeddannende pronephros udvikling på fast tidspunkt peger 9,10 afsløret at wt1a mangel resulterer i forstyrret glomerulær morfogenese og mislykkedes podocyte specifikation. I modsætning til disse statiske tilgange, tidsforskudte optagelser direkte visualisere dynamikken i tidlig nephrogenesis i kontrolrum embryoner og migration af GFP-positive celler fra pronephric region wt1a morphants. Muligheden for at spore misrouted celler over tid giver en mere detaljeret fænotype-analyse.
Generelt er fremgangsmåden, der er præsenteret her tilvejebringer en billig og nem at bruge alternativ til komplekset, og mindre tilgængelig SEtups normalt anvendes til time-lapse billeddannelse såsom laser scanning mikroskop (udstyret med en miljømæssig kammer og anti-vibration tabel) eller lys ark mikroskop. Den beskrevne rutine til at fastsætte afdrift problemer kan også anvendes til at udføre time-lapse billeder på opsætninger uden optiske sektionsopdelingen muligheder, såsom fluorescens stereo mikroskoper.
Teknikken er ikke kun egnet til at undersøge nyre udvikling, men kan også anvendes for at følge normale og defekte morfogenese af andre organer, såsom hjerte og lever. Endvidere kan fremgangsmåden anvendes til at observere forskellige mere dynamiske processer i embryonal og voksen modelorganismer såsom sårheling eller regenerering.
Disclosures
Forfatteren Michael Graf er ansat i Carl Zeiss Microscopy GmbH, der producerer instrumenter i denne artikel.
Acknowledgments
Vi takker Thomas Bates for kritisk læsning og forbedre manuskriptet. Vi takker også Christina Ebert og Sabrina Stötzer for fisk vedligeholdelse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Control Morpholino | Gene tools, LLC | Standard control oligo | Prepared control oligo |
| wt1a Morpholinos | Gene tools, LLC | customized | Designted to target the first splice donor site, sequence as published in Ref. 9 |
| 0.5% Phenol red solution | Sigma | P0290 | Injection tracer |
| peqGOLD universal agarose | peqlab | 35-1020 | To prepare microinjection dish |
| Glass capillaries (GC100F-10) | Hugo Sachs Elektronik | 30-0019 | To generate injection needles |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | To load the microinjection needle |
| Dumont forceps | Fine Sience Tools | 91150-20 | To generate an opening at the needle tip |
| Embryo water (0.3x Danieaus´ solution) | 1x: 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4, 0.6 Ca(NO3)2, 5 mM HEPES, pH: 7,5; Do not add methylene blue! | ||
| Graticule 5 mm/0.05 mm | Science Services | PY68039-02 | For calculation of injection amount |
| Pasteur pipette 137 mm, 4.8 ml | Roth | E305.1 | To collect eggs, to transfer embryos and to remove dead embryos |
| Pasteur pipette with ultra-thin tip 157 mm, 3.5 ml | Roth | E304.1 | To remove excess of water |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma | P7629 | For suppression of melanization |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma | E10521 | To anethesize zebrafish |
| Low melting agarose | Biozym | 850111 | For embedding |
| µ-dish 35 mm, high Glass Bottom Grid-50 | ibidi | 81148 | Imaging chamber |
| Gel loader tips | Hartenstein | GS05 | To orient the embryo for proper embedding |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Micropipette puller (model P-97) | Sutter Instrument | To generate injection needles | |
| Micromanipulator | Saur Laborbedarf | For microinjection | |
| Thermomixer copact | Eppendorf | Thermoblock for tempering the low melting agarose | |
| SZ61 (Stereomicroscope) | Olympus | For injection control | |
| Axio Zoom. V16 | Zeiss | For embedding and imaging | |
| ApoTome.2 slider | Zeiss | For optical sectioning | |
| AxioCam MRm | Zeiss | For image acquisition | |
| ZEN 2012 | Zeiss | Imaging software |
References
- Lieschke, G. J. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Drummond, I. A. Kidney development and disease in the zebrafish. J Am Soc Nephrol. 16 (2), 299-304 (2005).
- Drummond, I. A., et al. Early development of the zebrafish pronephros and analysis of mutations affecting pronephric function. Development. 125 (23), 4655-4667 (1998).
- Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3 (10), 1922-1938 (2007).
- Kramer-Zucker, A. G., Wiessner, S., Jensen, A. M., Drummond, I. A. Organization of the pronephric filtration apparatus in zebrafish requires Nephrin, Podocin and the FERM domain protein Mosaic eyes. Dev Biol. 285 (2), 316-329 (2005).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation. Kidney Int. 73 (10), 1120-1127 (2008).
- Kreidberg, J. A., et al. Wt-1 Is Required for Early Kidney Development. Cell. 74 (4), 679-691 (1993).
- Bollig, F., et al. Identification and comparative expression analysis of a second wt1 gene in zebrafish. Dev Dyn. 235 (2), 554-561 (2006).
- Perner, B., Englert, C., Bollig, F. The Wilms tumor genes wt1a and wt1b control different steps during formation of the zebrafish pronephros. Dev Biol. 309 (1), 87-96 (2007).
- Schnerwitzki, D., et al. Alternative splicing of Wilms tumor suppressor 1 (Wt1) exon 4 results in protein isoforms with different functions. Dev Biol. 393 (1), 24-32 (2014).
- Bedell, V. M., Westcot, S. E., Ekker, S. C. Lessons from morpholino-based screening in zebrafish. Brief Funct Genomics. 10 (4), 181-188 (2011).
- Rembold, M., Lahiri, K., Foulkes, N. S., Wittbrodt, J. Transgenesis in fish: efficient selection of transgenic fish by co-injection with a fluorescent reporter construct. Nat Protoc. 1 (3), 1133-1139 (2006).
- Conchello, J. A., Lichtman, J. W. Optical sectioning microscopy. Nat Methods. 2 (12), 920-931 (2005).
- Jensen, E. C. Types of imaging, Part 2: an overview of fluorescence microscopy. Anat Rec (Hoboken). 295 (10), 1621-1627 (2012).
- Chasles, F., Dubertret, B., Boccara, A. C. Optimization and characterization of a structured illumination microscope. Opt Express. 15 (24), 16130-16140 (2007).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Hsu, H. J., Lin, G., Chung, B. C. Parallel early development of zebrafish interrenal glands and pronephros: differential control by wt1 and ff1b. Development. 130 (10), 2107-2116 (2003).
- O'Brien, L. L., et al. Wt1a, Foxc1a, and the Notch mediator Rbpj physically interact and regulate the formation of podocytes in zebrafish. Dev Biol. 358 (2), 318-330 (2011).
