Summary
Il metodo descritto qui permette l'analisi time-lapse di sviluppo degli organi in embrioni di zebrafish utilizzando un microscopio a fluorescenza dissezione in grado di eseguire sezionamento ottico e semplici strategie di riadattamento per correggere la deriva focale e planare.
Abstract
Per comprendere organogenesi, le alterazioni spaziali e temporali che si verificano durante lo sviluppo dei tessuti devono essere registrati. Il metodo descritto qui permette l'analisi time-lapse di sviluppo normale e compromessa rene in embrioni di zebrafish utilizzando un microscopio a fluorescenza dissezione attrezzata per l'illuminazione strutturata e acquisizione z-stack. Per visualizzare nefrogenesi, zebrafish transgenico (Tg (wt1b: GFP)) strutture del rene con fluorescente sono stati utilizzati. Difetti renali sono stati innescati da iniezione di un oligonucleotide antisenso morfolino contro il Wilms gene del tumore wt1a, un fattore noto per essere cruciale per lo sviluppo del rene.
Il vantaggio del setup sperimentale è la combinazione di un microscopio dello zoom con strategie semplici per i movimenti ri-regolazione in direzione X, Y o Z senza apparecchiature aggiuntive. Per aggirare drift focale che è indotto da variazioni di temperatura e vibrazioni meccaniche, Una strategia autofocus stata applicata invece di utilizzare una camera ambientale normalmente richiesta. Al fine di ri-regolare i cambiamenti di posizione a causa di una xy-drift, sono state impiegate le camere di imaging con griglie di trasferimento impressa.
In confronto a configurazioni più complesse per la registrazione time-lapse con sezionamento ottico come la scansione laser confocale o microscopi foglio di luce, un microscopio zoom è facile da maneggiare. Inoltre, offre dissezione benefici specifici del microscopio come l'elevata profondità di campo e una distanza di lavoro prolungato.
Il metodo per studiare organogenesi qui presentata può essere utilizzato anche con microscopi a fluorescenza stereo non in grado di sezionamento ottico. Anche se limitata per high-throughput, questa tecnica offre un'alternativa ai mezzi più complessa che viene normalmente utilizzato per la registrazione time-lapse di tessuti in via di sviluppo e le dinamiche di organi.
Introduction
A seguito di gastrulazione, organogenesi è la prossima fase del ciclo di vita di un individuo. Esso comporta il riarrangiamento, interazione e molto spesso la migrazione di cellule a produrre tessuti e organi. Inaccuratezza nei processi alla base dello sviluppo di organi porta spesso a malattie che possono manifestarsi immediatamente o anche più tardi nella vita. Pertanto, la comprensione organogenesi è stato un grande sforzo in biologia dello sviluppo e della ricerca biomedica. Per essere in grado di esaminare lo sviluppo di un particolare organo, deve essere visibile anche attraverso la parete del corpo dell'embrione. Ciò consente la registrazione delle alterazioni spaziali e temporali che si verificano durante lo sviluppo. Inoltre al fine di analizzare l'importanza dei fattori coinvolti nella organogenesi, deve essere suscettibile di manipolazione.
Un organismo che è estremamente adatto per l'indagine dell'organogenesi in vivo è zebrafish. La sua trasparenza durante lo sviluppo embrionale in combinazione con l'uso di linee transgeniche fluorescenti permette l'osservazione delle dinamiche di localizzazione proteine e di espressione, così come la visualizzazione degli organi interni 1. Ciò fornisce un vantaggio unico per quanto riguarda la ricerca di sviluppo degli organi in tempo reale rispetto ai modelli di mammiferi i cui organi sono inaccessibili per l'analisi microscopica. Inoltre, diversi strumenti sono disponibili per manipolare lo sviluppo embrionale di zebrafish. Accanto alla generazione di linee mutanti, oligonucleotidi antisenso morfolino (MO) possono essere utilizzati per abbattere l'attività di particolari geni che sono coinvolti nello sviluppo di certi organi. MO sia bersaglio di un sito giunzione o la traslazione codone di inizio (AUG), e quindi interferiscono con splicing del pre-mRNA o la traduzione.
Il rene embrionale zebrafish, i pronephros, è un modello anatomicamente semplice ma prezioso per studiare lo sviluppo dei reni e la funzione di generazionees legate a malattie renali 2. Si compone di due sole unità funzionali chiamate nefroni. Ogni nefrone è composto da un glomerulo dove filtrazione del sangue avviene 3. Ulteriori componenti sono regione del collo breve e tubulo segmentato per la secrezione e il riassorbimento di soluti e del condotto, che termina nella cloaca 4. Indipendentemente dalla sua composizione semplice, l'organizzazione ed i diversi tipi cellulari dei pronephros zebrafish sono molto simili al rene mammiferi 5,6.
Un fattore, che è criticamente coinvolta nello sviluppo del rene, è codificata dal gene soppressore del tumore di Wilms WT1 7. Zebrafish possiede due paraloghi chiamati wt1a e wt1b essere espresso in un modello identico sovrapposizione, ma non durante lo sviluppo dei pronephros 8. Utilizzando zebrafish transgenico con strutture Pronefro GFP-marcato, è stato dimostrato che la completa knock-down di wt1a </ em> o di una particolare forma di giunzione porta a malformazioni gravi o lievi del rene embrionale, rispettivamente 9,10.
Il metodo descritto qui permette l'analisi time-lapse di nefrogenesi normale e compromessa in embrioni di zebrafish utilizzando un microscopio a fluorescenza dissezione attrezzata per sezionamento ottico tramite l'illuminazione strutturata. sezioni ottiche in generale consentono l'acquisizione di immagini che contengono solo informazioni di messa a fuoco. Out-of-focus informazioni può essere evitato vari approcci, come algoritmi matematici (ad es. Deconvoluzione), design ottico (ad es confocale a scansione laser microscopia) o una combinazione di entrambi (per esempio illuminazione strutturata).
Per indurre difetti di sviluppo del rene abbiamo usato un antisenso MO contro wt1a che è stato iniettato in una linea di zebrafish transgenico (Tg (wt1b: GFP)). Questa linea mostra GFP-fluorescenza nel glomerulo, il collo e la parte anterioreparte del tubulo 9,10. In confronto a configurazioni più complesse per le registrazioni time-lapse con sezionamento ottico come la scansione laser o microscopi foglio di luce, un microscopio zoom è facile da gestire e meno costoso. Inoltre, Attrezzature per illuminazione strutturata può facilmente essere combinato con apparecchiature convenzionali di fluorescenza (ad esempio fluorescenza lampada, filtri) e offerte sezionare vantaggi specifici microscopio ad esempio una distanza di lavoro estesa e ampio campo visivo. I problemi con la deriva sono stati risolti senza l'utilizzo di ulteriori attrezzature (camera ambientale, tavolo anti-vibrazione) di solito necessari per ottenere risultati stabili. Per correggere la deriva focale è stata stabilita una strategia di messa a fuoco automatica e le camere di imaging con griglie di trasferimento impresse sono stati utilizzati per ri-regolare il posizionamento a seguito di una deriva in direzione xoy.
Il metodo proposto può essere applicato anche per microscopi senza opzioni sezionamento ottico, come la fluorescenza stereo microscopes e offre un'alternativa ai mezzi più complessa che viene normalmente utilizzato per la registrazione time-lapse di tessuti in via di sviluppo e le dinamiche di organi.
Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali sono state eseguite secondo i "principi della cura degli animali da laboratorio", nonché alla versione corrente della legge tedesca sulla protezione degli animali.
1. Preparazione di antisenso morfolino (MO)
- Per preparare una soluzione madre 3 mM MO, aggiungere 100 ml di sterili, acqua ultrapura al MO liofilizzato (300 nmol in flaconcino di vetro). Per completa dissoluzione, riscaldare la soluzione madre a 65 ° C per 5 min. Sigillare la fiala con Parafilm e conservare la soluzione di riserva MO a temperatura ambiente (RT). Non raffreddare la soluzione madre MO perché questo potrebbe causare una associazione del MO con le pareti della fiala.
- Preparare una soluzione di lavoro 1 mM MO diluendo la soluzione madre MO con sterile, acqua ultrapura e aggiungere la soluzione rossa 0,5% di fenolo ad una concentrazione finale di 0,05%.
- Per ottenere 10 ml di una soluzione di lavoro MO, aggiungere 3,3 ml di soluzione MO e 1 ml di soluzione di fenolo-rosso dello 0,5% a 5,7 ml di acqua. Esserefore preparazione di un nuovo lotto di soluzione di lavoro riscaldare la soluzione MO magazzino a 65 ° C per 5 min.
- Prima dell'uso, centrifugare la soluzione di lavoro MO per prevenire ago intasamento. Ad esempio, girare 10 ml di soluzione madre MO a 15.000 xg per 5 min (RT) e rimuovere 8 ml di surnatante per l'iniezione.
NOTA: La perdita di attività può verificarsi in soluzioni morpholino nel tempo 11. Per escludere questo, si può testare le soluzioni per spettrofotometria UV seguendo il protocollo fornito dal produttore. Nel caso dei wt1a utilizzati morfolino un'efficacia ridotta non è stato osservato per un lungo periodo di stoccaggio (3 soluzione di lavoro mM è stato immagazzinato per più di uno anno).
2. Configurazione di coppie di accoppiamento e la raccolta di uova fecondate
- Il pomeriggio precedente microiniezione, impostare cinque coppie del Tg (wt1b: GFP) di linea, ciascuna in un contenitore dotato di allevamento un setaccio rimovibile per separaremaschi e femmine durante la notte.
NOTA: per garantire che abbastanza uova sono disponibili per un esperimento di iniezione di successo, pesce utilizzato come coppie di accoppiamento avrebbe dovuto essere pre-screening e valutati come buoni "produttori". - La mattina seguente, dopo le luci si accendono, mettere il maschio e la femmina insieme sopra il setaccio che impedisce il pesce da mangiare le loro uova.
- Vedere la deposizione delle uova. Una volta che una quantità di uova vengono deposte che possono essere iniettati prima della fase 4 celle viene raggiunta (circa 50), maschio separato dal femminile di nuovo. Trasferire le uova con una pipetta Pasteur in una capsula di Petri riempita con acqua di embrioni per un primo giro di iniezione. Per ottenere ulteriori cicli di uova, posizionare una coppia di accoppiamento insieme e separati più volte.
3. Il lavoro preparatorio per microiniezione
NOTA: Eseguire i punti 3.1 e 3.2 in anticipo.
- Per preparare un piatto che contiene gli embrioni in posizione durante l'iniezione (piatto microiniezione) inserire un glass scivolo a un angolo di 40-45 ° in un piatto 94 millimetri Petri riempita di liquido, trasparente, puro, silicio di grado alimentare. Rimuovere la diapositiva quando il silicio è indurito. Ciò produce una scanalatura nello strato di silicio.
NOTA: In alternativa, utilizzare 1.5-3% agarosio al posto del silicio e memorizzare il piatto a 4 ° C. - Generare aghi da iniezione da capillari di vetro con un estrattore ago.
- Utilizzare capillari che contengono filamenti interni.
NOTA: Il filamento contribuirà a trasportare la soluzione MO verso la punta dell'ago dopo il riempimento (vedi 3.3). - Stabilire impostazioni appropriate sul estrattore ago. Buone aghi per l'iniezione in zebrafish dovrebbero avere punte lunghe e sottili 12. Generare punte con una lunghezza di circa 10 mm e un diametro di 1,5-2 micron al loro fine. Ad esempio, utilizzare un estrattore ago orizzontale con le seguenti impostazioni: Calore = 330, Pull = 0, velocità = 40, Tempo = 100.
- Esaminare la qualità degli aghi sottodissezione microscopio e risolvere quelli con punte corto o troppo lungo.
NOTA: Aghi con brevi punte tendono a danneggiare l'embrione, mentre tale con molto lunghi e sottili punte curva quando si tocca il corion e non penetrano esso.
- Utilizzare capillari che contengono filamenti interni.
- Backfill l'ago con 2 ml di soluzione di lavoro MO utilizzando una punta microloader e inserirla nel supporto dell'ago dell'apparato microiniezione.
- Poiché gli aghi sono chiusi alla fine della punta, generare un'apertura pizzicando indietro alla fine dell'ago con le pinzette taglienti al microscopio di dissezione. In alternativa, utilizzare l'apparato microiniezione per spingere delicatamente la punta di una superficie rigida (ad es. Blocco piccolo metallo o sul retro di una pinzetta).
- Calibrare il volume di iniezione per iniettare la soluzione di lavoro MO in una goccia di olio minerale collocato su un reticolo. Regolare la durata di iniezione per la produzione di un diametro goccia di 75 micron per ottenere un volume di iniezione di circa 200 pl.
- Disporre gli embrioni fase 1-cell lungo la scanalatura del piatto microiniezione con il polo vegetale verso la direzione da cui l'ago venga (verso l'angolo di 45 ° della scanalatura).
- Perforare il corion e il tuorlo con l'ago e iniettare 200 pl della soluzione 1 di lavoro mm MO (0,2 pmol) nel tuorlo di 1 a 2 embrioni di cellule.
- Usando una pipetta Pasteur con un'ampia apertura, raccogliere tutti gli embrioni iniettati in una capsula di Petri riempita con acqua embrione e incubare a 28,5 ° C.
- Nel pomeriggio, rimuovere gli embrioni morti utilizzando una pipetta Pasteur con un'ampia apertura e sostituire l'acqua dell'embrione.
5. Preparazione di embrioni per imaging in vivo
- La mattina seguente, sostituire l'acqua embrione con acqua embrione contenente 0,003% N-feniltiourea (PTU) per inibire melanizzazione. Non applicare PTU prima della fine del gastrulazione perché INTERFeres con sviluppo embrionale precoce.
ATTENZIONE: PTU è tossico e teratogeno. Indossare guanti in ogni momento e evitare l'inalazione e il contatto con la pelle. - Dechorionate gli embrioni con pinzette taglienti sotto un microscopio dissezione allo stadio di sviluppo desiderato. Afferrare il corion con una coppia di pinzette e cercare di afferrare l'altro lato del corion con una seconda coppia di pinzette. Estrarre con cautela le pinzette in direzioni opposte senza interrompere l'embrione.
- Anestetizzare l'embrione sostituendo l'acqua embrione contenente PTU (0,003%) con acqua embrione contenente PTU (0,003%) e 0,02% di etile metanosolfonato 3 aminobenzoate (Tricaine).
- Incorpora l'embrione a basso punto di fusione agarosio su un μ-piatto coverglass a fondo con una griglia di trasferimento di 50 micron. Una corretta inclusione richiede una certa pratica.
- Preparare 1 ml aliquote di 0,7% agarosio in provette da 1,5 ml e metterli su un blocco di calore impostato a 36 ° C. Utilizzare una pipetta Pasteur con ampia apertura a Trànsfer l'embrione per la μ-piatto. Rimuovere l'acqua di embrioni in eccesso con una pipetta Pasteur con punta ultra-sottile e sovrapporre l'embrione con agarosio temperato.
- Mentre l'agarosio è ancora liquido, orientare l'embrione con due punte gel caricatore nella posizione desiderata, per quanto riguarda la struttura di interesse e la distanza dalla griglia di trasferimento. Posizionare la struttura di interesse (qui i pronephros) il più vicino possibile al fondo di vetro (qui: dorsale giù) e nelle immediate vicinanze della griglia.
- Per una qualità di immagine ottimale minimizzare lo strato di agarosio tra l'embrione e il fondo di vetro posizionando la struttura di interesse dell'embrione il più vicino possibile al fondo. Oltre a ciò, individuare l'embrione nelle immediate vicinanze della griglia, ma fare attenzione che la griglia non si sovrapporrà con la struttura di interesse. Incorpora 3-4 embrioni in diverse μ-piatti ciascuno e utilizzare quello che è nella posizione migliore.
- Quando l'agarosio è difficile sufficiente per contenere l'embrione attesa per 2-3 Min e sovrapporre l'embrione embedded con acqua embrione contenente 0,003% PTU e 0,02% Tricaine. Decantare l'acqua in eccesso dell'embrione o rimuoverlo utilizzando una pipetta Pasteur con punta ultra-sottile. Chiudere il coperchio del μ-piatto nella posizione di bloccaggio per evitare l'evaporazione.
NOTA: evitare il verificarsi di bolle d'aria nel μ-piatto, come sarebbero compromettere la registrazione dell'immagine.
6. Microscopia
NOTA: utilizzare un microscopio dotato di sezionamento ottico tramite l'illuminazione strutturata. Registrazione di immagini con un software che contiene i seguenti moduli: multicanale, Z-Stack, serie temporali, Software autofocus e messa a fuoco estesa.
- Acquisizione di Z-stack
- Invertire la μ-piatto. Il fondo di vetro ora rivolta verso l'obiettivo e l'μ-piatto serve da camera di imaging.
- Spostare il cursore nella posizione di rete e attivare la modalità di illuminazione strutturata nei controlli software.
- Calibrarela messa a fuoco della griglia per il canale (s) di scelta con il campione da esaminare (embrione incorporato) seguendo le istruzioni della procedura guidata di calibrazione di messa a fuoco.
- Attivare la modalità di acquisizione z-stack e impostarlo in modalità centro. Mettere a fuoco in mezzo al provino e impostarlo come il piano centrale della pila Z cliccando Center. Impostare la dimensione del z-stack definendo l'intervallo intorno alla posizione centrale.
NOTA: strutture oggetto non deve essere visto nettamente fuori il primo e l'ultimo piano della z-stack. - Regolare la spaziatura tra sezioni ottiche. Per la migliore z-risoluzione clic sul pulsante ottimale. Sulla base della profondità obiettivi di campo del software impostare una distanza raccomandata seguendo il criterio di Nyquist (50% di sovrapposizione).
NOTA: Se l'obiettivo per il file di dimensioni più piccole e dei permessi di struttura, impostare manualmente una dimensione più grande distanza. Impostazione passi più piccoli di quanto raccomandato si limiterà a portare a file di grandi dimensioni senza aumentare in seguitoinformazioni al.
- Time-lapse imaging
- Aprire lo strumento Time Series e impostare l'intervallo dell'esperimento serie storiche. Per esempio registrare le immagini z-stack ogni 30 min per un periodo di 5 ore.
- Per correggere la deriva focale nel corso del tempo, impostare una strategia di messa a fuoco automatica. Selezionare la casella di dialogo strategia di messa a fuoco, selezionare Software messa a fuoco automatica dall'elenco a discesa e scegliere il canale TL-Brightfield come canale di riferimento.
- Iniziare ogni punto del tempo con la messa a fuoco automatica. Al fine di garantire un intervallo di ricerca affidabile all'interno di un periodo di tempo ottimale, impostare un 200 micron relativo campo di ricerca fisso. Questa gamma è completamente scansionato (parametro raggio di copertura) con qualità di base (parametro di qualità) in una (parametro di campionamento) dimensione massima step.
- Per aumentare la precisione della messa a fuoco automatica, attivare la misurazione all'interno di una regione centro dell'interesse (messa a fuoco ROI) e la posizione di messa a fuoco, ha detto il ROI nella finestra di visualizzazione dal vivo intorno alla struttura di interesse.
NOTA: Seil sistema manca il modulo software Autofocus che aggiorna il centro z-posizione automaticamente durante la registrazione time-lapse, mettere in pausa l'esperimento in un dato momento e regolare la messa a fuoco manualmente e continuare l'esperimento. - Per compensare un potenziale XY-deriva durante la registrazione di serie temporali, posizionare un particolare punto della griglia impressa (della camera di imaging) in mirino del software e salvare il posizionamento facendo uno screenshot.
- Avviare l'esperimento serie storiche. Prima l'intervallo di serie temporale è finito, sospendere l'esperimento e, se necessario, ri-regolare il posizionamento in base alla schermata. Continuare con l'esperimento.
Processing 7. Immagine
- Passare alla scheda di elaborazione e selezionare la profondità estesa di messa a fuoco (FES) nella finestra di dialogo Method. Poiché sezioni ottiche vengono acquisiti, applicare l'algoritmo Maximum proiezione alla serie di immagini.
NOTA: Qui l'algoritmo proietterà il brightest o più scura pixel dalla pila a un'immagine composita 2D in una prima fase e poi utilizzare quello con la massima varianza immagine un risultato per ogni punto. - Utilizzare il metodo Film Export per creare un lasso di film di tempo (ad esempio avi o spostare file) fuori dalla serie di immagini FES.
Representative Results
Time-lapse microscopia è una tecnica potente per guardare processi biologici dinamici per un periodo di tempo più lungo. Un problema spesso si verificano durante time-lapse imaging è un movimento in direzione x, y oppure z, chiamato deriva, che è indotto dalle variazioni di temperatura e vibrazioni meccaniche. Il metodo presentato qui permette la registrazione di strutture fluorescente negli embrioni di zebrafish o larve su un microscopio da dissezione, senza camera ambientale e tavolo antivibrazione time-lapse.
Per la compensazione di xy-drift, il campione è stato incorporato in una camera di imaging con una griglia trasferimento impresso (Figura 1). La posizione di un punto particolare della griglia relative al puntatore del software è stato utilizzato per restituire l'esemplare alla posizione di pre-regolato (Figura 2A). I risultati presentati sono stati ottenuti utilizzando un microscopio zoomcon un cursore integrato per sezionamento ottico con illuminazione strutturata (Figura 2B). Per la correzione focale continua, è stata istituita una strategia di messa a fuoco automatica. In questa strategia, la messa a fuoco automatica software viene utilizzato per trovare la messa a fuoco sulla base di massimo contrasto prima di ogni punto di tempo. Questo piano focale così definito viene successivamente impostato come piano di centro per l'acquisizione z-stack. Per minimizzare fototossicità nel campione, il canale in campo chiaro luce trasmessa viene utilizzato come canale di riferimento in quanto consente tempi di esposizione sufficientemente brevi durante la fase di messa a fuoco automatica (Figura 2C).
Il metodo è stato applicato per l'analisi comparativa di sviluppo del rene negli embrioni morphant controllori e wt1a di una linea di zebrafish transgenico (Tg (wt1b: GFP)). Durante nefrogenesi all'inizio di questa linea mostra fluorescenza verde nel mesoderma intermedio, sono stati i progenitori renali derivano da 9,10 e più tardinei tubuli Formatura e nephron primordi (Figura 3).
Time-lapse registrazione delle immagini rivela che nefrogenesi nel controllo morpholino iniettato embrioni è inalterato rispetto a quelli uninjected (risultati non mostrati) e segue la procedura descritta di sviluppo iniziale del rene zebrafish 3. Al 20 HPF i tubuli in via di sviluppo pronephric sono visibili e alle loro punte anteriori, accumuli sferiche di cellule, che rappresentano la formazione nefrone primordi possono essere rilevati. Nel corso delle prossime ore, tubuli e primordi nefrone crescono e più tardi i primordi iniziano a fondere alla linea mediana (Figura 4, il video 2). Al contrario, nefrogenesi è gravemente perturbato negli embrioni wt1a morphant. Sebbene strutture tubolari GFP-positive sono visibili a 20 HPF, sembrano essere più diffusa e meno sviluppata. Inoltre, sono state formate non primordi nefrone corretto. La differenza più evidente a tsi controlla embrioni a questo punto di tempo, tuttavia, è la comparsa di un gran numero di cellule fluorescenti fuori delle pronephros sviluppo (Figura 4, video 2). Successivamente, queste cellule lasciano il campo pronephric e migrano ventrale (video 2).
Lo sviluppo del rene negli embrioni di controllo e morphants wt1a della linea transgenica wt1b essere stata precedentemente rispetto prendendo immagini in diversi momenti fisso 9,10. In contrasto con questo metodo statico, la registrazione time-lapse consente di seguire la dinamica di nefrogenesi normale e misrouting di cellule progenitrici renali causati dalla deplezione wt1a.
Figura 1: Schema Illustrazione di un embrione integrati in una camera reperibile in commercio con Relocation griglie. Il piatto haquattro griglie, ognuna suddivisa in una distanza di ripetizione di 50 micron, impresso in un fondo di vetro coprioggetto. L'embrione per essere ripreso è incorporato a testa in giù, con la struttura del rene in prossimità di una piazza di osservazione, ma senza sovrapposizione con la rete. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2:. Rettifiche per di compensazione della deriva in Time-lapse imaging e Grid Proiezione di illuminazione strutturata una posizione distinta della griglia di delocalizzazione è stato portato al centro dell'immagine (contrassegnate da mirino gialle) e serve come punto di riferimento per la successiva XY-allineamento in caso di piccoli spostamenti. Il rettangolo rosso rappresenta la regione di interesse (ROI) utilizzato nella strategia autofocus (A). wa sezionamento otticoS ottenuto dall'illuminazione strutturato. L'immagine mostra una struttura a griglia proiettata nel piano focale dopo corretto calibrazione (B). Il ROI per la strategia messa a fuoco automatica (rettangolo rosso) è impostato per coprire le strutture embrionali distintivi ad alto contenuto di contrasto (qui somiti) che permettono messa a fuoco automatica affidabile nella struttura di interesse (C). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: transgenico wt1b:. GFP embrioni con Green fluorescenza nel rene di sviluppo Sovrapposizioni di dorsale (A) o trasmissione laterale (B) e immagini di fluorescenza sono mostrati con anteriore a sinistra. np, nefrone primordium; pt, tubulo pronephric; così cosìacari. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Knockdown di wt1a provoca l'interruzione dello sviluppo embrionale del rene Rappresentante, la profondità estesa di immagini messa a fuoco da registrazioni time-lapse.. Nel controllo morpholino embrioni iniettati, lo sviluppo del rene mostra il progresso normale con tubuli in crescita e nefrone primordi che iniziano a fondere sulla linea mediana. Al contrario, morphants wt1a non riescono a formare una corretta primordi nefrone e una massiccia quantità di cellule GFP positive sono al di fuori del campo pronephric. (np, nefrone primordio, pt, tubulo pronephric). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa fifigura.
Supplemental Video 1. registrazione Time-lapse di sviluppo renale normale controllo morpholino embrioni iniettati. (Clic destro per il download). Il video mostra come tubuli crescono e primordi nefrone cominciano a fondersi. A partire da 20 HPF, immagini sono state prese in intervalli di 30 min per un periodo di 5 ore.
Supplemental Video registrazione 2. Time-lapse di nefrogenesi disturbato negli embrioni wt1a morphant. (Clic destro per il download). Il video mostra la migrazione di cellule GFP-positive dalla regione pronephric. A partire da 20 HPF, le immagini sono state scattate in 30 min intervalli per un periodo di 5 ore.
Discussion
Il pesce zebra è diventato un organismo modello popolare per gli studi di sviluppo dei vertebrati e modellizzazione di malattie umane. Perché zebrafish embrioni rimangono trasparenti, in via di sviluppo organi come il cervello e il cuore può essere osservato con un microscopio di preparazione standard. Approfittando di linee transgeniche con organo fluorescenza specifica consente valutazioni di organogenesi tutto diversi stadi di sviluppo all'interno di embrioni che vivono al microscopio a fluorescenza. Una limitazione per l'imaging dettagli strutturali di organi interi con epifluorescenza standard è l'impatto di segnali da oggetti sopra e sotto il piano focale. Questa luce out-of-focus non solo i risultati in contrasto diminuito e la risoluzione, ma anche può oscurare importanti strutture di interesse 13,14. Diverse tecniche quali la scansione laser confocal-, filatura confocal- disco o microscopia multiphoton sono state sviluppate per minimizzare le informazioni fuori fuoco e con ciò increascontrasto dell'immagine e così come risoluzione assiale. Un metodo alternativo per ottenere sezioni ottiche è la libera microscopia illuminazione strutturata al laser e scansione, un'ampia tecnica di illuminazione campo base, che è e semplice da implementare su un microscopio regolare 15. I risultati qui presentati illustrano che sezionamento ottico, raggiunto da illuminazione strutturata, implementato su un microscopio da dissezione e combinato con la ricostruzione di immagini messa a fuoco estesa, consente la visualizzazione dei dettagli strutturali del normale e disturbato lo sviluppo dei reni in zebrafish. In particolare, le cellule GFP-positive in morphants wt1a sono disperse a varie profondità focali, e le immagini di un solo piano con out-of-fuoco sfocatura sottostimerebbero tre complessità dimensionale del fenotipo.
Per seguire le dinamiche di organo organizzazione, riassetto o interruzione, time-lapse microscopia a fluorescenza è una potente seppur tecnica complessa. Durante il time-lapseimmagini lievi vibrazioni o variazioni di temperatura minori provocano derive in direzione X, Y o Z. Ciò richiede dispositivi aggiuntivi (camera ambientale, tavolo antivibrante) al fine di ottenere risultati stabili. Il metodo presentato utilizza la capacità di un microscopio da dissezione con un drive fuoco motorizzata per la registrazione di immagini in tempo-lapse senza dispositivi aggiuntivi. Per mantenere un focus stabile, una strategia autofocus è stato stabilito e una griglia trasferimento impresso sul fondo della camera di imaging è stato utilizzato per la correzione di x, y instabilità.
La corretta incorporamento dell'embrione è un passo fondamentale all'interno del protocollo. Alcuni pratica è necessaria per posizionare la struttura di interesse più vicino possibile al fondo di vetro e nelle immediate vicinanze alla rete senza sovrapposizione con esso.
Il principale vantaggio del metodo è che è uno strumento economico e semplice per l'osservazione diretta dei processi di sviluppo come la crescita e la migrazione nel soggiornoembrioni per diverse ore. Inoltre, la dissezione specifici microscopio vantaggi quali grande campo di vista e la distanza di lavoro estesa facilitare l'esame dei campioni più grandi, tra cui interi organi. Tuttavia, alcune limitazioni devono essere tenuti in considerazione. Pausa dell'esperimento per controllare e regolare la posizione rende la procedura richiede tempo e l'assenza di un controllo di temperatura robusta cambia il tempo di sviluppo "standard", che è definito come hr dopo la fecondazione a 28,5 ° C per 16 zebrafish. Un altro potenziale problema è la profondità ristretta di imaging nella animale, in particolare quando la struttura di interesse si trova all'interno del embrione o larve. Tale struttura è il glomerulo pronephric zebrafish, che si trova tra le somiti e il sacco vitellino. La profondità limitante per l'imaging del glomerulo è risultata essere di circa 200 micron, una distanza che si raggiunge dopo 5 giorni di sviluppo. Al contrario, le strutture fluorescenti che sono lituato vicino alla superficie dell'animale può essere ripreso per un tempo più lungo. Per esempio cellule epatiche sono accessibili per l'imaging almeno fino 9 dpf. Un'ulteriore limitazione è che l'immobilizzazione lungo termine dell'embrione o larve in agarosio e trattamento Tricaine indurre ritardo della crescita e edema cardiaco, rispettivamente. Perché questo può interferire con lo sviluppo normale, si raccomanda di limitare la durata della registrazione time-lapse per un certo periodo di interesse. Per garantire che durante strutture di imaging di interesse sviluppano normalmente è utile confrontare (alla fine) l'aspetto complessivo con quella di un animale tenuto sotto stesse condizioni sperimentali, ma senza incorporare e anestesia.
Registrazione di un z-pila di sezioni ottiche ogni 30 minuti per un periodo di 5 ore e il successivo calcolo della profondità delle immagini sfocate esteso fornito informazioni spaziali e temporali su eventi precoci del normale e disturbato lo sviluppo del rene che è stato indotto batterramento di wt1a y morfolino-mediata. Esperimenti morpholino atterramento precedentemente svolte hanno già dimostrato che Wt1a svolge un ruolo precoce e essenziale nella formazione pronephros ibridazione in situ con l'indicatore del rene 17,18 e l'occupazione del wt1b transgenico:. Linea GFP per lo sviluppo pronephros di imaging in tempo fisso sottolinea 9,10 rivelato che i risultati carenza wt1a nella morfogenesi glomerulare interrotto e non è riuscito specifica podocyte. In contrasto con questi approcci statici, registrazioni time-lapse visualizzare direttamente le dinamiche di nefrogenesi presto embrioni controllo e la migrazione delle cellule GFP-positive dalla regione pronephric in morphants wt1a. La possibilità di monitorare le cellule pervenute all'indirizzo sbagliato nel tempo permette una più dettagliata analisi del fenotipo.
In generale, il metodo che viene qui presentato fornisce un economico e facile da usare alternativa al complesso, e meno accessibili seTups normalmente utilizzati per time-lapse imaging come microscopio a scansione laser (dotato di una camera climatica e tavolo anti-vibrazione) o microscopio foglio di luce. La routine descritta per risolvere i problemi di deriva può essere applicato anche per eseguire time-lapse immagini su configurazioni senza opzioni sezionamento ottico, come microscopi a fluorescenza stereo.
La tecnica non è adatto solo per indagare sviluppo renale, ma può essere applicato anche per monitorare morfogenesi normale e difettoso di altri organi come il cuore o il fegato. Inoltre, il metodo può essere usato per osservare i vari processi più dinamici in organismi modello embrionali e adulte, come la guarigione o la rigenerazione delle ferite.
Disclosures
L'autore Michael Graf è un dipendente di Carl Zeiss Microscopia GmbH che produce strumenti utilizzati in questo articolo.
Acknowledgments
Ringraziamo Thomas Bates per la lettura e migliorare il manoscritto in modo critico. Ringraziamo anche Christina Ebert e Sabrina Stötzer per la manutenzione del pesce.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Control Morpholino | Gene tools, LLC | Standard control oligo | Prepared control oligo |
| wt1a Morpholinos | Gene tools, LLC | customized | Designted to target the first splice donor site, sequence as published in Ref. 9 |
| 0.5% Phenol red solution | Sigma | P0290 | Injection tracer |
| peqGOLD universal agarose | peqlab | 35-1020 | To prepare microinjection dish |
| Glass capillaries (GC100F-10) | Hugo Sachs Elektronik | 30-0019 | To generate injection needles |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | To load the microinjection needle |
| Dumont forceps | Fine Sience Tools | 91150-20 | To generate an opening at the needle tip |
| Embryo water (0.3x Danieaus´ solution) | 1x: 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4, 0.6 Ca(NO3)2, 5 mM HEPES, pH: 7,5; Do not add methylene blue! | ||
| Graticule 5 mm/0.05 mm | Science Services | PY68039-02 | For calculation of injection amount |
| Pasteur pipette 137 mm, 4.8 ml | Roth | E305.1 | To collect eggs, to transfer embryos and to remove dead embryos |
| Pasteur pipette with ultra-thin tip 157 mm, 3.5 ml | Roth | E304.1 | To remove excess of water |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma | P7629 | For suppression of melanization |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma | E10521 | To anethesize zebrafish |
| Low melting agarose | Biozym | 850111 | For embedding |
| µ-dish 35 mm, high Glass Bottom Grid-50 | ibidi | 81148 | Imaging chamber |
| Gel loader tips | Hartenstein | GS05 | To orient the embryo for proper embedding |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Micropipette puller (model P-97) | Sutter Instrument | To generate injection needles | |
| Micromanipulator | Saur Laborbedarf | For microinjection | |
| Thermomixer copact | Eppendorf | Thermoblock for tempering the low melting agarose | |
| SZ61 (Stereomicroscope) | Olympus | For injection control | |
| Axio Zoom. V16 | Zeiss | For embedding and imaging | |
| ApoTome.2 slider | Zeiss | For optical sectioning | |
| AxioCam MRm | Zeiss | For image acquisition | |
| ZEN 2012 | Zeiss | Imaging software |
References
- Lieschke, G. J. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Drummond, I. A. Kidney development and disease in the zebrafish. J Am Soc Nephrol. 16 (2), 299-304 (2005).
- Drummond, I. A., et al. Early development of the zebrafish pronephros and analysis of mutations affecting pronephric function. Development. 125 (23), 4655-4667 (1998).
- Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3 (10), 1922-1938 (2007).
- Kramer-Zucker, A. G., Wiessner, S., Jensen, A. M., Drummond, I. A. Organization of the pronephric filtration apparatus in zebrafish requires Nephrin, Podocin and the FERM domain protein Mosaic eyes. Dev Biol. 285 (2), 316-329 (2005).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation. Kidney Int. 73 (10), 1120-1127 (2008).
- Kreidberg, J. A., et al. Wt-1 Is Required for Early Kidney Development. Cell. 74 (4), 679-691 (1993).
- Bollig, F., et al. Identification and comparative expression analysis of a second wt1 gene in zebrafish. Dev Dyn. 235 (2), 554-561 (2006).
- Perner, B., Englert, C., Bollig, F. The Wilms tumor genes wt1a and wt1b control different steps during formation of the zebrafish pronephros. Dev Biol. 309 (1), 87-96 (2007).
- Schnerwitzki, D., et al. Alternative splicing of Wilms tumor suppressor 1 (Wt1) exon 4 results in protein isoforms with different functions. Dev Biol. 393 (1), 24-32 (2014).
- Bedell, V. M., Westcot, S. E., Ekker, S. C. Lessons from morpholino-based screening in zebrafish. Brief Funct Genomics. 10 (4), 181-188 (2011).
- Rembold, M., Lahiri, K., Foulkes, N. S., Wittbrodt, J. Transgenesis in fish: efficient selection of transgenic fish by co-injection with a fluorescent reporter construct. Nat Protoc. 1 (3), 1133-1139 (2006).
- Conchello, J. A., Lichtman, J. W. Optical sectioning microscopy. Nat Methods. 2 (12), 920-931 (2005).
- Jensen, E. C. Types of imaging, Part 2: an overview of fluorescence microscopy. Anat Rec (Hoboken). 295 (10), 1621-1627 (2012).
- Chasles, F., Dubertret, B., Boccara, A. C. Optimization and characterization of a structured illumination microscope. Opt Express. 15 (24), 16130-16140 (2007).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Hsu, H. J., Lin, G., Chung, B. C. Parallel early development of zebrafish interrenal glands and pronephros: differential control by wt1 and ff1b. Development. 130 (10), 2107-2116 (2003).
- O'Brien, L. L., et al. Wt1a, Foxc1a, and the Notch mediator Rbpj physically interact and regulate the formation of podocytes in zebrafish. Dev Biol. 358 (2), 318-330 (2011).
