Summary
Burada anlatılan yöntemi fokal ve düzlemsel kaymasını düzeltmek için optik bölümlendirilmeleri ve güçlük basit stratejileri yürütebilecek diseksiyon mikroskobu bir floresan kullanılarak Zebra balığı embriyolarının organ gelişiminin time-lapse analiz sağlar.
Abstract
organogenez anlamak için, doku gelişimi sırasında meydana gelen uzamsal ve zamansal değişiklikler kaydedilmesi gerekir. Burada anlatılan yöntemi yapılandırılmış aydınlatma ve z-yığın edinimi için donatılmış bir floresan diseksiyon mikroskobu kullanarak Zebra balığı embriyolarının normal ve bozulmuş böbrek gelişiminin time-lapse analiz sağlar. Ile floresan etiketli böbrek yapıları kullanılmıştır: nefrogenezisi, transgenik zebra balığı (GFP) Tg (wt1b) görselleştirmek için. Böbrek kusurları Wilms tümörü geni wt1a, böbrek gelişimi için çok önemli olduğu bilinen bir faktör karşı antisens morfolino oligonükleotid enjeksiyonu ile tetiklenmesi.
deney düzeneği avantajı ek donanım olmadan x, y veya z yönünde yeniden ayarlama hareketler için basit stratejileri ile zoom mikroskop birleşimidir. sıcaklık değişimlerine ve mekanik titreşimler tarafından uyarılan odak kayması aşmak içinBir otofokus stratejisi yerine genellikle gerekli çevresel odasını kullanan uygulandı. nedeniyle xy-sürüklenme için konumsal değişiklikler yeniden ayarlamak için, baskılı tehcir ızgaraları ile görüntüleme odaları istihdam edilmiştir.
Böyle konfokal lazer tarama veya hafif levha mikroskoplar gibi optik kesit ile time-lapse kayıt için daha karmaşık kurulumları ile karşılaştırıldığında, bir yakınlaştırma mikroskop kullanımı kolaydır. Ayrıca, bu tür alan yüksek derinliği ve uzun bir çalışma mesafesi olarak mikroskop özgü yararları diseksiyon sunmaktadır.
Burada sunulan organogenez çalışma yöntemi aynı zamanda optik olarak kısımlara ayırma yeteneğine sahip değildir Flüoresans stereo mikroskobu ile birlikte kullanılabilir. yüksek verimlilik için sınırlı olmasına rağmen, bu tekniğin normal gelişim gösteren dokular ve organ dinamiklerinin zaman atlamalı kayıt için kullanılan daha karmaşık ekipman için bir alternatif sunuyor.
Introduction
gastrulasyon ardından, organogenesis bir bireyin yaşam döngüsünün bir sonraki aşamasıdır. Bu doku ve organların üretmek için yeniden düzenleme, etkileşim ve hücrelerin çok sık göç içerir. organların gelişimini altında yatan süreçlerinde yanlışlık genellikle ileri yaşlarda hemen ya da kendilerini ortaya çıkabilir hastalıklara yol açar. Böylece, organogenezi anlama gelişimsel biyoloji ve biyomedikal araştırmalarda önemli bir çaba olmuştur. Belli bir organ gelişimine araştırmak edebilmek için, bu da embriyo gövde duvarı aracılığıyla görünür olması gerekir. Bu gelişim sırasında meydana gelen mekansal ve zamansal değişikliklerin kaydedilmesini sağlar. Ayrıca organogenez katılan faktörlerin önemi analiz etmek amacıyla, bu manipülasyon duyarlı olması gerekir.
In vivo organogenez soruşturma son derece uygun olan bir organizma Zebra balığı olduğunu. onun transparFloresan transgenik hatların kullanımı ile kombinasyon halinde, embriyonik gelişimi sırasında Ensi protein lokalizasyonu ve ifade dinamiklerinin gözlem, aynı zamanda, iç organların 1 görselleştirme sağlar. Bu kimin organları mikroskopik analiz için erişilemez memeli modellere göre gerçek zamanlı olarak, organ gelişiminin soruşturma ile ilgili benzersiz bir avantaj sağlar. Ayrıca, farklı araçlar zebrafish embriyo gelişimini işlemek için kullanılabilir. Mutant çizgilerinin üretilmesine yanında, antisens morfolino oligonükleotitler (MO), bazı organların gelişiminde dahil olan belirli bir gen aktivitesinin demonte etmek için kullanılabilir. MOs bir ekleme sitesi veya translasyon başlangıç kodonunu (Ağustos) hedef ve böylece ön-mRNA veya çeviri eklenmesine engel ya.
Zebra balığı embriyonik böbrek, pronephros, böbrek gelişimi ve gen işlevini incelemek için anatomik basit ama değerli bir modeldirböbrek hastalıklarının 2 ile ilgili es. Bu nefron denilen sadece iki fonksiyonel birimden oluşmaktadır. Her nefron kan filtrasyon yer 3 alan bir glomerulus oluşur. Ayrıntılı bileşenler kısa boyunlu bölgenin yanı sıra kloakanın 4 biter sekresyon ve çözünen maddelerin reabsorbsiyonunun ve kanal için parçalı borucuk vardır. Ne olursa olsun basit kompozisyon, organizasyon ve zebra balığı pronephros farklı hücre tipleri memeli böbrek 5,6 çok benzer.
Böbrek gelişiminde kritik rol oynayan bir faktör, Wilms Tümör baskılayıcı gen WT1 7 tarafından kodlanmıştır. Balığı wt1a adlandırılan iki paralog sahiptir ve pronephros 8 geliştirilmesi sırasında üst üste binen, ancak aynı desen içinde ilave edildiği, wt1b. GFP-etiketli pronephros yapılarla transgenik zebrafish kullanılarak, wt1a <o tam devirerek gösterilmiştir/ em> veya belirli bir ekleme formu embriyonik böbrek ağır ya da hafif malformasyonlar, sırasıyla 9,10 yol açar.
Burada anlatılan yöntemi yapılandırılmış aydınlatma yoluyla optik kesit için donatılmış bir floresan diseksiyon mikroskobu kullanılarak Zebra balığı embriyolarının normal ve bozulmuş nefrogenezisi zaman atlamalı analiz sağlar. Genel olarak optik kesitler sadece odak içi bilgi içeren görüntü edinme sağlar. Out-of-odak bilgiler, matematiksel algoritmalar (örn. Deconvolution), optik tasarım (örneğin Konfokal lazer tarama mikroskopisi) ya da her ikisinin kombinasyonu (örneğin yapılandırılmış aydınlatma) gibi çeşitli yaklaşımlarla önlenebilir.
Böbrek geliştirme kusurları neden biz bir antisens bir transgenik zebrafish hattı enjekte edildi wt1a karşı MO (GFP) Tg (wt1b) kullanılır. Bu hat glomerulus, boyun ve ön GFP floresan gösterirtübül 9,10 parçası. Böyle lazer tarama veya hafif levha mikroskoplar gibi optik kesit ile time-lapse kayıtları için daha karmaşık kurulumları ile karşılaştırıldığında, bir yakınlaştırma mikroskop kullanımı kolay ve ucuzdur. Ayrıca, yapılandırılmış aydınlatma ekipmanı kolayca uzun bir çalışma mesafesi ve bakış geniş alanı olarak geleneksel floresan ekipmanı (örneğin floresan lamba, filtreler) ve mikroskop özel avantajlar diseksiyon teklifler ile kombine edilebilir. sürüklenme ile ilgili sorunlar genellikle istikrarlı sonuçlar için gerekli olan ek donanım (çevre odasını, titreşim önleyici tablo) kullanmadan çözüldü. bir otofokus stratejisi kurulmuş ve baskılı taşınma ızgaraları ile görüntüleme odaları x veya y yönünde bir sürüklenme aşağıdaki konumlandırma yeniden ayarlamak için kullanılmıştır odak kayması için düzeltmek için.
Bu çözümler aynı zamanda, floresans, stereo m optik kesit amaç olmadan mikroskoplar uygulanabiliricroscopes ve normal gelişim gösteren dokular ve organ dinamiklerinin zaman atlamalı kayıt için kullanılan daha karmaşık ekipman için bir alternatif sunuyor.
Protocol
Tüm hayvan deneyleri 'laboratuvar hayvanları bakım İlkeleri' yanı sıra Hayvanları Koruma Kanunu Alman geçerli sürümüne göre yapıldı.
Antisens-Morfolino 1. Hazırlama (MO)
- 3 mm MO stok solüsyonu hazırlamak liyofilize MO (cam şişede 300 nmol) için steril aşırı saf su 100 ul ekleyin. Tam çözünme için, 5 dakika için 65 ° C stok çözeltisi ısıtılır. Parafilm ile şişeyi Seal ve oda sıcaklığında (RT), MO stok solüsyonu saklayın. Bu flakon duvarları ile MO arasında bir ilişki neden olabilir çünkü MO stok solüsyonu soğuk yok.
- steril aşırı saf su ile MO stok çözelti seyreltilerek 1 mM MO çalışma çözeltisi hazırlayın ve% 0.05 arasında bir nihai konsantrasyona kadar% 0.5 fenol kırmızı bir çözelti ilave edin.
- Bir MO çalışma çözeltisinin 10 ul olsun 3.3 ul MO stok çözeltisi ve 5.7 ul su,% 0.5 fenol-kırmızısı çözelti 1 ul ekleyin. olmakçözeltisi yeni bir çalışma parti hazırlamak nedenle, 5 dakika boyunca 65 ° C'ye kadar, MO stok solüsyonu ısıtın.
- İğne tıkanmasını önlemek için, santrifüj MO çalışma çözümü kullanmak önce. Örneğin, 5 dakika boyunca (RT) 15,000 xg'de MO stok çözeltisi 10 ul spin ve enjeksiyon için süpernatan 8 ul çıkarın.
NOT: aktivitenin kaybı zaman 11 üzerinde morfolino çözümleri ortaya çıkabilir. Bu hariç tutmak için, tek bir üretici tarafından sağlanan protokole uyularak, UV spektrometresi ile çözüm test edebilir. Düşürülmüş etkinliği uzun bir depolama süresi boyunca gözlenmemiştir morfolino kullanılan wt1a halinde (3 mM çalışma çözeltisi uzun bir daha depolanmıştır yıl).
2. Çiftleşme Çiftleri Kurma ve Koleksiyon döllenmiş yumurta
- Ayırmak için çıkarılabilir bir elek ile donatılmış bir ıslah kapta hattı, her biri: (GFP wt1b) Önceki mikroenjeksiyon öğleden sonra Tg beş çift ayarlamakGece boyunca kadın ve erkekler.
NOT: çiftleşme çiftleri olarak kullanılan balık ön elemeden ve iyi "üretici" olarak değerlendirilmiştir gerektiği kadar yumurta başarılı bir enjeksiyon deney için kullanılabilir sağlamak. - ışıklar açıldıktan sonra ertesi sabah, yumurtalarını yiyip balık engeller elek üstünde birlikte erkek ve dişi koyun.
- yumurtlama izleyin. 4-hücreli aşamasından önce enjekte edilebilir koyulur yumurta bir miktar yine kadın dan (yaklaşık 50), ayrı erkek ulaşıldığında. Enjeksiyon bir birinci tur embriyo su ile dolu bir petri Pasteur pipeti ile yumurta transferi. yumurta ilave mermi almak için bir araya ve ayrı birkaç kez çiftleşme çifti yerleştirin.
Mikroenjeksiyon 3. Hazırlık Çalışmaları
NOT: Önceden adımları 3.1 ve 3.2 gerçekleştirin.
- enjeksiyonu (mikroenjeksiyon çanak) sırasında pozisyonda embriyolar tutan bir tabak, bir gl eklemek hazırlamak içinSıvı, şeffaf, saf, gıda sınıfı silikon ile dolu bir 94 mm Petri kabı içine bir 40-45 ° açıyla eşek slayt. Silikon sertleşmiş olduğunda slayt çıkarın. Bu silikon katman bir oluk oluşturur.
NOT: Alternatif olarak, silikon agaroz yerine 1.5-3% kullanımı ve 4 ° C'de çanak saklayın. - Bir iğne çektirmesi ile cam kılcal damarlar enjeksiyon iğneleri oluşturun.
- İç filamentleri ihtiva kılcal kullanın.
NOT: Filament (3.3) dolgu sonra iğne ucuna doğru MO çözüm taşımak için yardımcı olacaktır. - İğne çektirmesi uygun ayarları kurmak. Zebrabalıkları içine enjeksiyon için iyi iğneler ince uzun uçları 12 olması gerekir. yaklaşık 10 mm uzunluğunda ve en sonunda 1.5-2 um bir çapı olan ipucu oluşturur. = Hız = 40, Zaman = 100 0 çekin, Isı = 330: Örneğin, aşağıdaki ayarlarla yatay iğne çektirmesi kullanın.
- Bir küçük iğne kalitesinin incelenmesidiseksiyon mikroskobu ve kısa veya çok uzun ipuçları ile bu sıralamak.
NOT: Kısa ipuçları ile İğneler çok uzun ve ince ipuçları viraj böyle koryon dokunurken ise embriyo zarar eğilimindedir ve nüfuz etmezler.
- İç filamentleri ihtiva kılcal kullanın.
- Bir Microloader ucu kullanarak MO çalışma çözeltisi 2 ul iğne dolgu ve mikroenjeksiyon cihazının iğne tutucu takın.
- iğneler ucu sonunda kapalı olarak, diseksiyon mikroskobu altında keskin cımbız ile iğne çok ucunu arka kısma bir açıklık oluşturur. Alternatif hafifçe sert bir yüzeye (örn., Küçük metal blok ya da cımbız arka) ucu itmek için mikroenjeksiyon aparatı kullanın.
- bir mercek ağı yerleştirilen mineral yağı bir damla halinde MO çalışma çözeltisi enjekte edilmesiyle, enjeksiyon hacmi kalibre edin. yaklaşık 200 ul bir enjeksiyon hacmi elde etmek için 75 um'lik bir damla çapı üretilmesi için enjeksiyon süresini ayarlayın.
- İğne (oluk 45 ° açı doğru) nereden geldiğini yönünde bitkisel kutup mikroenjeksiyon çanak oluk boyunca 1-hücre sahne embriyolar düzenleyin.
- koryon ve iğne ile yumurta sarısı delmek ve 2 hücreli embriyolar, 1- sarısı içine 1mM MO çalışma çözeltisi (0.2 pmol), 200 pl enjekte edilir.
- geniş bir açıklığı olan bir Pasteur pipeti kullanılarak, embriyo, su ile doldurulmuş bir petri tabağına enjekte edilen embriyoların toplamak ve 28.5 ° C sıcaklıkta inkübe.
- Öğleden sonra, geniş bir açıklığı olan bir Pasteur pipeti kullanarak ölü embriyolar kaldırmak ve embriyo su yerine.
In vivo görüntüleme için embriyo 5. hazırlanması
- Ertesi sabah, melanization inhibe% 0.003 N-feniltiyoüre (PTU) içeren embriyo su ile embriyo su yerine. gastrulasyon sonunda bunun nedeni interf önce PTU geçerli değildirerken embriyonik gelişimi ile eres.
DİKKAT: PTU toksik ve teratojenik olduğunu. her zaman eldiven giyin ve solunması ve cilt ile temasa geçin. - istenilen gelişimsel aşamada bir diseksiyon mikroskobu altında keskin cımbız ile embriyolar Dechorionate. cımbız bir çift ile koryon kapmak ve cımbız ikinci bir çift ile koryon diğer tarafında kapmak için deneyin. Dikkatle embriyo aksatmadan zıt yönlerde cımbız çekin.
- PTU (% 0.003) ve% 0.02 Etil 3-aminobenzoat metansülfonat (Tricaine) içeren embriyo su ile PTU içeren embriyo su (% 0.003) değiştirerek embriyo anestezisi.
- agaroz 50 mikron taşınma ızgara ile bir coverglass tabanlı μ-çanak düşük erime embriyo gömün. Uygun katıştırma bazı pratik gerektirir.
- 1.5 ml'lik tepkime tüpleri içinde% 0.7 agaroz 1 ml'lik numuneler hazırlayın ve 36 ° C'ye ayarlanmış bir sıcaklıkta bir blok üzerinde koydu. Tra geniş açılması ile Pasteur pipeti kullanınμ-çanak embriyo nsfer. ultra-ince uçlu bir Pasteur pipeti kullanarak aşırı embriyo suyu çıkarmak ve temperli agaroz ile embriyo kaplaması.
- Agaroz halen sıvı iken, ilgi konusu yapının yanı sıra yer değiştirme ızgarasına mesafe ile ilgili olarak, arzu edilen bir konumda, iki jel yükleyici uçları embriyo yönlendirmek. ızgara ve yakın çevresinde: olarak (aşağı dorsal burada) cam alt mümkün olduğunca yakın ilgi yapısını (burada pronephros) yerleştirin.
- En iyi görüntü kalitesi için alttan mümkün olduğunca yakın embriyo ilgi yapısını yerleştirerek embriyo ve cam alt kısmı arasındaki agaroz katmanı en aza indirmek. Bunun yanı sıra, ızgaraya yakın çevresinde embriyo bulun ama grid ilgi yapısı ile bindirme olmayacak özen gösterin. Farklı μ-yemekleri 3-4 embriyo her embed ve en iyi konumlandırılmış birini kullanın.
- Agaroz zor olduğunda yeterince 2 için embriyo beklemek tutmak için-3 Dakika ve% 0.003 PTU ve% 0.02 Tricaine içeren embriyo su ile gömülü embriyo kaplaması. Fazla embriyo suyu süzün ya da ultra-ince uçlu bir Pasteur pipeti kullanarak kaldırın. buharlaşmasını önlemek için kilit konumunda μ-çanak kapağını kapatın.
NOT: Görüntü Kaydı zarar gibi, μ-çanak hava kabarcıklarının oluşumunu kaçının.
6. Mikroskopi
NOT: yapılandırılmış aydınlatma yoluyla optik kesit için donatılmış bir mikroskop kullanın. Çok kanallı, Z-Stack, Zaman Serileri, Yazılım otofokus ve Genişletilmiş Odak: aşağıdaki modülleri içeren bir yazılım ile rekor görüntüler.
- Z-yığınlarının kazanılması
- μ-çanak ters çevirin. cam alt şimdi objektif dönük ve μ-çanak, bir görüntüleme odası olarak hizmet vermektedir.
- ızgara pozisyonuna kaydırıcıyı geçiş ve yazılım kontrolleri yapılandırılmış aydınlatma modunu etkinleştirin.
- ayarlamaknumune ile seçim kanal (lar) için ızgara odak Odak Kalibrasyon Sihirbazı'nın yönergeleri izleyerek (gömülü embriyo) incelenecek.
- z-Stack edinme modunu etkinleştirmek ve merkez moduna ayarlayın. Numunenin ortasına odaklanın ve Merkezi'ni tıklatarak z yığının merkez düzlemi olarak ayarlayın. merkez konumu etrafında aralığı tanımlayarak z yığının boyutunu ayarlayın.
Not: nesne yapıları, birinci ve z yığın son düzlemi dışında keskin görülmemelidir. - Optik bölümler arasındaki boşluğu ayarlayın. En iyi z çözümü için optimal düğmesine tıklayın. Yazılım Nyquist kriter (% 50 örtüşme) Aşağıdaki önerilen mesafe koyacaktır alan hedefleri derinliği dayalı.
Not: daha küçük dosya boyutları ve yapısı izni hedefleyen, el büyük bir aralık boyutunu ayarlayın. Tavsiye edilenden daha küçük adımlar ayarlanması sadece daha sonra arttırmadan daha büyük dosya boyutlarına neden olural bilgiler.
- Time-lapse Görüntüleme
- Zaman Serisi aracını açın ve zaman serisi deney aralığını ayarlayabilirsiniz. örnek kayıt z yığın görüntü 5 saat arasında bir süre boyunca her 30 dakika karıştırıldı.
- zamanla odak kayması düzeltmek için, bir otofokus stratejisi kurdu. Focus Strateji diyalog kutusunu işaretleyin açılan listeden Yazılım Autofocus seçin ve referans kanalı olarak TL-aydınlık kanalı seçin.
- otofokus ile her zaman başlangıç noktası. optimize edilmiş bir zaman dilimi içinde güvenilir bir arama aralığı sağlamak amacıyla, sabit bir 200 mikron bağıl arama aralığını ayarlayın. Bu aralık tamamen maksimum adım boyutu (Numune parametresi) temel kalite (Kalite parametresi) ile (Aralık Kapsama parametresi) taranır.
- Çevrede (odak ROI) ve pozisyon odağı bölgede ölçümü etkinleştirmek, otofokus hassasiyetini artırmak için faiz yapı etrafında canlı görüntü penceresinde odak ROI söyledi.
NOT: EğerSistem time-lapse kayıt sırasında otomatik olarak merkez z konumunu günceller Yazılım otofokus modülü yoksun, belirli bir zamanda deney duraklatmak ve Odağı manuel olarak ayarlayabilirsiniz ve denemelerimiz devam ediyor. - Zaman serisi kayıt sırasında potansiyel bir xy-sürüklenme telafi etmek için, yazılım crosshair'i içine (görüntüleme odasının) baskılı ızgara belirli bir noktaya yerleştirin ve bir ekran yaparak konumlandırma kaydedin.
- Zaman serisi deney başlayın. Zaman serisi aralığı bitmeden gerekirse, konumlandırma ekran göre yeniden ayarlayın, deney duraklatmak ve. deney ile devam edin.
7. Görüntü İşleme
- işleme sekmesine geçin ve Yöntem diyalog kutusunda Focus (EDF) Genişletilmiş Derinliği seçin. Optik bölümler elde edilen bu yana, resim serisi Maksimum Projeksiyon algoritması uygulanır.
NOT: Burada algoritma br proje olacakightest ya bir birinci aşamada bir bileşik 2D görüntü istiften en koyu piksel ve en sonunda, her bir zaman noktası için bir sonucu görüntü olarak en varyansı kullanmak. - EDF resim serisi dışında bir zaman atlamalı film (örneğin avi veya hareket dosyası) oluşturmak için Film verme yöntemini kullanın.
Representative Results
Time-lapse mikroskopi uzun bir süre boyunca dinamik biyolojik süreçleri izlemek için güçlü bir tekniktir. Time-lapse görüntüleme sırasında sık meydana gelen bir sorun sıcaklık değişimlerine ve mekanik titreşimler tarafından uyarılan sürüklenme denir x, y veya z yönünde bir hareket, olduğunu. Burada sunulan yöntem, çevre odasında ve anti-vibrasyon tablo olmadan bir diseksiyon mikroskobu Zebra balığı embriyolarının veya larva içinde floresan etiketli yapıları kayıt time-lapse sağlar.
Xy-sürüklenme tazmini için, numune bir baskılı tehcir ızgara (Şekil 1) ile bir görüntüleme odasında gömülü idi. Yazılım aracı kursöre ilgili ızgara belirli bir noktasının konumu önceden ayarlanmış bir konumda (Şekil 2A) için numune dönmek için kullanılmıştır. Sunulan sonuçlar, bir yakınlaştırma mikroskobu kullanılarak elde edilmiştiryapılandırılmış aydınlatma (Şekil 2B) üzerinden optik kesit için entegre bir kaydırıcı ile. Sürekli odak düzeltme, bir otofokus stratejisi kuruldu. Bu stratejide, yazılım otofokus her zaman noktasından önce maksimum kontrast dayalı odak bulmak için kullanılır. Bu yüzden tanımlanmış odak düzlemi sonradan z yığın edinimi için merkez planı olarak ayarlanır. Otofokus aşama (Şekil 2C) esnasında yeterince kısa bir kalma süreleri verir gibi numunede fototoksisite en aza indirmek için, iletilen ışık aydınlık kanalı referans kanalı olarak kullanılır.
Yöntem, bir transgenik zebra balığı hattının kontrol ve wt1a morphant embriyolar (GFP) Tg (wt1b) böbrek gelişimi karşılaştırmalı analizi uygulandı. Erken nefrogenezisi sırasında bu hat böbrek atalarıdır 9,10 ve daha sonra ortaya çıkan, orta tabaka mezodermin yeşil floresan gösterirşekillendirme tübüller ve nefron primordia (Şekil 3).
Time-lapse görüntü kayıt kontrol morfolino enjekte edilen embriyolar nefrogenezisi (sonuçlar gösterilmemiştir) uninjected olanlar karşılaştırıldığında değiştirilmemiş ve erken zebrabalıkları böbrek gelişimi 3 açıklanan adımları takip ettiğini ortaya koymaktadır. Gelişmekte olan Pronephric tübüller hpf 20 görünür ve onların ön ucunda at, şekillendirme nefron Primordia temsil hücrelerin küresel birikimleri, tespit edilebilir. Bir sonraki saatlerinde, tübüller ve nefron taslakları büyür ve daha sonra primordia üzerinde orta hat (Şekil 4, Video 2) de kaynaşmaya başlar. Bunun aksine, nefrogenezisi ciddi wt1a morphant embriyolarda bozulur. GFP-pozitif boru şekilli yapılar 20 hpf görebilir de, daha yaygın ve daha az gelişmiş olduğu görülmektedir. Ayrıca, hiçbir şekilde nefron taslakları oluşturulmuştur. En çarpıcı fark tAncak o gelişmekte pronephros (Şekil 4, Video 2) dışında floresan hücrelerin çok sayıda ortaya çıkmasıdır, bu zaman noktasında kontrol embriyolarına. Daha sonra, bu hücreler Pronephric alanını terk ve ventral (Video 2) göç.
Kontrol embriyo ve wt1b transgenik hattın wt1a morphants Böbrek gelişme, daha önce farklı sabit zaman noktalarında 9,10 görüntüleri alarak karşılaştırılmıştır. Bu statik yöntemi aksine, time-lapse kayıt normal nefrogenezisi ve wt1a tükenmesi nedeniyle böbrek progenitör hücrelerin yanlış iletilmesi dinamiklerini takip etmesini sağlar.
Şekil 1: Tehcir Izgaralar ile Ticarete Elverişli Odası Gömülü Embriyo şematik İllüstrasyon. çanak varDört ızgaralar, her biri bir cam lamel altına baskılı 50 um bir tekrarlanma mesafesi bölünmüştür. Yansıması için embriyo bir gözlem kareye yakın böbrek yapısı ile, baş aşağı gömülü ama ızgara ile kaplanacağı olmadan. Olan bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2:. Time-lapse Görüntüleme ve Yapılandırılmış Aydınlatma Izgara Projection içinde Drift Tazminat için ayarlamalar taşınma ızgara bir farklı pozisyon görüntü merkezi haline getirildi (sarı crosshairs ile işaretlenmiş) ve daha sonra xy-uyum için bir referans noktası olarak hizmet küçük vardiya halinde. Kırmızı dikdörtgen otofokus stratejisi (A) kullanılan faiz (ROI) bölgesini temsil eder. Optik kesit wayapılandırılmış aydınlatma ile elde s. Görüntü doğru kalibrasyon (B) sonrasında odak düzlemi öngörülen bir ızgara yapısını göstermektedir. Otofokus stratejisi (kırmızı dikdörtgen) için ROI faiz (C) yapısına güvenilir otomatik netleme sağlayan (Somitlerin burada) aksine yüksek ayırt edici embriyonik yapıların kapsayacak şekilde ayarlanır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: Transgenik wt1b. Yeşil Floresan ile GFP Embriyolar Gelişmekte Böbrek dorsal (A) veya yan (B) iletim ve floresan görüntüleri Kaplamaları sol anterior gösterilir. np, nefron primordium; nk, Pronephric tübül; Eh işteakar. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: wt1a demonte Embriyonik Böbrek Geliştirme bozan Temsilcisi time-lapse kayıtları odak görüntüleri genişletilmiş derinliği.. Kontrol morfolino enjekte edilen embriyolar, böbrek gelişme orta hatta sigorta başlangıç büyüyen tübüller ve nefron primordiasında normal ilerleme gösterir. Bunun aksine, wt1a morphants uygun nefron Primordia formu başarısız ve GFP pozitif hücrelerin büyük bir miktarı Pronephric alanının dışındadır. (np, nefron primordium, pt, Pronephric tübül). Bu fi büyük halini görmek için tıklayınızşekil.
Kontrol morfolino enjekte edilen embriyoların normal böbrek gelişiminin Ek Video 1. Time-lapse kayıt. . (Sağ indirmek için tıklayın) tübül büyür ve nefron taslakları kaynaştırmak başlar nasıl bir video gösterir. 20 HPF başlayarak, görüntü 5 saat arasında bir süre boyunca 30 dakika aralıklarla alındı.
Wt1a morphant embriyolarda rahatsız nefrogenezisi arasında Ek Video 2. Time-lapse kayıt. (Sağ indirmek için tıklayın). Video Pronephric bölge dışına GFP pozitif hücrelerin göçünü gösteriyor. 20 hpf başlayarak, görüntüler 30 mi alınmıştır5 saat arasında bir süre boyunca N aralıkları.
Discussion
Zebra balığı insan hastalıklarının omurgalı gelişimi ve modelleme çalışmaları için popüler bir model organizma haline gelmiştir. Zebra balığı embriyolar saydam kalır, çünkü beyin ve kalp gibi gelişmekte olan organlar bir standart hazırlama mikroskobu kullanılarak görülebilir. organ spesifik floresan transgenik yararlanarak floresan mikroskobu ile yaşayan embriyoların içinde farklı gelişim aşamalarında organogenez değerlendirmelerini sağlar. Standart Epifloresans mikroskobu ile tüm organların yapısal ayrıntıları görüntüleme için bir sınırlama odak düzlemi üstündeki ve altındaki nesnelerin gelen sinyallerin etkisidir. Bu out-of-focus ışığı değil azalmış görüntü kontrastı ve çözünürlüğü sadece sonuçlar, aynı zamanda ilgi 13,14 önemli yapılarını gizleyebilir. Disk confocal- veya multiphoton mikroskobu iplik gibi lazer tarama confocal- olarak çeşitli teknikler, out-of-focus bilgisini ve böylece increas en aza indirmek için geliştirilmiştire görüntü kontrastı yanı sıra eksenel çözünürlük. Optik bölümleri elde etmek için alternatif bir yöntem lazerli ve tarama ücretsiz yapılandırılmış aydınlatma mikroskopisi, düzenli bir mikroskop 15 uygulamak basit ve geniş bir alan bazlı aydınlatma tekniğidir. Burada sunulan sonuçlar mikroskop uygulanan ve genişletilmiş odak görüntüleri yeniden birlikte yapılandırılmış aydınlatma elde optik kesit, normal yapısal detayları görselleştirme sağladığını göstermektedir ve Zebra balığı böbrek gelişimini rahatsız. Özellikle, wt1a morphants GFP-pozitif hücreler değişik odak derinliklerde disperse edilir ve dışı olma odaklama bulanıklık sadece tek bir düzlemde görüntüleri fenotipi üç boyutlu karmaşık hafife olacaktır.
Organ organizasyonu, düzenlenmesi ya da bozulma dinamiklerini takip etmek, zaman atlamalı floresan mikroskopi karmaşık tekniği olsa bir güçlüdür. time-lapse sırasındagörüntüleme hafif titreşimler veya küçük sıcaklık dalgalanmaları x, y veya z yönünde sürükleniyor neden olur. Bu istikrarlı sonuçlar elde etmek için ek donanım (çevre odasını, titreşim önleyici tablo) gerektirir. sunulan yöntem ekstra cihazlar olmadan zaman atlamalı görüntüleri kaydetmek için motorlu odak sürücü ile bir mikroskop yeteneği kullanır. istikrarlı bir odak sağlamak için, bir otofokus stratejisi kurulmuş ve görüntüleme odasının dibine baskılı bir tehcir ızgara x düzeltilmesi, y istikrarsızlık kullanıldı.
embriyonun uygun gömme protokolü içinde kritik bir adımdır. Bazı uygulama onunla bindirilirken olmadan ızgara olarak cam alt mümkün olduğu kadar yakın ve yakın çevresinde ilgi yapısını yerleştirmek için gereklidir.
yöntemin en önemli avantajı bu tür yaşam büyüme ve göç gibi gelişim süreçleri doğrudan gözlem için uygun fiyatlı ve basit bir araçtır olmasıdırbirkaç saat boyunca embriyolar. Ayrıca, bu tür görünüm ve genişletilmiş çalışma mesafesi geniş alanı olarak diseksiyonu mikroskop özgü yararları bütün organları dahil büyük örneklerin incelenmesini kolaylaştırır. Bununla birlikte, bazı sınırlamalar göz önünde tutulması gerekir. Kontrol ve konumlandırma yeniden ayarlamak için deney duraklatma işlemi zaman alıcı ve sağlam bir sıcaklık kontrolü yokluğu zebrabalıkları 16 28.5 ° C'de saat sonra döllenme olarak tanımlanan "standart" gelişimsel zaman, değişiklikleri yapar. Bir diğer potansiyel sorun çıkar yapısı embriyo veya larva içinde bulunan, özellikle hayvana görüntüleme kısıtlı derinliğidir. Böyle bir yapı Somitlerin ve yolk kesesi arasında yer almaktadır Zebra balığı Pronephric glomerulus vardır. glomerul görüntüleme için sınırlayıcı derinliği yaklaşık 200 um, gelişme 5 gün sonra ulaşılır bir mesafe olduğu bulunmuştur. Bunun aksine, L flüoresan yapılar olduğuDaha uzun bir süre için görüntülenebilir hayvanın yüzeyine yakın ocated. Örneğin karaciğer hücreleri en az 9 dpf'e kadar görüntüleme için erişilebilir. Bir başka sınırlama agaroz ve Tricaine tedavisinde embriyo veya larva uzun süreli immobilizasyon sırasıyla büyüme geriliği ve kalp ödemi neden olmasıdır. Bu normal gelişim engel olabilir, çünkü ilgi belirli bir süre için time-lapse kayıt süresini kısıtlamak için önerilmektedir. ilgi görüntüleme yapılarının sırasında emin olmak için bir hayvan olduğu ile genel görünümünü aynı deney koşulları altında, ancak gömme ve Anesthetization olmadan muhafaza (sonunda) karşılaştırmak yararlı olur normalde gelişir.
5 saat ve odak görüntü uzatılmış derinliği daha sonra hesaplama bir süre boyunca her 30 dakikada bir, normal erken olayları mekansal ve zamansal bilgiler ve optik kesit bir z-yığın kayıt b indüklenmiştir böbrek gelişimi rahatsızy wt1a ve demonte morfolino aracılı. Sabit zaman görüntüleme pronephros geliştirilmesi için GFP hattı 9,10 işaret ortaya. Daha önce gerçekleştirilen morfolino demonte deneyler Mevcut böbrek markör 17,18 ve transjenik wt1b istihdamı in situ hibridizasyon Wt1a pronephros oluşumunda bir erken ve gerekli bir rol oynadığı göstermiştir kesintiye glomerüler morfojenezinde o wt1a eksikliği sonuçları ve podosit şartname başarısız oldu. Bu statik yaklaşımların aksine, zaman atlamalı kayıtları doğrudan erken kontrol embriyolar nefrogenezisi ve wt1a morphants uzak Pronephric bölgeden GFP pozitif hücrelerin göç dinamiklerini görselleştirmek. zamanla yanlış yönlendirilmiş hücreleri izlemek için olasılık daha detaylı fenotip analiz sağlar.
Genel olarak, burada sunulan yöntem sağlayan ucuz ve karmaşık alternatif kullanımı kolay ve daha az erişilebilir setups normalde böyle (bir çevre odasına ve anti-vibrasyon masası ile donatılmış) lazer tarama mikroskobu veya hafif levha mikroskop gibi zaman atlamalı görüntüleme için kullanılır. sürüklenme sorunları gidermek için açıklanan rutin ayrıca floresan stereo mikroskop gibi optik kesit seçenekleri olmadan kurulumları zaman atlamalı görüntüleri gerçekleştirmek için uygulanabilir.
tekniği, sadece böbrek gelişimi araştırmak için uygundur, ancak, aynı zamanda, kalp, karaciğer ve diğer organların normal ve kusurlu morfonogenezi izlemek için uygulanabilir. Bundan başka, metot, yara iyileşmesi veya rejenerasyonu embriyonik ve yetişkin model organizmaların çeşitli dinamik işlemleri gözlemlemek için kullanılabilir.
Disclosures
yazar Michael Graf Bu maddede kullanılan aletleri üreten Carl Zeiss Mikroskopi GmbH'nin bir çalışanıdır.
Acknowledgments
Biz eleştirel okuma ve el yazması geliştirmek için Thomas Bates teşekkür ederiz. Biz de balık bakımı için Christina Ebert ve Sabrina Stötzer teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Control Morpholino | Gene tools, LLC | Standard control oligo | Prepared control oligo |
| wt1a Morpholinos | Gene tools, LLC | customized | Designted to target the first splice donor site, sequence as published in Ref. 9 |
| 0.5% Phenol red solution | Sigma | P0290 | Injection tracer |
| peqGOLD universal agarose | peqlab | 35-1020 | To prepare microinjection dish |
| Glass capillaries (GC100F-10) | Hugo Sachs Elektronik | 30-0019 | To generate injection needles |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | To load the microinjection needle |
| Dumont forceps | Fine Sience Tools | 91150-20 | To generate an opening at the needle tip |
| Embryo water (0.3x Danieaus´ solution) | 1x: 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4, 0.6 Ca(NO3)2, 5 mM HEPES, pH: 7,5; Do not add methylene blue! | ||
| Graticule 5 mm/0.05 mm | Science Services | PY68039-02 | For calculation of injection amount |
| Pasteur pipette 137 mm, 4.8 ml | Roth | E305.1 | To collect eggs, to transfer embryos and to remove dead embryos |
| Pasteur pipette with ultra-thin tip 157 mm, 3.5 ml | Roth | E304.1 | To remove excess of water |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma | P7629 | For suppression of melanization |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma | E10521 | To anethesize zebrafish |
| Low melting agarose | Biozym | 850111 | For embedding |
| µ-dish 35 mm, high Glass Bottom Grid-50 | ibidi | 81148 | Imaging chamber |
| Gel loader tips | Hartenstein | GS05 | To orient the embryo for proper embedding |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Micropipette puller (model P-97) | Sutter Instrument | To generate injection needles | |
| Micromanipulator | Saur Laborbedarf | For microinjection | |
| Thermomixer copact | Eppendorf | Thermoblock for tempering the low melting agarose | |
| SZ61 (Stereomicroscope) | Olympus | For injection control | |
| Axio Zoom. V16 | Zeiss | For embedding and imaging | |
| ApoTome.2 slider | Zeiss | For optical sectioning | |
| AxioCam MRm | Zeiss | For image acquisition | |
| ZEN 2012 | Zeiss | Imaging software |
References
- Lieschke, G. J. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Drummond, I. A. Kidney development and disease in the zebrafish. J Am Soc Nephrol. 16 (2), 299-304 (2005).
- Drummond, I. A., et al. Early development of the zebrafish pronephros and analysis of mutations affecting pronephric function. Development. 125 (23), 4655-4667 (1998).
- Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3 (10), 1922-1938 (2007).
- Kramer-Zucker, A. G., Wiessner, S., Jensen, A. M., Drummond, I. A. Organization of the pronephric filtration apparatus in zebrafish requires Nephrin, Podocin and the FERM domain protein Mosaic eyes. Dev Biol. 285 (2), 316-329 (2005).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation. Kidney Int. 73 (10), 1120-1127 (2008).
- Kreidberg, J. A., et al. Wt-1 Is Required for Early Kidney Development. Cell. 74 (4), 679-691 (1993).
- Bollig, F., et al. Identification and comparative expression analysis of a second wt1 gene in zebrafish. Dev Dyn. 235 (2), 554-561 (2006).
- Perner, B., Englert, C., Bollig, F. The Wilms tumor genes wt1a and wt1b control different steps during formation of the zebrafish pronephros. Dev Biol. 309 (1), 87-96 (2007).
- Schnerwitzki, D., et al. Alternative splicing of Wilms tumor suppressor 1 (Wt1) exon 4 results in protein isoforms with different functions. Dev Biol. 393 (1), 24-32 (2014).
- Bedell, V. M., Westcot, S. E., Ekker, S. C. Lessons from morpholino-based screening in zebrafish. Brief Funct Genomics. 10 (4), 181-188 (2011).
- Rembold, M., Lahiri, K., Foulkes, N. S., Wittbrodt, J. Transgenesis in fish: efficient selection of transgenic fish by co-injection with a fluorescent reporter construct. Nat Protoc. 1 (3), 1133-1139 (2006).
- Conchello, J. A., Lichtman, J. W. Optical sectioning microscopy. Nat Methods. 2 (12), 920-931 (2005).
- Jensen, E. C. Types of imaging, Part 2: an overview of fluorescence microscopy. Anat Rec (Hoboken). 295 (10), 1621-1627 (2012).
- Chasles, F., Dubertret, B., Boccara, A. C. Optimization and characterization of a structured illumination microscope. Opt Express. 15 (24), 16130-16140 (2007).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Hsu, H. J., Lin, G., Chung, B. C. Parallel early development of zebrafish interrenal glands and pronephros: differential control by wt1 and ff1b. Development. 130 (10), 2107-2116 (2003).
- O'Brien, L. L., et al. Wt1a, Foxc1a, and the Notch mediator Rbpj physically interact and regulate the formation of podocytes in zebrafish. Dev Biol. 358 (2), 318-330 (2011).
