Summary
ここで説明する方法は、焦点平面ドリフトを補正する光学切片および再調整の単純な戦略を実行することができる顕微鏡解剖蛍光を用いて、ゼブラフィッシュ胚における器官の発達の時間経過解析を可能にします。
Abstract
器官形成を理解するために、組織の発育中に発生する空間的および時間的変化を記録する必要があります。ここで説明する方法は、構造化照明およびzスタックの取得のために装備蛍光解剖顕微鏡を用いて、ゼブラフィッシュ胚における正常および減損腎臓発生の経時分析を可能にします。腎形成を視覚化するために、トランスジェニックゼブラフィッシュ（Tgは（wt1b：GFP））、蛍光標識された腎臓構造を有するが、使用されました。腎欠陥はウィルムス腫瘍遺伝子wt1a、腎臓の開発のために重要であることが知られている因子に対するアンチセンスモルホリノオリゴヌクレオチドの注射によって誘発されました。
実験の利点は、追加の機器なしで、X、Yまたはz方向で再調整の動きのためのシンプルな戦略とズーム顕微鏡を組み合わせたものです。温度変化や機械的振動によって引き起こされる焦点ドリフトを回避します、オートフォーカス方式は、通常、必要な環境チャンバを利用するのではなく、適用されました。 XYドリフトによる位置変化を再調整するために、インプリント再配置グリッドの撮像チャンバーを使用しました。
このような共焦点レーザー走査または光シート顕微鏡などの光学切片とタイムラプス撮影のために、より複雑な設定と比較して、ズーム顕微鏡は、取り扱いが容易です。また、そのようなフィールドの高い深さと拡張作動距離などの顕微鏡固有の利点を解剖提供しています。
ここに提示器官形成を研究するための方法は、光学セクショニングすることができない蛍光実体顕微鏡で使用することができます。高スループットのために制限されているが、この技術は、通常、開発組織や臓器のダイナミクスのタイムラプス撮影のために使用される、より複雑な機器への代替手段を提供しています。
Introduction
原腸形成に続いて、器官は、個人のライフサイクルの次の段階です。これは、組織および器官を生成するために再配置、相互作用および細胞の非常に多くの場合、移行を含みます。臓器の開発の基礎をなす過程での不正確さは、多くの場合、その後の人生で直ちにまたはも現れることができる疾患につながります。したがって、理解器官形成は、発生生物学と生物医学研究における主要な取り組みとなっています。特定の器官の発達を調査することができるようにするために、それも、胚の体壁を通して可視でなければなりません。これは、開発中に発生する空間的、時間的変化の記録を可能にします。また、器官形成に関与する因子の重要性を分析するためには、操作の影響を受けやすいことが必要です。
in vivoでの器官の調査のために非常に適している一つの生物はゼブラフィッシュです。そのtranspar蛍光トランスジェニック系統の使用と組み合わせて、胚発生時のencyは、タンパク質の局在と発現動態の観察だけでなく、内臓1の可視化を可能にします。これは、その臓器顕微鏡分析のためにアクセスできません哺乳動物のモデルに比べてリアルタイムで臓器開発の調査に関するユニークな利点を提供します。また、異なるツールは、ゼブラフィッシュの胚発生を操作するために利用可能です。変異株の生成の横に、アンチセンスモルホリノオリゴヌクレオチド（MO）は、特定の器官の発達に関与する特定の遺伝子の活性をノックダウンするために使用することができます。 MOはスプライス部位または翻訳開始コドン（8月）を対象とし、それにより、プレmRNAのスプライシングまたは翻訳を妨害するのどちらか。
ゼブラフィッシュの胚性腎臓、前腎は、腎臓の開発とGENの機能を研究するために、解剖学的にシンプルですが、貴重なモデルです腎臓病2に関連したエス。これは、ネフロンと呼ばれる2つだけの機能ユニットで構成されています。各ネフロンは、血液濾過が行わ3を取る糸球体で構成されています。さらなる成分は、短いネック領域だけでなく、排出腔4で終了溶質およびダクトの分泌及び再吸収のためのセグメント化された細管、です。かかわらず、そのシンプルな構成の、組織とゼブラフィッシュ前腎の異なる種類の細胞は、哺乳動物の腎臓5,6と非常によく似ています。
腎臓の開発に決定的に関与している要因の一つは、ウィルムス腫瘍抑制遺伝子WT1 7によってコードされます。ゼブラフィッシュはwt1aと呼ばれる2つのパラログを有し、前腎8の開発中に重複するが同一でないパターンで発現されているwt1b。 GFP標識前腎構造を有するトランスジェニックゼブラフィッシュを使用することにより、wt1aの完全なノックダウンが示されています</ em>のまたは特定のスプライス型のは、それぞれ9,10、胚性腎臓の重度または軽度の奇形につながります。
ここで説明する方法は、構造化照明を介して光切片用に装備した蛍光解剖顕微鏡を用いることにより、ゼブラフィッシュ胚における正常および減損腎形成の経時分析を可能にします。一般的に、光学切片は、合焦の情報を含む画像の取得を可能にします。焦点外の情報は、数学的ア ルゴリズム（ 例えば 、デコンボリューション）、光学設計（ 例えば 、共焦点レーザ走査顕微鏡法）、または両方の組合せ（ 例えば、構造化照明）など様々な手法によって回避することができます。
腎臓発生の欠陥を誘導するために、我々はトランスジェニックゼブラフィッシュの行（：GFP）のTg（wt1b）に注入したwt1aに対するアンチセンスMOを使用していました。この行は、糸球体、首と前にGFP蛍光を示しています細管9,10の一部。このようなレーザ走査または光シート顕微鏡などの光学切片とタイムラプス録画のためのより複雑なセットアップと比較して、ズーム顕微鏡は、取り扱いが容易で安価です。また、構造化照明のための装置は、容易にこのような拡張された作動距離と広い視野のような従来の蛍光機器（ 例えば 、蛍光灯、フィルタ）、顕微鏡固有の利点を解剖オファーと組み合わせることができます。ドリフトの問題は通常、安定した結果を得るために必要な追加機器（環境室、除振台）を使用せずに解決されました。オートフォーカス戦略を確立したと刷り込ま移転グリッドの撮像チャンバはxまたはy方向のドリフト次の位置を再調整するために利用された焦点ドリフトを修正するには。
提示された方法はまた、蛍光ステレオmとして、光学切片のオプションなしで顕微鏡にも適用することができますicroscopesと正常に発達した組織や臓器のダイナミクスのタイムラプス撮影のために使用される、より複雑な機器への代替手段を提供しています。
Protocol
全ての動物実験は、「実験動物のケアの原則」と同様に動物の保護に関するドイツの法律の現在のバージョンに従って行いました。
アンチセンス・モルホリノ（MO）の調製
- 3 mMのMOストック溶液を調製し、凍結乾燥したMO（ガラスバイアル中300ナノモル）に滅菌超純水100μlを追加します。完全な溶解のために、5分間65℃までストック溶液を加熱します。パラフィルムでバイアルを密封し、室温（RT）でMO原液を格納します。それがバイアル壁とMOの会合を引き起こす可能性があるため、MOストック溶液を冷却しないでください。
- 滅菌超純水でMOストック溶液を希釈して1mMのMOワーキング溶液を調製し、0.05％の最終濃度を0.5％フェノールレッド溶液を加えます。
- MOワーキング溶液10μlを取得するには、3.3μlのMO原液と5.7μlの水に0.5％フェノールレッド溶液1μlを追加します。あります作業溶液の新しいバッチを調製前部を5分間65℃にMOストック溶液を加熱します。
- 針の目詰まりを防止するために、遠心MOワーキング溶液を使用前に。たとえば、5分（RT）を15,000×gでMOストック溶液10μlをスピンし、注射のための上清の8μLを削除します。
注：活動の損失は時間11にわたってホリノソリューションで発生することがあります。これを除外するためには、製造業者によって供給されたプロトコルに従って、UV分光分析によりソリューションをテストすることができます。使用する場合にはwt1a（3 mMのワーキング溶液は長い1よりも格納されていた減少効果は、ストレージの長い期間にわたって観察されなかったモルホリノ年）。
2.交尾ペアを設定し、受精卵のコレクション
- ライン、取り外し可能なふるいを装備した飼育容器内の各分離するために：午後は、マイクロインジェクション前に、Tgは（GFP wt1b）の5組を設定しました夜の間に雄と雌。
注：十分な卵が成功注入実験のために利用可能であることを確認するには、交配のペアとして使用される魚が良い "プロデューサー"として事前にスクリーニングされ、評価されている必要があります。 - ライトがオンにした後に次の日の朝、それらの卵を食べてから魚を防ぐふるいの上に一緒にオスとメスを入れました。
- 産卵を見ます。卵の量は、4細胞期に到達する前に注入することができる配置されている一回（約50）、再び女性から分離男性。注射の最初のラウンドのための胚の水で満たされたペトリ皿にパスツールピペットで卵を移します。卵のさらなるラウンドを取得するには、一緒に、別の複数回交尾ペアを配置します。
マイクロインジェクションのため3.準備作業
注：事前に手順3.1と3.2を実行します。
- 注入（マイクロインジェクション皿）の間の位置に胚を保持している料理を準備するには、GLを挿入します液体、透明、純粋な、食品グレードのシリコンを充填した94ミリメートルペトリ皿に40〜45°の角度でお尻のスライド。シリコンが硬化するときに、スライドを削除します。すなわち、シリコン層に溝を生成します。
注：また、珪素の代わりに1.5から3パーセントのアガロースを使用し、4℃で料理を保存します。 - 針プラーとガラスキャピラリーから注射針を生成します。
- 内部のフィラメントが含まれている毛細血管を使用してください。
注：フィラメントは（3.3を参照）埋め戻した後、針の先端に向かってMOソリューションを輸送するのに役立ちます。 - 針プラー上で適切な設定を確立します。ゼブラフィッシュへの注入のための良い針は長くて細い先端12を持っている必要があります。約10mmの長さとその最後の最後で1.5〜2ミクロンの直径を有する先端を生成します。 =、ベロシティ= 40、時間= 100 0を引いて、ヒート= 330：たとえば、次の設定で水平ニードルプラーを使用します。
- 下針の品質を調べ解剖顕微鏡と短いまたは長すぎるのヒントを持つものを整理。
注：短いヒントと針が非常に長く、細い先端の曲がりと、このような絨毛膜に触れたときにしながら、胚を損傷する傾向があり、それを貫通しません。
- 内部のフィラメントが含まれている毛細血管を使用してください。
- microloaderチップを使用してMOワーキング溶液2μlの針を埋め戻し及びマイクロインジェクション装置の針ホルダに挿入します。
- 針が先端に閉じられるように、解剖顕微鏡下での鋭いピンセットで針の非常にバックエンドをつまんで開口部を生成します。代わりに軽く剛性の表面（ 例えば小さな金属ブロックやピンセットの背面）に先端をプッシュするマイクロインジェクション装置を使用しています。
- 目盛上に配置された鉱物油の滴にMO作動液を注入して注入量を較正します。約200μlの注入量を得るために、75ミクロンの液滴直径を製造するための噴射期間を調整します。
- 針は（溝の45°の角度に向けて）来て、そこからの方向に向かって植物極を持つマイクロインジェクション皿の溝に沿って1細胞期の胚を配置します。
- 針で絨毛膜と卵黄を穿孔し、1〜2細胞期胚の卵黄に1 mMのMO作業溶液（0.2ピコモル）の200 PLを注入。
- 広い開口部でパスツールピペットを用いて、胚の水で満たされたペトリ皿に注入した胚のすべてを収集し、28.5℃でそれらをインキュベートします。
- 午後には、広い開口部でパスツールピペットを使用して死んだ胚を除去し、胚の水を交換してください。
in vivoイメージングのための胚の5準備
- 翌朝は、メラニンを抑制するために0.003％N-フェニルチオ尿素（PTU）を含む胚水で胚の水を交換してください。そのため、原腸形成の終了前にPTUを適用しないでくださいINTERF初期胚発生でERES。
注意：PTUは毒性と催奇形性です。常に手袋を着用し、吸入を避け、皮膚との接触。 - 希望の発達段階での解剖顕微鏡下で鋭いピンセットで胚をDechorionate。ピンセットの1組と絨毛膜をつかみ、ピンセットの第二の対と絨毛膜の反対側をつかむためにしてみてください。慎重に胚を破壊することなく、反対方向にピンセットを引きます。
- 胚PTUを含む水（0.003％）、0.02％エチル3-アミノベンゾエートメタンスルホネート（トリカイン）とPTU（0.003％）を含有する胚の水を置換することにより、胚を麻酔。
- 50μmの再配置グリッドとカバーガラス底μ-皿に低融点アガロースで胚を埋め込みます。適切な埋め込みは、いくつかの練習が必要です。
- 1.5ミリリットルの反応管に0.7％アガロースの1mlアリコートを準備し、36℃に設定したヒートブロック上に置きます。 TRAの広い開口部をパスツールピペットを使用して、μ-皿に胚nsfer。超薄型チップでパスツールピペットを用いて、余分な胚の水を除去し、焼戻し、アガロースで胚を重ねます。
- アガロースはまだ液体である一方で、関心のある構造と同様に再配置グリッドまでの距離に関して、所望の位置に2ゲルローダーのヒントで胚を向けます。 （：ダウン背ここ）とグリッドに近接したガラス底のできるだけ近くに（ここでは前腎）関心の構造を置きます。
- 最適な画像品質のために底にできるだけ近い胚の関心の構造を配置することにより、胚とガラス底部との間のアガロース層を最小限に抑えます。それに加えて、グリッドに近接して胚を見つけたが、グリッドは、関心のある構造とオーバレイされません注意してください。埋め込み異なるμ-皿中の3-4胚それぞれ最高の配置されているものを使用します。
- アガロースは2のための胚の待ち時間を保持するのに十分な困難であるとき-3分とは、0.003％のPTUと0.02％トリカインを含む胚の水で埋め込まれた胚を重ねます。過剰胚の水をデカントまたは超薄型チップでパスツールピペットを使用して削除。蒸発を防ぐために、ロック位置でμ-皿の蓋を閉じます。
注：これらは画像記録を損なうとして、μ-皿の中の気泡の発生を避けてください。
6.顕微鏡
注：構造化照明を介して光切片用に備えた顕微鏡を使用してください。マルチチャネル、Zスタック、時系列、ソフトウェアオートフォーカスおよび拡張フォーカス：以下のモジュールを含むソフトウェアで録音イメージ。
- Z-スタックの取得
- μ-皿を反転。ガラスボトムは今客観的に向いているとμ-皿は、イメージング室となります。
- グリッド位置にスライダーを切り替え、ソフトウェアのコントロールで構造化照明モードを有効にします。
- 調整しますフォーカスキャリブレーションウィザードの指示に従うことによって検査されるべき試料と、選択したチャネル（複数可）のためのグリッド・フォーカス（埋め込まれた胚）。
- zスタックの取得モードをアクティブにして、センターモードに設定します。試験片の中央に集中し、 センターをクリックすることで、Z-スタックの中心面として設定します。中心位置の周りに範囲を定義することで、zスタックの大きさを設定します。
注：オブジェクトの構成は、第1およびzスタックの最後の面外に急激に見られるべきではありません。 - 光学切片間の間隔を調整します。最良のz解像度のための最適なボタンをクリックします。フィールドの目的の深さに基づいてソフトウェアがナイキストクリテリウム（50％オーバーラップ）次の推奨距離を設定します。
注：小さいファイルサイズと構造の許可を目指す場合は、手動でより大きな間隔のサイズを設定します。推奨よりも小さなステップを設定するだけで、後に増加させることなく、より大きなファイルサイズになりますアル情報。
- タイムラプスイメージング
- 時系列ツールを開いて、時系列実験の間隔を設定します。例えばレコードzスタック画像のための5時間かけて30分毎に。
- 時間をかけて焦点ずれを補正するために、オートフォーカスの計画を立てます。フォーカス戦略のダイアログボックスをチェックし、ドロップダウンリストから[ソフトウェアオートフォーカスを選択し、基準チャネルとしてTL-明チャネルを選択します。
- オートフォーカスで各時点を開始します。最適化された時間枠内で信頼性のある探索範囲を確保するために、固定された200μmの相対的な探索範囲を設定します。この範囲は完全に最大ステップサイズ（サンプリングパラメータ）における基本的な品質（品質パラメータ）と（範囲カバレッジパラメータ）を走査します。
- オートフォーカスの精度を高めるために、焦点関心領域（ROIを集中）と位置内に計量を活性化させる関心のある構造の周りのライブビューウィンドウにフォーカスROIを述べました。
注：もしシステムは、所定の時間に実験を一時停止して、手動でピントを調整し、実験を継続し、タイムラプス撮影時に自動的に中央のz位置を更新するソフトウェアオートフォーカスモジュールを欠いています。 - 時系列の記録中に潜在的なのxy-ドリフトを補償するために、ソフトウェアの十字線に（撮像チャンバーの）インプリントされ、グリッドの特定のポイントを配置し、スクリーンショットをすることによって、位置決めを保存します。
- 時系列の実験を開始します。シリーズ間隔が終わった時間の前に、スクリーンショットによると、実験や、必要に応じて、再調整の位置決めを一時停止します。実験を続行します。
7.画像処理
- 処理]タブに切り替えて、メソッドのダイアログボックスにフォーカス（EDF）の拡張深さを選択します。光学切片を取得しているため、画像シリーズに最大投影アルゴリズムを適用します。
注：ここではアルゴリズムはBRを投影しますightestまたは第一段階で合成2D画像のスタックから最も暗いピクセルと、最終的には、各時点で結果画像として最高分散のいずれかを使用します。 - EDFの画像シリーズのうち、タイムラプスムービー（ 例えば aviファイルまたは移動ファイル）を作成するムービーExportメソッドを使用します。
Representative Results
タイムラプス顕微鏡は、長期間にわたってダイナミックな生物学的プロセスを監視する強力な手法です。タイムラプスイメージング中に頻繁に発生する問題は、温度変化や機械的振動によって誘発されるドリフトと呼ばれるX、Y、またはz方向の移動、です。ここで紹介する方法は、環境室と除振台なしに解剖顕微鏡上のゼブラフィッシュの胚や幼生での蛍光標識された構造を記録するタイムラプスを可能にします。
XYドリフトの補償のために、試料は、インプリント再配置グリッド（ 図1）と撮像チャンバ内に埋め込 まれました。ソフトウェア・ツールの十字線に関連したグリッドの特定の点の位置は、事前調整位置（ 図2A）に試料を返すために使用されました。示された結果は、ズーム顕微鏡を用いて得ました。構造化照明（ 図2B）を介して光学切片のための統合されたスライダーで。連続焦点補正のため、オートフォーカス戦略を確立しました。この戦略では、ソフトウェアのオートフォーカスは、すべての時点の前に最大のコントラストに基づいて焦点を見つけるために使用されます。このように定義された焦点面は、その後、zスタックの取得のための中央計画として設定されています。それはオートフォーカスステップ（ 図2C）中に十分に短い露光時間を可能にするように、サンプル中の光毒性を最小限にするために、透過光の明視野チャネルを基準チャネルとして使用されます。
この方法は、トランスジェニックゼブラフィッシュラインの制御及びwt1aモルファント胚（：GFP）のTg（wt1b）における腎臓発生の比較分析のために適用しました。早期腎形成の間、この行は中間中胚葉で緑色の蛍光を示し、腎前駆細胞は、9,10以降から生じました形成細管とネフロン原基（ 図3）インチ
タイムラプス画像記録が制御モルホリノ注入胚における腎形成を注射していないものと比較して変更されていない（結果は示されていない）と早期ゼブラフィッシュ腎臓開発3の説明する手順を以下のことが明らかになりました。開発前腎細管HPF 20で表示され、その前方の先端に、形成ネフロン原基を表す細胞の球状の蓄積を検出することができます。次の時間、尿細管およびネフロン原基の間に成長し、それ以降の原基上の正中線（ 図4、映像2）で融合し始めます。これとは対照的に、腎形成に重大なwt1aのモルファント胚で破壊されています。 GFP陽性の管状構造は20 HPFで表示されているが、それらはより拡散し、発展途上であるように思われます。また、全く適正ネフロン原基が形成されていません。トンへの最も著しい違い彼はこの時点で、胚を制御するが、（ 図4、映像2）現像前腎外蛍光細胞が多数出現します。その後、これらの細胞は前腎フィールドを離れると腹側（ ビデオ2）を移行します。
wt1bトランスジェニック系統の制御胚およびwt1aのモルファントにおける腎臓の開発は以前に別の一定の時間点9,10で画像を撮影することにより比較されてきました。この静的メソッドとは対照的に、タイムラプス撮影はwt1a枯渇によって引き起こされる腎前駆細胞の正常な腎形成とmisroutingのダイナミクスに追従することができます。
図1：再配置グリッド有する市販の商工会議所に埋め込 まれた胚の概略図 。料理は持っています4グリッド、50μmの反復距離に細分それぞれ、カバーガラスの底にインプリント。撮像される胚を観察広場に近接した腎臓の構造ではなくグリッドに重ね合わせずに、逆さまに埋め込 まれている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：タイムラプスイメージングと構造化照明のグリッド投影におけるドリフトの補償のための調整の再配置グリッドの個別の位置は（黄色の十字線でマーク）画像中心に持ってきて、それ以降のXYアライメント用の基準点として機能しました。小さなシフトの場合インチ赤い長方形は、オートフォーカス方式（A）で使用される関心領域（ROI）を表します。光学切片府構造化照明によって得られた秒。画像が正しく較正（B）の後焦点面に投影された格子構造を示します。オートフォーカス戦略（赤い四角形）のためのROIが関心（C）の構造に信頼性の高いオートフォーカスを可能にする（体節ここ）コントラストの高い独特の胚の構造をカバーするように設定されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：トランスジェニック wt1b：緑色蛍光を持つ GFP 胚の開発腎臓における背側（A）または横方向（B）伝送および蛍光画像のオーバーレイは、左の前方で示されています。 NP、ネフロン原基。 PT、前腎管;まあまあダニ。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：wt1aのノックダウンは代表、タイムラプス記録からフォーカス画像の拡張深胎児腎臓開発が中断されます。制御モルホリノ注入胚では、腎臓の開発は正中線で融合するために開始し、成長細管とネフロン原基と通常の進行状況が表示されます。これとは対照的に、wt1aのモルファントは、適切なネフロン原基とGFP陽性細胞の大規模な量を形成するために失敗する前腎フィールドの外にあります。 （NP、ネフロン原基; PT、前腎管）。 このFiのの拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。グレ。
制御モルホリノ注入胚における正常な腎臓発生の補足ビデオ1.タイムラプス記録。 （右クリックしてダウンロード）。ビデオは、細管が成長を示し、およびネフロン原基が融合し始めます。 20 HPFで始まる、画像は5時間にわたって30分間隔で採取しました。
補足ビデオwt1aモルファント胚における乱れ腎形成の2タイムラプス記録。 （右クリックしてダウンロード）。ビデオは前腎領域外GFP陽性細胞の遊走を示しています。 20 HPFで開始し、画像は30マイルで撮影されました5時間かけて、n個の間隔。
Discussion
ゼブラフィッシュは、ヒト疾患の脊椎動物の発生とモデリングの研究のための人気のモデル生物となっています。ゼブラフィッシュ胚は透明なままであるため、脳や心臓などの現像器官は、標準品の顕微鏡を用いて観察することができます。臓器特異的な蛍光を有するトランスジェニックラインの利点を取ることは、蛍光顕微鏡によって生きている胚内の発達の異なる段階を通じて器官の評価を可能にします。標準的な落射蛍光顕微鏡と全器官の構造の詳細を画像化するための1つの制限は、焦点面の上下にオブジェクトからの信号の影響です。この焦点外の光がない減少し、画像のコントラストや解像度で唯一の結果は、それはまた、関心13,14の重要な構造を曖昧にすることができます。ディスクconfocal-または多顕微鏡紡糸、レーザ走査confocal-ようないくつかの技術が、焦点外の情報とそれによってincreasを最小化するために開発されています電子画像のコントラストだけでなく、軸方向の解像度。光学切片を得るための別の方法は、レーザー-とスキャン無料の構造化照明顕微鏡、定期的な顕微鏡15に実装が簡単であり、広視野ベースの照明技術です。ここに提示した結果は、構造化照明によって達成光学切片は、解剖顕微鏡上に実装し、拡張焦点画像の再構成と組み合わせることを示し、正常の構造的詳細の可視化を可能にし、ゼブラフィッシュで腎臓の発達を妨げ。特に、wt1aのモルファントにおけるGFP陽性細胞は、様々な焦点深さで分散しており、焦点外れによるぼけとの1面のみの画像は、表現型の3次元複雑さを過小評価することになります。
臓器組織、転位や中断のダイナミクスに従うには、タイムラプス蛍光顕微鏡は、複雑な技術ではあるが強力です。タイムラプスの間イメージングわずかな振動やマイナーな温度の変動は、x、yのまたはz方向のドリフトを引き起こします。これは、安定した結果を得るために、追加の機器（環境チャンバ、除振台）を要求します。提示された方法は、余分な装置なしタイムラプス映像を記録するための電動式フォーカス駆動で解剖顕微鏡の機能を使用しています。安定したフォーカスを維持するために、オートフォーカス方式が確立され、撮像チャンバーの底に刻印再配置グリッドは、x、y軸の不安定性を補正するために使用しました。
胚の適切な埋め込みは、プロトコル内の重要なステップです。いくつかの練習は、それと重ね合わせずにガラス下部に、グリッドに近い付近にできるだけ近い関心のある構造を配置するために必要とされます。
この方法の主な利点は、そのような生活での成長や移行などの発生過程の直接観察のための手頃な価格とシンプルなツールであるということです数時間にわたって胚。また、このような大きな視野および拡張作動距離などの解剖顕微鏡固有の利点は、全体の臓器を含むより大きなサンプルの検査を容易にします。しかし、いくつかの制限が念頭に置いておく必要があります。位置を確認し、再調整するための実験の一時停止は、手続きの時間がかかり、堅牢な温度制御の欠如は、ゼブラフィッシュ16のために28.5℃で時間後に受精のように定義されている「標準」発生時に、変更することができます。別の潜在的な問題は、目的の構造が胚または幼虫の内側に配置される場合は特に、動物に撮像限定深さです。このような構造は、体節と卵黄嚢の間に位置しているゼブラフィッシュ前腎糸球体、です。糸球体を撮像するための制限深さは約200μm、開発の5日後に到達した距離であることが見出されました。対照的に、L蛍光構造であること長時間画像化することができる動物の表面に近いocated。例えば、肝細胞は、少なくとも9 DPFまで画像化のためにアクセス可能です。さらなる制限は、アガロースで胚または幼虫の長期固定化およびトリカイン処理はそれぞれ、成長遅延および心臓浮腫を誘導することです。これは正常な発達を妨げる可能性があるので、関心のある特定の期間にタイムラプス撮影の持続時間を制限することをお勧めします。関心の撮像構造中に正常にそれを開発することを確実にするために（最後に）動物のものと全体的な外観を比較することが有用であるのと同じ実験条件ではなく埋め込み、麻酔なしで続けました。
光学切片のzスタックを記録フォーカス画像の拡張深さの5時間とその後の計算の期間にわたって30分ごとに、通常の初期事象に関する空間的、時間的な情報を提供し、bは誘導された腎臓の開発を妨げwt1aのyモルホリノによるノックダウン。一定時間でのイメージング前腎の開発のためのGFPのラインは9,10ポイントを明らかにした：以前行っモルフォリノノックダウン実験はすでに腎臓マーカー17,18およびトランスジェニックwt1bの雇用とin situハイブリダイゼーションWt1aは前腎形成の早期かつ重要な役割を果たしていることを示しています破壊された糸球体の形態形成におけるそのwt1a欠乏結果と足細胞の仕様に失敗しました。これらの静的なアプローチとは対照的に、時間の経過記録は、直接コントロール胚と離れwt1aのモルファントで前腎領域から、GFP陽性細胞の遊走に早期腎形成のダイナミクスを可視化します。時間をかけて誤ってルーティング細胞を追跡する可能性は、より詳細な表現型解析を可能にします。
一般的には、ここに提示された方法は、安価かつ複雑に代替を使用して簡単に提供し、アクセスしにくいSEtupsは、通常、（環境室と除振台を装備した）レーザー走査顕微鏡や光シート顕微鏡のようなタイムラプスイメージングのために使用されます。ドリフト問題を解決するための説明ルーチンはまた、蛍光実体顕微鏡のような光学セクショニングオプションなしでセットアップ上のタイムラプス画像を実行するために適用することができます。
技術だけでなく、腎臓の発達を調査するのに適しているだけでなく、心臓や肝臓などの他の器官の正常な欠陥形態形成を監視するために適用することができます。さらに、この方法は、創傷治癒または再生等の胚および成体のモデル生物における種々の多くの動的プロセスを観察するために使用することができます。
Disclosures
著者マイケル・グラーフは、この記事で使用する楽器を作り出すカールツァイス顕微鏡GmbHの従業員です。
Acknowledgments
私たちは、批判的に原稿を読み取り、改善するためのトーマス・ベイツに感謝します。また、魚のメンテナンスのためにクリスティーナ・エバートとサブリナStötzerに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Control Morpholino | Gene tools, LLC | Standard control oligo | Prepared control oligo |
| wt1a Morpholinos | Gene tools, LLC | customized | Designted to target the first splice donor site, sequence as published in Ref. 9 |
| 0.5% Phenol red solution | Sigma | P0290 | Injection tracer |
| peqGOLD universal agarose | peqlab | 35-1020 | To prepare microinjection dish |
| Glass capillaries (GC100F-10) | Hugo Sachs Elektronik | 30-0019 | To generate injection needles |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | To load the microinjection needle |
| Dumont forceps | Fine Sience Tools | 91150-20 | To generate an opening at the needle tip |
| Embryo water (0.3x Danieaus´ solution) | 1x: 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4, 0.6 Ca(NO3)2, 5 mM HEPES, pH: 7,5; Do not add methylene blue! | ||
| Graticule 5 mm/0.05 mm | Science Services | PY68039-02 | For calculation of injection amount |
| Pasteur pipette 137 mm, 4.8 ml | Roth | E305.1 | To collect eggs, to transfer embryos and to remove dead embryos |
| Pasteur pipette with ultra-thin tip 157 mm, 3.5 ml | Roth | E304.1 | To remove excess of water |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma | P7629 | For suppression of melanization |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma | E10521 | To anethesize zebrafish |
| Low melting agarose | Biozym | 850111 | For embedding |
| µ-dish 35 mm, high Glass Bottom Grid-50 | ibidi | 81148 | Imaging chamber |
| Gel loader tips | Hartenstein | GS05 | To orient the embryo for proper embedding |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Micropipette puller (model P-97) | Sutter Instrument | To generate injection needles | |
| Micromanipulator | Saur Laborbedarf | For microinjection | |
| Thermomixer copact | Eppendorf | Thermoblock for tempering the low melting agarose | |
| SZ61 (Stereomicroscope) | Olympus | For injection control | |
| Axio Zoom. V16 | Zeiss | For embedding and imaging | |
| ApoTome.2 slider | Zeiss | For optical sectioning | |
| AxioCam MRm | Zeiss | For image acquisition | |
| ZEN 2012 | Zeiss | Imaging software |
References
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