Summary
Metoden er beskrevet her kan time-lapse analyse av organutvikling i sebrafisk embryoer ved hjelp av en fluorescens dissekere mikroskop stand til å utføre optisk seksjonering og enkle strategier for omstilling for å rette fokus og planar drift.
Abstract
For å forstå organogenese, de romlige og tidsmessige forandringer som oppstår under utvikling av vev trenger å bli tatt opp. Metoden er beskrevet her kan time-lapse analyse av normal og nedsatt nyre utvikling i sebrafisk embryoer ved hjelp av en fluorescens dissekere mikroskop utstyrt for strukturert belysning og z-stack oppkjøpet. For å visualisere nephrogenesis, transgen sebrafisk (Tg (wt1b: GFP)) med fluorescensmerkede nyre strukturer ble brukt. Nyreskader ble utløst ved injeksjon av et antisens oligonukleotid morfolino mot Wilms tumor genet wt1a, en faktor som er kjent for å være avgjørende for utvikling nyre.
Fordelen med den eksperimentelle oppsettet er kombinasjonen av en zoom mikroskop med enkle strategier for re-justering bevegelser i x, y eller z-retningen uten ekstra utstyr. For å omgå fokal avdrift som er indusert av temperaturvariasjoner og mekaniske vibrasjoner, En autofokus strategien ble brukt i stedet for å benytte en vanligvis nødvendig miljøkammeret. For å re-justere posisjonsendringer på grunn av en xy-drift, ble bilde kamre med trykt flytte nett ansatt.
I forhold til mer komplekse oppsett for intervallopptak med optisk seksjonering som confocal laserskanning eller lyse ark mikroskoper, er lett å håndtere en zoom mikroskop. Dessuten tilbyr det dissekere mikroskop-spesifikke fordeler som høy dybdeskarphet og en utvidet arbeidsavstand.
Fremgangsmåten for å studere organogenese presentert her, kan også brukes med fluorescens stereomikroskop ikke er i stand til optisk snitting. Selv om begrenset for høy gjennomstrømning, denne teknikken tilbyr et alternativ til mer komplisert utstyr som vanligvis brukes for intervallopptak for å utvikle vev og organ dynamikk.
Introduction
Etter gastrulation er organogeneseperioden den neste fasen av et individs livssyklus. Det innebærer den omleiring, samhandling og meget ofte migrasjon av celler til å produsere vev og organer. Unøyaktighet i de prosesser som ligger bak utvikling av organer fører ofte til sykdommer som kan manifestere seg enten umiddelbart eller også senere i livet. Dermed forstå organogeneseperioden har vært en stor innsats i utviklingsbiologi og biomedisinsk forskning. For å være i stand til å undersøke utviklingen av et spesielt organ, må den være synlig selv gjennom kroppsveggen av embryoet. Dette muliggjør opptak av de romlige og tidsmessige forandringer som oppstår under utvikling. Også for å analysere betydningen av faktorer involvert i organogenese, må den være utsatt for manipulering.
En organisme som er svært egnet for undersøkelse av in vivo organogenesen er sebrafisk. dens gjennoency under embryonal utvikling i kombinasjon med bruk av fluorescerende transgene linjer tillater observasjon av protein lokalisering og uttrykk dynamikk, så vel som den visualiseringen av de indre organer 1. Dette gir en unik fordel om etterforskningen av organutvikling i sanntid i forhold til pattedyr modeller som organer er utilgjengelige for mikroskopisk analyse. Videre ulike verktøy er tilgjengelige for å manipulere embryonal utvikling av sebrafisk. Ved genereringen av mutante linjer, kan antisense-oligonukleotider morfolino (MO) anvendes for å knockdown aktiviteten av visse gener som er involvert i utviklingen av enkelte organer. Mos enten målrette en spleisesete eller translasjonsstartkodonet (august), og dermed forstyrre skjøting av pre-mRNA eller oversettelse.
Sebrafisk embryonale nyre, de pronephros, er en anatomisk enkelt, men verdifull modell for å studere nyre utvikling og funksjon av genes knyttet til nyresykdommer 2. Den består av bare to funksjonelle enheter kalt nephrons. Hver nephron består av en glomerulus hvor blodfiltrering foregår tre. Ytterligere komponenter er den korte halsområde, så vel som den segmenterte tubulære for sekresjon og reabsorpsjon av oppløste stoffer og den kanal, som ender i cloaca 4. Uavhengig av dens enkle sammensetning, organisering og de forskjellige celletyper av sebrafisk pronephros er svært lik pattedyrnyre 5,6.
En faktor som er kritisk involvert i nyre utvikling, er kodet av Wilms tumor suppressor-gen WT1 7. Sebrafisk har to paraloger kalt wt1a og wt1b blir uttrykt i et overlappende, men ikke identisk mønster under utviklingen av pronephros 8. Ved å bruke transgene sebrafisk med GFP-merket pronephros strukturer, har det vist seg at fullstendig knock-down av wt1a </ em> eller av en bestemt spleise skjema fører til alvorlige eller mild misdannelser i embryonale nyre, henholdsvis 9,10.
Metoden er beskrevet her kan time-lapse analyse av normal og nedsatt nephrogenesis i sebrafisk embryoer ved å ansette en fluorescens dissekere mikroskop utstyrt for optisk seksjonering via strukturert belysning. Optiske seksjoner generelt tillate oppkjøpet av bilder som bare inneholder i fokus informasjon. Out-of-fokus informasjonen kan unngås ved ulike tilnærminger som for eksempel matematiske algoritmer (f.eks. Dekonvolvering), optisk design (f.eks konfokal laser scanning mikroskopi) eller en kombinasjon av begge (f.eks strukturert belysning).
For å indusere defekter i nyre utvikling vi brukte et anti MO mot wt1a som ble injisert i en transgen sebrafisk linje (Tg (wt1b: GFP)). Denne linjen viser GFP-fluorescens i glomerulus, nakke og fremredel av rørelementet 9,10. I forhold til mer komplekse oppsett for intervallopptak med optisk snitting eksempel laserskanning eller lyse ark mikroskoper, er enkel å håndtere og billigere en zoom mikroskop. Videre kan utstyr for strukturert belysning enkelt kombineres med konvensjonell fluorescens utstyr (f.eks fluorescens lampe, filtre) og tilbud dissekere mikroskop-spesifikke fordeler som en utvidet arbeidsavstand og stort synsfelt. Problemer med drift ble løst uten bruk av ekstra utstyr (miljøkammer, anti-vibrasjon tabell) vanligvis nødvendig for stabile resultater. For å korrigere for fokus drift en autofokus strategien ble etablert og bilde kamre med trykt flytte rutenett ble utnyttet til å re-justere plasseringen etter en drift i x- eller y-retningen.
Den presenterte metoden kan også brukes på mikroskoper uten optiske snitt alternativer, for eksempel fluorescens stereo microscopes og tilbyr et alternativ til mer komplisert utstyr som vanligvis brukes for intervallopptak for å utvikle vev og organ dynamikk.
Protocol
Alle dyreforsøk ble utført i henhold til de prinsipper av forsøksdyr omsorg ", samt til gjeldende versjon av den tyske loven om beskyttelse av dyr.
1. Utarbeidelse av Antisense-Morpholino (MO)
- For å fremstille en 3 mM MO stamløsning, tilsett 100 ul sterilt, ultrarent vann til det frysetørkede MO (300 nmol i hetteglass). For fullstendig oppløsning, oppvarme stamløsning til 65 ° C i 5 minutter. Forsegl flasken med Parafilm og lagre MO stamløsningen ved romtemperatur (RT). Ikke chill MO stamløsning fordi det kan føre til en sammenslutning av MO med hetteglassvegger.
- Tilbered en 1 mM MO arbeidsløsning ved å fortynne den MO stamløsning med sterilt, ultrarent vann og tilsett 0,5% fenol rød løsning til en sluttkonsentrasjon på 0,05%.
- For å få 10 ul av en MO arbeidsløsning, tilsett 3,3 mL MO stamløsning og 1 mL av 0,5% fenol-rød løsning til 5,7 mL vann. Væreforgrunnen å fremstille en ny gruppe med arbeidsløsning oppvarme MO stamløsning til 65 ° C i 5 minutter.
- Før bruk, sentrifuger MO arbeidsoppløsning for å forhindre tilstopping nål. For eksempel, spinn 10 ul av MO stamløsningen ved 15 000 xg i 5 min (RT) og fjerne 8 pl av supernatanten for injeksjon.
MERK: Tap av aktivitet kan forekomme i morfolino løsninger over tid 11. For å utelukke dette, kan man teste oppløsninger ved UV-spektrometri henhold til protokollen fra produsenten. I tilfelle av de benyttede wt1a morfolino en redusert effektivitet ikke er blitt observert i løpet av en lengre tids lagring (3 mM arbeidsløsning ble lagret i mer enn ett år).
2. Sette opp Mating Pairs og innkreving av befruktede egg
- Ettermiddagen før mikroinjeksjon, sette opp fem par Tg (wt1b: GFP) linjer, hver i en yngle beholder utstyrt med en avtagbar sil for å skillehanner og hunner løpet av natten.
MERK: For å sikre at nok egg er tilgjengelig for en vellykket injeksjon eksperiment, fisk brukt som parring par burde ha vært pre-screenet og vurderes som gode "produsenter". - Neste morgen, etter at lysene slås på, sette den mannlige og kvinnelige sammen over silen som hindrer fisk fra å spise opp eggene sine.
- Se gyting. Når et beløp på eggene er lagt som kan injiseres før 4-cellers stadiet er nådd (ca. 50), separat male female igjen. Overfør eggene med en Pasteur-pipette inn i en petriskål fylt med embryo vann for en første runde av injeksjon. For å få flere runder med egg, plasserer en parring par sammen og separat flere ganger.
3. forberedende arbeid for Mikroinjeksjon
MERK: Utfør trinn 3,1 og 3,2 på forhånd.
- For å forberede en rett som holder embryoene i posisjon under injeksjonen (mikroinjeksjon rett) setter inn et glass lysbilde om 40-45 ° vinkel inn en 94 mm petriskål fylt med væske, gjennomsiktig, ren, mat grade silisium. Fjern lysbildet når silisium er herdet. Dette produserer et spor i silisiumlaget.
MERK: Du kan også bruke 1,5-3% agarose i stedet for silisium og lagre fatet ved 4 ° C. - Generer kanyler fra glasskapillærer med en nål avtrekker.
- Bruk kapillærer som inneholder interne filamenter.
MERK: Filamentet vil bidra til å transportere MO oppløsningen mot tuppen av nålen etter omfylling (se 3.3). - Etablere nødvendige innstillingene på nålen avtrekker. Gode nåler for injeksjon i sebrafisk bør ha lange og slanke tips 12. Generer tips med en lengde på ca. 10 mm og en diameter på 1,5-2 um ved deres meget ende. For eksempel bruke en horisontal nål avtrekker med følgende innstillinger: Varme = 330, Pull = 0, Velocity = 40, Tid = 100.
- Undersøke kvaliteten av nålene under endissekere mikroskop og sortere ut de med kort eller for lang tips.
MERK: Nåler med korte tips tendens til å skade fosteret mens slik med veldig lange og tynne tips svingen ved berøring av chorion og ikke trenge det.
- Bruk kapillærer som inneholder interne filamenter.
- Fylle nål med 2 mL av MO arbeidsløsning ved hjelp av en microloader tips og sett den inn i nåleholderen av mikroinjeksjon apparat.
- Som nålene er stengt på spissen slutten, generere en åpning ved å knipe tilbake helt i enden av nålen med skarpe pinsett under disseksjon mikroskop. Alternativt kan du bruke den mikroinjeksjon apparat for å presse forsiktig tuppen til en stiv overflate (f.eks. Små metallblokk eller baksiden av pinsett).
- Kalibrer injeksjonsvolum ved å injisere MO arbeidsoppløsning i en dråpe mineralolje plassert på et gradnett. Justere varigheten av injeksjonen for å frembringe en dråpe diameter på 75 um for å oppnå et injeksjonsvolum på omtrent 200 pl.
- Anordne en celle-trinns embryoer langs sporet i mikroinjeksjon fatet med det vegetabilske pol mot den retning hvorfra nålen kommer (i retning av 45 ° vinkel av sporet).
- Perforere chorion og eggeplomme med nålen og injisere 200 pl av 1 mM MO arbeidsløsning (0,2 pmol) inn i eggeplomme fra 1- til 2-celle-embryoer.
- Ved hjelp av en Pasteur-pipette med en bred åpning, samle alle de injiserte embryoer i en petriskål fylt med embryo vann og inkuber dem ved 28,5 ° C.
- På ettermiddagen, fjerner døde embryoer ved hjelp av en Pasteur pipette med en bred åpning og erstatte embryo vann.
5. Forberedelse av befruktede egg for in vivo avbildning
- Neste morgen, erstatte embryoet vannet med embryo vann som inneholder 0,003% N-phenylthiourea (PTU) for å hemme melanization. Ikke påfør PTU før slutten av gastrulation fordi det interferes med tidlig embryoutvikling.
FORSIKTIG: PTU er giftig og teratogent. Bruk hansker til alle tider og unngå innånding og kontakt med huden. - Dechorionate embryoene med skarpe pinsett under et disseksjon mikroskop på ønsket utviklingsstadiet. Grab chorion med en pinsett og prøver å ta den andre siden av chorion med andre pinsett. Trekk forsiktig pinsett i motsatte retninger uten å forstyrre embryo.
- Bedøve embryo ved å erstatte embryoet vann inneholdende PTU (0,003%) med embryo vann inneholdende PTU (0,003%) og 0,02% etyl-3-aminobenzoat-metansulfonat (Tricaine).
- Embed embryoet i lavt smelte agarose på et dekkglass-bunn μ-tallerken med et 50 um flytting rutenett. Riktig embedding krever litt øvelse.
- Forbered 1 ml porsjoner av 0,7% agarose i 1,5 ml reaksjonsrørene og sette dem på en varmeblokk satt til 36 ° C. Bruk en Pasteur pipette med bred åpning i Transfer embryoet til μ-parabolen. Fjern overflødig embryo vann ved hjelp av en Pasteur pipette med ultra-tynne tuppen og overlay embryoet med herdet agarose.
- Mens agarose fremdeles er flytende, orientere embryoet med to gel laster tips i den ønskede posisjon, med hensyn til strukturen av interesse, så vel som avstanden til flytting rutenettet. Plasser strukturen av interesse (her pronephros) så nær som mulig til glassbunn (her: dorsal ned) og i umiddelbar nærhet til nettet.
- For optimal bildekvalitet minimalisere agarose lag mellom embryoet og glassbunn ved å plassere strukturen av interesse for embryoet så nær som mulig til bunnen. Bortsett fra det, finne embryo i umiddelbar nærhet til nettet, men pass på at nettet ikke vil overlappe med strukturen av interesse. Embed 3-4 embryoer i ulike u-retter hver og bruke den som er plassert beste.
- Når agarose er vanskelig nok å holde fosteret ventetiden for 2-3 Min og kle den innebygde embryo med embryo vann som inneholder 0,003% PTU og 0,02% Tricaine. Dekanter skytende embryo vann eller fjerne den ved hjelp av en Pasteur pipette med ultra-tynne tuppen. Lukk lokket på μ-parabolen låst posisjon for å hindre fordamping.
MERK: Unngå forekomsten av luftbobler i μ-fatet, som de ville forringe bildeopptak.
6. Mikroskopi
MERK: Bruk et mikroskop utstyrt for optisk seksjonering via strukturert belysning. Ta bilder med en programvare som inneholder følgende moduler: Multikanal, Z-Stack, tidsrekke, programvare autofokus og utvidet fokus.
- Oppkjøp av Z-stabler
- Snu μ-parabolen. Glasset bunnen vender nå mot målet og μ-fatet fungerer som en avbildningskammeret.
- Veksle glideren inn i stillingen nettet og aktiverer strukturert lysmodusen i programvareinnstillingene.
- kalibrererutenettet fokus for kanalen (e) av valget med prøven som skal undersøkes (innebygd embryo) ved å følge instruksjonene på Calibration Wizard Focus.
- Aktiver z-Stack oppkjøpsmodus og sett den til sentermodus. Fokus i midten av prøven og sett den som senterplan z-stack ved å klikke Center. Innstille dimensjonen til z-stabelen ved å definere området rundt midtstilling.
MERK: Objekt strukturer bør ikke sees skarpt utenfor den første og den siste flyet av z-stack. - Justere avstanden mellom optiske seksjoner. For best z-oppløsning klikk på Optimal-knappen. Basert på målene dybdeskarphet programvaren vil sette en anbefalt avstand etter Nyquist kriterium (50% overlapping).
MERK: Hvis sikter til mindre filstørrelser og strukturen tillater det, sette en større avstand størrelse manuelt. Innstilling mindre trinn enn anbefalt vil bare føre til større filstørrelser uten å øke senereal informasjon.
- Time-lapse Imaging
- Åpne Time Series-verktøyet og sette intervallet av tidsserier eksperiment. For eksempel rekord z-stack bilder hvert 30 min i løpet av en periode på fem timer.
- For å korrigere for fokus drift over tid, sette opp en autofokus strategi. Sjekk Focus Strategi dialogboksen, velg Programvare Autofokus fra rullegardinlisten og velg TL-Lysfelt kanal som referansekanal.
- Begynn hvert tidspunkt med autofokus. For å sikre en pålitelig søkeområde innenfor en optimalisert tidsramme, satt en fast 200 mikrometer relativ søkeområde. Denne serien er fullt skannet (Range Dekning parameter) med grunnleggende kvalitet (Kvalitet parameter) i maksimalt trinnstørrelse (Sampling parameter).
- For å øke presisjonen på autofokus, aktiverer måling innenfor et fokus region av interesse (fokus ROI) og posisjon sa fokus ROI i live view-vindu rundt strukturen av interesse.
MERK: Hvissystemet mangler Programvaren autofokusmodul som oppdaterer sentrum z-posisjon automatisk under intervallopptak, stanse forsøket på et gitt tidspunkt og justere fokus manuelt og fortsette eksperimentet. - For å kompensere for en potensiell xy-drift i løpet av serien opptakstid, plassere et bestemt punkt av trykt rutenettet (på bilde kammer) i trådkorset av programvaren og lagre posisjonering ved å lage en skjermdump.
- Start tidsserier eksperimentet. Før tidsserien intervallet er over, stoppe forsøket og, om nødvendig, re-justere posisjonering i henhold til skjermbilde. Fortsett med forsøket.
7. Bildebehandling
- Bytt til fanen behandling og velg utvidet dybdeskarphet (EDF) i Method dialogboksen. Siden optiske delene er kjøpt, gjelder maksimal projeksjon algoritme til bildeserien.
MERK: Her algoritmen vil projisere brightest eller den mørkeste pixel fra bunken til et sammensatt 2D-bilde i et første skritt og til slutt bruke den med høyest varians som følge bilde for hvert tidspunkt. - Bruk Movie Export metode for å lage en time lapse film (f.eks avi eller flytte filer) ut av EDF bildeserie.
Representative Results
Time-lapse mikroskopi er en kraftfull teknikk for å se på dynamiske biologiske prosesser over en lengre periode. Et ofte forekommende problem i løpet av time-lapse imaging er en bevegelse i x, y eller z-retningen, kalt drift, som er forårsaket av temperatursvingninger og mekaniske vibrasjoner. Metoden som presenteres her muliggjør time-lapse opptak av fluorescensmerkede strukturer i sebrafisk embryoer eller larver på en dissekere mikroskop uten miljøkammer og antivibrasjonsbord.
For kompensasjon av xy-drift, ble prøven innebygd i en avbildnings kammer med en trykt flytting grid (figur 1). Plasseringen av et bestemt punkt av nettet knyttet til trådkorset av verktøy ble brukt til å returnere prøven til den forhåndsinnstilt stilling (figur 2A). De presenterte resultater ble oppnådd ved å bruke en zoom mikroskopmed en integrert glidebryteren for optisk seksjonering via strukturert belysning (figur 2B). For kontinuerlig fokus korreksjon, ble en autofokus strategi etablert. I denne strategien, er programvaren autofokus brukes til å finne fokus basert på maksimal kontrast før hvert tidspunkt. Dette så definert fokusplan er senere satt som sentrum plan for z-stack oppkjøpet. For å minimalisere fototoksisitet i prøven, blir det overførte lys lysfelt kanal anvendt som referansekanal som den tillater tilstrekkelig korte eksponeringstider under autofokus trinn (figur 2C).
Metoden ble brukt for komparativ analyse av nyre utvikling i kontroll- og wt1a morphant embryoer fra en transgen sebrafisk linje (Tg (wt1b: GFP)). I løpet av tidlig nephrogenesis denne linjen viser grønn fluorescens i mellom mesoderm ble nyre forfedre oppstår fra 9,10 og senerei formings tubuli og nephron primordia (figur 3).
Time-lapse bildeopptak avslører at nephrogenesis i kontroll morfolino injisert embryo er uendret i forhold til uninjected de (resultater ikke vist) og følger de beskrevne trinnene tidlig sebrafisk nyre utvikling 3. Ved 20 HPF utviklings pronephric tubuli er synlige og på sitt fremre tips, kan sfæriske ansamlinger av celler, som representerer den danner nephron primordia bli oppdaget. I løpet av de neste timene, tubuli og nephron primordia vokse og senere på primordia begynner å smelte på midtlinjen (figur 4, video 2). I kontrast er nephrogenesis alvorlig forstyrret i wt1a morphant embryoer. Selv GFP-positive rørformede strukturer er synlig på 20 HPF, de synes å være mer diffus og mindre utviklet. Videre har ingen skikkelig nephron primordia blitt dannet. Den mest slående forskjellen til tHan styrer embryoer på dette tidspunkt, er imidlertid fremkomsten av et stort antall fluorescerende celler utenfor utviklings pronephros (figur 4, video 2). Deretter disse cellene forlater pronephric feltet og migrere ventralt (video 2).
Nyre utvikling i styrings embryoer og wt1a morphants av wt1b transgene linjen har tidligere blitt sammenlignet med å ta bilder på ulike faste tidspunkter 9,10. I kontrast til dette statiske metoden, intervallopptak gjør det mulig å følge dynamikken i normal nephrogenesis og misrouting av nyre stamceller forårsaket av wt1a uttømming.
Figur 1: Skjematisk illustrasjon av et innebygd Embryo i en kommersielt tilgjengelig Chamber med Flytte Grids. Retten harfire nett, hver delt inn i en gjentakelse avstand på 50 mikrometer, trykt i et glass dekk bunn. Embryoet som skal avbildes er innebygd opp ned, med nyre strukturen i umiddelbar nærhet til en observasjon firkantet, men uten overliggende med rutenettet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2:. Justeringer for Kompensasjon av Drift i Time-lapse Imaging og Grid projeksjon av Structured Illumination En tydelig posisjon av flytting nettet ble brakt inn i bildet sentrum (markert med gule trådkors) og fungerer som et referansepunkt for senere xy-alignment i tilfelle av små forskyvninger. Den røde firkanten representerer regionen av interesse (ROI) som brukes i autofokus strategi (A). Optiske snitt was oppnås ved strukturert belysning. Bildet viser et rutenett struktur anslått i fokusplanet etter riktig kalibrering (B). ROI for autofokus strategi (rød firkant) er satt til å dekke særegne embryonale strukturer høy i kontrast (her somites) som gjør det mulig pålitelig autofokus i strukturen av interesse (C). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Transgene wt1b. GFP embryoer med grønn fluorescens i Utvikling Nyre overlegg av rygg (A) eller lateral (B) overføring og fluorescens bilder vises med anterior til venstre. np, nephron primordium; pt, pronephric tubule; så såmidd. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: knockdown av wt1a forstyrrer Embryonic Nyre Development Representative, utvidet dybde av fokus bilder fra time-lapse opptak.. I kontroll morfolino injisert embryo, viser nyre utvikling normal fremgang med økende tubuli og nephron primordia som begynner å smelte ved midtlinjen. I kontrast, wt1a morphants ikke klarer å danne riktig nephron primordia og en massiv mengde GFP positive celler er utenfor pronephric feltet. (np, nephron primordium; pt, pronephric tubuli). Klikk her for å se en større versjon av dette figur.
Supplemental Video 1. Time-lapse opptak av normal nyre utvikling i kontroll morfolino injiserte embryoer. (Høyreklikk for å laste ned). Videoen viser hvordan tubuli vokse og nephron primordia begynne å smelte. Fra 20 HPF, ble bilder som er tatt i løpet av 30 min intervaller i løpet av en periode på 5 timer.
Supplemental Video 2. Time-lapse opptak av forstyrret nephrogenesis i wt1a morphant embryoer. (Høyreklikk for å laste ned). Videoen viser migrasjon av GFP-positive celler ut av pronephric regionen. Starter på 20 HPF, ble bildene tatt i 30 min mellomrom over et tidsrom på 5 timer.
Discussion
Sebrafisk har blitt et populært modellorganisme for studier av virveldyr utvikling og modellering av menneskelige sykdommer. Fordi sebrafisk embryoer forbli gjennomsiktig, kan utvikle organer som hjerne og hjerte holdes ved hjelp av en standard forberedelse mikroskop. Benytte seg av transgene linjer med organspesifikk fluorescens gjør vurderinger av organogeneseperioden gjennom ulike stadier av utviklingen innen levende embryoer ved fluorescens mikroskopi. En begrensning for avbildning av konstruksjonsdetaljer av hele organer med standard epifluorescens mikroskopi er virkningen av signaler fra gjenstander over og under midtplanet. Dette ut-av-fokus lys ikke bare resulterer i redusert bilde kontrast og oppløsning, det også kan tilsløre viktige strukturer av interesse 13,14. Flere teknikker som laser scanning confocal-, spinning disk confocal- eller multiphoton mikroskopi er utviklet for å minimere ut-av-fokus informasjon og dermed increase kontrasten i bildet, så vel som aksial oppløsning. En alternativ metode for å skaffe optiske seksjoner er laser- og skanning fri strukturert belysning mikroskopi, et bredt felt basert belysning teknikk som er og enkel å implementere på et vanlig mikroskop 15. Resultatene som presenteres her viser at optisk snitting oppnås ved strukturert belysning, implementert på en dissekere mikroskop og kombinert med rekonstruksjon av utvidet fokus bilder, muliggjør visualisering av strukturelle detaljer om normal og forstyrret nyre utvikling i sebrafisk. Spesielt er de GFP-positive celler i wt1a morphants dispergert ved forskjellige fokal dybder, og bilder av bare ett plan med ut-av-fokus uskarphet, vil undervurdere den tredimensjonale kompleksiteten av fenotype.
Å følge dynamikken i organ organisasjon, omorganisering eller avbrudd, er time-lapse fluorescens mikros en kraftig riktignok komplisert teknikk. Under time-lapsebildebehandling små vibrasjoner eller mindre temperatursvingninger føre fonner i x, y eller z-retningen. Dette krever ekstra utstyr (miljøkammer, anti-vibrasjonsbord) for å oppnå stabile resultater. Den presenterte metoden bruker evnen til en dissekere mikroskop med en motorisert fokus stasjon for opptakstid-lapse bilder uten ekstra enheter. For å opprettholde en stabil fokus, ble en autofokus strategi etablert og en flytting gitter trykt inn i bunnen av avbildningskammeret ble brukt for korrigering av x, y-ustabilitet.
Riktig innebygging av embryoet er et kritisk punkt i protokollen. Litt øvelse er nødvendig for å plassere strukturen av interesse så nær som mulig til glassbunn og i umiddelbar nærhet til nettet uten å overliggende med den.
Den største fordel ved fremgangsmåten er at det er en rimelig og enkelt verktøy for direkte observasjon av utviklingsmessige prosesser som vekst og migrasjon i levendeembryoer over flere timer. Videre disseksjon mikroskop-spesifikke fordeler som stort synsfelt og utvidet arbeidsavstand lette undersøkelse av større prøver, inkludert hele organer. Men noen begrensninger må holdes i tankene. Midlertidig stopping av forsøket for å kontrollere og justere posisjoneringen gjør prosedyren tidkrevende og fraværet av en robust temperaturkontroll forandrer "standard" utviklings tid, som er definert som timer etter befruktning ved 28,5 ° C i 16 sebrafisk. Et annet potensielt problem er begrenset dybden av bildebehandling i dyret, spesielt når strukturen av interesse ligger inne embryo eller larver. En slik struktur er sebrafisk pronephric glomerulus, som ligger mellom somites og plommesekken. Den begrensende dybde for å avbilde glomerulus ble funnet å være omtrent 200 um, en avstand som er nådd etter 5 dagers utvikling. I motsetning til dette, fluorescerende strukturer som er located nærmere overflaten av dyret kan avbildes for en lengre tid. For eksempel leverceller er tilgjengelige for avbildning i hvert fall inntil 9 dpf. En ytterligere begrensning er at langvarig immobilisering av embryoet eller larver i agarose og Tricaine behandling indusere veksthemming og hjerteødem, respektivt. Fordi dette kan forstyrre normal utvikling, er det anbefalt å begrense varigheten av intervallopptak til en viss interesse. For å sikre at under bilde strukturer av interesse utvikle seg normalt er det nyttig å sammenligne (på slutten) helhetsinntrykket med at av et dyr holdes under samme eksperimentelle forhold, men uten innebygging og bedøvelsen.
Spille inn en z-stack av optiske deler hvert 30. minutt i løpet av en periode på fem timer og påfølgende beregning av utvidet dybde av fokus bilder gitt romlig og tidsmessig informasjon om tidlige hendelsene i normal og forstyrret nyre utvikling som ble indusert by morfolino-mediert knockdown av wt1a. Tidligere utførte morfolino knockdown forsøk har allerede vist at Wt1a oppfyller en tidlig og viktig rolle i pronephros formasjon In situ hybridisering med nyre markør 17,18 og ansettelse av transgene wt1b. GFP linje for bildebehandling pronephros utvikling på fast tid peker 9,10 avslørt at wt1a mangel fører til forstyrret glomerulær morphogenesis og mislyktes podocyte spesifikasjonen. I motsetning til disse statiske metoder, time-lapse opptak direkte visualisere dynamikk tidlig nephrogenesis i kontrollembryoer og migrering av GFP-positive celler fra pronephric region i wt1a morphants. Muligheten for å spore sendt feil celler over tid muliggjør en mer detaljert analyse fenotype.
Generelt er fremgangsmåten som er presentert her gir en billig og enkel å bruke alternativ til de komplekse, og mindre tilgjengelig for segtups normalt brukes for time-lapse bildebehandling som for eksempel laser scanning mikroskop (utstyrt med et miljøkammer og anti-vibrasjon bord) eller lys ark mikroskop. Det beskrevne rutine å fikse driftproblemer kan også brukes til å utføre intervall bilder på oppsett uten optiske snitt alternativer, for eksempel fluorescens stereomikroskop.
Teknikken er ikke bare egnet for å undersøke nyrene utvikling, men kan også anvendes for å overvåke normal og defekte morfogenese av andre organer slik som hjerte og lever. Videre kan fremgangsmåten brukes til å observere forskjellige flere dynamiske prosesser i embryonisk og voksen modellorganismer så som sårheling og regenerering.
Disclosures
Forfatteren Michael Graf er en ansatt av Carl Zeiss Mikros GmbH som produserer instrumenter som brukes i denne artikkel.
Acknowledgments
Vi takker Thomas Bates for kritisk lesing og forbedre manuskriptet. Vi takker også Christina Ebert og Sabrina Stötzer for fisk vedlikehold.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Control Morpholino | Gene tools, LLC | Standard control oligo | Prepared control oligo |
| wt1a Morpholinos | Gene tools, LLC | customized | Designted to target the first splice donor site, sequence as published in Ref. 9 |
| 0.5% Phenol red solution | Sigma | P0290 | Injection tracer |
| peqGOLD universal agarose | peqlab | 35-1020 | To prepare microinjection dish |
| Glass capillaries (GC100F-10) | Hugo Sachs Elektronik | 30-0019 | To generate injection needles |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | To load the microinjection needle |
| Dumont forceps | Fine Sience Tools | 91150-20 | To generate an opening at the needle tip |
| Embryo water (0.3x Danieaus´ solution) | 1x: 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4, 0.6 Ca(NO3)2, 5 mM HEPES, pH: 7,5; Do not add methylene blue! | ||
| Graticule 5 mm/0.05 mm | Science Services | PY68039-02 | For calculation of injection amount |
| Pasteur pipette 137 mm, 4.8 ml | Roth | E305.1 | To collect eggs, to transfer embryos and to remove dead embryos |
| Pasteur pipette with ultra-thin tip 157 mm, 3.5 ml | Roth | E304.1 | To remove excess of water |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma | P7629 | For suppression of melanization |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma | E10521 | To anethesize zebrafish |
| Low melting agarose | Biozym | 850111 | For embedding |
| µ-dish 35 mm, high Glass Bottom Grid-50 | ibidi | 81148 | Imaging chamber |
| Gel loader tips | Hartenstein | GS05 | To orient the embryo for proper embedding |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Micropipette puller (model P-97) | Sutter Instrument | To generate injection needles | |
| Micromanipulator | Saur Laborbedarf | For microinjection | |
| Thermomixer copact | Eppendorf | Thermoblock for tempering the low melting agarose | |
| SZ61 (Stereomicroscope) | Olympus | For injection control | |
| Axio Zoom. V16 | Zeiss | For embedding and imaging | |
| ApoTome.2 slider | Zeiss | For optical sectioning | |
| AxioCam MRm | Zeiss | For image acquisition | |
| ZEN 2012 | Zeiss | Imaging software |
References
- Lieschke, G. J. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Drummond, I. A. Kidney development and disease in the zebrafish. J Am Soc Nephrol. 16 (2), 299-304 (2005).
- Drummond, I. A., et al. Early development of the zebrafish pronephros and analysis of mutations affecting pronephric function. Development. 125 (23), 4655-4667 (1998).
- Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3 (10), 1922-1938 (2007).
- Kramer-Zucker, A. G., Wiessner, S., Jensen, A. M., Drummond, I. A. Organization of the pronephric filtration apparatus in zebrafish requires Nephrin, Podocin and the FERM domain protein Mosaic eyes. Dev Biol. 285 (2), 316-329 (2005).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation. Kidney Int. 73 (10), 1120-1127 (2008).
- Kreidberg, J. A., et al. Wt-1 Is Required for Early Kidney Development. Cell. 74 (4), 679-691 (1993).
- Bollig, F., et al. Identification and comparative expression analysis of a second wt1 gene in zebrafish. Dev Dyn. 235 (2), 554-561 (2006).
- Perner, B., Englert, C., Bollig, F. The Wilms tumor genes wt1a and wt1b control different steps during formation of the zebrafish pronephros. Dev Biol. 309 (1), 87-96 (2007).
- Schnerwitzki, D., et al. Alternative splicing of Wilms tumor suppressor 1 (Wt1) exon 4 results in protein isoforms with different functions. Dev Biol. 393 (1), 24-32 (2014).
- Bedell, V. M., Westcot, S. E., Ekker, S. C. Lessons from morpholino-based screening in zebrafish. Brief Funct Genomics. 10 (4), 181-188 (2011).
- Rembold, M., Lahiri, K., Foulkes, N. S., Wittbrodt, J. Transgenesis in fish: efficient selection of transgenic fish by co-injection with a fluorescent reporter construct. Nat Protoc. 1 (3), 1133-1139 (2006).
- Conchello, J. A., Lichtman, J. W. Optical sectioning microscopy. Nat Methods. 2 (12), 920-931 (2005).
- Jensen, E. C. Types of imaging, Part 2: an overview of fluorescence microscopy. Anat Rec (Hoboken). 295 (10), 1621-1627 (2012).
- Chasles, F., Dubertret, B., Boccara, A. C. Optimization and characterization of a structured illumination microscope. Opt Express. 15 (24), 16130-16140 (2007).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Hsu, H. J., Lin, G., Chung, B. C. Parallel early development of zebrafish interrenal glands and pronephros: differential control by wt1 and ff1b. Development. 130 (10), 2107-2116 (2003).
- O'Brien, L. L., et al. Wt1a, Foxc1a, and the Notch mediator Rbpj physically interact and regulate the formation of podocytes in zebrafish. Dev Biol. 358 (2), 318-330 (2011).
