Abstract
diferenciação terminal músculo esquelético começa com o compromisso de células precursoras pluripotentes mesodermais de mioblastos. Estas células ainda tem a capacidade de proliferar ou eles podem se diferenciar e se fundem em miotubos multinucleadas, que maturate ainda mais para formar fibras musculares. diferenciação terminal músculo esquelético é orquestrada pela ação coordenada de vários fatores de transcrição, em particular os membros dos fatores ou MRFs reguladoras muscular (MyoD, miogenina, Myf5 e MRF4), também chamado de bHLH miogênica fatores de transcrição da família. Estes factores cooperar com complexos de remodelação da cromatina dentro da rede reguladora da transcrição elaborada para atingir tecido muscular esquelético. Neste, MyoD é considerado o fator de transcrição miogênica mestre no desencadeamento de diferenciação terminal muscular. Esta noção é reforçada pela sua capacidade de converter MyoD células não musculares em células do músculo esquelético. Aqui nós descrevemos uma abordagem utilizada para identificar MyoDparceiros de proteína de forma exaustiva, a fim de elucidar os diferentes fatores envolvidos na diferenciação terminal músculo esquelético. O objectivo a longo prazo é compreender os mecanismos epigenéticos envolvidos na regulação de genes musculares esqueléticas, ie., Metas MyoD. parceiros MyoD são identificados usando purificação de afinidade em tandem (TAP-tag) a partir de um sistema heterólogo acoplada a espectrometria de massa de caracterização (MS), seguido de uma validação do papel de parceiros relevantes durante a diferenciação terminal de músculo esquelético. formas aberrantes de factores miogénicos, ou a sua regulação aberrante, está associada com um número de desordens musculares: miastenia congénita, distrofia miotónica, rabdomiossarcoma e defeitos na regeneração muscular. Como tal, os factores miog�icas fornecer um conjunto de potenciais alvos terapêuticos em doenças musculares, tanto no que diz respeito aos mecanismos que causam doença em si e os mecanismos regenerativos que pode melhorar o tratamento da doença. Assim, o understan detalhadaDing das interacções intermoleculares e os programas genéticos controlados pelos factores miog�icas é essencial para a concepção racional de terapias eficientes.
Introduction
organismos multicelulares eucarióticos são compostas de diferentes órgãos e tecidos. Cada tecido funcional tem um padrão de expressão do gene específico, o qual é determinado em cada passo de diferenciação. Diferenciação celular envolve a activação de genes específicos, manutenção da sua expressão e, geralmente, o silenciamento de um conjunto de genes tais aqueles que estão envolvidos na proliferação celular. diferenciação de músculo esquelético, ou miogénese, é, assim, um processo multi-etapa, que começa com a determinação de células estaminais mesodermal em mioblastos, e, em seguida, leva à diferenciação terminal destes mioblastos em primeiro mono-nucleadas, e, em seguida, multi-nucleadas, miotubos . Assim, mioblastos são "determinado" células, que ainda são capazes de proliferar, mas eles estão comprometidos com a linhagem músculo esquelético, e, portanto, pode diferenciar exclusivamente em células musculares esqueléticas, quer durante o desenvolvimento embrionário ou em regeneração muscular adulta. O processo de terminal de músculo esquelético diferemciação é orquestrado por um programa genético específico que se inicia com a saída permanente do ciclo celular de células precursoras de mioblastos que leva a um silenciamento definitivo da proliferação de genes associados, tais como E2F genes alvo 1. Com efeito, durante o processo de diferenciação terminal, paragem proliferação de mioblastos é um passo crucial que precede a expressão de genes específicos do músculo esquelético e a fusão de mioblastos em miotubos 2. Tal programa permite que as células-tronco musculares adultas, também chamados de células satélites, para diferenciar durante o processo de regeneração após lesão do músculo esquelético.
Myogenesis mamíferos é criticamente dependente de uma família de miogênica hélice-volta-hélice (bHLH) fatores de transcrição MyoD, Myf5, MRF4 e miogenina, frequentemente referida como a família de fatores esqueléticos determinação muscular ou MRFs (músculo fatores regulatórios) 3. Cada um deles desempenha um papel essencial na especificação e DIFdiferen- das células musculares esqueléticas e tem um padrão de expressão específico abril 05-07. A ativação de Myf5 e MyoD constitui o passo determinante que compromete as células da linhagem miogênica e subsequente expressão de miogenina desencadeia myogenesis com a ativação de genes específicos do músculo esquelético, como MCK (Muscle Creatina Quinase). Factores de transcrição bHLH Miogênica cooperar com os membros da família MEF2 na activação de genes musculares de loci anteriormente silenciosos 8. Eles também estimulam esquelético transcrição do gene muscular como heterodímeros com proteínas bHLH onipresente, E12 e E47, conhecidas como proteínas E, que se ligam chamados E-caixas em várias regiões do gene-regulação 8. Torção, Id (inibidor de diferenciação) e outros factores regulam negativamente este processo, por competir com MyoD para proteínas E de ligação 8.
MyoD é considerado como o jogador mais importante no desencadeamento de terminal muscular diferenciação 9 10-13. Na verdade, a expressão forçada de MyoD induz a trans-diferenciação de diferentes tipos celulares, mesmo aqueles derivados de outra origem embriológica 12. Por exemplo, pode converter MyoD hepatócitos, f ibroblastos, melanócitos, neuroblastos e adipocitos em células musculares semelhante. A ação trans-de diferenciação de MyoD envolve uma ativação anormal do programa genético miogênica (nomeadamente os seus genes-alvo) em um ambiente não-muscular, concomitante ao silenciamento do programa genético de origem (nomeadamente, os genes de proliferação).
Em proliferando mioblastos, MyoD é expresso, mas não é capaz de ativar seus genes-alvo, mesmo quando ele se liga aos seus promotores 14-16. Por conseguinte, o requisito de MyoD de ser continuamente expresso em mioblastos indiferenciadas permanece bastante Elusive. MyoD pôde reprimir seus genes-alvo devido ao recrutamento de enzimas modificadoras da cromatina repressivas em proliferando mioblastos antes do carregamento de ativar cromatina remodelação enzimas 14,17. Por exemplo, na proliferação mioblastos, MyoD está associada com o co-repressor de transcrição KAP-1, histona desacetilases (HDACs) e metiltransferases lisina repressivas (KMTS), incluindo a histona H3 lisina 9 ou H3K9 e H3K27 KMTS, e suprimir de forma activa a expressão de genes alvo através do estabelecimento de uma estrutura de cromatina 14,17 localmente repressivo. Importante, um relatório recente indicou que MyoD é em si directamente metilado pelo H3K9 KMT G9a resultando na inibição da sua actividade de transactivação 16.
Os mecanismos epigenética envolvidas neste trans-diferenciação de células não musculares por MyoD são em grande parte desconhecida. Notavelmente, algumas linhas de células são resistentes a trans-diferenciação induzida por MyoD. Assim, em células HeLa, MyoD é ou inactiva ouainda pode funcionar como repressor, em vez de activador da transcrição devido à falta de expressão da subunidade BAF60C remodelação da cromatina complexo SWI / SNF 18. Este modelo pode, assim, ser de escolha para melhor caracterizar os mecanismos de repressão do gene induzida por MyoD. É igualmente apropriado para ensaiar a capacidade de MyoD para induzir ambiente cromatina repressivo na sua loci alvo com seus parceiros associados e, portanto, desvendar os mecanismos repressivos dependente de MyoD em proliferando mioblastos para afinar a diferenciação terminal.
Aqui descrevemos o protocolo para a identificação de parceiros MyoD usando purificação de afinidade em tandem (TAP-tag) acoplada a espectrometria de massa (MS) caracterização. A utilização de células HeLa-S3 que expressam estavelmente Bandeira-HA-MyoD permitida para obter material suficiente para purificar os complexos a partir de extractos nucleares MyoD fraccionados. A identificação de parceiros MyoD no sistema heterólogo foi seguido por validatino em um sistema relevante.
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Protocol
1. Preparação de fracções HeLa-S3 Nuclear Salt-extraíveis e cromatina-bound
- Recolha das células
- Cresça HeLa-S3 Bandeira-HA-MyoD e HeLa-S3 Bandeira-HA (linha celular de controlo) em Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal de vitelo, 100 U / ml de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina (crescimento meio) a 37 ° C e 5% de CO 2 num incubador húmido.
Nota: as células HeLa-S3 expressam de forma estável células transduzidas com o vector vazio (HeLa-S3 Bandeira-HA) Flag-HA-MyoD e HeLa-S3 poderia ser ou estabelecida usando o protocolo descrito em: 19,20, ou fornecido pelos autores. - Amplificar as células até 10 completamente confluentes pratos 150 mm de cada linha celular (células HeLa-S3 Bandeira-HA-MyoD e HeLa-S3 Bandeira-HA).
- Recolher o sobrenadante (contêm subpopulação não aderente) em 5 L Spinner.
- Lava-se a subpopulação aderente com 10 ml de PBS por prato de 150 mm, trypsinize células durante 1 min a TEM quartoratura (solução de tripsina-EDTA a 0,05%, 2 ml para cerca de 15 cm de disco).
- Adicionar 4 ml de meio por mm prato 150 e recolher as células em tubos de 50 ml.
- Combinar o sobrenadante a partir do passo 1.1.3 (no 5 L Spinner) e as células a partir do passo 1.1.5, adicionar 500 ml de meio de crescimento fresco pré-aquecido para cada linha celular.
- Transferir suspensão de células em 5 L rotativo e crescer as células durante pelo menos 60 horas a 37 ° C e 5% de CO 2 num incubador húmido.
- Adicionar 500 ml de meio de crescimento fresco e as células crescer durante 24 h.
- Adicionar 1 L de meio de crescimento fresco e as células crescer durante 24 h.
- Retire 1 ml da suspensão de células para contagem das células e verificar a viabilidade das células. Cor 30 ul de suspensão de células com 30 ul de 0,4% de azul de tripano e contagem de células vivas (não azul) sob o microscópio usando hemocitômetro.
- Manter a densidade de células a 2 - 6 x 10 5 células / ml por adição de meio de crescimento fresco diariamente; não exceda 1 X 10 6 células / ml. O máximode volume durante um 5 L Spinner é de 2,5 L.
Nota: Para os passos seguintes, proceder por lotes de 2-2,5 L de cultura a uma densidade de 1 x 10 6 células / ml. Repita os passos 1.1.12 - 1.1.14 para recolher cerca de 20 L (≈ 20 g de sedimento seco) de cada linha celular antes de prosseguir para o passo seguinte. - as células por centrifugação a 500 xg durante 5 min a 4 ° C e desprezar o sobrenadante.
- Ressuspender as células em 100 ml de PBS gelado por pipetagem e centrifugar a 500 xg durante 5 min a 4 ° C para lavar o sedimento.
- Repetir a lavagem por ressuspensão das células com 25 ml de PBS gelado, transferindo a suspensão para tubo de 50 ml e centrifugar a 500 xg durante 5 min a 4 ° C.
Nota: Os sedimentos celulares podem ser imediatamente utilizada ou congelado em azoto líquido e armazenado a -80 ° C durante vários dias.
- Cresça HeLa-S3 Bandeira-HA-MyoD e HeLa-S3 Bandeira-HA (linha celular de controlo) em Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal de vitelo, 100 U / ml de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina (crescimento meio) a 37 ° C e 5% de CO 2 num incubador húmido.
- Isolamento dos Núcleos
Nota: Execute as etapas 1.2.1 - 1.4.3 na câmara fria.- da-manhã pré-chillrs e homogeneizadores.
- Se usando material congelado, descongelar rapidamente os sedimentos de células em banho de água a 37 ° C.
- Ressuspender 20 g (Å 20 ml) de células em 20 ml (volume igual ao tamanho do agregado de células) de tampão hipotónico A (Tabela 3), utilizando 10 ml de tampão a primeira, em seguida, a adição de 5 ml, em seguida, adicionando mais 5 ml. Lavam-se as pipetas bem com tampão fresco para obter o máximo de células.
- Transferência de suspensão de células de 40 ml para o homogeneizador de pré-refrigerada com um pilão apertada.
- Homogeneizar células com 20 golpes num homogeneizador (20 dentro e fora movimentos) e transferir a suspensão de células em tubo de 50 ml.
- Lavar o homogeneizador com 7 ml de tampão de sacarose (1/3 do volume inicial da célula, Tabela 3) para recuperar o máximo de células. Transferir esta suspensão rapidamente para dentro do tubo 50 ml do passo 1.2.5 para preservar os núcleos e limitar as fugas.
- Manchar uma alíquota de 30 ul com 30 ul de 0,4% de trypan azul, analisar ao microscópio para controlar a eficiência de lise (Se a lise for bem sucedida, todos os núcleos devem ser azul). Se necessário, repita o passo de homogeneização.
- Centrifugar durante 7 min a 10000 xg e 4 ° C para sedimentar os núcleos. Salve o sobrenadante como a fracção citoplasmática.
- Preparação de Sal-extraível (SE) Fraction Nuclear
- Ressuspender o sedimento de núcleos em 8 ml de tampão de sacarose (um volume igual ao tamanho do grânulo de núcleo). Adicionar gota a gota, enquanto se mistura cuidadosamente sobre um vórtice 8 ml de tampão de alto teor salino (volume de sedimento 1 núcleos, Tabela 3) para obter uma concentração final de NaCl de 300 mM. Incubar durante 30 min em gelo e misturar a cada 5 min.
- Diminuir a concentração de NaCl para 150 mM, por adição de 8 ml (1/3 do volume total) de tampão de sacarose. Centrifugar durante 10 minutos a 13000 xg e 4 ° C. Recolher o sobrenadante (fracção de sal-extraível nuclear, SE).
Nota: Ou vá para o passo 1.3.3 ou sair da SEfração no gelo durante a preparação da fracção ligada à cromatina e, em seguida, ultra-centrifugação ambas as frações simultaneamente. - Ultra-SE centrífuga durante 30 min a 85000 xg, a 4 ° C. Tome sobrenadante (≈ 26 ml).
- Congelar 100 ul aliquota em azoto líquido. Avance para o passo 2 "Protein purificação complexa", usando o resto do extrato.
Nota: A alíquota é para ser usado como um controle de entrada durante o passo 5.1.1.
- Preparação da fracção ligada à cromatina
- Ressuspender o sedimento (a partir do passo 1.3.5.) Meticulosamente em 7 ml (um volume igual ao tamanho do grânulo) de tampão de sacarose.
- Adicionar CaCl2 até uma concentração final de 1 mM (28 ul de 0,5 M de CaCl2 por 14 ml de suspensão) para activar MNase (passo 1.4.4) e misturar.
- suspensão de pré-aquecimento durante 1 min a 37 ° C.
- Adicionar 70 ul nuclease Micrococo (MNase) para obter concentração final de 0,0025 U / mL (1/200 diluição de 0,5estoque / ul U) e misturar.
- Incubar exactamente 12 minutos a 37 ° C. Misture todos os 4 min.
- Imediatamente coloque a reação no gelo.
- Para parar a actividade MNase, adicionar 112 ul de EDTA 0,5 M, pH 8,0 (1/125 diluição) a uma concentração final de 4 mM. Incubar durante 5 min em gelo.
- Sonicar 5 vezes durante 1 minuto a alta amplitude, entre dois sonicações permitir uma pausa de 1 min (10 min no total).
- Ultracentrífuga durante 30 min a 85000 xg e 4 ° C.
- Recolhe-se o sobrenadante (fracção enriquecida nucleossoma, NE, ≈ 12 ml).
- Congelar aliquota de 50 ul em azoto líquido. Avance para o passo 2 "Protein purificação complexa", usando o resto do extrato.
Nota: A alíquota é para ser usado como um controle de entrada durante o passo 5.1.1.
2. Proteína Complexos de Purificação
Nota: Proceda extratos paralelas provenientes de cada linha de células (HeLa-S3 Bandeira-HA-MyoD e de controle, Hela-S3 Bandeira-HA).
- Purificação com base FLAG-
- Pré-lavagem de resina Bandeira. Utilize 600 mL de resina Bandeira (do estoque comercial de 50%) para cada ponto experimental (frações SE e NE para cada linha de células).
- Resina de transferência em tubo de 15 ml, ressuspender em 13 ml de tegn fria (Tabela 3), centrifuga-se durante 2 min a 1000 x g e remover o sobrenadante. Repita 5 vezes. Após a resina Bandeira ressuspender última lavagem em igual volume de tegn (300 ml para cada ponto experimental).
- Para cada ponto experimental, misturar 600 ul de resina bandeira lavadas e os extractos de proteína correspondentes (em um tubo de 15 mL para o 12 ml de NE e em um tubo de 50 ml para as fracções de 26 ml SE, respectivamente). Incubar durante a noite em uma roda rotativa, a 4 ° C.
- Centrifugar durante 2 minutos a 1000 xg, a 4 ° C, o sobrenadante posto de lado e manter a 4 ° C até que o resultado do teste de eficiência de purificação (2.2).
- Para as amostras SE, ressuspender a resina Bandeiraem 4 ml de tegn e transferir para um tubo de 15 ml. Repetir esta etapa 3 vezes, cada vez que a transferência para o mesmo tubo de 15 mL para evitar a perda de pérolas. Centrifugar 2 min a 1000 xg e 4 ° C e remover o sobrenadante.
- Lavar a resina bandeira 7 vezes em um tubo de 15 mL, utilizando 13 ml de tegn e centrifugação 2 min a 1000 xg e 4 ° C.
- Após a última lavagem, ressuspender em 1 ml tegn e transferir para um tubo de 1,5 ml de baixa ligação. Centrifugar 2 min a 1000 xg e 4 ° C e remover o sobrenadante.
- Ressuspender em 200 ul de solução de péptido FLAG no 4 mg / ml a pH 7,8 para cada ponto experimental. Misturar os grânulos e péptido. Adicionar 200 ul de tampão tegn e incubar a 4 ° C durante pelo menos 4 horas ou durante a noite para eluir as proteínas ligadas.
- Centrifugar durante 2 minutos a 1000 xg, a 4 ° C e transferir a resina e o sobrenadante (a bandeira de eluato) a uma coluna de centrifugação vazia colocada num tubo de 2 mL.
- Centrifugar a coluna, recolher o sobras de sobrenadante no tubo de 2 mL. Recolhe-se o Bandeira resina através da adição de tampão tegn à coluna e prossiga para a segunda eluição Bandeira com 200 ul de solução de péptido Flag (4 mg / ml) durante a noite a 4 ° C para cada ponto experimental.
- Repita os passos 2.1.9 - 2.1.10 para coletar segunda eluição. Combine primeiro e segundo eluatos.
- Ensaio de eficiência de purificação
Nota: Durante o passo 2.1.11 - 2.1.12, execute SDS-PAGE e coloração de prata (2.2.1 - 2.2.2).- Tomar 15 ul dos produtos de eluição, adicionam-se 5 ul de tampão de carga 4x e 10x 2 ul de agente de redução, ferver durante 5 min a 96 ° C e executar um de SDS-poliacrilamida a 4 - 12% de gel de acordo com as instruções do fabricante.
- Mancha do gel utilizando o kit de coloração de prata (siga as instruções do fabricante). Se há diferenças claras nos padrões de proteínas entre Flag-HA-MyoD e bandeira-HA eluatos mock, em especial, a banda da Bandeira-HA MyoD (cerca de 50 kDa, Figura 1A), prossiga para a próxima step.
- A hemaglutinina (HA) com base na purificação
- Lavar a resina de HA por transferência para 15 ml de tubo, ressuspensão em 13 ml de tegn e centrifugação 2 min a 1000 xg, a 4 ° C. etapa de lavagem Repita 5 vezes. Depois de pérolas ressuspender última lavagem em igual volume de tampão tegn.
Nota: O volume deve ser ajustado de acordo com a eficiência de purificação baseado em bandeira. Comece com 300 ul do estoque comercial de 50% para cada ponto experimental. - Transferência de resina HA para cada ponto experimental dentro de um tubo de ligação baixa de 1,5 ml. Centrifugar 2 min a 1000 xg, a 4 ° C, para eliminar o máximo do tampão de lavagem (Tabela 3) e adicionar os produtos de eluição da purificação à base de bandeira para a resina de HA.
- Incubar os tubos sobre a roda rotativa durante a noite a 4 ° C.
- Centrifugar durante 2 minutos a 1000 xg, a 4 ° C, o sobrenadante posto de lado e manter a 4 ° C até que o resultado do teste de eficiência de purificação (2.3.12.).
- Résuspender a resina de HA em 0,5 mL de tegn, transferir para um novo tubo de 1,5 ml de ligação baixa. Repetir a adição de ressuspensão uma vez com o mesmo tubo de 1,5 mL para evitar a perda de contas e de centrifugação 2 min a 1000 xg e 4 ° C. Remover o sobrenadante.
- Lavar as esferas 8 vezes usando 1 ml de cada vez tegn, centrifugação 2 min a 1000 xg e 4 ° C e remoção de sobrenadante (evitar perder grânulos). Após a última lavagem, transferir as contas em 0,5 ml tubos.
- Remover tanto sobrenadante quanto possível. Adicionar 100 ul de solução de HA péptido livre (4 mg / ml) a pH 7,8 em grânulos para eluir as proteínas ligadas. Incubar na roda rotativa durante a noite a 4 ° C.
Nota: A quantidade de AH-péptido tem de ser ajustado dependendo da abundância dos complexos. - Centrifugar durante 2 minutos a 1000 xg, a 4 ° C e transferir a resina e o sobrenadante (HA eluato) a uma coluna de centrifugação vazia colocada num tubo de 2 mL.
- Centrifugar a coluna para recolher o sobrenadante esquerda cima no tubo de 2 mL. Executar uma segunda eluição com 100 ul de péptido HA (4 mg / ml) para cada ponto experimental. Incubar na roda rotativa durante a noite a 4 ° C. Repita o passo 2.3.8 - 2.3.9 para coletar segunda eluição.
- Combine primeiro e segundo eluatos.
- Ensaio de eficiência de purificação por SDS-PAGE e coloração com prata (ver passos 2.2.) (Figura 1A).
- Concentra-se o eluato para HA 30 ul usando unidades de filtro centrífugo com cerca de 10 kDa de corte (limite de peso molecular nominal, NMWL) de acordo com as instruções do fabricante.
- Dividir as amostras concentradas em duas partes: 22,5 (3/4) e 7,5 (1/4) ul. Snap congelar 1/4 de amostras em azoto líquido e armazenar a -80 ° C. Use a parte 3/4 para a etapa 3.
Nota: A parte congelada 1/4 é para ser usado para a confirmação dos resultados de espectrometria de massa por Western blot (ver passo 5.1).
- Lavar a resina de HA por transferência para 15 ml de tubo, ressuspensão em 13 ml de tegn e centrifugação 2 min a 1000 xg, a 4 ° C. etapa de lavagem Repita 5 vezes. Depois de pérolas ressuspender última lavagem em igual volume de tampão tegn.
Análise 3. Espectrometria de Massa
Nota: Os seguintes passos devem ser discutidos com a instalação de Espectrometria de Massa, que irá realizar a análise.
- Suplemento 3/4 (22,5 ul) das amostras com 7,5 ul de tampão de carga 4x e 10x 3,3 ul de agente de redução e ferver durante 5 min a 96 ° C.
- amostras de carga em um SDS-poliacrilamida 4 - gel a 12%. Executar gel a 150 V constante durante 5 min para permitir que todas as proteínas de entrar no gel de separação, sem.
- Lavar o gel com água; fixar para 20 - 30 min com a solução fixadora (10% de ácido acético, 50% de metanol, 40% de água ultra-limpo), em seguida, lavar o gel fixo 5 vezes em água ultra-limpo.
- Corte as bandas que contêm as proteínas de armazenamento, em 1 ml de água em um tubo de 1,5 ml e enviar a instalação de espectrometria de massa.
Análise 4. Dados
Nota: Esta é uma orientação geral para a análise. Os passos exactos dependerá do modo particular de os dados fornecidos pela instalação MSusado para realizar a análise (por exemplo, 21,22).
- Compare a lista das proteínas identificadas em eluatos "MyoD" com a lista obtida a partir de correspondente preparação de controlo negativo. Excluir a partir da análise das proteínas encontradas em ambas as listas.
- Eliminar as proteínas que têm ≤2 número total de peptídeos identificados a partir de lista restante.
- Acesso anotação funcional e classificação funcional da lista obtida de proteínas utilizando os recursos DAVID Bioinformática (http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp) e classificar a lista das proteínas 23,24.
- (Opcional) remover da lista de "caronas", encarregados proteínas não-nucleares com forte acidental vinculativas para carga negativa DNA 25. Estes contêm proteínas do citoesqueleto, citoplasmáticos, mitocondriais, membrana e receptores (dobramento de proteínas, as proteínas do grupo citoesqueleto e diversos em Tabelas 1 e 2). </ Li>
- Comparar as listas obtidos dos interactores provenientes de fracções MyoD SE e NE para identificar proteínas e proteínas comuns específicos para cada fracção (Figura 2).
5. A confirmação de interactianos identificado por Western Blot
- Confirmação em HeLa-S3 Bandeira-HA-MyoD e HeLa-S3 Bandeira-HA
- Descongelar as amostras de eluato obtido no passo 2.3.14 (7,5 ul) em gelo. Adicionar 12 ul de tampão tegn, 10 ul de tampão de carga 4x e 10x 3 ul de agente redutor. amostras ferver durante 5 min a 96 ° C.
- Preparar amostras de entrada para a transferência de Western.
- Descongelar alíquotas dos passos 1.3.9 e 1.4.11 e medir a concentração de proteína, por exemplo, utilizando o kit BCA (siga as instruções do fabricante).
- Usar 15 jig de proteína por pista. Medir a quantidade apropriada do extracto e ajustar o volume da amostra até 15 ul com tampão de tegn.
- Adicionar 5 mL de buffer 4x carga e1,5 ul 10x agente redutor. amostras ferver durante 5 min a 96 ° C.
- Realizar uma análise de Western blot com anticorpos de interesse (específicos para o candidato parceiro identificados durante a análise MS), utilizando 15 ul de amostras de eluato. Use extractos de entrada como um controlo dos níveis endógenos de proteína (Figura 3A).
- Confirmação no Sistema Cellular Relevante
- Preparação do extracto nuclear total de mioblastos de rato C2C12.
- Cresça mioblastos C2C12 de rato em meio DMEM suplementado com 15% de soro fetal de vitelo, 100 U / ml de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina a 37 ° C e 5% de CO 2 num incubador húmido. Nunca exceda a confluência celular de 80% para manter as células em estado proliferativo.
- Crescer pelo menos dois pratos de 150 mm de C2C12 para um ponto (um anticorpo) de imunoprecipitação (IP). Aspirar o meio, lavar as células duas vezes com 10 ml de PBS.
- Raspe as células e recolher em tubo de 15 ml. Centrifuge a 250 xg durante 5 min a 4 ° C. sobrenadante de descarte.
- Estimar o volume do (= células V) da pelota celular. Suavemente ressuspender o sedimento em 3 volumes de células de V hipotónico tampão B para interromper membrana citoplasmática (Tabela 3).
- Adicionar o volume da célula de 0,44 V x de 10% de NP-40 para atingir a concentração final de 1% (v / v). Inverter cuidadosamente o tubo várias vezes para misturar.
- Adicionar o volume das células V 0,89 x de SR (Tabela 3) para preservar a integridade núcleos. Inverter cuidadosamente o tubo várias vezes para homogeneizar a suspensão e centrifuga-se durante 5 min a 2000 xg para sedimentar os núcleos.
- Remover o sobrenadante (fracção citosólica). Estimar o volume de sedimento núcleos (= V nuc). Pelete núcleos Ressuspender em um volume V nucA de tampão de sacarose.
- Adicionar gota a gota, enquanto se mistura cuidadosamente sobre um vórtice um volume V nucA de tampão de elevado teor de sal para obter uma concentração final de 300 mMDe NaCl, e incubar durante 30 min em gelo. Misture todos os 5 min.
- Adicionar um volume V nucA de tampão de sacarose (para diminuir a concentração de NaCl a 150 mM) e CaCl2 (1 mM de concentração final). Misturar.
- suspensão de pré-aquecimento durante 1 min a 37 ° C, adiciona-nuclease microcócica para obter final da concentração de 0,0025 U / mL (1/200 de estoque de 0,5 U / ul). Misturar.
- Incubar exactamente 12 minutos a 37 ° C. Misture a cada 3 min.
- Imediatamente coloque reacção em gelo e adicionar EDTA (concentração final 4 mM) para parar a atividade MNase. Incubar durante 5 min em gelo.
- Sonicar 5 vezes para cada 0,5 minutos em alta amplitude. Entre dois sonicações, permite uma quebra de 0,5 min (5 min no total).
- Ultra-centrifugação durante 30 min a 85000 xg e 4 ° C. Recolher o sobrenadante (extracto nuclear total).
- Medir a concentração de proteína do extracto nuclear total de, por exemplo, utilizando o kit BCA (siga as instruções do fabricante), e proceder immédiatEly para a etapa 5.2.2.
- A imunoprecipitação (IP) de MyoD endógena.
- Para pré-clara os extractos, lavar 10 ul de proteína G agarose para cada ponto de IP.
- Transferir o volume necessário de proteína G esferas de agarose para um tubo de 1,5 ml, ressuspender em 1,4 mL de tegn frio, centrifugar durante 2 minutos a 1800 x g e remover o sobrenadante. Repita 3 vezes.
- Misture pré-lavado esferas de Proteína G agarose com o volume apropriado de extracto nuclear total. Use 500 ug de proteína total extracto nuclear por ponto IP.
- Incubar numa roda rotativa, a 4 ° C durante 2 hr de pré-limpar os extractos.
- Centrifugar durante 5 min a 1800 xg, a 4 ° C. Mantenha sobrenadante.
- Misture 5 ug de MyoD Ab ou 5 ug de IgG de coelho com 500 ug extractos nucleares total de pré-apuradas em tubos de 1,5 ml de ligação baixas. Adicionar tampão tegn até 1 ml. Incubar numa roda rotativa, a 4 ° C durante a noite.
Nota: Execute o fepois etapas durante o passo 5.2.2.3. - Pré-lavagem 7,5 ul de proteína A / G solução grânulos Stock por ponto IP.
- Transferir o volume necessário de esferas em um tubo de 1,5 ml, grânulos ressuspender em 1 ml de tegn e centrifugar a 1800 xg, a 4 ° C durante 2 min. Remover o sobrenadante. Repita 3 vezes.
- / G esferas de proteína A ressuspender em 1,5 ml de solução (Tabela 3) e incuba-se numa roda rotativa de bloqueio durante a noite a 4 ° C.
- extractos nucleares totais Centrífuga incubadas com ABS (passo 5.2.2.5) a 16.000 xg durante 10 min a 4 ° C. Mantenha sobrenadante.
- Centrifugar bloqueado Uma proteína / g de resina (passo 5.2.2.7) a 1800 xg durante 2 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante e ressuspender em 1 ml de tampão de tegn. Re-centrifugar a 1800 xg durante 2 min a 4 ° C para lavar o tampão de bloqueio.
- Ressuspender bloqueado proteína A / g de resina em 1 ml de tampão e tegn aliquota em novos tubos de baixa ligação de proteína para se obter 7,5 blo ulproteína cked Uma resina / G por ponto IP. Centrifugar a 1800 xg, a 4 ° C durante 2 min e remover tanto quanto possível do sobrenadante.
- Adicionar os extractos nucleares totais incubadas com o Abs (ou IgG de controlo) para a resina A / G. Misturar e incubar durante 2 horas à temperatura ambiente (TA) sobre uma roda rotativa.
- suspensão Centrífuga 1800 xg à temperatura ambiente durante 2 min. Elimine o sobrenadante, ressuspender em 1 ml de tampão de lavagem e suspensão de transferência para novos tubos de ligação baixas. Incubar à temperatura ambiente numa roda rotativa durante 5 min.
- Centrifuga-se a suspensão à TA 1800 xg durante 2 min, ressuspender em 1 ml de tampão de lavagem e incubar à TA numa roda rotativa durante 5 min. Repita 4 vezes. Para a última transferência para a lavagem para um novo tubo de ligação baixa.
- Remover o máximo do sobrenadante. Adicionar 7 ul de tampão de lavagem, 7 uL de tampão de carga 4x e 10x 3 ul de agente de redução para os grânulos, misturar e deixar ferver durante 5 min a 96 ° C.
- Realizar uma análise de Western blot com anticorpos de interest (específico para o candidato parceiro para o imunológico precipitada proteína). Use 1% (5 ug) de extractos de entrada como um controlo dos níveis endógenos de proteína (Figura 3B).
- Para pré-clara os extractos, lavar 10 ul de proteína G agarose para cada ponto de IP.
- Preparação do extracto nuclear total de mioblastos de rato C2C12.
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Representative Results
Para compreender a regulação da actividade MyoD, realizamos a caracterização exaustiva dos complexos MyoD usando purificação bioquímica, com base no imunopurificação de uma forma marcada com o dobro da MyoD seguido por espectrometria de massa (MS). A utilização da linha de células de HeLa-S3 que expressa Flag-MyoD marcada com HA e uma linha de células de controlo que expressam HA-autorizações de bandeira para obter material suficiente para purificar o complexo MyoD efectuando a purificação por afinidade de duplo-Flag-HA-MyoD.
Nós fracionado os extratos de células em frações citoplasmáticos e nucleares, em seguida, mais fraccionado a fração nuclear para extraído-sal (sal-extraível nuclear, SE) e enriquecida para nucleossomos (, enriquecido com nucleossomos NE) frações. Purificação TAP-Tag a partir destas fracções nucleares separados (Figura 1, as Tabelas 1 e 2) permitiu desvendar parceiros que têm relativamente baixa abundance quando localizada num compartimento subnuclear específica. Além disso, tal estratégia foi explorada para descobrir parceiros de desacoplado (SE) versus (NE) MyoD ligado ao ADN para obter insights sobre a regulação da atividade MyoD.
Para a purificação TAP-Tag, foi utilizado o sistema em tandem epitopo Flag-HA. A pequena bandeira hidrofílica e epitopos HA tem o mínimo de interferência com a função da proteína e são altamente acessível para interação antígeno-anticorpo. Anti-Flag e anti-HA imunopurificação sequencial à base de resina foi realizada, seguida de eluição dos complexos imunopurificados utilizando péptidos da bandeira e HA. As proteínas eluídas foram então executados sobre um gel de SDS-PAGE para permitir que todas as proteínas de entrar no gel. Os pedaços de gel contendo todas as proteínas purificadas foram cortados; as proteínas foram extraídas, e identificado por espectrometria de massa (MS) digerido com tripsina.
Como mostrado na Figura 2, (Figura 2 e 3) 26-28. Isto lança luz sobre parceiros MyoD ligados a DNA e possíveis co-reguladores que podem estabelecer um ambiente repressivo-cromatina. Por exemplo, as proteínas HP1, que foram identificados como parceiros MyoD por metodologia descrita, são conhecidos por se ligarem H3K9 metilado para manter a repressão do gene e estrutura heterocromatina. Com efeito, o HP1 inibe a actividade de transcrição MyoD resultando em expressão do gene alvo MyoD prejudicada e músculo diferenciação terminal 26.
Fraccionamento adicional deos complexos MyoD SE e NE em gradiente de glicerol (como descrito em 29) descobriram os MyoD sub-complexos nos dois compartimentos subnucleares (Figura 1B). Em particular, SE MyoD é distribuída em três sub-complexos, enquanto o MyoD ligada a cromatina pertence principalmente a um complexo.
Algumas das TAP-tag / MS revelou interagentes foram confirmados por western blot em complexos MyoD. Estes incluem a CBF fator de transcrição, EBB, MTG8R eo BAF47 SWI / SNF subunidade (SNF5) (Figura 3A, à esquerda) e proteínas HP1 (CBX1 e CBX3) (Figura 3A, à direita). Importante, uma vez que as células HeLa que não são células musculares e não expressam MyoD, é necessário confirmar interacções entre interactores recentemente identificados e MyoD em mioblastos BD (Figura 3). Notavelmente, por essa validação, os extractos nucleares totais (sem separação em SE e NE) são geralmente suficientes, which permite a redução da quantidade de mioblastos utilizados para a preparação da amostra. Os ensaios de interação in vitro, em 26,27, ajudam a validar esses achados. Finalmente, os significados funcionais destas interações em células musculares devem ser abordadas como em 26-28.
Tomados em conjunto, apresentou dados mostram uma visão global de parceiros de MyoD ubiquamente expressas e pavimentar o caminho para novos estudos funcionais em um modelo muscular mais relevante.
Figura 1: MyoD complexos isolados por afinidade em tandem de purificação (a) Uma coloração com prata dos complexos eMyoD purificados por afinidade duplas isoladas a partir de sal-extraível nuclear (SE) ou nucleossoma enriquecido (NE) fracções nucleares de linhas de células HeLa-S3 estável. expressando Bandeira-HA-MyoD (complexo MyoD) umlinha celular de controlo d (Mock). MW, marcador de peso molecular em daltons quilo (kDa). A seta indica Bandeira-HA-MyoD (eMyoD). Esta pesquisa foi publicada originalmente em 37. Copyright A Sociedade Americana de Bioquímica e Biologia Molecular. Este valor foi modificado a partir de 26: as pistas com purificações simulados e eMyoD complexo isolado de frações nucleares SE são agora mostrados. (B) eMyoD complexos purificados por afinidade dupla como em (A) foram fraccionados em gradiente de glicerol varia desde 20% a 41%. As fracções foram recolhidas manualmente, concentrados e analisados por Western blot (WB) utilizando anticorpos anti-FLAG. Observe a presença de vários eMyoD contendo sub-complexos na fração nuclear de sal-extraível (SE). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2:. Comparação de cromatina-bound (nucleossomo enriquecido, NE) versus Solúvel Nuclear (sal nuclear extraível, SE) MyoD Parceiros Top: Venn diagrama mostrando sobreposição entre interactianos eMyoD isoladas de sal-extraível nuclear (SE) e enriqueceu-nucleossomo ( NE) fração. As proteínas ribossomais, factores de iniciação de tradução, factores de reparação de ADN e as isoformas de tubulina foram excluídos da análise de como eles estão presentes em diversos conjuntos diferentes de dados obtidos pela TAP e considerados não-específica inferior:. Os interactores MyoD encontrados tanto em SE e frações NE (comuns) ou específicas para uma das fracções (únicas) foram divididos em grupos com base em suas anotações funcionais. Citoesqueleto relacionadas com outras proteínas e variado não estão representados. As proteínas sublinhadas são interagentes MyoD validadas tanto em HeLa e / ou em myoblasts por co-imunoprecipitação. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3:. Validação do conjunto selecionado de MyoD interactianos (A) Validação de interagentes MyoD, identificado por espectrometria de massa, na linha de células HeLa-S3 expressando estavelmente Bandeira-HA-MyoD (eMyoD) Painel esquerdo:. Análise de Western blot de afinidade de casal complexos MyoD -purified isoladas de sal-extraível nuclear (SE) ou (NE) frações enriquecidas com nucleossomos de linha de células HeLa-S3 expressando estavelmente linha eMyoD ou célula de controlo (Mock) com os anticorpos indicados. MW, marcador de peso molecular Painel direito:. Análise de Western blot de complexos MyoD duplas purificados por afinidade isolado a partir de fracções enriquecidas com nucleossomos nucleares de HeLa-S3 linha de células svitavelmente expressar ou linha celular de controlo eMyoD (Mock) com anticorpos indicados. Este painel foi originalmente publicado no The Journal of Biological Chemistry. Yahi H, Fritsch L, Philipot O, Guasconi V, Souidi M, Robin P, Polesskaya A, Losson R, Harel-Bellan A, Ait-Si-Ali S. J Biol Chem. 2008 29 de agosto; 283 (35): 23692-700. doi: 10,1074 / jbc.M802647200. Epub 2008 Jul 2. Direitos Autorais A Sociedade Americana de Bioquímica e Biologia Molecular. Este valor foi modificado a partir de 26: tipo e tamanho de polícia foi alterada eo texto foi rodado para unificar a rotulagem no âmbito da figura. MyoD foi etiquetado como eMyoD para evitar a confusão com IP endógena apresentado nos outros painéis. (BD) Validação de interagentes MyoD em mioblastos de rato C2C12. (B) extratos totais nucleares de proliferação mioblastos C2C12 foram utilizadas para imunoprecipitação (IP) com anticorpos produzidos contra BAF47 (SNF5) ou MyoD, ou com IgG de controlo. Os precipitados resultantes foram analisados por wit WBh os anticorpos indicados. Para anticorpos anti-MyoD mais longos (longa exposição.) E menor (expo curta.) Tempos de exposição são mostrados. extratos de entrada foram carregadas para mostrar os níveis de proteínas endógenas. Este painel foi publicado em 28 sob a licença Creative Commons Attribution (CC BY) (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Este valor foi modificado a partir de 28: tipo e tamanho polícia foi alterado e o teste foi rodado para unificar a rotulagem no âmbito da figura. (C) Os extractos totais nuclear a partir de mioblastos C2C12 em proliferação foram utilizadas para imunoprecipitação com anticorpos criados contra MyoD, Suv39h1 (controlo positivo), ou IgG de controlo (controlo negativo). Os precipitados resultantes foram então submetidas a WB com os anticorpos indicados. Este painel foi originalmente publicado no The Journal of Biological Chemistry. Yahi H, Fritsch L, Philipot O, Guasconi V, Souidi M, Robin P, Polesskaya A, Losson R, Harel-Bellan A, Ait-Si-Ali S. J Biol Chem. 2008 29 de agosto; 283(35): 23692-700. doi: 10,1074 / jbc.M802647200. Epub 2008 Jul 2. Direitos Autorais A Sociedade Americana de Bioquímica e Biologia Molecular. Este valor foi modificado a partir de 26: tipo e tamanho de polícia foi alterada eo texto foi rodado para unificar a rotulagem no âmbito da figura. (D) Os extractos totais nucleares de proliferar (prolif.) E diferenciadoras C2C12 de mioblastos (48 h, indicada como Diff.) Foram utilizados para imunoprecipitação (IP) com os anticorpos criados contra MyoD e Myf5, ou com IgG de coelho normal e com pérolas vazias quanto controle negativo. Os precipitados resultantes foram analisados por WB com os anticorpos indicados. extratos de entrada foram carregadas para mostrar os níveis de proteínas endógenas. Este painel foi publicado em 27 sob a licença Creative Commons Attribution (CC BY) (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Este valor foi modificado a partir de 27: tipo e tamanho de polícia foi alterada eo texto foi rodado para unificar a rotulagem no âmbito da figura. Os painéis com os resultados obtidos com a proliferar e diferenciar C2C12 são separados em dois, em oposição à figura original. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1:. Lista de proteínas identificadas por análise de MS em Complexos eMyoD Duplo Affinity purificadas isoladas a partir Nuclear Fraction Salt-extraível após a subtração das proteínas de fundo (proteínas identificadas pelo MS em eluatos de linha celular de controlo foram consideradas como pano de fundo não específica .) os dados representam a soma de quatro purificações independentes. por favor clique aqui para baixar esse arquivo.
Tabela 2: Lista de Proteínas Identified por Análise MS em Complexos eMyoD Duplo Affinity purificadas isoladas a partir Fraction Nucleosome enriquecido após a subtração das proteínas de fundo. Os dados representam a soma de três purificações independentes. Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.
Tabela 3. O tampão de composições. Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.
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Discussion
O método apresentado permite a identificação exaustiva de parceiros de um fator de transcrição, MyoD. Revelou parceiros MyoD num sistema heterólogo resistente a diferenciação induzida por MyoD, nomeadamente células de HeLa-S3. Assim, por definição, MyoD parceiros identificados são expressos ubiquamente. Estes incluem factores gerais e específicos de sequência de transcrição, enzimas modificadoras da cromatina, proteínas de processamento de RNA, quinases (Tabelas 1 e 2). Dado que as células de HeLa-S3 são resistentes a trans-diferenciação induzida por MyoD, MyoD actividade é principalmente repressiva e os parceiros identificados são susceptíveis de ser MyoD co-repressores. Isto é realçado pela presença de proteínas Id (Tabelas 1 e 2, Figura 2), que inibem a MyoD capacidade transativação 8. É importante ressaltar que tal estado repressivo corresponde ao status MyoD em proliferando mioblastos. Na verdade, confirmou que as interações MyoD com CBFβ, um MyoDparceiro identificado pelo método descrito, podem ser detectados em mioblastos C2C12 proliferar, mas são perdidas quando as células foram submetidos a diferenciação (ver a Figura 3D). No entanto, é importante notar que uma das principais limitações da metodologia apresentada é a falta de identificação MyoD co-activadores. Consistentemente, usando este método de nenhum dos co-activadores MyoD conhecidos, tais como histona-acetiltransferases 32 foram identificados.
Purificação de complexos MyoD, quer a partir da fracção solúvel (sal nuclear extraível, SE) do núcleo ou a fracção enriquecida em cromatina (nucleossoma enriquecido, NE) (Figura 1A), que serve, pelo menos, duas funções principais. Em primeiro lugar, tal fraccionamento aumenta a representação dos parceiros não estequiométricas que seriam mascarados se purificação MyoD realizada a partir de extractos nucleares totais. Em segundo lugar, isto permite a separação de duas subpopulações funcionais de MyoD: pré-depositados / EVICted (SE) e ligados a cromatina (NE). Entre interagentes específicas para MyoD DNA-desacoplado, muitas quinases, factores de transcrição, o tráfico de proteínas, bem como foram identificados alguns remodelers cromatina (Figura 2). Quando totalmente validado, uma rede deste tipo poderia fornecer uma visão sobre o modo de regulação de MyoD DNA-desacoplado atividade. Pesquisa adicional para MyoD modificações pós-traducionais nestes dois compartimentos nucleares por espectrometria de massa, poderia desvendar ainda mais regulação da atividade MyoD. Finalmente, o fraccionamento dos complexos solúveis e ligadas MyoD-cromatina em um gradiente de glicerol revelou que, enquanto a MyoD ligada a cromatina está contida principalmente em um complexo, MyoD ADN não ligado é distribuída em três sub-complexos (Figura 1B). Caracterização destes sub-complexos por qualquer MS e / ou Western blot contra os candidatos de proteína deve elucidar o modo de regulação MyoD.
Como ressaltado acima, as células HeLa naturalmente não EXPREss o fator de transcrição músculo MyoD. Foi, portanto, importante para confirmar as interações encontradas em um modelo de músculo esquelético (Figura 3). Muitos relatórios confirmados em modelos relevantes tais interacções funcionais entre MyoD e alguns dos parceiros identificados no ensaio de TAP-tag apresentados. Este é, por exemplo, o caso de proibitina 33, DDX17 34, MEIS1 35, CBF 27, HP1 26 e SWI / SNF 36,28,30 complexo remodelação da cromatina.
Note-se que é possível efectuar tal purificação TAP-tag da baixa quantidade de células, tais como a partir de mioblastos, quando combinados com MS sensíveis. De fato, um estudo recente descreveu parceiros MyoD caracterização após a expressão indutível de MyoD marcada com Flag em mioblastos 30. Desde estável e contínuo superexpressão MyoD em mioblastos é deletéria, uma abordagem alternativa seria adicionando as tags Bandeira-HA para o alelo (s) MyoD endógeno em mioblastosusando métodos de edição de genoma, tais como CRISPR-Cas9 31. Notavelmente, a adição da etiqueta (s) poderia potencialmente alterar a função da proteína e / ou associação com os parceiros de ligação, por conseguinte o local da etiqueta (N- ou C-terminal) deve ser escolhida com cuidado. Um ensaio funcional da proteína de fusão no sistema em causa deve ser realizado antes de purificação para TAP-tag para assegurar a proteína etiquetada é funcional. A imunoprecipitação de proteínas endógenas evita estes problemas, no entanto, apoia-se na disponibilidade de um anticorpo específico e de afinidade elevada, o que é raramente disponível.
Outro valor acrescentado da abordagem descrita, é a possibilidade de identificação de modificações pós-traducionais (PTMs) da própria proteína purificada e dos seus parceiros abundantes. Assim, com este recurso a purificação TAP-tag é adequado para identificar não só novos parceiros de interação, mas também novas funções enzimáticas associadas à proteína de interesse e / ou seus parceiros. Dentrono caso de uma proteína de ligação da cromatina (ie., factores de transcrição, enzimas), este método é, assim, adaptado para a identificação do "código de histona" associado. Com efeito, as caudas das histonas amino-terminais, que estão expostas na superfície do nucleossoma, estão sujeitas a múltiplas PTMs covalentes. PTMs histonas conferem uma única assinatura para os nucleossomos envolvidos. Uma combinação de diferentes modificações nas caudas N-terminais das histonas pode assim alterar a estrutura da cromatina para permitir a regulação da expressão do gene. Assim, caracterizando tais modificações associadas a uma determinada proteína pode fornecer insights sobre as funções e mecanismos de ação das proteínas de ligação de cromatina estudados 22.
Em resumo, a metodologia apresentada permite a identificação completa de parceiros MyoD. A purificação TAP-tag fornece uma alternativa a outras abordagens, tais como GST pull-baixos, ensaios de levedura de dois híbridos e de exibição em fagos. Mesmo que por razões práticas (production de grande quantidade de extractos nucleares), temos de usar um sistema celular heteróloga, temos sido capazes de confirmar a participação dos parceiros MyoD identificados na diferenciação do músculo esquelético. Os dados obtidos demonstraram que o factor miogénica MyoD parece interagir com uma variedade de proteínas que variam de reguladores da transcrição a proteínas de ligação de ARN, sugerindo que os diferentes mecanismos que regulam a actividade de um factor de transcrição.
Em conclusão, a mesma metodologia pode ser utilizada para identificar parceiros ubiquamente expressas de numerosos factores nucleares que podem ser difíceis de estudar no seu contexto celular específica.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell lines | |||
| HeLa-S3 | ATCC | CCL-2.2 | |
| C2C12 | ATCC | CRL-1772 | |
| Equipment | |||
| Spinner | Corning | 778531 | |
| Homogenizer: Dounce homogenizer | Wheaton | 432-1273 and 432-1271 | |
| Agitating device for spinners | Bellco | 778531 | |
| Sonicator | Diagenode | UCD 200 | |
| Hemocytometer | Marienfeld Superior | 640610 | |
| Low-binding tubes | Sorenson | 27210 | |
| Empty spin column | Bio-Rad | 7326204 | |
| Reagents | |||
| SDS-polyacrylamide 4-12% gel | Life technologies | NP0336BOX | |
| 4x loading buffer | Life technologies | NP0007 | |
| 10x reducing agent | Life technologies | NP0004 | |
| Silver staining kit | Life technologies | A8592 | |
| Centrifugal filter units, 10K | Millipore | UFC501024 | |
| Protein G agarose beads | Sigma-Aldrich | P4691 | |
| Protein A/G Resin | Thermo Scientific | 53132 | |
| Flag resin (anti-Flag M2-agarose affinity gel) | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| HA resin (monoclonal Anti-HA agarose) | Sigma-Aldrich | A2095 | |
| MNase | Sigma-Aldrich | N3755 | |
| Flag free peptide (DYKDDDDK) | Ansynth Service BV | Custom synthesis | Resuspend up to 4 mg/ml in 50 mM Tris-HCl, pH 7.8 |
| HA free peptide (YPYDVPDYA) | Ansynth Service BV | Custom synthesis | Resuspend up to 4 mg/ml in 50 mM Tris-HCl, pH 7.8 |
| Bicinchoninic acid based protein assay kit : BCA kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Protease inhibitors | Sigma-Aldrich | S8830 | |
| Luminol-based enhanced chemiluminescence (ECL) HRP substrate | Life technologies | 34075 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Sheared salmon sperm DNA (Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes) | Sigma-Aldrich | D1626 | |
| Spermine tetrahydrochloride | Sigma-Aldrich | S1141 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S0266 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| MOPS running buffer | Life technologies | NP0001 | |
| DMEM (high glucose) | Sigma-Aldrich | D0822 | Pre-warm at 37 °C before use |
| Trypsin-EDTA (0.05% phenol red | Life technologies | 25300-054 | |
| Serum | GE healthcare life sciences | PAA A15-102 | Each lot of serum has to be first tested for your cells. |
| Penicillin and Streptomycin | Life technologies | 15140-122 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Life technologies | 15250-061 | |
| Water (sterile-filtered) | Sigma-Aldrich | W3500 | |
| Antibodies | |||
| HA from rat (12CA5) | Roche | 11583816001 | |
| Flag | Sigma-Aldrich | A8592 | |
| MyoD | Santa Cruz | sc-32758 | To use for western blotting |
| MyoD | Santa Cruz | SC-760 | To use for immunoprecipitation and western blotting |
| CBFbeta | Santa Cruz | FL-182 | |
| HP1alpha | Euromedex | 2HP2G9 | |
| HP1beta | Euromedex | 1MOD1A9AS | |
| HP1gamma | Euromedex | 2MOD1GC | |
| Suv39h1 | Cell Signaling Technology | 8729 | |
| BAF47 | BD Biosciences | 612111 | |
| Myf5 | Santa Cruz | SC-302 | |
| Tubulin | Sigma-Aldrich | T9026 | |
| Actin | Sigma-Aldrich | A5441 | |
| IgG Mouse | Santa Cruz | SC-2025 | |
| IgG Rabbit | Santa Cruz | SC-2027 | |
| Goat anti-rat -HRP | Sigma-Aldrich | A9037 | |
| Goat anti-rabbit -HRP | Sigma-Aldrich | A6154 | |
| Goat anti-mouse -HRP | Sigma-Aldrich | A4416 |
References
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