Abstract
Skeletspieren terminale differentiatie begint met de inzet van pluripotente mesodermale voorlopercellen te myoblasten. Deze cellen nog steeds de proliferatie- of ze kunnen differentiëren en zekering in meerkernige myotubes, die verder rijpen om myovezels te vormen. Skeletspieren terminale differentiatie wordt georkestreerd door de gecoördineerde actie van de verschillende transcriptiefactoren, in het bijzonder de leden van de Muscle Regulatory Factors of MRFs (MyoD, myogenin, Myf5 en MRF4), ook wel de myogene bHLH transcriptiefactoren familie. Deze factoren werken samen met chromatine-remodeling complexen binnen uitgewerkte transcriptie regulerende netwerk om het skelet myogenesis bereiken. Hierbij wordt MyoD beschouwd als de meester myogene transcriptiefactor bij het ontstaan van de spieren terminale differentiatie. Deze opvatting wordt versterkt door het vermogen van MyoD niet-spiercellen zetten in skeletspiercellen. Hier beschrijven we een aanpak gebruikt om MyoD identificereneiwitpartners limitatief om de verschillende factoren die bij skeletspier differentiatie helderen. De lange-termijn doel is om de epigenetische mechanismen die betrokken zijn bij de regulatie van de skeletspieren genen, dwz., MyoD doelen begrijpen. MyoD partners worden aangegeven met Tandem Affinity Purification (TAP-Tag) vanaf een heteroloog gekoppeld met massaspectrometrie (MS) karakterisering, gevolgd door validatie van de rol van de relevante partners in skeletspier terminale differentiatie. Afwijkende vormen van myogene factoren, of de afwijkende regelgeving, worden geassocieerd met een aantal van spieraandoeningen: aangeboren myasthenia, myotone dystrofie, rhabdomyosarcoom en gebreken in de spieren regeneratie. Als zodanig myogene factoren een pool van mogelijke therapeutische doelwitten in spieraandoeningen, zowel wat de mechanismen die ziekte zelf en regeneratieve mechanismen die ziektebehandeling kunnen verbeteren veroorzaken. Zo is de gedetailleerde understanding van de intermoleculaire interacties en genetische programma gecontroleerd door de myogene factoren essentieel voor een rationeel ontwerp van efficiënte therapieën.
Introduction
Eukaryote multicellulaire organismen zijn samengesteld uit verschillende organen en weefsels. Elke functionele weefsel heeft een specifiek gen-expressie patroon dat wordt bepaald bij elke differentiatiestap. Celdifferentiatie omvat activering van specifieke genen, onderhoud van hun expressie en algemeen zwijgen van een aantal genen, die betrokken zijn bij celproliferatie. Skeletspierdifferentiatie of myogenese, dus een meerstaps-proces, dat begint met het bepalen van mesodermale stamcellen in myoblasten en vervolgens leidt tot de differentiatie van deze myoblasten in eerste mono-kernhoudende en vervolgens meerdere kernen, myotubes . Zo myoblasten worden 'bepaald' cellen, die nog steeds in staat zijn te laten groeien, maar ze zijn toegewijd aan de skeletspieren afstamming, en kan dus alleen differentiëren in skeletspiercellen ofwel tijdens de embryonale ontwikkeling of bij volwassen spier regeneratie. Het proces van de skeletspieren terminal verschillenentiation wordt georkestreerd door een specifieke genetische programma dat begint met de permanente verlaten de celcyclus van myoblast precursorcellen die leidt tot een definitieve silencing van proliferatie geassocieerde genen, zoals E2F doelgenen 1. Inderdaad, tijdens het proces van terminale differentiatie, proliferatie van myoblasten arrestatie een cruciale stap die de expressie van specifieke genen skeletspier en fusie van myoblasten in myotubes 2 voorafgaat. Een dergelijk programma maakt spier stamcellen volwassen, ook wel satelliet-cellen, om te differentiëren tijdens het regeneratieproces volgende skeletspieren letsel.
Zoogdieren myogenesis is sterk afhankelijk van een familie van myogene basic helix-loop-helix (bHLH) transcriptiefactoren MyoD, Myf5, MRF4 en myogenin, vaak aangeduid als de familie van de skeletspieren bepaling factoren of MRFs (Muscle Regulatory Factors) 3. Elk van hen speelt een essentiële rol in de specificatie en differentiatie van de skeletspieren cellen en heeft een specifieke uitdrukking patroon 5-7 april. De activering van Myf5 en MyoD vormt de bepalende stap die cellen verbindt aan de myogene lineage, en daaropvolgende expressie van myogenin triggers myogenesis met activatie van skeletspieren specifieke genen, zoals MCK (Muscle Creatine Kinase). Myogene bHLH transcriptiefactoren samen met leden van de familie MEF2 in de activatie van spier- genen uit eerder stille loci 8. Ze stimuleren ook de skeletspier gentranscriptie als heterodimeren met alomtegenwoordige bHLH eiwitten, E12 en E47, bekend als E-eiwitten, die de zogenaamde E-dozen in diverse gen-regulatoire gebieden 8 te binden. Twist, Identiteitskaart (remmer van differentiatie) en andere factoren negatief regelen dit proces, door te concurreren met MyoD voor E eiwitten binden 8.
MyoD wordt beschouwd als de voornaamste speler in triggering spier terminale differentiatie 9 10-13 induceren. Inderdaad, gedwongen expressie van MyoD induceert de trans-differentiatie van verschillende celtypes zelfs die afgeleid van een ander embryonale oorsprong 12. Zo kan MyoD hepatocyten, fibroblasten, melanocyten, neuroblasten, en adipocyten zetten in spier-achtige cellen. De trans-differentiërende werking van MyoD omvat een abnormale activatie van het myogene genetische (met name de doelwitgenen) in een niet-musculaire omgeving, gelijktijdig aan de onderdrukking van de genetica`s (met name, proliferatie genen).
In prolifererende myoblasten, wordt MyoD uitgedrukt, maar is niet in staat om zijn doel genen te activeren, zelfs wanneer het zich bindt aan hun promotoren 14-16. Daarom is de eis MyoD continu worden uitgedrukt in niet-gedifferentieerde myoblasten steeds vrij elusive. MyoD kon zijn doel genen als gevolg van de aanwerving van repressieve chromatine modificerende enzymen onderdrukken in delende myoblasten vóór het laden van het activeren van chromatine remodeling enzymen 14,17. Bijvoorbeeld, in prolifererende myoblasten, MyoD is geassocieerd met transcriptionele co-repressor KAP-1, histondeacetylasen (HDACs) en repressieve lysine methyltransferasen (kmts), waaronder histon H3 lysine 9 of H3K9 en H3K27 kmts en actief onderdrukken de doelwitgenen expressie door de oprichting van een lokaal repressieve chromatinestructuur 14,17. Belangrijk is dat een recent rapport blijkt dat MyoD zelf direct gemethyleerd door de H3K9 KMT G9a wat resulteert in de remming van zijn transactiverende activiteit 16.
De epigenetische mechanismen betrokken bij de trans-differentiatie van niet-spiercellen door MyoD grotendeels onbekend. Met name sommige cellijnen resistent tegen MyoD geïnduceerde trans-differentiatie. Dus in HeLa-cellen, MyoD is inactief ofzelfs functioneren dan repressor plaats van transcriptie-activator door gebrek aan expressie van de BAF60C subeenheid van chromatine remodeling complex SWI / SNF 18. Dit model kan dus gekozen om beter te karakteriseren van de mechanismen van MyoD geïnduceerde genrepressie. Het is ook geschikt om het vermogen van MyoD repressieve chromatine milieu veroorzaken bij zijn doel loci met de daarbij behorende partners en dus ontdek de MyoD-afhankelijke repressieve mechanismen in delende myoblasten te fine-tunen terminale differentiatie testen.
Hier beschrijven we het protocol voor de identificatie van MyoD partners met behulp van Tandem Affinity Purification (TAP-Tag) gekoppeld aan massaspectrometrie (MS) karakterisering. Het gebruik van HeLa-S3-cellen stabiel tot expressie Flag-HA-MyoD toegestaan voldoende materiaal naar de MyoD complexen van gefractioneerde kernextracten zuiveren. De identificatie van MyoD partners in het heterologe systeem volgde validatiop in een relevante systeem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van HeLa-S3 Nuclear Salt-extraheerbare en chromatine-gebonden fracties
- Het verzamelen van de cellen
- Groeien HeLa-S3 Flag-HA-MyoD en HeLa-S3 Flag-HA (controlecellijn) in Dulbecco's Gemodificeerd Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal kalfsserum, 100 U / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine (groei medium) bij 37 ° C en 5% CO2 in een vochtige incubator.
Opmerking: HeLa-S3-cellen stabiel tot expressie Flag-HA-MyoD en HeLa-S3-cellen getransduceerd met de lege vector (HeLa-S3 Flag-HA) kan worden vastgesteld hetzij bij protocol beschreven: 19,20, of door de auteurs. - Amplify cellen tot 10 volledig confluente 150 mm gerechten van elke cellijn (HeLa-S3 vlag-HA-MyoD en HeLa-S3 vlag-HA-cellen).
- Verzamel de bovenstaande vloeistof (bevatten niet hechtende subpopulatie) in 5 L spinner.
- Was de hechtende subpopulatie met 10 ml PBS per 150 mm schaal, trypsinize cellen gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur temperatuur (0,05% trypsine-EDTA oplossing, 2 ml van een 15 cm schaal).
- Voeg 4 ml medium per 150 mm schaal en laat de cellen in 50 ml buizen.
- Combineer de supernatant van stap 1.1.3 (in 5 L spinner) en de cellen uit stap 1.1.5, voeg 500 ml verse voorverwarmde groeimedium voor elke cellijn.
- Transfer celsuspensie in 5 L spinner en groeien cellen gedurende ten minste 60 uur bij 37 ° C en 5% CO2 in een vochtige incubator.
- Voeg 500 ml vers groeimedium kweken cellen gedurende 24 uur.
- Voeg 1 liter vers kweekmedium en kweken cellen gedurende 24 uur.
- Neem 1 ml van de celsuspensie om de cellen te tellen en controleren levensvatbaarheid van de cellen. Kleur 30 pi celsuspensie met 30 ul van 0,4% trypan blauw en tel tot leven (niet blauw) cellen onder de microscoop met behulp van hemocytometer.
- Houd de cel dichtheid bij 2-6 x 10 5 cellen / ml door het toevoegen van verse groeimedium dagelijks; niet meer dan 1 x 10 6 cellen / ml. Het maximumvolume van een 5 L spinner is 2,5 L.
Opmerking: Voor de volgende stappen gaat u door batches van 2-2,5 L van de cultuur in een dichtheid 1 x 10 6 cellen / ml. Herhaal stap 1.1.12 - 1.1.14 voor het verzamelen van ongeveer 20 L (≈ 20 g droog pellet) van elke cellijn alvorens over te gaan naar de volgende stap. - Pellet cellen door centrifugatie bij 500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C en werp de supernatant.
- Resuspendeer cellen in 100 ml ijskoude PBS door pipetteren en centrifugeer bij 500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C om de pellet te wassen.
- Herhaal het wassen door resuspenderen van de cellen met 25 ml ijskoude PBS, het overbrengen van de suspensie in 50 ml buis en centrifugeren bij 500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
Opmerking: Celpellets kunnen onmiddellijk worden gebruikt of bevroren in vloeibare stikstof en gedurende enkele dagen bewaard bij -80 ° C.
- Groeien HeLa-S3 Flag-HA-MyoD en HeLa-S3 Flag-HA (controlecellijn) in Dulbecco's Gemodificeerd Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal kalfsserum, 100 U / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine (groei medium) bij 37 ° C en 5% CO2 in een vochtige incubator.
- Isolatie van kernen
Opmerking: Voer de stappen 1.2.1 - 1.4.3 in de koude kamer.- Pre-chill Buffers en homogenisatoren.
- Bij gebruik ingevroren materiaal snel ontdooien de celpellets in een waterbad bij 37 ° C.
- Resuspendeer 20 g (≈ 20 ml) van cellen in 20 ml (een volume gelijk aan de omvang van de celpellet) hypotone buffer A (tabel 3) met 10 ml van de buffer eerst, vervolgens toevoegen van 5 ml, vervolgens toevoegen een 5 ml. Was de pipetten goed met verse buffer om het maximum van cellen krijgen.
- Breng 40 ml celsuspensie in de voorgekoeld homogenisator met een nauwsluitende stamper.
- Homogeniseren cellen met 20 slagen in een homogenisator (20 in en uit bewegingen) en breng celsuspensie in 50 ml buis.
- Was de homogenisator met 7 ml sucrose buffer (1/3 van het oorspronkelijke celvolume, tabel 3) het maximum van cellen herstellen. Breng deze suspensie snel in de 50 ml buis uit stap 1.2.5 om de kernen te behouden en de lekkage te beperken.
- Stain een 30 pl monster met 30 ul van 0,4% trypan blauw, analyseert onder de microscoop naar de lysis efficiency te controleren (als de lysis succesvol is, moeten alle kernen blauw zijn). Indien nodig, herhaal homogenisatie stap.
- Centrifugeer gedurende 7 min bij 10.000 xg en 4 ° C om de nuclei te pelleteren. Sla de supernatant als de cytoplasmatische fractie.
- Voorbereiding van de Nuclear Salt-extraheerbare (SE) Fraction
- Resuspendeer de kernen pellet in 8 ml sucrose buffer (een inhoud gelijk aan de grootte van de kernen pellet). Druppel voor druppel toevoegen onder mengen goed op een vortex 8 ml buffer met hoog zoutgehalte (1 kernen volume pellet, tabel 3) tot een eindconcentratie van 300 mM NaCl krijgen. Incubeer gedurende 30 minuten op ijs en meng elke 5 min.
- Verlagen NaCl concentratie 150 mM door toevoeging van 8 ml (1/3 van het totale volume) sucrose-buffer. Centrifugeer 10 minuten bij 13.000 xg en 4 ° C. Verzamel de bovenstaande vloeistof (nucleair zout-extraheerbare fractie, SE).
Opmerking: Ofwel ga dan naar stap 1.3.3 of laat de SEfractie op ijs tijdens de bereiding van chromatine-gebonden fractie en vervolgens ultra-centrifuge beide fracties tegelijk. - Ultra-centrifuge SE gedurende 30 min bij 85.000 xg bij 4 ° C. Neem supernatant (≈ 26 ml).
- Freeze 100 pi aliquot in vloeibare stikstof. Verder met stap 2 "eiwitcomplex zuivering" met de rest van het extract.
Opmerking: Het monster wordt gebruikt als input control tijdens stap 5.1.1.
- Bereiding van chromatine-gebonden fractie
- Resuspendeer de pellet (uit stap 1.3.5.) Nauwkeurig in 7 ml (volume gelijk aan de grootte van de pellet) sucrose-buffer.
- Voeg CaCl2 tot een eindconcentratie van 1 mM (28 pl 0,5 M CaCl2 gedurende 14 ml suspensie) aan MNase (stap 1.4.4) activeren en meng.
- Voorverwarmen suspensie gedurende 1 min bij 37 ° C.
- Voeg 70 ul micrococcal nuclease (MNase) tot de uiteindelijke concentratie te krijgen van 0,0025 U / gl (1/200 verdunning van 0,5U / gl voorraad) en meng.
- Incubeer precies 12 min bij 37 ° C. Meng elke 4 min.
- Onmiddellijk plaats de reactie op het ijs.
- Om MNase te beëindigen, voeg 112 ul van 0,5 M EDTA pH 8,0 (1/125 verdunning) om een eindconcentratie van 4 mM. Incubeer gedurende 5 minuten op ijs.
- Ultrasone trillingen 5 maal gedurende 1 minuut bij hoge amplitude, tussen twee sonicaties mogelijk een onderbreking van 1 min (10 min in totaal).
- Ultracentrifuge gedurende 30 min bij 85.000 xg en 4 ° C.
- Verzamel de bovenstaande vloeistof (nucleosoom verrijkte fractie, NE, ≈ 12 ml).
- Freeze 50 pi aliquot in vloeibare stikstof. Verder met stap 2 "eiwitcomplex zuivering" met de rest van het extract.
Opmerking: Het monster wordt gebruikt als input control tijdens stap 5.1.1.
2. eiwitcomplexen Purification
Opmerking: Ga in parallel uittreksels uit elke cellijn (HeLa-S3 vlag-HA-MyoD en de controle, Hela-S3 vlag-HA).
- De Vlag het gebaseerd Zuivering
- Voorwas Vlag hars. Gebruik 600 ul van de Vlag hars (van het commerciële 50% aandelen) voor elk punt in de proef (SE en NE fracties voor elke cellijn).
- Transfer hars in 15 ml buis, resuspendeer in 13 ml koud tegn (tabel 3), centrifugeer gedurende 2 min bij 1000 x g en verwijder supernatant. Herhaal 5 keer. Na de laatste wasbeurt resuspendeer Vlag hars in gelijke volume van tegn (300 ul voor elke experimentele punt).
- Voor elk experimenteel punt meng 600 pi gewassen vlag hars en de bijbehorende eiwitextracten (in een 15 ml buis voor de 12 ml NE en in een 50 ml buis voor de 26 ml fracties SE, respectievelijk). Incubeer op een roterend wiel gedurende de nacht bij 4 ° C.
- Centrifugeer gedurende 2 min bij 1000 xg bij 4 ° C, de supernatant opzij zetten en laten 4 ° C totdat het resultaat van de zuivering efficiëntietest (2,2).
- Voor de SE monsters, resuspendeer de Vlag harsin 4 ml tegn overgebracht in een 15 ml buis. Herhaal dit 3 maal, telkens overdracht naar hetzelfde 15 ml buis om te voorkomen dat korrels. Centrifugeer 2 min bij 1000 xg en 4 ° C en verwijder supernatant.
- Wassen Flag hars 7 keer in een 15 ml buis met behulp van 13 ml tegn centrifugeren en 2 min bij 1000 xg en 4 ° C.
- Na de laatste wasbeurt, resuspendeer in 1 ml tegn en de overdracht in een 1,5 ml low-bindend buis. Centrifugeer 2 min bij 1000 xg en 4 ° C en de bovenstaande vloeistof.
- Resuspendeer in 200 ul Flag peptide oplossing bij 4 mg / ml bij pH 7,8 voor elk experimenteel punt. Meng de kralen en peptide. Voeg 200 gl tegn buffer en incuberen bij 4 ° C gedurende ten minste 4 uur of een nacht gebonden eiwitten te elueren.
- Centrifugeer gedurende 2 min bij 1000 xg bij 4 ° C en breng het hars en supernatant (Flag eluaat) een lege spinkolom in een 2 ml buisje.
- Centrifugeer de kolom, verzamel de overgebleven supernatant in 2 ml buis. Verzamel de vlag hars door toevoeging tegn buffer aan de kolom en naar de tweede vlag elutie met 200 gl Flag peptide oplossing (4 mg / ml) overnacht bij 4 ° C voor elk experimenteel punt.
- Herhaal stap 2.1.9 - 2.1.10 naar tweede elutie verzamelen. Combineer eerste en tweede eluaten.
- Test van zuiveringsrendement
Opmerking: Tijdens stap 2.1.11 - 2.1.12, het uitvoeren van SDS-PAGE en zilverkleuring (2.2.1 - 2.2.2).- Neem 15 ul van de eluaten, voeg 5 ul van 4x beladingsbuffer en 2 pl 10x reductiemiddel; laat 5 minuten bij 96 ° C en uitvoeren van een SDS-polyacrylamide 4-12% gel volgens de instructies van de fabrikant.
- Vlekken op de gel met behulp van zilverkleuring kit (volg de instructies van de fabrikant). Als er duidelijke verschillen in eiwit patronen tussen vlag-HA-MyoD en vlag-HA mock eluaten, in het bijzonder de band van de vlag-HA MyoD (ongeveer 50 kDa, figuur 1A), gaan naar de volgende step.
- Hemagglutinine (HA) -gebaseerde Zuivering
- Wassen HA hars door overdracht in 15 ml buis, opnieuw suspenderen in 13 ml tegn centrifugeren en 2 min bij 1000 xg bij 4 ° C. Herhaal wasstap 5 keer. Na de laatste wasbeurt resuspendeer kralen in gelijke volume van tegn buffer.
Opmerking: Het volume moet worden aangepast aan de efficiëntie van Flag-gebaseerde zuivering. Begin met 300 pi van het commerciële 50% aandelen voor elk punt in de proef. - Transfer HA hars voor elk punt in de proef in een 1,5 ml lage binding buis. Centrifugeer 2 min bij 1000 xg bij 4 ° C, het maximaal elimineren van de wasbuffer (Tabel 3) en voeg de eluaten van Flag-gebaseerde zuivering HA hars.
- Incubeer buizen op de draaiende schijf overnacht bij 4 ° C.
- Centrifugeer gedurende 2 min bij 1000 xg bij 4 ° C, de supernatant opzij zetten en laten 4 ° C totdat het resultaat van de zuivering efficiëntietest (2.3.12.).
- Opnieuwschorten de HA hars in 0,5 ml tegn, over te dragen aan een nieuw dieptepunt bindend 1,5 ml buis. Herhaal resuspensie keer toevoegen aan dezelfde 1,5 ml buis om te voorkomen dat korrels en centrifugeer 2 min bij 1000 xg en 4 ° C. Verwijder supernatant.
- Was beads 8 keer met 1 ml tegn telkens centrifugeren 2 min bij 1000 xg en 4 ° C en verwijderen van supernatant (voorkomen dat korrels). Na de laatste wasbeurt, de overdracht van de kralen in 0,5 ml buizen.
- Verwijder zoveel supernatant mogelijk. Voeg 100 ul van HA vrij peptide oplossing (4 mg / ml) bij pH 7,8 op kralen gebonden eiwitten te elueren. Incubeer op het roterende wiel een nacht bij 4 ° C.
Opmerking: De hoeveelheid HA-peptide moet worden aangepast aan de overvloed van de complexen. - Centrifugeer gedurende 2 min bij 1000 xg bij 4 ° C en breng het hars en supernatant (HA eluaat) een lege spinkolom in een 2 ml buisje.
- Centrifugeer de kolom overgebleven supernatant te verzamelen in de 2 ml buis. Voer een tweede elutie met 100 pl HA peptide (4 mg / ml) voor elk punt in de proef. Incubeer op het roterende wiel een nacht bij 4 ° C. Herhaal stap 2.3.8 - 2.3.9 naar tweede elutie verzamelen.
- Combineer eerste en tweede eluaten.
- Test zuiveringsrendement door SDS-PAGE en zilverkleuring (zie stap 2.2.) (Figuur 1A).
- Concentreer de HA eluaat tot 30 ul met behulp van centrifugaal filter units met een 10 kDa cut-off (nominale moleculaire gewichtslimiet, NMGL) volgens de instructies van de fabrikant.
- Verdeel de geconcentreerde monsters in twee delen: 22.5 (3/4) en 7,5 (1/4) pl. Snap bevriezen 1/4 van monsters in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 ° C. Gebruik de 3/4 deel voor stap 3.
Opmerking: Het bevroren 1/4 deel wordt gebruikt voor de bevestiging van massaspectrometrie resultaten op Western blot (zie stap 5,1).
- Wassen HA hars door overdracht in 15 ml buis, opnieuw suspenderen in 13 ml tegn centrifugeren en 2 min bij 1000 xg bij 4 ° C. Herhaal wasstap 5 keer. Na de laatste wasbeurt resuspendeer kralen in gelijke volume van tegn buffer.
3. massaspectrometrie Analyse
Opmerking: De volgende stappen moeten met de massaspectrometrie faciliteit die het onderzoek zal uitvoeren worden besproken.
- Supplement 3/4 (22,5 ui) van de monsters met 7,5 ul van 4x beladingsbuffer en 3,3 pl 10x reductiemiddel en kook gedurende 5 minuten bij 96 ° C.
- samples belasting op een SDS-polyacrylamide 4-12% gel. Run gel bij 150 V constant gedurende 5 minuten om alle eiwitten op de gel voeren zonder afscheiding.
- Was de gel met water; vast te stellen voor 20 - 30 min Met lijm oplossing (10% azijnzuur, 50% methanol, 40% ultra-schone water) dan was het vaste gel 5 keer in ultra-schone water.
- Snijd de banden met de eiwitten, op te slaan in 1 ml water in een 1,5 ml tube en stuur die naar massaspectrometrie faciliteit.
4. Data Analysis
Let op: Dit is een algemene leidraad voor de analyse. De exacte procedure is afhankelijk van de specifieke wijze van de door MS gevensgebruikt om de analyse uit te voeren (bijvoorbeeld 21,22).
- Vergelijk de lijst van de geïdentificeerde eiwitten in "MyoD" eluaten met de lijst verkregen uit overeenkomstige negatieve controle voorbereiding. Uit te sluiten van de analyse van de eiwitten die in beide lijsten.
- Verwijder eiwitten die ≤2 totaal aantal geïdentificeerde peptiden uit resterende lijst.
- Toegang functionele annotatie en functionele indeling van de verkregen lijst van eiwitten met behulp van DAVID Bioinformatica Resources (http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp) en classificeren van de lijst van de eiwitten 23,24.
- (Optioneel) verwijderen uit de lijst "lifters", geladen niet-nucleaire eiwitten met sterke onvoorziene binding aan negatief geladen DNA 25. Deze bevatten cytoskelet, cytoplasma, mitochondriën, membraan en receptoreiwitten (eiwitvouwing cytoskelet en Restgroep eiwitten in de tabellen 1 en 2). </ Li>
- Vergelijk deze lijsten van de MyoD interactoren van SE en NE fracties algemene eiwitten en eiwitten die specifiek zijn voor elke fractie (figuur 2) te identificeren.
5. Bevestiging van Identified Interactors door Western Blot
- Bevestiging in HeLa-S3 vlag-HA-MyoD en HeLa-S3 vlag-HA
- Dooi eluaatmonsters verkregen bij de stap 2.3.14 (7,5 pi) op ijs. Voeg 12 pl tegn buffer, 10 ui 4x beladingsbuffer en 3 pl 10x reductiemiddel. Kook monsters gedurende 5 minuten bij 96 ° C.
- Opstellen van monsters voor de Western blotting.
- Ontdooi aliquots van de stappen 1.3.9 en 1.4.11 en meet eiwitconcentratie, bijvoorbeeld met BCA kit (Aanwijzingen fabrikant).
- Gebruik 15 ug van het eiwit per baan. Meet de juiste hoeveelheid van het extract en het volume van het monster aanpassen tot 15 gl met tegn buffer.
- Voeg 5 ul 4x ladingsbuffer en1,5 pl 10x reductiemiddel. Kook monsters gedurende 5 minuten bij 96 ° C.
- Voer een western blot analyse met antilichamen van belang (specifiek voor partner kandidaat die tijdens MS-analyse) met behulp van 15 pl eluaatmonsters. Met ingang extracten als controle van endogene eiwitniveaus (Figuur 3A).
- Bevestiging in de Relevante Cellular System
- Voorbereiding van de totale nucleaire extract van C2C12 muis myoblasten.
- Groeien muis C2C12-myoblasten in DMEM medium aangevuld met 15% foetaal kalfsserum, 100 U / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine bij 37 ° C en 5% CO2 in een vochtige incubator. Nooit meer dan 80% cel samenvloeiing aan cellen in proliferatieve toestand te houden.
- Groeien tenminste twee 150 mm schalen van C2C12 voor een punt (een antilichaam) van immunoprecipitatie (IP). Zuig het medium, wassen cellen tweemaal met 10 ml PBS.
- Schraap de cellen en verzamelen in 15 ml buis. Centrifuge bij 250 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Teruggooi supernatant.
- Schatten het volume van de celpellet (= V cel). Voorzichtig resuspendeer de pellet in 3 volumina V cell hypotone buffer B cytoplasmatische membraan (tabel 3) verstoren.
- Voeg 0,44 x V celvolume van 10% NP-40 tot een eindconcentratie van 1% bereikt (v / v). Keer de buis een paar keer om te mengen.
- Voeg 0,89 x V celvolume van SR (tabel 3) om de kernen integriteit te bewaren. Keer de buis een paar keer om de suspensie gehomogeniseerd en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 2000 xg om nuclei te pelleteren.
- Verwijder het supernatant (cytosolische fractie). Schatting van het volume van de kernen pellet (= V nuc). Resuspendeer kernen pellet in één volume V nuc van sucrose buffer.
- Druppel voor druppel toevoegen onder mengen goed op een vortex één volume V nuc hoge zout buffer tot een eindconcentratie van 300 mM krijgenNaCl, en incubeer 30 min op ijs. Meng om de 5 min.
- Voeg een volume V nuc van sucrose buffer en CaCl2 (eindconcentratie 1 mM) (om NaCl-concentratie tot 150 mM te verlagen). Mengen.
- Voorverwarmen suspensie gedurende 1 min bij 37 ° C, voeg micrococcal nuclease uiteindelijke concentratie van 0,0025 U / pl (1/200 uit voorraad van 0,5 U / pl) te krijgen. Mengen.
- Incubeer precies 12 min bij 37 ° C. Meng elke 3 min.
- Onmiddellijk plaats reactie op ijs en voeg EDTA (eindconcentratie 4 mm) MNase activiteit te stoppen. Incubeer gedurende 5 minuten op ijs.
- Sonificeer 5 keer voor 0,5 minuten elk met een hoge amplitude. Tussen twee sonicaties, zodat een breuk van 0,5 min (5 min in totaal).
- Ultra-centrifuge gedurende 30 minuten bij 85.000 xg en 4 ° C. Verzamel de supernatant (totale nucleaire extract).
- Meten eiwitconcentratie van de totale nucleaire extract, bijvoorbeeld met BCA kit (Aanwijzingen fabrikant), waarna immediatEly naar stap 5.2.2.
- Immunoprecipitatie (IP) van endogene MyoD.
- Om pre-clear de extracten, was 10 ul van proteïne G agarose parels voor elk IP-punt.
- Breng de benodigde hoeveelheid proteïne G agarose korrels in een 1,5 ml buis, hersuspenderen in 1,4 ml koude tegn, centrifugeer gedurende 2 min bij 1800 x g en verwijder supernatant. Herhaal dit 3 keer.
- Meng voorgewassen proteïne G agarose kralen met de juiste hoeveelheid van de totale nucleaire extract. Gebruik 500 ug totaal nucleair extract eiwit per IP punt.
- Incubeer op een draaiend wiel bij 4 ° C gedurende 2 uur tot vooraf duidelijk de extracten.
- Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 1800 xg bij 4 ° C. Houd supernatant.
- Meng 5 ug MyoD Ab of 5 ug konijn IgG met 500 ug pre-ontruimd totale nucleaire extracten in 1,5 ml lage binding buizen. Voeg tegn buffer tot 1 ml. Incubeer op een draaiend wiel bij 4 ° C overnacht.
Opmerking: Voer de fadat stappen tijdens stap 5.2.2.3. - Pre-wash 7,5 pl proteïne A / G stock kralen oplossing per IP punt.
- Breng de benodigde hoeveelheid kralen in een 1,5 ml buis, resuspendeer kralen in 1 ml tegn en centrifugeer bij 1800 xg bij 4 ° C gedurende 2 minuten. Verwijder het supernatant. Herhaal dit 3 keer.
- Resuspendeer proteïne A / G kralen in 1,5 ml blokkeeroplossing (Tabel 3) en incubeer op een roterend wiel gedurende de nacht bij 4 ° C.
- Centrifugeer totale nucleaire extracten geïncubeerd met Abs (stap 5.2.2.5) bij 16.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Houd supernatant.
- Centrifuge geblokkeerde proteïne A / G-hars (stap 5.2.2.7) bij 1800 g gedurende 2 min bij 4 ° C. Gooi supernatant en resuspendeer in 1 ml tegn buffer. Re-centrifuge bij 1800 xg gedurende 2 min bij 4 ° C te wassen blokkerende buffer.
- Resuspendeer geblokkeerde proteïne A / G hars in 1 ml tegn buffer en het monster in nieuwe low-eiwit binding buizen tot 7,5 ul blo verkrijgencked proteïne A / G hars per IP punt. Centrifugeer bij 1800 xg bij 4 ° C gedurende 2 minuten en verwijder zoveel mogelijk van de supernatant.
- Voeg de totale nucleaire extracten geïncubeerd met het Abs (of controle-IgG) met de A / G-hars. Meng en incubeer 2 uur bij kamertemperatuur (RT) op een roterend wiel.
- Centrifugeer suspensie 1800 xg bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten. Gooi supernatant, resuspendeer in 1 ml wasbuffer en de overdracht schorsing naar nieuw dieptepunt bindende buizen. Incubeer bij kamertemperatuur op een roterend wiel gedurende 5 min.
- Centrifugeer suspensie bij 1800 xg bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten, resuspendeer in 1 ml wasbuffer en geïncubeerd bij kamertemperatuur op een roterend wiel gedurende 5 min. Herhaal 4 keer. Voor de laatste wasbeurt transfer naar een nieuw dieptepunt bindende buis.
- Verwijder het supernatant maximaal. Voeg 7 pl wasbuffer, 7 ul van 4x beladingsbuffer en 3 pl 10x reductiemiddel aan de korrels, mengen en koken gedurende 5 minuten bij 96 ° C.
- Voer een western blot analyse met antilichamen van interest (specifiek voor partner kandidaat voor het immuunsysteem neergeslagen eiwit). Met 1% (5 ug) input extracten als controle van endogene eiwitniveaus (Figuur 3B).
- Om pre-clear de extracten, was 10 ul van proteïne G agarose parels voor elk IP-punt.
- Voorbereiding van de totale nucleaire extract van C2C12 muis myoblasten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om de regulering van MyoD activiteit te begrijpen, ondernam we de volledige karakterisering van de MyoD complexen met behulp van biochemische zuivering, op basis van de immunozuivering van een dubbele tag vorm van MyoD gevolgd door massaspectrometrie (MS). Het gebruik van HeLa-S3 cellijn die vlag-HA-tag MyoD en een controle-cellijn die vlag-HA toelaat om genoeg materiaal om de MyoD complex te zuiveren door het uitvoeren van dubbel-affiniteitszuivering van Flag-HA-MyoD krijgen.
We gefractioneerde de cel extracten in cytoplasmatische en nucleaire fracties, vervolgens verder gefractioneerd de nucleaire fractie-zout gewonnen (nucleaire zout-extraheerbaar, SE) en verrijkt voor nucleosomen (-nucleosoom verrijkt, NE) fracties. TAP-Tag zuivering uit deze afgescheiden nucleaire fracties (Figuur 1, Tabellen 1 en 2) toegestane ontrafelen partners die relatief lage ab hebbenAdirondack wanneer gelokaliseerd op één specifieke subnucleaire compartiment. Bovendien werd een dergelijke strategie benut om partners van ongebonden (SE) versus-DNA gebonden (NE) MyoD bloot te leggen om inzicht te krijgen op MyoD activiteitsregeling krijgen.
Voor TAP-Tag zuivering werd de vlag-HA-tandem epitoop systeem dat wordt gebruikt. De kleine hydrofiele Flag en HA epitopen hebben een minimale verstoring van de functies van eiwitten en zijn zeer toegankelijk zijn voor antilichaam-antigeen interactie. Anti-Flag en anti-HA-hars gebaseerde sequentiële immunozuivering werd uitgevoerd, gevolgd door elutie van de immuungezuiverd complexen met Vlag en HA peptiden. De geëlueerde eiwitten werden vervolgens uitgevoerd op een SDS-PAGE om alle eiwitten aan de gel voeren. De stukken gel met alle gezuiverde eiwitten werden gesneden; de eiwitten werden geëxtraheerd, trypsine gedigereerd en geïdentificeerd door massaspectrometrie (MS).
Zoals getoond in figuur 2, (figuur 2 en 3) 26-28. Dit werpt licht op DNA-gebonden MyoD partners en eventuele co-regelgevers dat een repressief chromatine-omgeving kan vaststellen. Bijvoorbeeld HP1 eiwitten, waar naar MyoD partners door beschreven methodologie is bekend dat gemethyleerd H3K9 binden genrepressie heterochromatine en te handhaven. Inderdaad, HP1 remt MyoD transcriptie-activiteit als gevolg gestoorde MyoD doelwit genexpressie en spieren terminale differentiatie 26.
Verdere fractionering vande SE en NE MyoD complexen op glycerol gradiënt (zoals beschreven in 29) onbedekte MyoD sub-complexen in de twee compartimenten subnucleaire (Figuur 1B). In het bijzonder wordt SE MyoD verdeeld in drie sub-complexen, terwijl het chromatine gebonden MyoD komt hoofdzakelijk één complex.
Sommige van de TAP-tag / MS openbaarde interactors werden bevestigd door western smet op MyoD complexen. Deze omvatten de transcriptiefactor CBF, EBB, MTG8R en de SWI / SNF subunit BAF47 (SNF5) (figuur 3A, links) en HP1 eiwitten (CBX1 en CBX3) (Figuur 3A, rechts). Belangrijk, omdat HeLa cellen niet spiercellen en niet tot expressie MyoD, moet om interacties tussen geïdentificeerde interactorenen MyoD in myoblasten (figuur 3 BD) bevestigen. Met name voor deze validatie, de totale nucleaire extracten (zonder scheiding op SE en NE) zijn meestal voldoende, which maakt verlaging van het bedrag van myoblasten gebruikt voor de monstervoorbereiding. De in vitro interactie assays zoals in 26,27, helpen verder gevalideerd deze bevindingen. Tenslotte moet de functionele betekenis van deze interacties in spiercellen verder worden behandeld als in 26-28.
Bij elkaar genomen, gepresenteerde gegevens tonen een globaal overzicht van alomtegenwoordig uitgedrukt MyoD partners en de weg vrijmaken voor verdere functionele studies in een meer relevante spier model.
Figuur 1: MyoD Complexen Geïsoleerd Tandem Affinity Purification (A) een zilverkleuring van een dubbele-affiniteit gezuiverd eMyoD complexen geïsoleerd van nucleaire zout-extraheerbaar (SE) of nucleosoom-verrijkte (NE) nucleaire fracties van HeLa-S3 cellijnen stabiel. uitdrukken vlag-HA-MyoD (MyoD complex) eend controle cellijn (Mock). MW, moleculair gewicht marker in kilo dalton (kDa). De pijl geeft vlag-HA-MyoD (eMyoD). Dit onderzoek werd oorspronkelijk gepubliceerd in 37. Auteursrecht De Amerikaanse Vereniging voor Biochemie en Moleculaire Biologie. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van 26: de lanen met mock zuiveringen en eMyoD complex geïsoleerd van SE nucleaire fracties worden nu getoond. (B) dubbele affiniteit gezuiverd eMyoD complexen zoals in (A) werden gefractioneerd op glycerol gradiënt van 20% tot 41%. De fracties werden handmatig verzameld, geconcentreerd en geanalyseerd door western blot (WB) met behulp van anti-Flag antilichamen. Let op de aanwezigheid van een aantal eMyoD bevattende sub-complexen in de nucleaire zout-extraheerbare (SE) fractie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2:. Vergelijking van chromatine-gebonden (nucleosoom verrijkt, NE) versus Nuclear Oplosbare (nucleaire zout winbare, SE) MyoD Partners Top: Venn diagram dat overlap tussen eMyoD interactors geïsoleerd van nucleaire zout-extraheerbare (SE) en nucleosoom verrijkt ( NE) fractie. De ribosomale eiwitten, translatie-initiatie factoren, DNA-reparatie factoren en de tubuline isovormen werden uitgesloten van de analyse als ze aanwezig zijn in verschillende datasets verkregen door TAP en wordt beschouwd als niet-specifieke Bottom zijn:. De MyoD interactoren gevonden in zowel SE en NE fracties (standaard) of specifiek voor een van de fracties (unieke) werden verdeeld in groepen op basis van hun functionele annotaties. Cytoskelet-gerelateerde en andere diverse eiwitten worden niet afgebeeld. De onderstreepte eiwitten zijn MyoD interactoren gevalideerd ofwel HeLa en / of myoblasts door co-immunoprecipitatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3:. Validatie van de geselecteerde set MyoD Interactors (A) Validatie van MyoD interactors, geïdentificeerd door massaspectrometrie, in HeLa-S3-cellijn stabiel tot expressie vlag-HA-MyoD (eMyoD) Links paneel:. Western blot analyse van dubbele affiniteit -purified MyoD complexen geïsoleerd van nucleaire zout-extraheerbare (SE) of nucleosoom verrijkte (NE) fracties van HeLa-S3-cellijn stabiel tot expressie eMyoD of de controle-cellijn (Mock) met de aangegeven antilichamen. MW, moleculair gewicht marker Rechts paneel. Western blot analyse van double-affiniteit gezuiverd MyoD complexen geïsoleerd van nucleaire-nucleosoom verrijkte fracties van HeLa-S3-cellijn stably uitdrukken eMyoD of de controle-cellijn (Mock) met de aangegeven antilichamen. Dit paneel werd oorspronkelijk gepubliceerd in The Journal of Biological Chemistry. Yahi H, Fritsch L, PHILIPOT O, Guasconi V, Souidi M, Robin P, Polesskaya A, Losson R, Harel-Bellan A, Ait-Si-Ali S. J Biol Chem. 2008 29 augustus; 283 (35): 23692-700. doi: 10,1074 / jbc.M802647200. Epub 2008 juli 2. Auteursrecht De Amerikaanse Vereniging voor Biochemie en Moleculaire Biologie. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van 26: politie type en de grootte werd veranderd en de tekst werd gedraaid om de etikettering in de figuur te verenigen. MyoD werd gemerkt als eMyoD de verwarring met endogene IP die in de andere panelen te voorkomen. (BD) Validatie van MyoD interactoren in C2C12 muis myoblasten. (B) Nuclear totale uittreksels uit prolifererende C2C12 myoblasten werden gebruikt voor immunoprecipitatie (IP) met antilichamen opgewekt tegen BAF47 (SNF5) of MyoD, of met controle-IgG. De verkregen precipitaten werden geanalyseerd door WB with de aangegeven antilichamen. Voor anti-MyoD antilichamen langer (lang expo.) En kortere (korte expo.) Belichtingstijden worden getoond. Input extracten werden geladen in endogene eiwitniveaus tonen. Dit paneel is gepubliceerd in 28 onder de Creative Commons Naamsvermelding (CC BY) licentie (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van 28: politie type en de grootte werd veranderd en de test werd gedraaid om de etikettering in de figuur te verenigen. (C) Nuclear totale uittreksels uit prolifererende C2C12 myoblasten werden gebruikt voor immunoprecipitatie met antilichamen opgewekt tegen MyoD, Suv39h1 (positieve controle), of controle IgG (negatieve controle). De verkregen precipitaten werden vervolgens onderworpen aan WB met de aangegeven antilichamen. Dit paneel werd oorspronkelijk gepubliceerd in The Journal of Biological Chemistry. Yahi H, Fritsch L, PHILIPOT O, Guasconi V, Souidi M, Robin P, Polesskaya A, Losson R, Harel-Bellan A, Ait-Si-Ali S. J Biol Chem. 2008 29 augustus; 283(35): 23.692-700. doi: 10,1074 / jbc.M802647200. Epub 2008 juli 2. Auteursrecht De Amerikaanse Vereniging voor Biochemie en Moleculaire Biologie. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van 26: politie type en de grootte werd veranderd en de tekst werd gedraaid om de etikettering in de figuur te verenigen. (D) Nuclear totaalextracten van prolifererende (Prolif.) En differentiëren C2C12-myoblasten (48 hr, aangeduid als Diff.) Werden gebruikt voor immunoprecipitatie (IP) met antilichamen opgewekt tegen MyoD en Myf5 of met normaal konijnenserum IgG en met lege kralen als negatieve controle. De verkregen precipitaten werden geanalyseerd door WB met de aangegeven antilichamen. Input extracten werden geladen in endogene eiwitniveaus tonen. Dit paneel is gepubliceerd in 27 onder de Creative Commons Naamsvermelding (CC BY) licentie (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van 27: politie type en de grootte werd veranderd en de tekst werd gedraaid om de etikettering te verenigen binnen de fIGUUR. De panelen met de resultaten van proliferatie en differentiatie C2C12 worden gescheiden in twee, in tegenstelling tot het oorspronkelijke cijfer resultaten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1:. Lijst van eiwitten geïdentificeerd door MS Analysis in Double Affiniteit-gezuiverd eMyoD Complexen Geïsoleerd van Nuclear Salt-extraheerbare fractie na het aftrekken van de achtergrond eiwitten (eiwitten geïdentificeerd door MS in eluaten van controle-cellijn werden beschouwd als niet-specifieke achtergrond .) de gegevens zijn de som van vier onafhankelijke zuiveringen. klik hier om dit bestand te downloaden.
Tabel 2: Lijst van eiwitten Identified door MS Analysis in Double Affiniteit-gezuiverd eMyoD Complexen Geïsoleerd van Nucleosome-verrijkte fractie na het aftrekken van de achtergrond eiwitten. De gegevens zijn de som van drie onafhankelijke zuiveringen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Tabel 3. Buffer Compositions. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De gepresenteerde methode maakt uitputtend identificatie van partners van een transcriptiefactor, MyoD. Geopenbaard MyoD partners in een heteroloog systeem resistent tegen MyoD geïnduceerde differentiatie, namelijk HeLa-S3-cellen. Dus per definitie, die MyoD partners zijn alomtegenwoordig uitgedrukt. Deze omvatten algemene en sequentie-specifieke transcriptiefactoren, chromatine-modificerende enzymen, RNA verwerking eiwitten, kinasen (tabellen 1 en 2). Omdat HeLa-S3-cellen zijn resistent tegen MyoD geïnduceerde trans-differentiatie, MyoD activiteit voornamelijk repressieve en de geïdentificeerde partners waarschijnlijk MyoD co-repressoren zijn. Dit wordt benadrukt door de aanwezigheid van Id eiwitten (tabellen 1 en 2, figuur 2), waarvan bekend MyoD transactivatie vermogen 8 remmen. Belangrijk is dat dergelijke repressieve toestand komt overeen met de MyoD status prolifererende myoblasten. Sterker nog, we bevestigd dat MyoD interacties met CBFβ, een MyoDpartner die door de beschreven werkwijze kunnen worden gedetecteerd in prolifererende C2C12-myoblasten, maar verloren wanneer cellen ondergingen differentiatie (zie figuur 3D). Niettemin dient te worden opgemerkt dat een van de belangrijkste beperkingen van de gepresenteerde methode is het gebrek aan MyoD co-activatoren identificatie. Consequent, deze methode geen van de bekende MyoD co-activatoren, zoals histon-acetyltransferase 32 geïdentificeerd.
Zuivering van MyoD complexen hetzij uit de oplosbare fractie (nucleaire zout extraheerbaar, SE) van de kern of chromatine-verrijkte fractie (nucleosoom verrijkte, NE) (Figuur 1A) dient ten minste twee belangrijke functies. Ten eerste, zoals fractionering verhoogt de representatie van de niet-stoichiometrische partners die zouden worden gemaskeerd als MyoD zuivering uitgevoerd van total kernextracten. Ten tweede maakt dit de scheiding van twee functionele subpopulaties van MyoD: pre-gedeponeerd / Evicted (SE) en chromatine-gebonden (NE). Onder interactors specifiek voor DNA-gebonden MyoD, vele kinases, transcriptiefactoren, trafficking eiwitten evenals enkele chromatine remodelers geïdentificeerd (Figuur 2). Wanneer deze volledig gevalideerd, kan een dergelijk netwerk een inzicht in de stand van de activiteit regulatie van DNA-ongebonden MyoD bieden. Extra zoeken naar MyoD post-translationele modificaties in deze twee nucleaire compartimenten met behulp van massaspectrometrie, kan verder ontrafelen MyoD activiteitsregeling. Tenslotte fractionering van oplosbare en gebonden chromatine MyoD complexen op een glycerol gradiënt bleek dat terwijl de chromatine gebonden MyoD hoofdzakelijk in één complex wordt DNA-ongebonden MyoD verdeeld in drie sub-complexen (Figuur 1B). Karakterisatie van deze sub-complexen door ofwel MS en / of western blot tegen eiwit kandidaten dienen verder te ontrafelen de wijze van MyoD regelgeving.
Zoals hierboven benadrukt, hoeft HeLa-cellen niet nature Express de spier transcriptiefactor MyoD. Het is dus belangrijk om de gevonden interacties in een skeletspier model (figuur 3) te bevestigen. Veel rapporten bevestigd relevante modellen zoals functionele interacties tussen MyoD en enkele partners die in de gepresenteerde TAP-tag assay. Dit is bijvoorbeeld het geval voor prohibitine 33, DDX17 34, MEIS1 35, CBF 27, HP1 26 en SWI / SNF chromatine remodeling complex 36,28,30.
Merk op dat het mogelijk is dergelijke TAP-tag zuivering uitvoeren van lage hoeveelheid cellen, zoals van myoblasten in combinatie gevoelige MS. Sterker nog, een recente paper beschreven MyoD partners karakterisering na induceerbare expressie van-Flag tag MyoD in myoblasten 30. Aangezien stabiele en continue MyoD overexpressie in myoblasten schadelijk is, zou een alternatieve aanpak toevoeging van Flag-HA markeringen in de endogene MyoD allel (en) in myoblastendoor-genoom bewerken werkwijzen, zoals CRISPR-Cas9 31. Met name de toevoeging van de tag (s) zou kunnen veranderen eiwit functie en / of associatie met bindende partners, dus de plaats van het label (N- en C-terminus) moet worden gekozen met de nodige voorzichtigheid. Een functionele test van het fusie-eiwit in relevante systeem moet worden uitgevoerd vóór het TAP-tag zuivering verzekeren de gelabelde eiwit functioneel. Immunoprecipitatie van endogene eiwitten vermijdt deze problemen, echter afhankelijk van de beschikbaarheid van een specifieke en hoge affiniteit antilichaam dat zelden beschikbaar is.
Een andere meerwaarde van de beschreven aanpak is de mogelijkheid om post-translationele modificaties te identificeren (PTM) van het gezuiverde eiwit zelf en de overvloedige partners. Daarbij, met deze functie de TAP-tag zuivering geschikt om niet alleen nieuwe interactiepartners maar ook nieuwe enzymatische functies in verband met het eiwit van belang en / of zijn partners identificeren. InBij een chromatine-bindend eiwit (bijv., transcriptiefactoren, enzymen), wordt deze werkwijze daardoor geschikt voor de identificatie van de bijbehorende "histoncode". Inderdaad, het aminoterminale histone staarten, die blootgesteld worden aan de nucleosoom oppervlak, onderworpen zijn aan meervoudige covalente fosforylatie. Histon PTMs verlenen van een unieke signatuur aan de betrokken nucleosomen. Een combinatie van verschillende wijzigingen op histone N-terminale staarten kan dus veranderen chromatinestructuur genexpressie regulatie mogelijk. Aldus karakteriseren dergelijke wijzigingen geassocieerd met een bepaald eiwit kan inzicht in de rol en werkingsmechanismen van de bestudeerde chromatine bindende eiwitten 22 verschaffen.
Samengevat, de voorgestelde methodiek maakt uitgebreide identificatie van MyoD partners. De TAP-tag zuivering is een alternatief voor andere benaderingen, zoals GST pull-downs, gist-twee-hybride-assays en faag display. Ook al om praktische redenen (production van de grote hoeveelheid nucleaire extracten) hebben we een heteroloog cellulair systeem te gebruiken, zijn we in staat om de betrokkenheid van de geïdentificeerde MyoD partners in skeletspierdifferentiatie bevestigen geweest. De verkregen gegevens tonen dat de MyoD myogene factor lijkt te communiceren met een overvloed aan eiwitten variërend van transcriptiefactoren RNA bindende eiwitten, suggereert de verschillende mechanismen reguleren van de activiteit van een transcriptiefactor.
Tot slot, kan dezelfde methodologische benadering gebruikt worden om alomtegenwoordig uitgedrukt partners van een groot aantal nucleaire factoren die moeilijk te bestuderen in hun specifieke cellulaire context zou kunnen identificeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell lines | |||
| HeLa-S3 | ATCC | CCL-2.2 | |
| C2C12 | ATCC | CRL-1772 | |
| Equipment | |||
| Spinner | Corning | 778531 | |
| Homogenizer: Dounce homogenizer | Wheaton | 432-1273 and 432-1271 | |
| Agitating device for spinners | Bellco | 778531 | |
| Sonicator | Diagenode | UCD 200 | |
| Hemocytometer | Marienfeld Superior | 640610 | |
| Low-binding tubes | Sorenson | 27210 | |
| Empty spin column | Bio-Rad | 7326204 | |
| Reagents | |||
| SDS-polyacrylamide 4-12% gel | Life technologies | NP0336BOX | |
| 4x loading buffer | Life technologies | NP0007 | |
| 10x reducing agent | Life technologies | NP0004 | |
| Silver staining kit | Life technologies | A8592 | |
| Centrifugal filter units, 10K | Millipore | UFC501024 | |
| Protein G agarose beads | Sigma-Aldrich | P4691 | |
| Protein A/G Resin | Thermo Scientific | 53132 | |
| Flag resin (anti-Flag M2-agarose affinity gel) | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| HA resin (monoclonal Anti-HA agarose) | Sigma-Aldrich | A2095 | |
| MNase | Sigma-Aldrich | N3755 | |
| Flag free peptide (DYKDDDDK) | Ansynth Service BV | Custom synthesis | Resuspend up to 4 mg/ml in 50 mM Tris-HCl, pH 7.8 |
| HA free peptide (YPYDVPDYA) | Ansynth Service BV | Custom synthesis | Resuspend up to 4 mg/ml in 50 mM Tris-HCl, pH 7.8 |
| Bicinchoninic acid based protein assay kit : BCA kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Protease inhibitors | Sigma-Aldrich | S8830 | |
| Luminol-based enhanced chemiluminescence (ECL) HRP substrate | Life technologies | 34075 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Sheared salmon sperm DNA (Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes) | Sigma-Aldrich | D1626 | |
| Spermine tetrahydrochloride | Sigma-Aldrich | S1141 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S0266 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| MOPS running buffer | Life technologies | NP0001 | |
| DMEM (high glucose) | Sigma-Aldrich | D0822 | Pre-warm at 37 °C before use |
| Trypsin-EDTA (0.05% phenol red | Life technologies | 25300-054 | |
| Serum | GE healthcare life sciences | PAA A15-102 | Each lot of serum has to be first tested for your cells. |
| Penicillin and Streptomycin | Life technologies | 15140-122 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Life technologies | 15250-061 | |
| Water (sterile-filtered) | Sigma-Aldrich | W3500 | |
| Antibodies | |||
| HA from rat (12CA5) | Roche | 11583816001 | |
| Flag | Sigma-Aldrich | A8592 | |
| MyoD | Santa Cruz | sc-32758 | To use for western blotting |
| MyoD | Santa Cruz | SC-760 | To use for immunoprecipitation and western blotting |
| CBFbeta | Santa Cruz | FL-182 | |
| HP1alpha | Euromedex | 2HP2G9 | |
| HP1beta | Euromedex | 1MOD1A9AS | |
| HP1gamma | Euromedex | 2MOD1GC | |
| Suv39h1 | Cell Signaling Technology | 8729 | |
| BAF47 | BD Biosciences | 612111 | |
| Myf5 | Santa Cruz | SC-302 | |
| Tubulin | Sigma-Aldrich | T9026 | |
| Actin | Sigma-Aldrich | A5441 | |
| IgG Mouse | Santa Cruz | SC-2025 | |
| IgG Rabbit | Santa Cruz | SC-2027 | |
| Goat anti-rat -HRP | Sigma-Aldrich | A9037 | |
| Goat anti-rabbit -HRP | Sigma-Aldrich | A6154 | |
| Goat anti-mouse -HRP | Sigma-Aldrich | A4416 |
References
- Ait-Si-Ali, S., et al. A Suv39h-dependent mechanism for silencing S-phase genes in differentiating but not in cycling cells. Embo J. 23 (3), 605-615 (2004).
- Buckingham, M. Skeletal muscle development and the role of the myogenic regulatory factors. Biochem Soc Trans. 24 (2), 506-509 (1996).
- Arnold, H. H., Winter, B. Muscle differentiation: more complexity to the network of myogenic regulators. Curr Opin Genet Dev. 8 (5), 539-544 (1998).
- Buckingham, M. Skeletal muscle formation in vertebrates. Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 440-448 (2001).
- Yun, K., Wold, B. Skeletal muscle determination and differentiation: story of a core regulatory network and its context. Curr Opin Cell Biol. 8 (6), 877-889 (1996).
- Molkentin, J. D., Olson, E. N. Defining the regulatory networks for muscle development. Curr Opin Genet Dev. 6 (4), 445-453 (1996).
- Arnold, H. H., Braun, T. Targeted inactivation of myogenic factor genes reveals their role during mouse myogenesis: a review. Int J Dev Biol. 40 (1), 345-353 (1996).
- Puri, P. L., Sartorelli, V. Regulation of muscle regulatory factors by DNA-binding, interacting proteins, and post-transcriptional modifications. J Cell Physiol. 185 (2), 155-173 (2000).
- Tapscott, S. J. The circuitry of a master switch: Myod and the regulation of skeletal muscle gene transcription. Development. 132 (12), 2685-2695 (2005).
- Lassar, A. B., Paterson, B. M., Weintraub, H. Transfection of a DNA locus that mediates the conversion of 10T1/2 fibroblasts to myoblasts. Cell. 47 (5), 649-656 (1986).
- Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts. Cell. 51, 987-1000 (1987).
- Tapscott, S. J., et al. MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts. Science. 242, 405-411 (1988).
- Weintraub, H., et al. Activation of muscle-specific genes in pigment, nerve, fat, liver, and fibroblast cell lines by forced expression of MyoD. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (14), 5434-5438 (1989).
- Mal, A., Harter, M. L. MyoD is functionally linked to the silencing of a muscle-specific regulatory gene prior to skeletal myogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (4), 1735-1739 (2003).
- Ohkawa, Y., Marfella, C. G., Imbalzano, A. N. Skeletal muscle specification by myogenin and Mef2D via the SWI/SNF ATPase Brg1. Embo J. 25 (3), 490-501 (2006).
- Ling, B. M., et al. Lysine methyltransferase G9a methylates the transcription factor MyoD and regulates skeletal muscle differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (3), 841-846 (2012).
- Zhang, C. L., McKinsey, T. A., Olson, E. N. Association of class II histone deacetylases with heterochromatin protein 1: potential role for histone methylation in control of muscle differentiation. Mol Cell Biol. 22 (20), 7302-7312 (2002).
- Forcales, S. V., et al. Signal-dependent incorporation of MyoD-BAF60c into Brg1-based SWI/SNF chromatin-remodelling complex. The EMBO journal. 31 (2), 301-316 (2011).
- Nakatani, Y., Ogryzko, V. Immunoaffinity purification of mammalian protein complexes. Methods Enzymol. 370, 430-444 (2003).
- Ouararhni, K., et al. The histone variant mH2A1.1 interferes with transcription by down-regulating PARP-1 enzymatic activity. Genes Dev. 20 (23), 3324-3336 (2006).
- Fritsch, L., et al. A subset of the histone H3 lysine 9 methyltransferases Suv39h1, G9a, GLP, and SETDB1 participate in a multimeric complex. Mol Cell. 37 (1), 46-56 (2010).
- Robin, P., Fritsch, L., Philipot, O., Svinarchuk, F., Ait-Si-Ali, S. Post-translational modifications of histones H3 and H4 associated with the histone methyltransferases Suv39h1 and G9a. Genome Biol. 8 (12), R270 (2007).
- Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).
- Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res. 37 (1), 1-13 (2009).
- Ohta, S., et al. The protein composition of mitotic chromosomes determined using multiclassifier combinatorial proteomics. Cell. 142 (5), 810-821 (2010).
- Yahi, H., et al. Differential cooperation between heterochromatin protein HP1 isoforms and MyoD in myoblasts. J Biol Chem. 283 (35), 23692-23700 (2008).
- Philipot, O., et al. The core binding factor CBF negatively regulates skeletal muscle terminal differentiation. PloS one. 5 (2), (2010).
- Joliot, V., et al. The SWI/SNF subunit/tumor suppressor BAF47/INI1 is essential in cell cycle arrest upon skeletal muscle terminal differentiation. PloS one. 9 (10), e108858 (2014).
- Tanese, N. Small-scale density gradient sedimentation to separate and analyze multiprotein complexes. Methods. 12 (3), 224-234 (1997).
- Singh, K., et al. A KAP1 phosphorylation switch controls MyoD function during skeletal muscle differentiation. Genes Dev. 29 (5), 513-525 (2015).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Yahi, H., Philipot, O., Guasconi, V., Fritsch, L., Ait-Si-Ali, S. Chromatin modification and muscle differentiation. Expert Opin Ther Targets. 10 (6), 923-934 (2006).
- Sun, L., Liu, L., Yang, X. J., Wu, Z. Akt binds prohibitin 2 and relieves its repression of MyoD and muscle differentiation. J Cell Sci. 117. 117 (Pt 14), 3021-3029 (2004).
- Caretti, G., et al. The RNA helicases p68/p72 and the noncoding RNA SRA are coregulators of MyoD and skeletal muscle differentiation. Dev Cell. 11 (4), 547-560 (2006).
- Knoepfler, P. S., et al. A conserved motif N-terminal to the DNA-binding domains of myogenic bHLH transcription factors mediates cooperative DNA binding with pbx-Meis1/Prep1. Nucleic Acids Res. 27 (18), 3752-3761 (1999).
- Albini, S., Puri, P. L. SWI/SNF complexes, chromatin remodeling and skeletal myogenesis: it's time to exchange! Exp Cell Res. 316 (18), 3073-3080 (2010).
- Yahi, H., Fritsch, L., Philipot, O., Guasconi, V., Souidi, M., Robin, P., Polesskaya, A., Losson, R., Harel-Bellan, A., Ait-Si-Ali, S. Differential Cooperation between Heterochromatin Protein HP1 Isoforms and MyoD in Myoblasts. J Biol Chem. 283 (35), 23692-23700 (2008).
