Abstract
Scheletrico differenziazione terminale muscolare inizia con l'impegno di cellule precursori mesodermiche pluripotenti a mioblasti. Queste cellule hanno ancora la capacità di proliferare o possono differenziarsi e si fondono in miotubi multinucleati, che maturare ulteriormente per formare fibre muscolari. Scheletrico differenziazione terminale muscolare è orchestrata con l'azione coordinata di diversi fattori di trascrizione, in particolare i membri dei fattori regolatori muscolari o MRF (MyoD, Myogenin, Myf5, e MRF4), chiamato anche il miogena bHLH fattori di trascrizione della famiglia. Questi fattori cooperano con i complessi della cromatina-rimodellamento all'interno della rete regolamentare trascrizionale elaborato per raggiungere miogenesi scheletrico. In questo, MyoD è considerato il maestro miogenico fattore di trascrizione nello scatenare differenziamento terminale muscolare. Questa nozione è rafforzata dalla capacità di MyoD convertire cellule non muscolari in cellule muscolari scheletriche. Qui si descrive un metodo utilizzato per identificare MyoDpartner proteici in modo esaustivo, al fine di chiarire i diversi fattori coinvolti nella scheletrico differenziazione terminale muscolare. L'obiettivo a lungo termine è quello di comprendere i meccanismi epigenetici coinvolti nella regolazione dei geni muscolo scheletrico, vale a dire., Obiettivi MyoD. partner MyoD sono identificati utilizzando Tandem Affinity Purification (TAP-Tag) da un sistema eterologo accoppiato alla caratterizzazione spettrometria di massa (MS), seguito dalla validazione del ruolo delle parti interessate durante scheletrico differenziamento terminale muscolare. forme aberranti di fattori miogenici, o la loro regolamentazione aberranti, sono associati con una serie di disturbi muscolari: miastenia congenita, distrofia miotonica, rabdomiosarcoma e difetti nella rigenerazione muscolare. Come tale, i fattori miogenici forniscono un pool di potenziali bersagli terapeutici nei disturbi muscolari, sia per quanto riguarda i meccanismi che causano la malattia stessa e meccanismi rigenerativi che possono migliorare il trattamento della malattia. Così, il understan dettagliatading delle interazioni intermolecolari ei programmi genetici controllate dai fattori miogenici è essenziale per la progettazione razionale di terapie efficaci.
Introduction
organismi pluricellulari eucarioti sono composti da diversi organi e tessuti. Ogni tessuto funzionale ha un pattern di espressione genica specifica, che è determinato ad ogni passo differenziazione. differenziazione cellulare coinvolge l'attivazione di geni specifici, manutenzione della loro espressione e, in generale, il silenziamento di una serie di geni come quelli coinvolti nella proliferazione cellulare. Scheletrico differenziamento muscolare, o miogenesi, è quindi un processo a più fasi, che inizia con la determinazione delle cellule staminali mesodermiche in mioblasti, e poi porta alla differenziazione terminale di questi mioblasti in primo mono-nucleate, e quindi multi-nucleate, miotubi . Così, i mioblasti vengono "determinate" Le cellule, che sono ancora in grado di proliferare, ma si sono impegnati a lignaggio muscolo scheletrico, e quindi in grado di differenziarsi solo in cellule del muscolo scheletrico sia durante lo sviluppo embrionale o nella rigenerazione del muscolo adulto. Il processo di terminale muscolo scheletrico differireziazione è orchestrato da uno specifico programma genetico che inizia con l'uscita permanente dal ciclo cellulare delle cellule precursori mioblasti che conduce ad un silenziamento definitiva di proliferazione associati geni, come E2F geni target 1. Infatti, durante il processo di differenziazione terminale, arresto mioblasti proliferazione è un passo cruciale che precede l'espressione di geni specifici muscolo scheletrico e la fusione dei mioblasti in miotubi 2. Tale programma permette cellule staminali muscolari adulte, dette anche cellule satelliti, per differenziare durante il processo di rigenerazione dopo un trauma del muscolo scheletrico.
Miogenesi mammiferi è criticamente dipendente da una famiglia di miogenico elica-ansa-elica (bHLH) fattori di trascrizione MyoD, Myf5, MRF4 e Myogenin, spesso indicato come la famiglia di fattori scheletrico determinazione muscolare o MRF (muscolo fattori normativi) 3. Ciascuno di essi ha un ruolo essenziale nella specifica e differenziazione delle cellule del muscolo scheletrico e ha uno specifico modello di espressione 4 5-7. L'attivazione di Myf5 e MyoD costituisce il passo determinante che impegna le cellule al lignaggio miogenico, e la successiva espressione di Myogenin innesca miogenesi con l'attivazione di geni specifici del muscolo scheletrico, come MCK (muscolo creatina chinasi). Myogenic fattori di trascrizione bHLH collaborano con i membri della famiglia MEF2 nel attivazione di geni muscolari da loci precedentemente silenziosa 8. Essi hanno inoltre stimolare scheletrico trascrizione genica muscolare eterodimeri con le proteine onnipresente bHLH, E12 e E47, note come proteine E, che legano i cosiddetti E-box in varie regioni del gene-normativo 8. Twist, Id (inibitore di differenziazione) e di altri fattori regolano negativamente questo processo, competendo con MyoD per le proteine di legame E 8.
MyoD è considerato come il giocatore importante nello scatenare muscolare terminale differenziazione 9 10-13. In effetti, l'espressione forzata di MyoD induce la trans-differenziazione dei diversi tipi cellulari, anche quelli derivati da un'altra origine embryologic 12. Ad esempio, MyoD in grado di convertire gli epatociti, fibroblasti, melanociti, neuroblasti, e adipociti in cellule muscolari-like. L'azione trans-differenziativo di MyoD comporta un'attivazione anomala del programma genetico miogenico (in particolare i suoi geni bersaglio) in un ambiente non-muscolare, concomitante al silenziamento del programma genetico originale (in particolare, i geni della proliferazione).
In proliferanti mioblasti, MyoD è espressa, ma non è in grado di attivare i suoi geni bersaglio anche quando si lega ai loro promotori 14-16. Pertanto, il requisito di MyoD siano continuamente espressi in mioblasti indifferenziati rimane abbastanza elusive. MyoD potrebbe reprimere i suoi geni bersaglio dovuto all'assunzione di enzimi cromatina modificanti repressive in proliferanti mioblasti prima del carico di attivare il rimodellamento della cromatina enzimi 14,17. Per esempio, in proliferanti mioblasti, MyoD è associata a trascrizionale co-repressori KAP-1, istone deacetilasi (HDAC) e metiltransferasi lisina repressive (km in linea), tra cui l'istone H3 lisina 9 o H3K9 e H3K27 km in linea, e sopprimere attivamente la sua espressione di geni bersaglio attraverso la definizione di un locale repressiva struttura della cromatina 14,17. È importante sottolineare che un recente rapporto ha indicato che MyoD è essa stessa direttamente metilato dalle H3K9 il KMT G9a con conseguente inibizione della sua attività transattivante 16.
I meccanismi epigenetici coinvolti in questa trans-differenziazione delle cellule non muscolari di MyoD sono largamente sconosciuti. In particolare, alcune linee cellulari sono resistenti a MyoD indotta trans-differenziazione. Così, in cellule HeLa, MyoD è inattivo oaddirittura potrebbe funzionare come repressore piuttosto che attivatore della trascrizione a causa della mancanza di espressione della subunità BAF60C del rimodellamento della cromatina complesso SWI / SNF 18. Questo modello può quindi essere di scelta per caratterizzare meglio i meccanismi di MyoD indotta repressione gene. E 'adatto anche per saggiare la capacità di MyoD di indurre ambiente cromatina repressiva alla sua loci bersaglio con i suoi partner associati e quindi scoprire i meccanismi repressivi MyoD-dipendente della proliferazione mioblasti per mettere a punto la differenziazione terminale.
Qui si descrive il protocollo per l'identificazione dei partner MyoD utilizzando Tandem Affinity Purification (TAP-Tag) accoppiata alla spettrometria di massa caratterizzazione (MS). L'uso di cellule HeLa-S3 esprimono stabilmente Flag-HA-MyoD consentito di ottenere abbastanza materiale per purificare i complessi MyoD da estratti nucleari frazionati. L'identificazione di partner MyoD nel sistema eterologo è seguito validation in un sistema di riferimento.
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Protocol
1. Preparazione delle frazioni HeLa-S3 nucleare Salt-estraibili e cromatina-bound
- Raccolta delle cellule
- Grow HeLa-S3 Flag-HA-MyoD e HeLa-S3 Flag-HA (linea cellulare di controllo) in Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supplementato con 10% di siero fetale bovino, 100 U / ml di penicillina e 100 mg / ml di streptomicina (crescita medium) a 37 ° C e 5% CO 2 in un incubatore umido.
Nota: le cellule HeLa-S3 esprimono stabilmente cellule trasdotte con il vettore vuoto (HeLa-S3 Flag-HA) Flag-HA-MyoD e HeLa-S3 potrebbe essere o stabiliti utilizzando il protocollo descritto in: 19,20, o forniti dagli autori. - Amplifica le cellule fino a 10 completamente confluenti piatti 150 mm di ciascuna linea cellulare (cellule HeLa-S3 Flag-HA-MyoD e HeLa-S3 Flag-HA).
- Raccogliere il surnatante (contenere sottopopolazione non aderente) in 5 L filatrice.
- Lavare la sottopopolazione aderenti con 10 ml di PBS per piatto 150 mm, trypsinize cellule per 1 min a temtemperatura (0,05% soluzione di tripsina-EDTA, 2 ml per un piatto 15 cm).
- Aggiungere 4 ml del mezzo a piatto 150 mm e raccogliere le cellule in 50 ml provette.
- Unire il surnatante dal punto 1.1.3 (in 5 L filatore) e le cellule dal punto 1.1.5, aggiungere 500 ml di terreno di crescita pre-riscaldato fresco per ciascuna linea cellulare.
- Trasferire sospensione cellulare in 5 L filatore e crescere cellule per almeno 60 ore a 37 ° C e 5% CO 2 in un incubatore umido.
- Aggiungere 500 ml di terreno di coltura fresco e far crescere le cellule per 24 ore.
- Aggiungere 1 litro di terreno di coltura fresco e far crescere le cellule per 24 ore.
- Estrarre 1 ml di sospensione cellulare per contare le cellule e controllare la vitalità cellulare. Colore 30 ml di sospensione cellulare con 30 ml di 0,4% trypan blu e contare cellule vive (non blu) al microscopio utilizzando emocitometro.
- Tenere la densità cellulare a 2 - 6 x 10 5 cellule / ml con l'aggiunta di terreno di coltura fresco tutti i giorni; non superiore ad 1 x 10 6 cellule / ml. Il massimodel volume per un 5 L filatore è 2,5 L.
Nota: Per le seguenti operazioni, procedere per lotti di 2 - 2,5 L di coltura ad una densità 1 x 10 6 cellule / ml. Ripetere i punti 1.1.12 - 1.1.14 a raccogliere circa 20 L (≈ 20 g di pellet secco) di ciascuna linea cellulare prima di procedere al passo successivo. - Cellule pellet per centrifugazione a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C e scartare il surnatante.
- Risospendere le cellule in 100 ml di PBS ghiacciato pipettando e centrifugare a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C per lavare il pellet.
- Ripetere il lavaggio risospendendo le cellule con 25 ml di PBS ghiacciato, trasferendo la sospensione in 50 ml di tubo e centrifugazione a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C.
Nota: I pellet cellulari possono essere utilizzati sia immediatamente o congelati in azoto liquido e conservati a -80 ° C per diversi giorni.
- Grow HeLa-S3 Flag-HA-MyoD e HeLa-S3 Flag-HA (linea cellulare di controllo) in Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supplementato con 10% di siero fetale bovino, 100 U / ml di penicillina e 100 mg / ml di streptomicina (crescita medium) a 37 ° C e 5% CO 2 in un incubatore umido.
- Isolamento del Nuclei
Nota: Eseguire i punti 1.2.1 - 1.4.3 nella stanza fredda.- Pre-freddo BuffeRS e omogeneizzatori.
- Se si utilizza materiale congelato, scongelare rapidamente il pellet di cellule in bagno d'acqua a 37 ° C.
- Risospendere 20 g (≈ 20 ml) di cellule in 20 ml (un volume uguale alla dimensione del pellet) di tampone ipotonico A (Tabella 3) utilizzando 10 ml di tampone a prima, poi aggiungendo 5 ml, quindi aggiungendo altri 5 ml. Lavare le pipette bene con tampone fresco per ottenere il massimo delle cellule.
- Trasferimento sospensione cellulare 40 ml in omogeneizzatore pre-raffreddata con un pestello aderente.
- Omogeneizzare le cellule con 20 colpi in un omogeneizzatore (20 dentro e fuori dei movimenti) e trasferire sospensione cellulare in tubo da 50 ml.
- Lavare l'omogeneizzatore con 7 ml di tampone saccarosio (1/3 del volume cellulare iniziale, Tabella 3) per recuperare il massimo di celle. Trasferire la sospensione rapidamente nel tubo 50 ml dal punto 1.2.5 per preservare i nuclei e limitare la perdita.
- Macchia un'aliquota di 30 ml con 30 ml di 0,4% trypan blue, analizzare al microscopio per controllare l'efficienza di lisi (se la lisi ha successo, tutti i nuclei dovrebbero essere blu). Se necessario, ripetere il passaggio omogeneizzazione.
- Centrifugare per 7 min a 10.000 xg e 4 ° C per far sedimentare i nuclei. Salvare il surnatante come frazione citoplasmatica.
- Preparazione del nucleare Salt-estraibile (SE) Frazione
- Risospendere il pellet nuclei in 8 ml di tampone saccarosio (un volume uguale alla dimensione del pellet nuclei). Aggiungere goccia a goccia sotto agitazione completamente ad un vortice 8 ml di tampone di sale (volume pellet 1 nuclei, Tabella 3) per ottenere una concentrazione finale di 300 mM NaCl. Incubare per 30 min in ghiaccio e mescolare ogni 5 min.
- Diminuire concentrazione di NaCl a 150 mm con l'aggiunta di 8 ml (1/3 del volume totale) di tampone di saccarosio. Centrifugare per 10 min a 13.000 xg e 4 ° C. Raccogliere il surnatante (frazione nucleare sale estraibile, SE).
Nota: o procedere al punto 1.3.3 o lasciare il SEfrazione sul ghiaccio durante la preparazione della frazione cromatina-bound e quindi ultra-centrifuga entrambe le frazioni contemporaneamente. - Ultra-centrifuga SE per 30 minuti a 85.000 xga 4 ° C. Prendere surnatante (≈ 26 ml).
- Congelare 100 un'aliquota ul in azoto liquido. Procedere al punto 2 "proteina complessa purificazione", utilizzando il resto dell'estratto.
Nota: L'aliquota deve essere usato come un controllo di input durante la fase 5.1.1.
- Preparazione della frazione cromatina-bound
- Risospendere il pellet (dal punto 1.3.5.) Meticolosamente in 7 ml (un volume uguale alla dimensione del pellet) di tampone saccarosio.
- Aggiungere CaCl 2 ad una concentrazione finale di 1 mM (28 ml di 0,5 M CaCl 2 per 14 ml di sospensione) per attivare MNase (passo 1.4.4) e miscelare.
- sospensione preriscaldamento per 1 min a 37 ° C.
- Aggiungere 70 ml nucleasi micrococcica (MNase) per ottenere la concentrazione finale di 0,0025 U / ml (1/200 di diluizione da 0,5U / ml magazzino) e mescolare.
- Incubare esattamente 12 minuti a 37 ° C. Mescolare ogni 4 min.
- Immediatamente posto la reazione in ghiaccio.
- Per interrompere l'attività MNase, aggiungere 112 ml di 0,5 M EDTA pH 8,0 (1/125 diluizione) ad una concentrazione finale di 4 mM. Incubare per 5 minuti in ghiaccio.
- Sonicare 5 volte per 1 minuto con ampiezza alta, tra due sonications consentire una pausa di 1 minuto (10 min in totale).
- Ultracentrifuga per 30 min a 85.000 xg e 4 ° C.
- Raccogliere il surnatante (nucleosoma arricchito frazione, NE, ≈ 12 ml).
- Congelare 50 un'aliquota microlitri in azoto liquido. Procedere al punto 2 "proteina complessa purificazione", utilizzando il resto dell'estratto.
Nota: L'aliquota deve essere usato come un controllo di input durante la fase 5.1.1.
2. Complessi proteina Purificazione
Nota: Procedere in estratti parallele da ciascuna linea cellulare (HeLa-S3 Flag-HA-MyoD e il controllo, Helun-S3 Flag-HA).
- Purificazione base della bandierina
- Prelavaggio resina Flag. Utilizzare 600 ml di resina Flag (dal commerciale 50% stock) per ogni punto sperimentale (SE e NE frazioni per ogni linea cellulare).
- Resin Transfer in 15 ml di tubo, risospendere in 13 ml di Tegn fredda (tabella 3), centrifugare per 2 min a 1000 xg e rimuovere il surnatante. Ripetere 5 volte. Dopo l'ultimo lavaggio resina risospendere Flag in uguale volume di Tegn (300 microlitri per ogni punto sperimentale).
- Per ogni punto sperimentale, miscelare 600 ml di resina Flag lavata ed i corrispondenti estratti proteici (in una provetta da 15 ml per la NE 12 ml e in un tubo da 50 ml per le frazioni 26 ml SE, rispettivamente). Incubare su una ruota girevole overnight a 4 ° C.
- Centrifugare per 2 min a 1000 xga 4 ° C, messo da parte il surnatante e mantenere a 4 ° C finché il risultato del test di efficienza di purificazione (2.2).
- Per i campioni SE, risospendere la resina Flagin 4 ml di Tegn e trasferire in una provetta da 15 ml. Ripetere questo passaggio 3 volte, ogni volta per trasferire lo stesso tubo 15 ml per evitare di perdere perline. Centrifugare 2 min a 1000 xg e 4 ° C e rimuovere il surnatante.
- resina lavata Flag 7 volte in una provetta da 15 ml con 13 ml di Tegn e centrifugazione 2 min a 1000 xg e 4 ° C.
- Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere in 1 ml Tegn e il trasferimento in un tubo di 1,5 ml a basso vincolante. Centrifugare 2 min a 1000 xg e 4 ° C e rimuovere il surnatante.
- Risospendere in 200 ml di soluzione di peptide Flag a 4 mg / ml a pH 7,8 per ogni punto sperimentale. Mescolare le perline e peptidi. Aggiungere 200 ml di tampone Tegn e incubare a 4 ° C per almeno 4 ore o durante la notte per eluire le proteine legate.
- Centrifugare per 2 min a 1000 xga 4 ° C e trasferire la resina e surnatante (eluato Flag) per una colonna di spin vuoto posto in una provetta 2 ml.
- Centrifugare la colonna, raccogli sinistra-over surnatante nel tubo 2 ml. Raccogliere la resina Flag aggiungendo tampone Tegn alla colonna e procedere alla seconda eluizione bandiera con 200 ml di soluzione Flag peptide (4 mg / ml) per una notte a 4 ° C per ogni punto sperimentale.
- Ripetere i punti 2.1.9 - 2.1.10 per raccogliere seconda eluizione. Combinare primo e secondo eluati.
- Prova della Purificazione efficienza
Nota: Durante la fase 2.1.11 - 2.1.12, eseguire SDS-PAGE e colorazione argento (2.2.1 - 2.2.2).- Prendere 15 ml di eluati, aggiungere 5 ml di tampone 4x carico e 2 ml di 10x agente riducente, far bollire per 5 minuti a 96 ° C ed eseguire un SDS-poliacrilammide 4 - gel al 12% in base alle istruzioni del produttore.
- Colorare il gel con kit di colorazione argento (seguire le istruzioni del produttore). Se c'è chiare differenze nei modelli di proteine tra Flag-HA-MyoD e Flag-HA eluiti finto, in particolare la fascia di Flag-HA MyoD (circa 50 kDa, Figura 1A), procedere alla successiva step.
- Emoagglutinina (HA) Purificazione basata su
- resina lavata HA trasferendo in 15 ml di tubo, risospendere in 13 ml di Tegn e centrifugazione 2 min a 1000 xga 4 ° C. fase di lavaggio ripetere 5 volte. Dopo l'ultimo lavaggio perline risospendere in uguale volume di tampone Tegn.
Nota: Il volume deve essere regolato secondo l'efficienza della depurazione Flag-based. Inizia con 300 ml dalla commerciale 50% stock per ogni punto sperimentale. - Trasferire la resina HA per ogni punto sperimentale in un tubo da 1,5 ml a basso vincolante. Centrifugare 2 min a 1000 xga 4 ° C, eliminare la massima del tampone di lavaggio (Tabella 3) e aggiungere gli eluati da depurazione Flag-based alla resina HA.
- Incubare le provette sulla rotazione overnight ruota a 4 ° C.
- Centrifugare per 2 min a 1000 xga 4 ° C, messo da parte il surnatante e mantenere a 4 ° C finché il risultato del test di efficienza di purificazione (2.3.12.).
- Risospendere la resina HA in 0,5 ml di Tegn, il trasferimento a un nuovo minimo vincolante 1,5 ml tubo. Ripetere risospensione volta aggiungendo alla stessa provetta da 1,5 ml per evitare di perdere perline e centrifugare 2 min a 1000 xg e 4 ° C. Rimuovere il surnatante.
- Lavare perline 8 volte utilizzando 1 ml di Tegn ogni volta, centrifugazione 2 min a 1000 xg e 4 ° C e rimozione surnatante (evitare perline perdere). Dopo l'ultimo lavaggio, trasferire le perline in 0,5 ml tubi.
- Rimuovere il più possibile surnatante. Aggiungere 100 ml di HA soluzione libera peptide (4 mg / ml) a pH 7,8 perline per eluire le proteine legate. Incubare sulla ruota girevole per tutta la notte a 4 ° C.
Nota: La quantità di HA-peptide deve essere regolata a seconda l'abbondanza dei complessi. - Centrifugare per 2 min a 1000 xga 4 ° C e trasferire la resina e surnatante (HA eluato) ad una colonna di spin vuoto posto in una provetta 2 ml.
- Centrifugare la colonna per raccogliere sinistra-over surnatante nel tubo 2 ml. Eseguire una seconda eluizione con 100 ml di HA peptide (4 mg / ml) per ciascun punto sperimentale. Incubare sulla ruota girevole per tutta la notte a 4 ° C. Ripetere il punto 2.3.8 - 2.3.9 per raccogliere seconda eluizione.
- Combinare primo e secondo eluati.
- Test di efficienza di purificazione mediante SDS-PAGE e colorazione argento (vedere i passaggi 2.2.) (Figura 1A).
- Concentrare l'eluato HA di 30 ml utilizzando unità filtro centrifugo con 10 kDa cut-off (limite di peso molecolare nominale, NMWL) secondo le istruzioni del produttore.
- Dividere i campioni sono concentrati in due parti: 22.5 (3/4) e 7.5 (1/4) ul. Snap congelare 1/4 dei campioni in azoto liquido e conservare a -80 ° C. Utilizzare la parte 3/4 per il passaggio 3.
Nota: La parte congelata 1/4 deve essere utilizzato per la conferma dei risultati di spettrometria di massa mediante Western blot (vedi passo 5.1).
- resina lavata HA trasferendo in 15 ml di tubo, risospendere in 13 ml di Tegn e centrifugazione 2 min a 1000 xga 4 ° C. fase di lavaggio ripetere 5 volte. Dopo l'ultimo lavaggio perline risospendere in uguale volume di tampone Tegn.
Analisi 3. Spettrometria di Massa
Nota: Le seguenti operazioni dovrebbero essere discussi con l'impianto spettrometria di massa che eseguirà l'analisi.
- Supplemento 3/4 (22,5 ml) dei campioni con 7,5 ml di tampone di 4x carico e 3,3 ml di 10x agente riducente e far bollire per 5 min a 96 ° C.
- Caricare i campioni su una SDS-poliacrilammide 4 - gel 12%. Eseguire gel a 150 V costante per 5 minuti per consentire tutte le proteine di entrare nel gel senza separazione.
- Lavare il gel con acqua; fissare per 20 - 30 min con soluzione fissativa (acido acetico al 10%, 50% metanolo, 40% di acqua ultra-pulita) poi lavare il gel fisso 5 volte in acqua ultra-pulita.
- Tagliare le bande contenenti le proteine, conservare in 1 ml di acqua in un tubo da 1,5 ml e invia a spettrometria di massa.
Analisi 4. I dati
Nota: Si tratta di un orientamento generale per l'analisi. I passaggi esatti dipenderanno dalla particolare modalità dei dati forniti da impianto MSutilizzato per eseguire l'analisi (ad esempio, 21,22).
- Confrontare l'elenco delle proteine identificate in eluati "MyoD" con l'elenco ottenuto dal corrispondente preparazione controllo negativo. Escludere dalle analisi delle proteine che si trovano in entrambe le liste.
- Rimuovere proteine che hanno ≤2 numero totale dei peptidi identificati dalla lista rimanente.
- L'accesso annotazione funzionale e la classificazione funzionale della lista ottenuto delle proteine utilizzando le risorse DAVID Bioinformatica (http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp) e classificare la lista delle proteine 23,24.
- (Opzionale) Rimuovere dalla lista "autostoppisti", cariche proteine non-nucleari con un forte accidentale vincolanti per carica negativa del DNA 25. Questi contengono proteine del citoscheletro, citoplasmatici, mitocondriale, membrana e recettori (folding delle proteine, citoscheletro e varie proteine di gruppo nelle tabelle 1 e 2). </ Li>
- Confrontare le liste ottenute delle interattori MyoD da SE e NE frazioni per identificare le proteine e proteine comuni specifici per ogni frazione (Figura 2).
5. Conferma di Interactiani identificato tramite Western Blot
- Conferma in HeLa-S3 Flag-HA-MyoD e HeLa-S3 Flag-HA
- campioni di eluato Scongelare ottenuto al passaggio 2.3.14 (7,5 ml) su ghiaccio. Aggiungere 12 ml di tampone Tegn, 10 ml di tampone 4x carico e 3 ml di 10x agente riducente. campioni Far bollire per 5 min a 96 ° C.
- Preparare campioni di ingresso per il Western blotting.
- Scongelare aliquote dai gradini 1.3.9 e 1.4.11 e misurare la concentrazione di proteine, per esempio utilizzando il kit BCA (seguire le istruzioni del produttore).
- Utilizzare 15 mg di proteina per corsia. Misurare la quantità appropriata di estratto e regolare il volume del campione fino a 15 microlitri con tampone Tegn.
- Aggiungere 5 microlitri di buffer di carico e 4x1.5 ml 10x agente riducente. campioni Far bollire per 5 min a 96 ° C.
- Eseguire un'analisi western blot con anticorpi specifici di interesse (per il candidato socio identificati durante l'analisi MS) con 15 ml di campioni di eluato. Utilizzare estratti ingresso come controllo dei livelli di proteine endogene (Figura 3A).
- La conferma nel sistema cellulare Rilevante
- Preparazione dell'estratto nucleare totale di C2C12 mioblasti di topo.
- Grow C2C12 mioblasti di topo in terreno DMEM supplementato con 15% di siero fetale di vitello, 100 U / ml di penicillina e 100 ug / ml di streptomicina a 37 ° C e 5% CO 2 in un incubatore umido. Non superare mai confluenza cella 80% per mantenere le cellule in stato proliferativa.
- Grow almeno due piatti 150 mm di C2C12 per un punto (un anticorpo) di immunoprecipitazione (IP). Aspirare il mezzo, lavare le cellule due volte con 10 ml di PBS.
- Raschiare le cellule e raccogliere in 15 ml di tubo. Centrifuge a 250 xg per 5 minuti a 4 ° C. surnatante degli scarti.
- Stima il volume del pellet cellulare (= cellule V). Risospendere delicatamente il pellet in 3 volumi V cella di ipotonica tampone B per interrompere membrana citoplasmatica (Tabella 3).
- Aggiungere 0,44 x volume cellulare V del 10% NP-40 per raggiungere la concentrazione finale di 1% (v / v). Capovolgere delicatamente la provetta diverse volte per mescolare.
- Aggiungere 0,89 x volume cellulare V SR (tabella 3) per preservare l'integrità nuclei. Capovolgere delicatamente la provetta diverse volte per omogeneizzare la sospensione e centrifugare per 5 min a 2000 xg per pellet nuclei.
- Rimuovere il surnatante (frazione citosolica). Stimare il volume di nuclei pellet (= V NUC). Risospendere pellet nuclei in un volume V NUC di tampone saccarosio.
- Aggiungere goccia a goccia sotto agitazione a fondo su un vortice un volume V nuc di tampone di sale per ottenere una concentrazione finale di 300 mMNaCl, e incubare per 30 min in ghiaccio. Mescolare ogni 5 minuti.
- Aggiungere un volume V nuc di tampone saccarosio (per ridurre la concentrazione di NaCl di 150 mM) e CaCl 2 (concentrazione finale 1 mM). Mescolare.
- sospensione pre-calore per 1 min a 37 ° C, aggiungere nucleasi micrococcica per ottenere finale della concentrazione di 0,0025 U / ml (1/200 a magazzino di 0,5 U / ml). Mescolare.
- Incubare esattamente 12 minuti a 37 ° C. Mescolare ogni 3 min.
- Porre immediatamente la reazione sul ghiaccio e aggiungere EDTA (concentrazione finale 4 mm) per fermare le attività MNase. Incubare per 5 minuti in ghiaccio.
- Sonicare 5 volte per 0,5 minuti ciascuno con ampiezza alta. Tra due sonications, consentire una pausa di 0,5 min (5 min in totale).
- Ultra-centrifuga per 30 minuti a 85.000 xg e 4 ° C. Raccogliere il surnatante (estratto nucleare totale).
- Misurare la concentrazione di proteine dell'estratto nucleare totale, ad esempio utilizzando il kit BCA (seguire le istruzioni del produttore) e procedere immediately al punto 5.2.2.
- Immunoprecipitazione (IP) di MyoD endogena.
- Per pre-chiaro gli estratti, lavare 10 ml di proteine G agarosio per ogni punto IP.
- Trasferire il volume necessario di proteine G agarosio in una provetta da 1,5 ml, risospendere in 1,4 ml di Tegn freddo, centrifugare per 2 min a 1.800 xg e rimuovere il surnatante. Ripetere 3 volte.
- Mescolare pre-lavati perline proteina G agarosio con il volume appropriato di estratto nucleare totale. Utilizzare 500 mg di proteine totali estratto nucleare per punto IP.
- Incubare su una ruota girevole a 4 ° C per 2 ore a pre-cancellare gli estratti.
- Centrifugare per 5 min a 1800 xga 4 ° C. Mantenere il surnatante.
- Mescolare 5 mg di MyoD Ab o 5 mg di IgG di coniglio con 500 mcg estratti nucleari totali pre-liquidati in 1,5 ml bassi tubi vincolanti. Aggiungi Tegn tampone fino a 1 ml. Incubare su una ruota girevole a 4 ° C durante la notte.
Nota: Eseguire la fopo passi durante la fase 5.2.2.3. - Prelavaggio 7,5 microlitri proteina A / G soluzione madre perline per punto IP.
- Trasferire il volume necessario di perline in una provetta da 1,5 ml, perline risospendere in 1 ml di Tegn e centrifugare a 1800 xga 4 ° C per 2 min. Rimuovere il surnatante. Ripetere 3 volte.
- Risospendere proteina A / G perline in 1,5 ml soluzione bloccante (Tabella 3) e incubare su una ruota girevole notte a 4 ° C.
- estratti centrifuga totale nucleari incubate con Abs (punto 5.2.2.5) a 16.000 xg per 10 minuti a 4 ° C. Mantenere il surnatante.
- Centrifuga bloccato proteina A / G resina (passo 5.2.2.7) a 1.800 xg per 2 minuti a 4 ° C. Gettare il surnatante e risospendere in 1 ml di tampone Tegn. Re-centrifugare a 1800 xg per 2 minuti a 4 ° C per lavare tampone di bloccaggio.
- Risospendere bloccato proteina A / G resina in 1 ml di tampone Tegn e aliquota in nuovi tubi a basso contenuto proteico vincolante per ottenere 7,5 microlitri blocked proteina A resina / G per punto IP. Centrifugare a 1.800 xg a 4 ° C per 2 min ed eliminare quanto più possibile del supernatante.
- Aggiungere gli estratti nucleari totali incubate con l'Abs (o controllare IgG) alla Una resina / G. Mescolare e incubare per 2 ore a temperatura ambiente (RT) su una ruota girevole.
- sospensione Centrifugare 1.800 xg a temperatura ambiente per 2 min. Gettare il surnatante, risospendere in 1 ml di tampone di lavaggio e la sospensione di trasferimento in nuovi tubi bassi vincolanti. Incubare a temperatura ambiente su una ruota girevole per 5 min.
- sospensione Centrifugare a 1.800 xg a temperatura ambiente per 2 min, risospendere in 1 ml di tampone di lavaggio e incubare a RT su una ruota girevole per 5 min. Ripeti 4 volte. Per l'ultimo trasferimento di lavaggio in una nuova provetta basso vincolante.
- Rimuovere massima del surnatante. Aggiungere 7 ml di tampone di lavaggio, 7 ml di tampone 4x carico e 3 ml di 10x agente riducente ai talloni, mescolare e far bollire per 5 minuti a 96 ° C.
- Eseguire un'analisi Western Blot con anticorpi di interest (specifica per il candidato partner per il sistema immunitario precipitato proteine). Utilizzare 1% (5 mg) di estratti di ingresso come controllo dei livelli di proteine endogene (Figura 3B).
- Per pre-chiaro gli estratti, lavare 10 ml di proteine G agarosio per ogni punto IP.
- Preparazione dell'estratto nucleare totale di C2C12 mioblasti di topo.
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Representative Results
Per comprendere la regolazione dell'attività MyoD, abbiamo intrapreso la caratterizzazione esaustivo dei complessi MyoD utilizzando purificazione biochimica, basato sulla immunopurificazione di una forma doppia targhetta di MyoD seguita da spettrometria di massa (MS). L'uso della linea di cellule HeLa-S3 esprime MyoD Flag-HA-tag e una linea cellulare di controllo che esprime permessi Flag-HA per ottenere abbastanza materiale per purificare il complesso MyoD eseguendo doppio affinità purificazione di Flag-HA-MyoD.
Abbiamo frazionato gli estratti di cellule in frazioni citoplasmatiche e nucleari, poi ulteriormente frazionato la frazione nucleare al sale estratti (sale-estraibili nucleari, SE) e arricchito per nucleosomi (NE, nucleosoma arricchito) le frazioni. TAP-Tag purificazione da queste frazioni nucleari separate (Figura 1, tabelle 1 e 2) è permesso svelare i partner che hanno relativamente basso abundance quando localizzato in uno specifico comparto subnucleare. Inoltre, tale strategia è stata sfruttata per scoprire partner non legato (SE) contro (NE) MyoD DNA-bound per ottenere approfondimenti sulla regolazione dell'attività MyoD.
Per la depurazione TAP-Tag, il sistema tandem epitopo Flag-HA è stato utilizzato. La piccola bandiera idrofila e epitopi HA hanno la minima interferenza con la funzione delle proteine e sono altamente accessibili per l'interazione antigene-anticorpo. Anti-Flag e anti-HA a base di resine immunopurificazione sequenziale è stata effettuata, seguita da eluizione dei complessi immunopurified con bandiera e HA peptidi. Le proteine eluite sono state poi eseguite su una SDS-PAGE per consentire tutte le proteine di entrare nel gel. I pezzi di gel contenenti tutte le proteine purificate sono stati tagliati; le proteine sono state estratte, tripsina digerito e identificati mediante spettrometria di massa (MS).
Come mostrato in figura 2, (Figura 2 e 3) 26-28. Questo mette in luce i partner MyoD DNA-bound e possibili co-regolatori che possono stabilire un ambiente repressivo-cromatina. Ad esempio, le proteine HP1, che sono stati identificati come partner MyoD di metodologia descritta, sono noti per legarsi H3K9 metilato per mantenere la repressione del gene e la struttura heterochromatin. Infatti, HP1 inibisce l'attività trascrizionale MyoD con conseguente compromissione della espressione del gene bersaglio MyoD e terminale muscolare differenziazione 26.
Ulteriore frazionamento dii complessi MyoD SE e NE su gradiente di glicerolo (come descritto in 29) scoperto sottosistemi complessi MyoD nei due compartimenti subnucleari (Figura 1B). In particolare, SE MyoD è distribuito in tre sub-complessi, mentre il MyoD cromatina-bound appartiene principalmente ad un unico complesso.
Alcuni dei TAP-tag / MS ha rivelato interattori sono stati confermati da Western Blot su complessi MyoD. Questi includono il fattore di trascrizione CBF, EBB, MTG8R e la subunità BAF47 SWI / SNF (SNF5) (Figura 3A, a sinistra) e le proteine HP1 (CBX1 e CBX3) (Figura 3a, a destra). È importante sottolineare che, poiché le cellule HeLa non sono cellule muscolari e non esprimono MyoD, è necessario confermare le interazioni tra interattori recentemente identificati e MyoD nei mioblasti (Figura 3 BD). In particolare, per tale convalida, gli estratti nucleari totali (senza separazione di SE e NE) sono in genere sufficienti, which consente la riduzione della quantità di mioblasti utilizzati per la preparazione del campione. I test in vitro di interazione come in 26,27, aiutano a validato ulteriormente questi risultati. Infine, i significati funzionali di queste interazioni in cellule muscolari dovrebbero essere ulteriormente trattate come in 26-28.
Nel loro insieme, hanno presentato i dati mostrano una visione globale di partner MyoD ubiquitariamente espressi e aprire la strada ad ulteriori studi funzionali in un modello muscolo più rilevante.
Figura 1: MyoD Complessi isolati da Tandem Affinity Purification (A) Una colorazione argento del doppio complessi eMyoD purificati per affinità isolati dal sale-estraibile nucleare (SE) o nucleosomi arricchito (NE) frazioni nucleari di linee di cellule HeLa-S3 stabile. esprimendo Flag-HA-MyoD (complesso MyoD) und linea cellulare di controllo (Mock). MW, marcatore di peso molecolare chilo Dalton (kDa). La freccia indica Flag-HA-MyoD (eMyoD). Questa ricerca è stato originariamente pubblicato in 37. Copyright L'American Society for Biochimica e Biologia Molecolare. Questa cifra è stata modificata da 26: le corsie con purificazioni finte e eMyoD complesso isolato da frazioni nucleari SE sono ora mostrati. (B) doppia purificati per affinità complessi eMyoD come in (A) sono stati frazionati sul gradiente di glicerolo che vanno dal 20% al 41%. Le frazioni sono state raccolte manualmente, concentrati e analizzati mediante Western blot (WB) con anticorpi anti-Flag. Si noti la presenza di diversi eMyoD contenenti sotto-complessi in (SE) frazione nucleare sale-estraibili. Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2:. Confronto di cromatina-bound (nucleosomi arricchito, NE) rispetto solubile nucleare (sale nucleare estraibile, SE) MyoD Partners Top: diagramma di Venn che mostra sovrapposizione tra interattori eMyoD isolati dal sale-estraibile nucleare (SE) e nucleosoma arricchito ( NE) frazione. Le proteine ribosomali, fattori di traduzione-iniziazione, fattori di riparazione del DNA e delle isoforme di tubulina sono stati esclusi dall'analisi in quanto sono presenti in vari insiemi di dati diversi ottenuti da TAP e considerati come non specifico basso:. Gli interattori MyoD si trovano in entrambi SE e frazioni NE (comuni) o specifici per una delle frazioni (uniche) sono stati divisi in gruppi in base alle loro annotazioni funzionali. Citoscheletro-correlata e altre proteine vari non sono raffigurati. Le proteine sono sottolineate interattori MyoD convalidati sia in HeLa e / o in myoblasts di co-immunoprecipitazione. Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3:. Validazione di Selected Set di MyoD Interactiani (A) Convalida di interattori MyoD, identificato mediante spettrometria di massa, in linea di cellule HeLa-S3 esprimono stabilmente Flag-HA-MyoD (eMyoD) Pannello sinistro:. Analisi Western Blot di doppia affinità complessi MyoD -purified isolati dal sale-estraibile nucleare (SE) o (NE) frazioni nucleosoma-arricchito della linea cellulare HeLa-S3 esprimono stabilmente eMyoD o cellule di controllo di linea (Mock) con gli anticorpi indicati. MW, marcatore peso molecolare pannello di destra:. Analisi Western Blot di doppi complessi MyoD purificati per affinità isolato da frazioni nucleosoma-arricchito nucleari di HeLa-S3 linea cellulare sesprimendo tably o linea cellulare di controllo eMyoD (Mock) con anticorpi indicati. Questo pannello è stato originariamente pubblicato su The Journal of Biological Chemistry. Yahi H, Fritsch L, Philipot O, Guasconi V, Souidi M, Robin P, Polesskaya A, Losson R, Harel-Bellan A, Ait-Si-Ali S. J Biol Chem. 29 agosto 2008; 283 (35): 23.692-700. doi: 10,1074 / jbc.M802647200. Epub 2008 luglio 2. Copyright L'American Society for Biochimica e Biologia Molecolare. Questa cifra è stata modificata da 26: il tipo e la dimensione della polizia è stato modificato e il testo è stato ruotato di unificare l'etichettatura all'interno della figura. MyoD è stato etichettato come eMyoD per evitare la confusione con IP endogena presentati negli altri pannelli. (BD) Validazione di interattori MyoD in C2C12 mioblasti di topo. (B) estratti totali nucleari proliferazione mioblasti C2C12 sono stati utilizzati per immunoprecipitazione (IP) con anticorpi contro BAF47 (SNF5) o MyoD, o con IgG di controllo. I precipitati risultanti sono stati analizzati con spirito WBh gli anticorpi indicati. Per gli anticorpi anti-MyoD più lunghi (lungo expo.) E più corta (short expo.) Sono riportati i tempi di esposizione. estratti di ingresso sono stati caricati per mostrare i livelli di proteina endogena. Questo pannello è stato pubblicato in 28 sotto la Creative Commons Attribution (CC BY) licenza (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Questa cifra è stata modificata da 28: tipo e dimensione di polizia è stata cambiata e il test è stato ruotato di unificare l'etichettatura all'interno della figura. (C) estratti totali nucleari proliferazione mioblasti C2C12 sono stati utilizzati per immunoprecipitazione con anticorpi contro MyoD, Suv39h1 (controllo positivo), o controllare IgG (controllo negativo). I precipitati ottenuti sono stati poi sottoposti a WB con gli anticorpi indicati. Questo pannello è stato originariamente pubblicato su The Journal of Biological Chemistry. Yahi H, Fritsch L, Philipot O, Guasconi V, Souidi M, Robin P, Polesskaya A, Losson R, Harel-Bellan A, Ait-Si-Ali S. J Biol Chem. 29 agosto 2008; 283(35): 23.692-700. doi: 10,1074 / jbc.M802647200. Epub 2008 luglio 2. Copyright L'American Society for Biochimica e Biologia Molecolare. Questa cifra è stata modificata da 26: il tipo e la dimensione della polizia è stato modificato e il testo è stato ruotato di unificare l'etichettatura all'interno della figura. (D) estratti totali nucleari proliferazione (prolif.) E differenziando C2C12 mioblasti (48 ore, indicato come Diff.) Sono stati utilizzati per immunoprecipitazione (IP) con anticorpi contro MyoD e Myf5, o con normale IgG di coniglio e con perline vuote come controllo negativo. I precipitati ottenuti sono stati analizzati mediante WB con gli anticorpi indicati. estratti di ingresso sono stati caricati per mostrare i livelli di proteina endogena. Questo pannello è stato pubblicato nel 27 sotto la Creative Commons Attribution (CC BY) licenza (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Questa cifra è stata modificata da 27: il tipo e la dimensione della polizia è stato modificato e il testo è stato ruotato di unificare l'etichettatura all'interno del fIGURA. I pannelli con i risultati ottenuti dal proliferare e differenziare C2C12 sono separati in due in contrapposizione alla figura originale. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Tabella 1:. Elenco delle proteine identificate da MS Analysis in complessi eMyoD doppio purificate per affinità Isolato da nucleare Frazione Salt-estraibile dopo la sottrazione delle proteine sfondo (proteine identificate da MS in eluati da linea di cellule di controllo sono stati considerati come sfondo non specifico .) I dati rappresentano la somma di quattro purificazioni indipendenti. cliccate qui per scaricare questo file.
Tabella 2: Elenco delle proteine Identified da MS Analysis in complessi eMyoD doppio purificate per affinità isolate dalla frazione Nucleosome arricchito dopo la sottrazione delle proteine di sfondo. I dati rappresentano la somma delle tre purificazioni indipendenti. Cliccate qui per scaricare questo file.
Tabella 3. Buffer composizioni. Cliccate qui per scaricare questo file.
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Discussion
Il metodo presentato consenta l'identificazione esaustivo di partner di un fattore di trascrizione, MyoD. Ha rivelato partner MyoD in un sistema eterologo resistente alla differenziazione MyoD indotta, ovvero cellule HeLa-S3. Così, per definizione, i partner MyoD identificati sono ubiquitariamente espressi. Questi includono fattori generali e specifici di sequenza di trascrizione, enzimi cromatina modificanti, proteine di elaborazione RNA, chinasi (Tabelle 1 e 2). Dato che le cellule HeLa-S3 sono resistenti a MyoD indotta trans-differenziazione, l'attività MyoD è prevalentemente repressivo e le parti individuate sono suscettibili di essere MyoD co-repressori. Ciò è evidenziato dalla presenza di proteine Id (Tabelle 1 e 2, Figura 2), noti per inibire MyoD capacità transattivazione 8. È importante sottolineare che tale stato repressivo corrisponde allo stato MyoD in proliferanti mioblasti. In effetti, abbiamo confermato che le interazioni con MyoD CBFβ, un MyoDPartner identificato con il metodo descritto, può essere rilevato in proliferanti mioblasti C2C12, ma vengono persi quando le cellule sono stati sottoposti differenziazione (vedi Figura 3D). Tuttavia, è importante notare che uno dei principali limiti del metodo presentato è la mancanza di MyoD identificazione co-attivatori. Coerentemente, utilizzando questo metodo nessuna delle note co-attivatori MyoD, come istone acetiltransferasi 32 sono stati identificati.
Purificazione di complessi MyoD sia dalla frazione solubile (sale nucleare estraibile, SE) del nucleo o dalla frazione cromatina arricchita (nucleosoma arricchito, NE) (Figura 1A) serve per almeno due funzioni principali. In primo luogo, tale frazionamento aumenta la rappresentanza delle parti non stechiometriche che verrebbero mascherati se la purificazione MyoD eseguita da estratti nucleari totali. In secondo luogo, questo permette la separazione delle due sottopopolazioni funzionali di MyoD: pre-depositato / EVICTed (SE) e della cromatina-bound (NE). Tra interattori specifici per MyoD DNA non legato, molti chinasi, fattori di trascrizione, il traffico di proteine così come sono stati individuati alcuni rimodellatori della cromatina (Figura 2). Quando è completamente convalidato, una tale rete potrebbe fornire uno spaccato del modo di regolazione dell'attività di MyoD DNA non legato. Ricerca aggiuntiva per MyoD modificazioni post-traslazionali in questi due compartimenti nucleari mediante spettrometria di massa, potrebbe svelare un'ulteriore regolamentazione dell'attività MyoD. Infine, frazionamento di complessi MyoD solubili e cromatina-bound su un gradiente di glicerolo ha rivelato che mentre la MyoD cromatina-bound è principalmente contenuta in un unico complesso, MyoD DNA legato viene distribuito in tre sotto-complessi (Figura 1B). La caratterizzazione di questi sotto-complessi di entrambi MS e / o Western blot contro i candidati di proteine dovrebbe chiarire ulteriormente il modo di regolazione MyoD.
Come sottolineato in precedenza, le cellule HeLa non è naturalmente Express il fattore di trascrizione muscolo MyoD. Era pertanto importante confermare le interazioni trovati in un modello muscolo scheletrico (Figura 3). Molti rapporti confermati nei modelli rilevanti tali interazioni funzionali tra MyoD e alcuni dei partner individuati nel test TAP-tag presentato. Questo è per esempio il caso di proibitina 33, DDX17 34, Meis1 35, CBF 27, HP1 26, e SWI / SNF cromatina-rimodellamento 36,28,30 complesso.
Si noti che è possibile eseguire tale purificazione TAP-tag dalla bassa quantità di cellule, ad esempio da mioblasti, se combinati a MS sensibili. Infatti, un recente documento descritto partner MyoD caratterizzazione dopo l'espressione inducibile di MyoD Flag-tag nei mioblasti 30. Dato stabile e continuo sovraespressione MyoD nei mioblasti è deleteria, un approccio alternativo sarebbe aggiungendo i tag Flag-HA nel allele endogena MyoD (s) nei mioblastiutilizzando metodi genoma-editing, come CRISPR-Cas9 31. In particolare, l'aggiunta del tag (s) potrebbe potenzialmente alterare la funzione delle proteine e / o associazione con partner di legame, quindi il luogo del tag (N- o C-terminale) deve essere scelto con cautela. Un test funzionale della proteina di fusione nel sistema in questione deve essere eseguito prima di purificazione per TAP-tag per garantire la proteina tag è funzionale. Immunoprecipitazione di proteine endogene evita questi problemi, tuttavia, si basa sulla disponibilità di un anticorpo specifico ed alta affinità, che è raramente disponibile.
Un altro valore aggiunto dell'approccio descritto è la possibilità di identificare modificazioni post-traduzionali (PTM) della proteina purificata stesso e dei suoi partner abbondanti. In tal modo, con questa caratteristica la purificazione TAP-tag è adatto per identificare non solo i nuovi partner di interazione, ma anche nuove funzioni enzimatiche associate alla proteina di interesse e / o ai suoi partner. Incaso di cromatina-binding protein (es., fattori di trascrizione, enzimi), questo metodo è pertanto adatta per l'identificazione del "codice istone" associato. In effetti, le code degli istoni amino-terminale, che sono esposte sulla superficie nucleosoma, sono soggette a molteplici PTM covalenti. PTM istone conferiscono una firma unica per i nucleosomi coinvolti. Una combinazione di diverse modifiche sul istoni N-terminale code può quindi alterare la struttura della cromatina per permettere regolazione dell'espressione genica. Così, che caratterizzano tali modifiche associati ad una data proteina potrebbe fornire approfondimenti sui ruoli e meccanismi di azione delle proteine della cromatina vincolante studiati 22.
In sintesi, la metodologia presentata consenta l'identificazione completa del partner MyoD. La purificazione TAP-tag fornisce un'alternativa ad altri approcci, come GST pull-down, lievito saggi a due ibridi e di visualizzazione dei fagi. Anche se per motivi pratici (production di grandi quantità di estratti nucleari) dobbiamo usare un sistema cellulare eterologo, siamo stati in grado di confermare la partecipazione delle parti MyoD identificati nella differenziazione muscolo scheletrico. I dati ottenuti dimostrano che il fattore miogenico MyoD sembra interagire con una pletora di proteine che vanno da regolatori trascrizionali alle proteine leganti RNA, suggerendo i diversi meccanismi che regolano l'attività di un fattore di trascrizione.
In conclusione, lo stesso approccio metodologico potrebbe essere utilizzato per individuare partner ubiquitariamente espressi di numerosi fattori nucleari che potrebbero essere difficili da studiare nel loro specifico contesto cellulare.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell lines | |||
| HeLa-S3 | ATCC | CCL-2.2 | |
| C2C12 | ATCC | CRL-1772 | |
| Equipment | |||
| Spinner | Corning | 778531 | |
| Homogenizer: Dounce homogenizer | Wheaton | 432-1273 and 432-1271 | |
| Agitating device for spinners | Bellco | 778531 | |
| Sonicator | Diagenode | UCD 200 | |
| Hemocytometer | Marienfeld Superior | 640610 | |
| Low-binding tubes | Sorenson | 27210 | |
| Empty spin column | Bio-Rad | 7326204 | |
| Reagents | |||
| SDS-polyacrylamide 4-12% gel | Life technologies | NP0336BOX | |
| 4x loading buffer | Life technologies | NP0007 | |
| 10x reducing agent | Life technologies | NP0004 | |
| Silver staining kit | Life technologies | A8592 | |
| Centrifugal filter units, 10K | Millipore | UFC501024 | |
| Protein G agarose beads | Sigma-Aldrich | P4691 | |
| Protein A/G Resin | Thermo Scientific | 53132 | |
| Flag resin (anti-Flag M2-agarose affinity gel) | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| HA resin (monoclonal Anti-HA agarose) | Sigma-Aldrich | A2095 | |
| MNase | Sigma-Aldrich | N3755 | |
| Flag free peptide (DYKDDDDK) | Ansynth Service BV | Custom synthesis | Resuspend up to 4 mg/ml in 50 mM Tris-HCl, pH 7.8 |
| HA free peptide (YPYDVPDYA) | Ansynth Service BV | Custom synthesis | Resuspend up to 4 mg/ml in 50 mM Tris-HCl, pH 7.8 |
| Bicinchoninic acid based protein assay kit : BCA kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Protease inhibitors | Sigma-Aldrich | S8830 | |
| Luminol-based enhanced chemiluminescence (ECL) HRP substrate | Life technologies | 34075 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Sheared salmon sperm DNA (Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes) | Sigma-Aldrich | D1626 | |
| Spermine tetrahydrochloride | Sigma-Aldrich | S1141 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S0266 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| MOPS running buffer | Life technologies | NP0001 | |
| DMEM (high glucose) | Sigma-Aldrich | D0822 | Pre-warm at 37 °C before use |
| Trypsin-EDTA (0.05% phenol red | Life technologies | 25300-054 | |
| Serum | GE healthcare life sciences | PAA A15-102 | Each lot of serum has to be first tested for your cells. |
| Penicillin and Streptomycin | Life technologies | 15140-122 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Life technologies | 15250-061 | |
| Water (sterile-filtered) | Sigma-Aldrich | W3500 | |
| Antibodies | |||
| HA from rat (12CA5) | Roche | 11583816001 | |
| Flag | Sigma-Aldrich | A8592 | |
| MyoD | Santa Cruz | sc-32758 | To use for western blotting |
| MyoD | Santa Cruz | SC-760 | To use for immunoprecipitation and western blotting |
| CBFbeta | Santa Cruz | FL-182 | |
| HP1alpha | Euromedex | 2HP2G9 | |
| HP1beta | Euromedex | 1MOD1A9AS | |
| HP1gamma | Euromedex | 2MOD1GC | |
| Suv39h1 | Cell Signaling Technology | 8729 | |
| BAF47 | BD Biosciences | 612111 | |
| Myf5 | Santa Cruz | SC-302 | |
| Tubulin | Sigma-Aldrich | T9026 | |
| Actin | Sigma-Aldrich | A5441 | |
| IgG Mouse | Santa Cruz | SC-2025 | |
| IgG Rabbit | Santa Cruz | SC-2027 | |
| Goat anti-rat -HRP | Sigma-Aldrich | A9037 | |
| Goat anti-rabbit -HRP | Sigma-Aldrich | A6154 | |
| Goat anti-mouse -HRP | Sigma-Aldrich | A4416 |
References
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