Abstract
Skelettmuskel terminal differentiering börjar med engagemang pluripotenta mesodermala prekursorceller till myoblaster. Dessa celler har fortfarande förmågan att föröka sig eller de kan differentiera och säkring i flerkärniga myotuber, som ska mogna vidare för att bilda myofibers. Skelettmuskel terminal differentiering iscensatt av den samordnade åtgärder av olika transkriptionsfaktorer, i synnerhet medlemmar av muskeln Regulatory faktorer eller MRFs (MyoD, myogenin, Myf5 och MRF4), även kallad myogenic bHLH transkriptionsfaktorer familj. Dessa faktorer samverkar med kromatin-ombyggnad komplex inom arbetade transkriptionsreglerande nätverk för att uppnå skelett myogenes. I detta är MyoD anses befälhavaren myogenic transkriptionsfaktor i att utlösa muskel terminal differentiering. Denna uppfattning stärks av förmågan hos MyoD att omvandla icke-muskelceller i skelettmuskelceller. Här beskriver vi en metod som används för att identifiera MyoDproteinpartner i ett uttömmande sätt i syfte att belysa de olika faktorer som påverkar skelettmuskulatur terminal differentiering. Det långsiktiga målet är att förstå de epigenetiska mekanismer som är inblandade i regleringen av skelettmuskel gener, dvs., MyoD mål. Myod partners identifieras med hjälp av Tandem Affinity Purification (TAP-Tag) från ett heterologt system kopplat till masspektrometri (MS) karakterisering, följt av validering av den roll som relevanta partner under skelettmuskulaturen terminal differentiering. Avvikande former av myogena faktorer, eller deras avvikande reglering, är förknippade med ett antal muskelsjukdomar: kongenital myasteni, Dystrofia myotonika, rabdomyosarkom och defekter i muskler förnyelse. Som sådan, myogena faktorer ger en pool av potentiella terapeutiska mål i muskelsjukdomar, både vad gäller mekanismer som orsakar sjukdom i sig och regenerativ mekanismer som kan förbättra sjukdomsbehandling. Således, den detaljerade understanding av de intermolekylära interaktioner och de genetiska program som kontrolleras av de myogena faktorer är avgörande för rationell utformning av effektiva terapier.
Introduction
Eukaryota flercelliga organismer är uppbyggda av olika organ och vävnader. Varje funktionell vävnad har en specifik gen mönster uttryck, som bestäms vid varje differentieringssteg. Cellulär differentiering innebär aktivering av specifika gener, underhåll av deras uttryck och i allmänhet tysta av en uppsättning av gener, som är involverade i celltillväxt. Skelettmuskeldifferentiering, eller myogenes, är således en process i flera steg, som börjar med fastställandet av mesodermala stamceller till myoblaster, och sedan leder till den terminala differentieringen av dessa myoblaster in i första mono-kärnbildade och sedan multikärnförsedd, myotuber . Således, myoblaster är "bestäms" celler, som fortfarande är i stånd att föröka sig, men de har åtagit sig att skelettmuskulaturen härstamning, och därmed kan skilja enbart i skelettmuskelceller antingen under embryoutveckling eller i vuxen muskelregenerering. Processen för skelettmuskulaturen terminal skiljer sigentiation är iscensatt av en specifik genetisk program som börjar med den permanenta utträde ur cellcykeln av myoblast prekursorceller som leder till en slutgiltig tysta spridning associerade gener, såsom E2F målgener 1. Faktum är att under processen av terminal differentiering, är myoblast spridning gripandet ett avgörande steg som föregår uttrycket av skelettmuskel specifika gener och fusions av myoblaster i myotuber 2. Ett sådant program tillåter vuxna muskel stamceller, även kallade satellitceller, för att differentiera under regenereringsprocessen efter skelett muskelskada.
Däggdjurs myogenes är kritiskt beroende av en familj av myogenic grundläggande helix-loop-helix (bHLH) transkriptionsfaktorer MyoD, Myf5, MRF4 och myogenin, ofta kallad familjen av skelettmuskelbestämningsfaktorer eller MRFs (Muscle reglerande faktorer) 3. Var och en av dem spelar en viktig roll i specifikationen och difpassad av skelettmuskelceller och har ett specifikt uttryck mönster 5-7 april. Aktiveringen av Myf5 och MyoD utgör den bestämmande steg som förbinder cellerna till myogenic härstamning, och efterföljande uttryck av myogenin utlöser myogenes med aktivering av skelettmuskelspecifika gener, såsom MCK (Muscle Creatine Kinase). Myogenic bHLH transkriptionsfaktorer samverkar med medlemmar av MEF2 familjen i aktivering av muskel gener från tidigare tysta loci 8. De stimulerar också skelettmuskulaturen gentranskription som heterodimerer med allestädes närvarande bHLH proteiner, E12 och E47, så kallade E-proteiner, som binder så kallade E-boxar i olika gen reglerande regioner 8. Twist, Id (hämmare av differentiering) och andra faktorer reglerar negativt denna process genom att konkurrera med MyoD för E-proteiner binder åtta.
MyoD anses vara den största aktören på utlöser muskel terminal differentiering 9 10-13. I själva verket tvingade uttryck av MyoD inducerar trans-differentieringen av olika celltyper även de som härrör från en annan embryologic ursprung 12. Till exempel, kan MyoD konvertera hepatocyter, fibroblaster, melanocyter, neuroblaster och adipocyter i en muskel-liknande celler. Den transdifferentierings verkan av MyoD innebär en onormal aktivering av myogenic genetiska programmet (särskilt dess målgener) i en icke-muskulära miljö, samtidigt som den tysta den ursprungliga genetiska programmet (särskilt spridnings gener).
I prolifererande myoblaster är MyoD uttrycks men är oförmögen att aktivera sina målgener även när det binder till sina initiativtagare 14-16. Därför kravet på MyoD kontinuerligt uttryckas i odifferentierade myoblaster fortfarande ganska elufattande. MyoD kunde undertrycka sina målgener på grund av rekrytering av repressiva kromatin-modifierande enzymer i prolifererande myoblaster före lastning av aktiverande kromatinremodellering enzymer 14,17. Till exempel, i prolifererande myoblaster, är MyoD associerad med transkriptionell co-repressor KAP-1, histondeacetylaser (HDAC) och repressiva lysin metyltransferaser (kmts), inklusive histon H3 lysin 9 eller H3K9 och H3K27 KMTs, och aktivt undertrycka dess målgener uttryck genom att etablera en lokalt repressiva kromatinstrukturen 14,17. Viktigt är en färsk rapport indikerade att MyoD är själv metyleras direkt av H3K9 KMT G9a resulterar i hämning av sin transaktiverande aktivitet 16.
De epigenetiska mekanismer som är involverade i detta trans-differentiering av icke-muskelceller från MyoD är till stor del okända. Noterbart är vissa cellinjer är resistenta mot MyoD-inducerad trans-differentiering. Således, i HeLa-celler, är MyoD antingen inaktiv elleräven kan fungera som repressor snarare än aktivator av transkription grund av bristande uttryck av BAF60C subenheten av kromatinremodellering komplexa SWI / SNF 18. Denna modell kan därför vara av val för att bättre karaktärisera mekanismerna MyoD-inducerad gen repression. Det är också lämpligt att analysera förmågan hos MyoD att inducera undertryckande kromatin miljö vid sitt mål loci med tillhörande partner och därför avslöja myod beroende repressiva mekanismer i prolifererande myoblaster att finjustera terminal differentiering.
Här beskriver vi protokoll för identifiering av myod partner med Tandem Affinity Purification (TAP-Tag) kopplat till masspektrometri (MS) karakterisering. Användningen av HeLa-S3-celler som stabilt uttrycker Flag-HA-MyoD tillåts att få tillräckligt med material för att rena myod komplex från fraktionekärnextrakt. Identifieringen av myod partners i heterologa systemet följdes av validatipå ett relevant systemet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Framställning av HeLa-S3 Nuclear Salt-extraherbara och Kromatin-bundna fraktioner
- Insamling av cellerna
- Växa HeLa-S3 Flag-HA-MyoD och HeLa-S3 Flag-HA (kontroll-cellinje) i Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) kompletterat med 10% fetalt kalvserum, 100 U / ml penicillin och 100 | ig / ml streptomycin (tillväxt medium) vid 37 ° C och 5% CO2 i en fuktig inkubator.
Obs: HeLa-S3-celler som stabilt uttrycker Flag-HA-MyoD och HeLa-S3-celler transducerade med tom vektor (HeLa-S3 Flag-HA) kan antingen fastställas med hjälp protokoll som beskrivs i: 19,20, eller som tillhandahålls av författarna. - Förstärk celler upp till 10 helt sammanflytande 150 mm skålar av varje cellinje (HeLa-S3 Flag-HA-MyoD och HeLa-S3 Flag-HA-celler).
- Samla supernatanten (innehålla icke-vidhäftande subpopulation) i 5 L spinner.
- Tvätta vidhäftande subpopulation med 10 ml PBS per 150 mm skål, trypsinize cellerna under 1 min vid rums-temperatur (0,05% trypsin-EDTA-lösning, 2 ml för en 15 cm skål).
- Tillsätt 4 ml av mediet per 150 mm skål och samla upp cellerna i 50 ml rör.
- Kombinera supernatanten från steg 1.1.3 (i 5 L spinner) och cellerna från steg 1.1.5, tillsätt 500 ml färsk förvärmda tillväxtmedium för varje cellinje.
- Överföra cellsuspension i 5 L spinnaren och odla celler under minst 60 h vid 37 ° C och 5% CO2 i en fuktig inkubator.
- Tillsätt 500 ml färskt tillväxtmedium och odla cellerna under 24 h.
- Lägg 1 L av färskt tillväxtmedium och odla cellerna under 24 h.
- Ta ut 1 ml av cellsuspensionen för att räkna cellerna och kontrollera cellviabiliteten. Färg 30 pl cellsuspension med 30 ^ 0,4% trypanblått och räkna levande (inte blå) celler under mikroskop med hjälp av hemocytometer.
- Hålla celldensitet på 2 - 6 x 10 5 celler / ml genom tillsats av färskt odlingsmedium dagligen; inte överstiger 1 x 10 6 celler / ml. Maximaltvolym för en 5 L spinner är 2,5 L.
Obs! För följande steg vidare genom att partier av 2-2,5 liter kultur vid en densitet 1 x 10 6 celler / ml. Upprepa steg 1.1.12 - 1.1.14 att samla ca 20 L (≈ 20 g torr pellet) av varje cellinje innan du fortsätter till nästa steg. - Pelletera celler genom centrifugering vid 500 xg under 5 min vid 4 ° C och kassera supernatanten.
- Resuspendera cellerna i 100 ml av iskall PBS genom att pipettera och centrifugera vid 500 xg under 5 min vid 4 ° C för att tvätta pelleten.
- Upprepa tvätta genom återsuspendering av cellerna med 25 ml iskall PBS, överför suspensionen till 50 ml-rör och centrifugering vid 500 xg under 5 min vid 4 ° C.
Notera: Cellpellettar kan antingen användas omedelbart eller frystes i flytande kväve och lagrades vid -80 ° C under flera dagar.
- Växa HeLa-S3 Flag-HA-MyoD och HeLa-S3 Flag-HA (kontroll-cellinje) i Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) kompletterat med 10% fetalt kalvserum, 100 U / ml penicillin och 100 | ig / ml streptomycin (tillväxt medium) vid 37 ° C och 5% CO2 i en fuktig inkubator.
- Isolering av Nuclei
Obs: Utför steg 1.2.1 - 1.4.3 i kylrummet.- Pre-chill buffers och homogenisatorer.
- Vid användning av fruset material, snabbt tina cellen pellets i vattenbad vid 37 ° C.
- Resuspendera 20 g (≈ 20 ml) av celler i 20 ml (en volym som är lika med storleken på cellpelleten) av hypoton buffert A (tabell 3) med användning av 10 ml av bufferten först, därefter tillsätta 5 ml, sedan tillsätta ytterligare 5 ml. Tvätta pipetterna väl med färsk buffert för att få maximalt celler.
- Transfer 40 ml cellsuspension i pre-kyld homogenisator med en tättslutande mortelstöt.
- Homogenisera cellerna med 20 slag i en homogenisator (20 in och ut rörelser) och överför cellsuspensionen i 50 ml rör.
- Tvätta homogenisatorn med 7 ml sackarosbuffert (1/3 av den ursprungliga cellvolymen, Tabell 3) att utvinna den maximala av celler. Överför denna suspension snabbt in i 50 ml rör från steg 1.2.5 att bevara kärnorna och begränsa läckaget.
- Färga ett 30 pl alikvot med 30 pl 0,4% trypan blått, analysera under mikroskop för att styra lys effektiviteten (om lysen är framgångsrik, bör samtliga kärnor vara blå). Om nödvändigt, upprepa homogeniseringssteg.
- Centrifugera i 7 min vid 10000 xg och 4 ° C för att pelletera kärnor. Spara supernatanten som den cytoplasmatiska fraktionen.
- Framställning av Nuclear Salt-extraherbar (SE) Fraktion
- Resuspendera kärnor pelleten i 8 ml sackarosbuffert (en volym som är lika med storleken på kärnorna pellet). Lägg droppvis under omrörning ordentligt på en virvel 8 ml buffert med hög salthalt (1 kärnor pelletvolym, tabell 3) för att få en slutlig koncentration av 300 mM NaCl. Inkubera i 30 minuter på is och blanda varje 5 min.
- Minska NaCl-koncentrationen till 150 mM genom tillsats av 8 ml (1/3 av den totala volymen) av sackarosbuffert. Centrifugera i 10 minuter vid 13.000 xg och 4 ° C. Samla supernatanten (kärnsalt extraherbar fraktion, SE).
Obs: Antingen gå vidare till steg 1.3.3 eller lämna SEfraktion på is under beredning av kromatin-bundna fraktionen och därefter ultracentrifug båda fraktionerna samtidigt. - Ultra-centrifug SE för 30 minuter vid 85.000 xg vid 4 ° C. Ta supernatanten (≈ 26 ml).
- Freeze 100 pl alikvot i flytande kväve. Fortsätt till steg 2 "proteinkomplex rening", med hjälp av resten av extraktet.
Obs: alikvot skall användas som en inmatningsstyrning under steg 5.1.1.
- Framställning av Kromatin-bundna fraktionen
- Suspendera pelleten (från steg 1.3.5.) Minutiöst i 7 ml (en volym lika med storleken hos pelleten) sackaros-buffert.
- Lägga CaCl2 till en slutlig koncentration av 1 mM (28 | il av 0,5 M CaCl 2 för 14 ml suspension) för att aktivera MNas (steg 1.4.4) och blanda.
- Värm suspensionen under 1 minut vid 37 ° C.
- Lägg 70 l mikrokocknukleas (MNas) för att få slutlig koncentration av 0,0025 U / l (1/200 utspädning från 0,5U / ul lager) och blanda.
- Inkubera exakt 12 minuter vid 37 ° C. Blanda alla 4 min.
- Placera omedelbart reaktionen på is.
- För att stoppa MNas aktivitet, tillsätt 112 pl 0,5 M EDTA pH 8,0 (1/125 utspädning) till en slutlig koncentration av 4 mM. Inkubera under 5 min på is.
- Sonikera 5 gånger i 1 min vid hög amplitud, mellan två sonications tillåter ett uppehåll på en min (10 min totalt).
- Ultracentrifug under 30 minuter vid 85.000 xg och 4 ° C.
- Samla supernatanten (nukleosomen fraktion, NE, ≈ 12 ml).
- Freeze 50 pl alikvot i flytande kväve. Fortsätt till steg 2 "proteinkomplex rening", med hjälp av resten av extraktet.
Obs: alikvot skall användas som en inmatningsstyrning under steg 5.1.1.
2. proteinkomplex Rening
Obs: Fortsätt i parallella extrakt från varje cellinje (HeLa-S3 Flag-HA-MyoD och kontroll, HELa-S3 Flag-HA).
- Flag- baserat Rening
- Förtvätt Flag harts. Använd 600 pl flagga harts (från kommersiella 50% lager) för varje experimentpunkt (SE och NE fraktioner för varje cellinje).
- Överföringsharts in i 15 ml rör, återsuspendera i 13 ml kall tegn (tabell 3), centrifugera för 2 min vid 1000 x g och avlägsna supernatanten. Upprepa 5 gånger. Efter den sista tvättningen återsuspendera sjunker hartset i lika stor volym av tegn (300 pl för varje försökspunkt).
- För varje experimentell punkt, blanda 600 pl tvättade flagga harts och motsvarande proteinextrakt (i ett 15 ml rör för 12 ml NE och i ett 50 ml rör för 26 ml SE fraktioner, respektive). Inkubera på ett roterande hjul över natten vid 4 ° C.
- Centrifugera i 2 min vid 1000 xg vid 4 ° C, lägga undan supernatanten och hålla vid 4 ° C tills resultatet av testet effektiviteten rening (2,2).
- För SE prover suspendera Flag hartsi 4 ml tegn och överföring till en 15 ml tub. Upprepa detta steg 3 gånger, varje gång överföring till samma 15 ml rör undvika att förlora pärlor. Centrifugera 2 min vid 1000 xg och 4 ° C och avlägsna supernatanten.
- Tvätt sjunker harts 7 gånger i ett 15 ml rör med användning av 13 ml tegn och centrifugering 2 min vid 1000 xg och 4 ° C.
- Efter den sista tvätten, återsuspendera i 1 ml tegn och överföring in i en 1,5 ml låg-bindande rör. Centrifugera 2 min vid 1000 xg och 4 ° C och avlägsna supernatanten.
- Återsuspendera i 200 ^ sjunker peptidlösning vid 4 mg / ml vid pH 7,8 för varje experimentpunkt. Blanda pärlor och peptid. Tillsätt 200 pl av tegn buffert och inkubera vid 4 ° C under åtminstone 4 h eller över natten för att eluera bundna proteiner.
- Centrifugera i 2 min vid 1000 xg vid 4 ° C och överföra hartset och supernatanten (Flag eluat) till en tom spinnkolonn placerades i ett 2 ml rör.
- Centrifugera kolumnen samla vänster-over supernatant i 2 ml rör. Samla upp sjunker hartset genom tillsats av tegn buffert till kolonnen och vidare till den andra flaggan eluering med 200 pl Flag peptidlösning (4 mg / ml) över natten vid 4 ° C för varje experimentpunkt.
- Upprepa steg 2.1.9 - 2.1.10 att samla andra elueringen. Kombinera första och andra eluat.
- Test av rening Effektivitet
Obs: Under steg 2.1.11 - 2.1.12, utföra SDS-PAGE och silverfärgning (2.2.1 - 2.2.2).- Ta 15 ul av eluaten, tillsätt 5 il 4x laddningsbuffert och 2 pl av 10x reduktionsmedel, koka i 5 min vid 96 ° C och kör en SDS-polyakrylamid 4-12% gel enligt tillverkarens instruktioner.
- Färga gelén med hjälp av silverfärgning kit (följ tillverkarens instruktioner). Om det finns tydliga skillnader i proteinmönster mellan Flag-HA-MyoD och Flag-HA mock eluat, i synnerhet bandet Flag-HA MyoD (cirka 50 kDa, Figur 1A), gå vidare till nästa stes.
- Hemagglutinin (HA) -baserad Rening
- Wash HA-harts genom att överföra in i 15 ml rör, återsuspendering i 13 ml tegn och centrifugering 2 min vid 1000 xg vid 4 ° C. Upprepa tvättsteg 5 gånger. Efter förra tvätta Resuspendera pärlor i lika stor volym av tegn buffert.
Notera: Volymen skall justeras i enlighet med effektiviteten för Flag-baserad rening. Börja med 300 ul från den kommersiella 50% lager för varje experimentpunkt. - Överför HA harts för varje experimentpunkt i en 1,5 ml låg bindnings rör. Centrifugera 2 min vid 1000 xg vid 4 ° C, eliminera maximum av tvättbuffert (Tabell 3) och tillsätt eluaten från Flag-baserad rening för HA-harts.
- Inkubera rören på det roterande hjulet över natten vid 4 ° C.
- Centrifugera i 2 min vid 1000 xg vid 4 ° C, lägga undan supernatanten och hålla vid 4 ° C tills resultatet av effektiviteten reningstest (2.3.12.).
- Reavbryta HA harts i 0,5 ml tegn, förflyttas till en ny låg bindning 1,5 ml rör. Upprepa resuspension gång tillsats till samma 1,5 ml rör för att undvika att förlora pärlor och centrifugera två min vid 1000 xg och 4 ° C. Avlägsna supernatanten.
- Tvätta pärlor 8 gånger genom användning av 1 ml av tegn varje gång, centrifugering 2 min vid 1000 xg och 4 ° C och avlägsnande supernatanten (undvika att förlora pärlor). Efter den sista tvätten, överför pärlorna i 0,5 ml rör.
- Avlägsna så mycket supernatant som möjligt. Tillsätt 100 pl av HA-fri peptid-lösning (4 mg / ml) vid pH 7,8 på kulor för att eluera bundna proteiner. Inkubera på det roterande hjulet över natten vid 4 ° C.
Obs: Mängden HA-peptid måste justeras beroende på det överflöd av komplexen. - Centrifugera i 2 min vid 1000 xg vid 4 ° C och överföra hartset och supernatanten (HA eluat) till en tom spinnkolonn placerades i ett 2 ml rör.
- Centrifugera kolonnen för att samla upp överblivna supernatant i 2 ml rör. Utföra en andra eluering med 100 pl av HA-peptid (4 mg / ml) för varje experimentpunkt. Inkubera på det roterande hjulet över natten vid 4 ° C. Upprepa steg 2.3.8 - 2.3.9 för att samla andra elueringen.
- Kombinera första och andra eluat.
- Provreningseffektiviteten genom SDS-PAGE och silverfärgning (se steg 2.2.) (Figur 1A).
- Koncentrera HA eluatet till 30 pl med hjälp av centrifugal filterenheterna med en 10 kDa cut-off (nominell molekylviktgräns NMWL) enligt tillverkarens anvisningar.
- Dela koncentrerade prover i två delar: 22,5 (3/4) och 7,5 (1/4) il. Snap frysa 1/4 av prover i flytande kväve och förvara vid -80 ° C. Använd 3/4 del för steg 3.
Anmärkning: 04/01 frusna delen skall användas för att bekräfta masspektrometri resultat genom western blöt (se steg 5.1).
- Wash HA-harts genom att överföra in i 15 ml rör, återsuspendering i 13 ml tegn och centrifugering 2 min vid 1000 xg vid 4 ° C. Upprepa tvättsteg 5 gånger. Efter förra tvätta Resuspendera pärlor i lika stor volym av tegn buffert.
3. masspektrometri Analys
Obs: Följande steg bör diskuteras med masspektrometri anläggning som kommer att utföra analysen.
- Supplement 04/03 (22,5 | il) av proven med 7,5 | il 4x laddningsbuffert och 3,3 ^ il 10 x reduktionsmedlet och koka i 5 min vid 96 ° C.
- Belastningsprov på en SDS-polyakrylamid 4-12% gel. Kör gelen vid 150 V konstant under 5 minuter så att alla proteiner att komma in i gelén utan separation.
- Tvätta gelén med vatten; fix för 20-30 minuter med fixeringslösning (10% ättiksyra, 50% metanol, 40% ultrarent vatten) tvätta den fasta gelén 5 gånger i ultrarent vatten.
- Klipp banden innehåller proteiner, butik i 1 ml vatten i ett 1,5 ml rör och skicka massa anläggning spektrometri.
4. Dataanalys
Notera: Detta är en allmän vägledning för analysen. De exakta steg kommer att bero på det speciella sättet för de uppgifter som ges av MS anläggninganvänds för att utföra analysen (t.ex. 21,22).
- Jämför listan över de identifierade proteiner i "myod" eluaten med listan som erhålls från motsvarande negativ kontrollberedningen. Uteslut från analysen av proteiner som finns i båda listorna.
- Avlägsna proteiner som har ≤2 totala antalet identifierade peptider från kvarvarande listan.
- Tillgång funktionell annotering och funktionella klassificeringen av den erhållna listan av proteiner med David Bioinformatik Resources (http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp) och klassificera listan av proteinerna 23,24.
- (Tillval) Ta bort från listan "liftare", laddade icke-nukleära proteiner med starka oavsiktlig bindning till negativt laddade DNA 25. Dessa innehåller cytoskelettala, cytoplasmatiska, mitokondriella membran och receptorproteiner (Protein vikning, cytoskelettet och diverse grupp proteiner i tabellerna 1 och 2). </ Li>
- Jämför de erhållna förteckningar över myod interactmedlemmar från SE och NE fraktioner att identifiera gemensamma proteiner och proteiner som är specifika för varje fraktion (Figur 2).
5. Bekräftelse av identifierade interactmedlemmar av Western Blot
- Bekräftelse i HeLa-S3 Flag-HA-MyoD och HeLa-S3 Flag-HA
- Tö eluatet prover erhållna vid steget 2.3.14 (7,5 | il) på is. Tillsätt 12 | il av tegn-buffert, 10 | il 4x laddningsbuffert och 3 ul av 10x reduktionsmedel. Koka proverna i 5 minuter vid 96 ° C.
- Förbered insampel för Western blotting.
- Tina alikvoter från steg 1.3.9 och 1.4.11 och mäta proteinkoncentration, till exempel med hjälp av BCA kit (följ tillverkarens instruktioner).
- Använd 15 pg av protein per bana. Mäta den lämpliga mängden av extraktet och justera volymen av provet upp till 15 | j, l med tegn buffert.
- Tillsätt 5 | il 4x laddningsbuffert och1,5 pl 10x reduktionsmedel. Koka proverna i 5 minuter vid 96 ° C.
- Utför en western blot-analys med antikroppar av intresse (specifika för partner kandidat som identifierats under MS-analys) med användning av 15 pl eluat prover. Använd ingångsextrakt som en kontroll av endogena proteinnivåer (figur 3a).
- Bekräftelse på Relevant Cellular System
- Framställning av den totala nukleära extrakt av C2C12 mus myoblaster.
- Växa C2C12 mouse myoblaster i DMEM-medium kompletterat med 15% fetalt kalvserum, 100 U / ml penicillin och 100 | ig / ml streptomycin vid 37 ° C och 5% CO2 i en fuktig inkubator. Aldrig överstiga 80% cellsammanflödet för att upprätthålla celler i proliferativa tillstånd.
- Växa minst två 150 mm skålar i C2C12 för en punkt (en antikropp) av immunoprecipitation (IP). Aspirera mediet, tvätta cellerna två gånger med 10 ml PBS.
- Skrapa cellerna och samla upp i 15 ml rör. centrifuge vid 250 xg under 5 min vid 4 ° C. Släng supernatanten.
- Skatta volymen av cellpelleten (= V cell). Försiktigt resuspendera pelleten i 3 volymer V cell i hypoton buffert B för att störa cytoplasmiska membranet (tabell 3).
- Lägga 0,44 x V cellvolym av 10% NP-40 för att nå en slutlig koncentration av 1% (volym / volym). Vänd försiktigt röret flera gånger för att blanda.
- Lägga 0,89 x V cellvolym av SR (tabell 3) för att bevara kärnorna integritet. Vänd försiktigt röret flera gånger för att homogenisera suspensionen och centrifugera i 5 minuter vid 2000 xg för att pelletera kärnor.
- Avlägsna supernatanten (cytosoliskt fraktionen). Uppskatta volymen av kärnor pellet (= V nucA). Resuspendera kärnor pelleten i en volym V nuc av sackarosbuffert.
- Lägg droppe för droppe under blandning noggrant på en virvel en volym V nuc av buffert med hög salthalt för att få en slutlig koncentration av 300 mMNaCl, och inkubera under 30 minuter på is. Blanda varje 5 min.
- Lägga en volym V nuc av sackarosbuffert (för att minska NaCl-koncentrationen till 150 mM) och CaCl2 (slutlig koncentration 1 mM). Blanda.
- Värm suspensionen under 1 minut vid 37 ° C, tillsätt mikrokocknukleas att få slutlig koncentration 0,0025 U / l (1/200 från lager av 0,5 U / l). Blanda.
- Inkubera exakt 12 minuter vid 37 ° C. Blanda alla 3 min.
- Placera omedelbart reaktion på is och tillsätt EDTA (slutlig koncentration 4 mM) för att stoppa MNas aktivitet. Inkubera under 5 min på is.
- Sonikera 5 gånger för 0,5 minuter vardera vid hög amplitud. Mellan två sonications, tillåter ett uppehåll på 0,5 min (5 min totalt).
- Ultra-centrifug i 30 minuter vid 85.000 xg och 4 ° C. Samla in supernatanten (totalt nukleärt extrakt).
- Mäta proteinkoncentration av den totala nukleärt extrakt, exempelvis med användning av BCA-kit (följ tillverkarens anvisningar) och fortsätt immediatEly till steg 5.2.2.
- Immunoprecipitation (IP) av endogen MyoD.
- Pre-klar extrakten, tvätta 10 pl av protein G-agarospärlor för varje IP-punkten.
- Överföra den nödvändiga volymen av protein G-agarospärlor till ett 1,5 ml rör, återsuspendera i 1,4 ml kall tegn, centrifugera i 2 min vid 1800 x g och avlägsna supernatanten. Upprepa 3 ggr.
- Blanda pre-tvättade protein G-agarospärlor med lämplig volym av den totala kärnextrakt. Använda 500 | j, g av total nukleärt extraktprotein per IP punkt.
- Inkubera på ett roterande hjul vid 4 ° C under 2 h för att i förväg ta bort extrakten.
- Centrifugera i 5 minuter vid 1800 xg vid 4 ° C. Hålla supernatanten.
- Blanda 5 mikrogram av MyoD Ab eller 5 mikrogram kanin-IgG med 500 mikrogram förväg rensas totala kärnextrakt i 1,5 ml låg bindnings rör. Lägg tegn buffert upp till 1 ml. Inkubera på ett roterande hjul vid 4 ° C över natten.
Obs: Utför ffter steg under steg 5.2.2.3. - Förtvätt 7,5 l protein A / G aktie pärlor lösning per IP punkt.
- Överföra den nödvändiga volymen av pärlorna i en 1,5 ml rör, återsuspendera pärlorna i 1 ml tegn och centrifugera vid 1800 xg vid 4 ° C under 2 min. Avlägsna supernatanten. Upprepa 3 ggr.
- Återsuspendera protein A / G pärlor i 1,5 ml blockeringslösning (Tabell 3) och inkubera på ett roterande hjul över natten vid 4 ° C.
- Centrifugera totala kärnextrakt inkuberade med Abs (steg 5.2.2.5) vid 16.000 xg under 10 minuter vid 4 ° C. Hålla supernatanten.
- Centrifugera blockerat protein A / G-harts (steg 5.2.2.7) vid 1800 xg under 2 minuter vid 4 ° C. Kassera supernatanten och återsuspendera i 1 ml av tegn buffert. Re-centrifug vid 1800 xg under 2 minuter vid 4 ° C för att tvätta ur blockeringsbuffert.
- Resuspendera blockerade protein A / G-harts i 1 ml tegn buffert och delprov i nya låg proteinbindnings rör för att erhålla 7,5 il blocked protein A / G-harts per IP punkt. Centrifugera vid 1800 xg vid 4 ° C under 2 min och ta bort så mycket som möjligt av supematanten.
- Lägga de totala kärnextrakt inkuberade med Abs (eller kontroll-IgG) till A / G-harts. Blanda och inkubera under 2 h vid rumstemperatur (RT) på ett roterande hjul.
- Centrifugera suspensionen 1800 xg vid RT under 2 min. Kassera supernatanten, återsuspendera i 1 ml tvättbuffert och överföring suspension i nya låga bindande rör. Inkubera vid RT på ett roterande hjul under 5 min.
- Centrifugera suspensionen vid 1800 xg vid RT i 2 minuter, återsuspendera i 1 ml tvättbuffert och inkubera vid RT på ett roterande hjul under 5 min. Upprepa 4 gånger. För den sista tvättningen förflyttas till en ny låg bindnings rör.
- Ta maximalt supernatanten. Lägga 7 pl av tvättbuffert, 7 | j, l av 4x laddningsbuffert och 3 ^ il 10 x reduktionsmedel till pärlorna, blanda och koka i 5 min vid 96 ° C.
- Utför en Western blot-analys med antikroppar av interest (specifik för partner kandidat för immun utfällt protein). Använd 1% (5 mikrogram) av ingångsextrakt som en kontroll av endogena proteinnivåer (Figur 3B).
- Pre-klar extrakten, tvätta 10 pl av protein G-agarospärlor för varje IP-punkten.
- Framställning av den totala nukleära extrakt av C2C12 mus myoblaster.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att förstå regleringen av MyoD aktivitet genomförde vi den uttömmande karakterisering av myod komplex med hjälp av biokemisk rening, baserat på immunorening av en dubbel märkt form av MyoD följt av masspektrometri (MS). Användningen av HeLa-S3 cellinje som uttrycker Flag-HA-märkta MyoD och en styr cellinje som uttrycker Flag-HA tillstånd att få tillräckligt med material för att rena MyoD komplexet genom att utföra dubbelaffinitetsrening av Flag-HA-MyoD.
Vi fraktion cellextrakten i cytoplasmiska och nukleära fraktioner, sedan ytterligare fraktion den nukleära fraktionen till salt extraheras (kärnsaltutvinningsbara, SE) och anrikas för nukleosomer (nukleosomen berikad, NE) fraktioner. TAP-Tag rening från dessa separerade nukleära fraktioner (figur 1, tabellerna 1 och 2) tillåtna unraveling partners som har relativt låg abUndance när lokaliserad vid en specifik subnuclear fack. Vidare har en sådan strategi utnyttjas för att avslöja partner obundet (SE) jämfört DNA-bundet (NE) MyoD att få insikter om MyoD aktivitet reglering.
För TAP-Tag rening erhölls Flag-HA tandem epitop system som används. Den lilla hydrofila sjunker och HA-epitoper har minimal störning med proteiners funktion och är mycket tillgänglig för antikropp-antigeninteraktion. Anti-Flag och anti-HA-hartsbaserat sekventiell immunrening utfördes, följt av eluering av de immunrenat komplex med användning av Flag och HA-peptider. De eluerade proteinerna kördes sedan på en SDS-PAGE för att tillåta alla proteiner för att komma in i gelén. Bitarna av gel innehållande samtliga renade proteinerna skars; de proteiner extraherades, trypsin-digere och identifieras genom masspektrometri (MS).
Såsom visas i figur 2, (Figur 2 och 3) 26-28. Detta belyser DNA bundna myod partner och eventuella co-regulatorer som kan etablera en repressiv-kromatin miljö. Till exempel, HP1 proteiner, som identifierades som myod partner genom metod som beskrivs, är kända för att binda metylerat H3K9 att upprätthålla gen förtryck och heterokromatin struktur. I själva verket, HP1 hämmar MyoD transkriptionsaktivitet resulterar i försämrad MyoD mål genuttryck och muskel terminal differentiering 26.
Ytterligare fraktionering avde SE och NE myod komplex på glycerolgradient (som beskrivs i 29) avslöjade myod underkomplex i de två subnukleära fack (Figur 1B). I synnerhet är SE MyoD fördelade i tre sub-komplex, medan kromatin-bundna MyoD hör huvudsakligen till ett komplex.
En del av TAP-taggen / MS avslöjade Interactmedlemmar bekräftades genom western blöt på myod komplex. Dessa inkluderar transkriptionsfaktorn CBF, EBB, MTG8R och SWI / SNF subenhet BAF47 (SNF5) (figur 3A, till vänster) och HP1 proteiner (CBX1 och CBX3) (figur 3A, höger). Viktigt, eftersom HeLa-celler är inte muskelceller och inte uttrycka MyoD, är det nödvändigt att bekräfta växelverkan mellan nyligen identifierade Interactmedlemmar och MyoD i myoblaster (Figur 3 BD). Noterbart är för sådan validering, den totala nukleära extrakt (utan separation på SE och NE) är vanligen tillräcklig, which tillåter minskning av mängden myoblaster används för provberedning. In vitro interaktionsanalyser som i 26,27, bidrar till att ytterligare bekräftat dessa fynd. Slutligen bör funktionella betydelsen av dessa interaktioner i muskelcellerna behandlas vidare som i 26-28.
Sammantaget presenterade data visar på en global syn på ubiquitously uttryckt myod partner och bana väg för ytterligare funktionella studier i en mer relevant muskel modell.
Figur 1: MyoD Anläggningar isolerades genom Tandem Affinitetsrening (A) en silverfärgning av dubbelaffinitetsrenade eMyoD komplex isolerade från kärn salt-extraherbar (SE) eller nukleosomen berikad (NE) nukleära fraktioner av HeLa-S3 cellinjer som stabilt. uttryckande Flag-HA-MyoD (MyoD komplex) end kontroll cellinje (Mock). MW, molekylviktsmarkör i kilo dalton (kDa). Pilen indikerar Flag-HA-MyoD (eMyoD). Denna forskning publicerades ursprungligen i 37. Copyright American Society för biokemi och molekylärbiologi. Denna siffra har ändrats från 26: banorna med mock reningar och eMyoD komplex isolerade från SE nukleära fraktioner visas nu. (B) Dubbelaffinitetsrenade eMyoD komplex som i (A) fraktionerades på glycerolgradient i intervallet från 20% till 41%. Fraktioner manuellt uppsamlades, koncentrerades och analyserades genom western blöt (WB) med användning av anti-Flag-antikroppar. Notera förekomsten av flera eMyoD innehållande under komplex i kärnsalt extraherbar (SE) fraktionen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. Jämförelse av kromatin-bundna (nukleosomen berikad, NE) kontra Nuclear Lösliga (kärn salt extraherbart, SE) MyoD Partners Top: Venn diagram som visar överlappningen mellan eMyoD Interactmedlemmar isolerats från kärnsalt extraherbar (SE) och nukleosomen berikad ( NE) fraktionen. De ribosomproteiner, översättning-initieringsfaktorer, DNA-reparationsfaktorer och tubulin isoformerna uteslöts från analysen eftersom de förekommer i olika datauppsättningar som erhållits genom TAP och betraktas som icke-specifik Botten:. De myod Interactmedlemmar finns i både SE och NE fraktioner (gemensamma) eller specifika för en av fraktionerna (unika) delades i grupper baserat på deras funktionella anteckningar. Cytoskelettet relaterade och andra diverse proteiner inte avbildas. De understrukna proteinerna är MyoD Interactmedlemmar validerade antingen i HeLa- och / eller i myoblasts av co-immunoprecipitation. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3:. Validering av utvalda uppsättningen myod Interactmedlemmar (A) Validering av myod Interactmedlemmar, identifieras genom masspektrometri, i HeLa-S3-cellinje som stabilt uttrycker Flag-HA-MyoD (eMyoD) vänstra panelen. Western blot-analys av dubbel affinitet -purified myod komplex isolerade från kärnsalt extraherbar (SE) eller nukleosomen berikad (NE) fraktioner av HeLa-S3-cellinje som stabilt uttrycker eMyoD eller kontroll-cellinje (Mock) med de angivna antikropparna. MW, molekylviktsmarkör Höger panel. Western blot-analys av dubbelaffinitetsrenade myod komplex isolerade från kärn nukleosomen berikade fraktioner av HeLa-S3-cellinje stably uttrycker eMyoD eller kontroll-cellinje (Mock) med angivna antikropparna. Denna panel publicerades ursprungligen i The Journal of Biological Chemistry. Yahi H, Fritsch L, Philipot O, Guasconi V, Souidi M, Robin P, Polesskaya A, Losson R, Harel-Bellan A, Ait-Si-Ali S. J. Biol Chem. 2008 29 augusti, 283 (35): 23.692 till 700. doi: 10,1074 / jbc.M802647200. Epub 2008 juli 2. Copyright American Society for biokemi och molekylärbiologi. Denna siffra har ändrats från 26: polis typ och storlek ändrades och texten roterades att förena märkningen i figuren. MyoD märktes som eMyoD att undvika förväxling med endogen IP presenteras i de andra panelerna. (BD) Validering av myod interactmedlemmar i C2C12 mus myoblaster. (B) Kärn totala extrakt från prolifererande C2C12 myoblaster användes för immunoutfällning (IP) med antikroppar mot BAF47 (SNF5) eller MyoD, eller med kontroll IgG. De erhållna fällningarna analyserades genom WB with de angivna antikropparna. För anti-myod antikroppar längre (lång expo.) Och kortare (kort expo.) Är exponeringstider visas. Ingångsextrakt laddades visa endogena proteinnivåer. Denna panel har publicerats i 28 under Creative Commons Attribution (CC BY) licens (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Denna siffra har ändrats från 28: polis typ och storlek ändrades och provroterades att förena märkningen i figuren. (C) Nukleära totala extrakt från prolifererande C2C12-myoblaster användes för immunoutfällning med antikroppar framtagna mot MyoD, Suv39h1 (positiv kontroll) eller kontroll-IgG (negativ kontroll). De erhållna fällningarna underkastades därefter WB med de angivna antikropparna. Denna panel publicerades ursprungligen i The Journal of Biological Chemistry. Yahi H, Fritsch L, Philipot O, Guasconi V, Souidi M, Robin P, Polesskaya A, Losson R, Harel-Bellan A, Ait-Si-Ali S. J. Biol Chem. 2008 29 augusti; 283(35): 23692-700. doi: 10,1074 / jbc.M802647200. Epub 2008 juli 2. Copyright American Society for biokemi och molekylärbiologi. Denna siffra har ändrats från 26: polis typ och storlek ändrades och texten roterades att förena märkningen i figuren. (D) Nukleära totala extrakt från prolifererande (prolif.) Och differentierande C2C12 myoblaster (48 h, indikerad som Diff.) Användes för immunoutfällning (IP) med antikroppar som tagits fram mot MyoD och Myf5, eller med normalt kanin-IgG och med tomma pärlor som negativ kontroll. De erhållna fällningarna analyserades genom WB med de angivna antikropparna. Ingångsextrakt laddades visa endogena proteinnivåer. Denna panel har publicerats i 27 under Creative Commons Attribution (CC BY) licens (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Denna siffra har ändrats från 27: polis typ och storlek ändrades och texten roterades att förena märkningen i figure. Panelerna med de resultat som erhållits från prolifererande och differentierande C2C12 separeras i två till skillnad från den ursprungliga siffran. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1:. Lista av proteiner identifierade genom MS-analys i dubbelaffinitetsrenade eMyoD komplex isolerade från Nuclear Salt-extraherbar fraktion efter subtraktion av bakgrunds Proteiner (Proteiner som identifierats av MS i eluaten från kontroll cellinje betraktades som icke-specifik bakgrunds .) Data representerar summan av fyra oberoende reningar. klicka här för att ladda ner filen.
Tabell 2: Lista av proteiner Identified av MS-analys i dubbelaffinitetsrenade eMyoD komplex isolerade från nukleosomen fraktionen efter subtraktion av bakgrunds Proteiner. Data representerar summan av tre oberoende reningar. Klicka här för att ladda ner filen.
Tabell 3. buffertkompositioner. Klicka här för att ladda ner filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna metod möjliggör uttömmande identifiering av partner en transkriptionsfaktor, MyoD. Det avslöjade myod partner i ett heterologt system resistent mot MyoD-inducerad differentiering, nämligen HeLa-S3-celler. Således, per definition, identifierade myod partners ubiquitously uttryckt. Dessa inkluderar allmänna och sekvensspecifika transkriptionsfaktorer, kromatin-modifierande enzymer, RNA-bearbetning proteiner, kinaser (tabellerna 1 och 2). Eftersom HeLa-S3-celler är resistenta mot MyoD-inducerad trans-differentiering, är MyoD aktivitet främst repressiva och de identifierade partners kommer sannolikt att vara myod co-repressorer. Detta understryks av närvaron av Id-proteiner (Tabell 1 och 2, Figur 2), som är kända för att hämma MyoD trans förmåga åtta. Viktigt är sådan repressiv stat motsvarar MyoD status i prolifererande myoblaster. I själva verket, bekräftade vi att myod interaktioner med CBFβ, en MyoDpartner som identifierats av den beskrivna metoden, kan detekteras i prolifererande C2C12-myoblaster, men försvinner när cellerna genomgick differentiering (se figur 3D). Det är dock viktigt att notera att en av de viktigaste begränsningarna hos den presenterade metodiken är bristen på MyoD samaktivatorer identifiering. Konsekvent, med den här metoden ingen av de kända MyoD samaktivatorer, såsom histonacetyltransferas 32 identifierades.
Rening av myod komplex antingen från den lösliga fraktionen (kärn- salt extraherbart, SE) av kärnan eller kromatinet fraktionen (nukleosomen berikad, NE) (Figur 1A) tjänar minst två huvudfunktioner. För det första ökar sådan fraktione representationen av de icke-stökiometriska partner som skulle maskeras om MyoD rening utförs från den totala nukleära extrakt. För det andra tillåter denna separation av två funktionella subpopulationer av MyoD: deponerats i förväg / evicTed (SE) och kromatin-bundna (NE). Bland interactmedlemmar specifika för DNA-obundna MyoD många kinaser, transkriptionsfaktorer, trafficking proteiner samt vissa kromatin remodelers identifierades (Figur 2). När fullt validerade, kan ett sådant nätverk ger en inblick i läget verksamhets reglering av DNA-obunden MyoD. Extra sökning efter myod posttranslationella modifieringar i dessa två kärn avdelningar genom masspektrometri, ytterligare kan riva MyoD aktivitet reglering. Slutligen, fraktionering av lösliga och kromatin-bundna myod komplex på en glycerolgradient avslöjade att medan kromatin bundna MyoD huvudsakligen återfinns i en komplex, är DNA-obundna MyoD distribueras i tre under komplex (Figur 1B). Karakterisering av dessa under komplex av antingen MS och / eller Western blöt mot protein kandidater bör ytterligare belysa sättet MyoD reglering.
Som betonas ovan, inte HeLa-celler inte naturligt express muskeln transkriptionsfaktorn MyoD. Det var därför viktigt att bekräfta de funna interaktioner i en skelettmuskel modell (Figur 3). Många rapporter bekräftade i relevanta modeller sådana funktionella interaktioner mellan MyoD och några av de partner som anges i den presenterade TAP-tag-analys. Detta är till exempel fallet för prohibitin 33, DDX17 34, Meis1 35, CBF 27 HP1 26, och SWI / SNF kromatin-ombyggnad komplex 36,28,30.
Observera att det är möjligt att utföra en sådan TAP-tag rening från låg mängd av celler, såsom från myoblaster, när de kombineras till känsliga MS. I själva verket beskrev nyligen papper myod partners karakterisering efter inducerbart uttryck av Flag-märkt MyoD i myoblaster 30. Eftersom stabil och kontinuerlig MyoD uttryck i myoblaster är skadlig, skulle ett alternativt tillvägagångssätt vara att lägga till Flag-HA-taggar i den endogena MyoD allelen (er) i myoblastergenom att använda genomredigering metoder, såsom crispr-Cas9 31. Notably, kunde tillsatsen av tagg (ar) skulle kunna förändra proteinfunktion och / eller association med bindningspartners därför platsen för etiketten (N- eller C-terminalen) bör väljas med försiktighet. En funktionell analys av fusionsproteinet i relevanta systemet måste utföras före TAP-taggen rening för att säkerställa det taggade proteinet är funktionella. Immunoutfällning av endogena proteiner undviker dessa problem, men förlitar sig på att det finns en specifik och hög affinitet antikropp, som är sällan tillgängliga.
En annan mervärde beskrivna tillvägagångssättet är möjligheten att identifiera posttranslationella modifieringar (PTMs) av det renade proteinet självt och dess rikliga partners. Därigenom med den här funktionen TAP-taggen rening är lämpligt att identifiera inte bara nya interaktionspartners men också nya enzymatiska funktioner associerade till proteinet av intresse och / eller dess partner. Ifallet med en kromatin-bindande protein (dvs., transkriptionsfaktorer, enzymer) är denna metod sålunda anpassat för identifiering av den associerade "histon kod". I själva verket, de aminoterminala histon svansar, som exponeras på nukleosomen ytan, är föremål för flera kovalenta PTMs. Histon PTMs ger en unik signatur till nukleosomer inblandade. En kombination av olika ändringar på histon N-terminal svansar kan således ändra kromatinstrukturen att tillåta genuttryck reglering. Således, som kännetecknar sådana ändringar i samband med ett givet protein kan ge insikter om roller och verkningsmekanismerna för de studerade kromatin-bindande proteiner 22.
Sammanfattningsvis medger omfattande identifiering av myod partners presenterade metoden. TAP-taggen rening ger ett alternativ till andra metoder såsom GST rullgardinsmenyerna, jäst två-hybrid analyser och fag display. Även om det av praktiska skäl (production stor mängd kärnextrakt) vi måste använda ett heterologt cellulärt system, har vi kunnat bekräfta medverkan av de identifierade myod partner i skelettmuskulaturen differentiering. Den erhållna data visar att den MyoD myogenic faktorn tycks interagera med en uppsjö av proteiner som sträcker sig från transkriptionsregulatorer till RNA-bindande proteiner, vilket tyder på de olika mekanismer som reglerar aktiviteten av en transkriptionsfaktor.
Sammanfattningsvis skulle Samma metod kan användas för att identifiera ubiquitously uttryckt partner i många nukleära faktorer som kan vara svåra att studera i deras specifika cellulära sammanhang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell lines | |||
| HeLa-S3 | ATCC | CCL-2.2 | |
| C2C12 | ATCC | CRL-1772 | |
| Equipment | |||
| Spinner | Corning | 778531 | |
| Homogenizer: Dounce homogenizer | Wheaton | 432-1273 and 432-1271 | |
| Agitating device for spinners | Bellco | 778531 | |
| Sonicator | Diagenode | UCD 200 | |
| Hemocytometer | Marienfeld Superior | 640610 | |
| Low-binding tubes | Sorenson | 27210 | |
| Empty spin column | Bio-Rad | 7326204 | |
| Reagents | |||
| SDS-polyacrylamide 4-12% gel | Life technologies | NP0336BOX | |
| 4x loading buffer | Life technologies | NP0007 | |
| 10x reducing agent | Life technologies | NP0004 | |
| Silver staining kit | Life technologies | A8592 | |
| Centrifugal filter units, 10K | Millipore | UFC501024 | |
| Protein G agarose beads | Sigma-Aldrich | P4691 | |
| Protein A/G Resin | Thermo Scientific | 53132 | |
| Flag resin (anti-Flag M2-agarose affinity gel) | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| HA resin (monoclonal Anti-HA agarose) | Sigma-Aldrich | A2095 | |
| MNase | Sigma-Aldrich | N3755 | |
| Flag free peptide (DYKDDDDK) | Ansynth Service BV | Custom synthesis | Resuspend up to 4 mg/ml in 50 mM Tris-HCl, pH 7.8 |
| HA free peptide (YPYDVPDYA) | Ansynth Service BV | Custom synthesis | Resuspend up to 4 mg/ml in 50 mM Tris-HCl, pH 7.8 |
| Bicinchoninic acid based protein assay kit : BCA kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Protease inhibitors | Sigma-Aldrich | S8830 | |
| Luminol-based enhanced chemiluminescence (ECL) HRP substrate | Life technologies | 34075 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Sheared salmon sperm DNA (Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes) | Sigma-Aldrich | D1626 | |
| Spermine tetrahydrochloride | Sigma-Aldrich | S1141 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S0266 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| MOPS running buffer | Life technologies | NP0001 | |
| DMEM (high glucose) | Sigma-Aldrich | D0822 | Pre-warm at 37 °C before use |
| Trypsin-EDTA (0.05% phenol red | Life technologies | 25300-054 | |
| Serum | GE healthcare life sciences | PAA A15-102 | Each lot of serum has to be first tested for your cells. |
| Penicillin and Streptomycin | Life technologies | 15140-122 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Life technologies | 15250-061 | |
| Water (sterile-filtered) | Sigma-Aldrich | W3500 | |
| Antibodies | |||
| HA from rat (12CA5) | Roche | 11583816001 | |
| Flag | Sigma-Aldrich | A8592 | |
| MyoD | Santa Cruz | sc-32758 | To use for western blotting |
| MyoD | Santa Cruz | SC-760 | To use for immunoprecipitation and western blotting |
| CBFbeta | Santa Cruz | FL-182 | |
| HP1alpha | Euromedex | 2HP2G9 | |
| HP1beta | Euromedex | 1MOD1A9AS | |
| HP1gamma | Euromedex | 2MOD1GC | |
| Suv39h1 | Cell Signaling Technology | 8729 | |
| BAF47 | BD Biosciences | 612111 | |
| Myf5 | Santa Cruz | SC-302 | |
| Tubulin | Sigma-Aldrich | T9026 | |
| Actin | Sigma-Aldrich | A5441 | |
| IgG Mouse | Santa Cruz | SC-2025 | |
| IgG Rabbit | Santa Cruz | SC-2027 | |
| Goat anti-rat -HRP | Sigma-Aldrich | A9037 | |
| Goat anti-rabbit -HRP | Sigma-Aldrich | A6154 | |
| Goat anti-mouse -HRP | Sigma-Aldrich | A4416 |
References
- Ait-Si-Ali, S., et al. A Suv39h-dependent mechanism for silencing S-phase genes in differentiating but not in cycling cells. Embo J. 23 (3), 605-615 (2004).
- Buckingham, M. Skeletal muscle development and the role of the myogenic regulatory factors. Biochem Soc Trans. 24 (2), 506-509 (1996).
- Arnold, H. H., Winter, B. Muscle differentiation: more complexity to the network of myogenic regulators. Curr Opin Genet Dev. 8 (5), 539-544 (1998).
- Buckingham, M. Skeletal muscle formation in vertebrates. Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 440-448 (2001).
- Yun, K., Wold, B. Skeletal muscle determination and differentiation: story of a core regulatory network and its context. Curr Opin Cell Biol. 8 (6), 877-889 (1996).
- Molkentin, J. D., Olson, E. N. Defining the regulatory networks for muscle development. Curr Opin Genet Dev. 6 (4), 445-453 (1996).
- Arnold, H. H., Braun, T. Targeted inactivation of myogenic factor genes reveals their role during mouse myogenesis: a review. Int J Dev Biol. 40 (1), 345-353 (1996).
- Puri, P. L., Sartorelli, V. Regulation of muscle regulatory factors by DNA-binding, interacting proteins, and post-transcriptional modifications. J Cell Physiol. 185 (2), 155-173 (2000).
- Tapscott, S. J. The circuitry of a master switch: Myod and the regulation of skeletal muscle gene transcription. Development. 132 (12), 2685-2695 (2005).
- Lassar, A. B., Paterson, B. M., Weintraub, H. Transfection of a DNA locus that mediates the conversion of 10T1/2 fibroblasts to myoblasts. Cell. 47 (5), 649-656 (1986).
- Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts. Cell. 51, 987-1000 (1987).
- Tapscott, S. J., et al. MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts. Science. 242, 405-411 (1988).
- Weintraub, H., et al. Activation of muscle-specific genes in pigment, nerve, fat, liver, and fibroblast cell lines by forced expression of MyoD. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (14), 5434-5438 (1989).
- Mal, A., Harter, M. L. MyoD is functionally linked to the silencing of a muscle-specific regulatory gene prior to skeletal myogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (4), 1735-1739 (2003).
- Ohkawa, Y., Marfella, C. G., Imbalzano, A. N. Skeletal muscle specification by myogenin and Mef2D via the SWI/SNF ATPase Brg1. Embo J. 25 (3), 490-501 (2006).
- Ling, B. M., et al. Lysine methyltransferase G9a methylates the transcription factor MyoD and regulates skeletal muscle differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (3), 841-846 (2012).
- Zhang, C. L., McKinsey, T. A., Olson, E. N. Association of class II histone deacetylases with heterochromatin protein 1: potential role for histone methylation in control of muscle differentiation. Mol Cell Biol. 22 (20), 7302-7312 (2002).
- Forcales, S. V., et al. Signal-dependent incorporation of MyoD-BAF60c into Brg1-based SWI/SNF chromatin-remodelling complex. The EMBO journal. 31 (2), 301-316 (2011).
- Nakatani, Y., Ogryzko, V. Immunoaffinity purification of mammalian protein complexes. Methods Enzymol. 370, 430-444 (2003).
- Ouararhni, K., et al. The histone variant mH2A1.1 interferes with transcription by down-regulating PARP-1 enzymatic activity. Genes Dev. 20 (23), 3324-3336 (2006).
- Fritsch, L., et al. A subset of the histone H3 lysine 9 methyltransferases Suv39h1, G9a, GLP, and SETDB1 participate in a multimeric complex. Mol Cell. 37 (1), 46-56 (2010).
- Robin, P., Fritsch, L., Philipot, O., Svinarchuk, F., Ait-Si-Ali, S. Post-translational modifications of histones H3 and H4 associated with the histone methyltransferases Suv39h1 and G9a. Genome Biol. 8 (12), R270 (2007).
- Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).
- Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res. 37 (1), 1-13 (2009).
- Ohta, S., et al. The protein composition of mitotic chromosomes determined using multiclassifier combinatorial proteomics. Cell. 142 (5), 810-821 (2010).
- Yahi, H., et al. Differential cooperation between heterochromatin protein HP1 isoforms and MyoD in myoblasts. J Biol Chem. 283 (35), 23692-23700 (2008).
- Philipot, O., et al. The core binding factor CBF negatively regulates skeletal muscle terminal differentiation. PloS one. 5 (2), (2010).
- Joliot, V., et al. The SWI/SNF subunit/tumor suppressor BAF47/INI1 is essential in cell cycle arrest upon skeletal muscle terminal differentiation. PloS one. 9 (10), e108858 (2014).
- Tanese, N. Small-scale density gradient sedimentation to separate and analyze multiprotein complexes. Methods. 12 (3), 224-234 (1997).
- Singh, K., et al. A KAP1 phosphorylation switch controls MyoD function during skeletal muscle differentiation. Genes Dev. 29 (5), 513-525 (2015).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Yahi, H., Philipot, O., Guasconi, V., Fritsch, L., Ait-Si-Ali, S. Chromatin modification and muscle differentiation. Expert Opin Ther Targets. 10 (6), 923-934 (2006).
- Sun, L., Liu, L., Yang, X. J., Wu, Z. Akt binds prohibitin 2 and relieves its repression of MyoD and muscle differentiation. J Cell Sci. 117. 117 (Pt 14), 3021-3029 (2004).
- Caretti, G., et al. The RNA helicases p68/p72 and the noncoding RNA SRA are coregulators of MyoD and skeletal muscle differentiation. Dev Cell. 11 (4), 547-560 (2006).
- Knoepfler, P. S., et al. A conserved motif N-terminal to the DNA-binding domains of myogenic bHLH transcription factors mediates cooperative DNA binding with pbx-Meis1/Prep1. Nucleic Acids Res. 27 (18), 3752-3761 (1999).
- Albini, S., Puri, P. L. SWI/SNF complexes, chromatin remodeling and skeletal myogenesis: it's time to exchange! Exp Cell Res. 316 (18), 3073-3080 (2010).
- Yahi, H., Fritsch, L., Philipot, O., Guasconi, V., Souidi, M., Robin, P., Polesskaya, A., Losson, R., Harel-Bellan, A., Ait-Si-Ali, S. Differential Cooperation between Heterochromatin Protein HP1 Isoforms and MyoD in Myoblasts. J Biol Chem. 283 (35), 23692-23700 (2008).
