Introduction
Microbi patogeni possono formare biofilm in vivo che portano a infezioni croniche non acute 1. Infezione biofilm-associata è un grave fattore di rischio di procedure mediche che coinvolgono l'impianto di corpi estranei (ad esempio, la sostituzione di ossa artificiali, le protesi mammarie) o l'installazione di tubi tracheali o cateteri urinari 2. In questi contesti, terapia anti-infettiva è quasi sempre necessario come infezioni biofilm-based sono raramente cancellati da soli, anche in individui immunocompetenti. Staphylococcus aureus è uno dei patogeni più frequentemente osservati implicati nella complicazioni biofilm correlati che si verificano durante l'uso di dispositivi medici invasivi 3.
Purtroppo, la natura stessa del biofilm da barriera protettiva rende più resistenti al trattamento delle cellule planctoniche 1,4, e la valutazione della efficacia clinica predetto è una parte critica sia inizialelo sviluppo di farmaci così come la sorveglianza della resistenza ai farmaci. Vi è un crescente riconoscimento che condizioni di laboratorio, si è concentrata sulle culture planctonici, potrebbero non rappresentare fedelmente la malattia del mondo reale 5. Ulteriori aggravando il problema, la replica di fenotipi biofilm è difficile, e modelli biofilm esistenti sono noioso e soffrono di alta inter- e intra-assay variabilità 6. Così, molti ricercatori, per necessità, di default per saggi cellulari planctonici di sensibilità ai farmaci, quindi potenzialmente trascurare un aspetto importante della virulenza batterica e la malattia.
Qui si descrive il protocollo per il saggio di batteri, in particolare S. aureus, in biofilm pre-grown utilizzando una base di 7,8 sistema di biofilm ben 96. Mentre il protocollo per la formazione di biofilm e la sfida segue essenzialmente la raccomandazione del costruttore, presentiamo una metodologia ricca di informazioni alternative per quantificare la fattibilità del BIOFilm dopo sfida. Brevemente, i batteri sono coltivate in piastra piolo, dove biofilm formano sui pioli sporgenti collegati al coperchio della piastra. Dopo la formazione di biofilm, i pioli sono delicatamente immersi in pozzetti di una piastra fresca ripiena con PBS per rimuovere le cellule planctoniche. Il peg-coperchio, con biofilm allegate, viene trasferito in una nuova piastra sfida, contenente varie concentrazioni di antibiotici da dosare. Dopo una seconda incubazione, coperchi sono nuovamente rimosso, lavato, e trasferiti ad una piastra di recupero contenente resazurina tintura, dove subiscono una incubazione finale. conversione resazurina può essere registrata cineticamente o preso come una lettura finale dopo un periodo di recupero definito. Questo metodo di tintura a base di quantificare la vitalità del biofilm si differenzia notevolmente dalle noiose CFU (unità formanti colonie) metodologia basata su conteggio descritto nel protocollo originale 7. OD 600 misurazioni della piastra sfida droga e resazurina cinetiche di conversione fungono redditività letturaout di cellule planctonici e biofilm, rispettivamente, offrendo un test veloce, affidabile e tecnicamente semplice ricco di informazioni per la sopravvivenza biofilm.
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Protocol
1. biofilm Initiation
- Crescere una cultura di biofilm producono organismo in un mezzo ricco di nutrienti. Seminare Staphylococcus aureus ceppo Newman in 10 ml di terreno Mueller-Hinton da uno stock di glicerolo. Eseguire tutti i lavori che coinvolgono la gestione di S. aureus con i guanti e all'interno di un armadio biosicurezza.
- Incubare per 16 ore a 37 ° C su shaker rotativo (100-200 rpm).
- Determinare OD 600 della coltura utilizzando uno spettrofotometro ed una cuvetta standard (lunghezza del percorso: 1cm).
- Calcolare il volume (V) della cultura necessari per preparare 20 ml di inoculo con OD 600 (inoculo) di 0,1 in chelexed mezzi Roswell Park Memorial Institute (CRPMI) 9 utilizzando la formula: [V = 20 ml * 0,1 / OD 600 (cultura )]
Nota: Riferimento 9 fornisce dettagli sulla preparazione CRPMI.- Aggiungere il volume coltura calcolata (dall'alto) in una provetta da centrifuga e cellule pellet mediante centrifugazione per 1 min a 10.000 x g. per prepare biofilm inoculo, aspirare il mezzo di crescita e risospendere pellet cellulare trascorso in 20 ml CRPMI.
- Versare inoculo in un serbatoio 25 ml.
- Rimuovere con cautela il coperchio da una piastra sterile piolo 96 pozzetti tirandola verso l'alto.
Nota: Fare attenzione a non contaminare i pioli che pendono dal coperchio. Il coperchio può essere posizionato a testa in giù su una superficie pulita all'interno di un armadio biosicurezza. - Usando una pipetta microlitri 200 multicanale, aggiungere 125 microlitri inoculo in ciascun pozzetto di righe da A a G della piastra inferiore.
- Riempire media 125 ml sterile CRPMI in ciascun pozzetto di fila H come controllo di sterilità.
- Prendere la peg-coperchio e tenerlo sopra il fondo piatto con i pioli rivolti verso il basso. Allineare con cura i singoli pioli con relativi pozzetti. Evitare il contatto fisico tra la piastra e le spine. Una volta allineati, abbassare il coperchio con cautela verso il basso. Evitare disallineamenti come aggiustamenti eseguiti dopo i picchetti hanno toccato la piastra inferiore può contcontrolli di sterilità aminate in fila H.
- Sigillare il coperchio alla piastra con la pellicola di paraffina per evitare l'evaporazione e mettere in un sacchetto di plastica richiudibile, tenuta saldamente. Mantenere il volume dell'aria nel sacchetto più basso possibile per minimizzare l'evaporazione.
- Incubare senza agitazione a 37 ° C per 48 ore in un incubatore CO 2 5%.
Nota: 48 ore di crescita è stato ottimale per S. aureus, ma varierà basato sul organismo utilizzato.
Nota: Anche se l'incubazione statico è un buon punto di partenza per ottimizzare il dosaggio, scuotendo leggermente a 150 giri al minuto, un vortex è una delle variazioni che possono migliorare la formazione di biofilm di alcuni S. aureus isolati.
2. Preparazione della piastra biofilm sfida
- Il giorno della sfida biofilm prendere una piastra a 96 pozzetti fresco e aggiungere 100 ml di CRPMI, equilibrati a RT, a ciascun pozzetto di righe B a H. Per evitare risultati inconsistenti, utilizzare una piastra a 96 pozzetti che può contenere 200 mldei media quando i pioli sono all'interno, e dispone pozzetti con dimensioni identiche a quelle della piastra biofilm iniziazione.
- Diluire fino a 4 composti di prova separatamente in 1,0 ml di CRPMI a 2x la concentrazione finale desiderata, al fine di spiegare una diluizione finale nel passo 2.7.
Nota: un buon punto di partenza è di 8 volte superiori alla concentrazione inibitoria delle cellule planctoniche. - Aggiungere 200 ml di composto 1 a Wells A1 a A3, composto di 2 pozzi in A4 A6, composto di 3 pozzi in A7 a A9 e composto 4 in pozzi A10 a A12.
- In serie diluire i composti di prova utilizzando una pipetta multicanale e trasferire 100 ul dalla fila A alla fila B e mescolare.
- In questo modo, continuare a trasferire 100 ul pozzetto a pozzetto. Mescolare dopo ogni trasferimento e sosta in fila F.
- Dopo la miscelazione, espellere i 100 ml di fila F in un contenitore per rifiuti. Non trasferire alcun liquido alle righe G e H.
- Aggiungere 100 ml di CRPMI a ciascun pozzetto della piastra con una pipetta multicanale perportare il volume a 200 ml. Vedere la Figura 1 per il layout piatto finale.
3. biofilm Sfida
- Aggiungere 200 ml di tampone fosfato salino (PBS) ad un nuovo sterile 96 pozzetti che dispone pozzetti con dimensioni identiche a quelle della piastra biofilm iniziazione.
- Rimuovere il sacchetto di plastica e pellicole di paraffina dalla piastra biofilm iniziazione incubate.
- Sollevare il coperchio verso l'alto. Evitare il contatto tra i picchetti e il fondo piatto come questo può danneggiare il biofilm. Tenere la parte inferiore per la successiva analisi OD 600 (vedi 3.8).
- Risciacquare cellule planctoniche posizionando il peg-coperchio sulla piastra contenente PBS (dal punto 3.1). Immergere pioli per 5 secondi, sollevare dalla PBS, e immergere ancora una volta, facendo attenzione a non colpire i picchetti contro i lati pure.
- Mettere il coperchio peg-risciacquato nella piastra sfida. Evitare il contatto inutili tra i picchetti e piastra di fondo per non danneggiare il biofilm che porta arisultati inconsistenti.
- piastra di tenuta con la pellicola di paraffina e riporre in un sacchetto di plastica richiudibile come descritto al punto 1.10.
- Incubare la piastra senza agitazione per 24 ore a 37 ° C in un incubatore CO 2 5%.
- Prendere parte inferiore della piastra di biofilm iniziazione da 3.3. Risospendere i batteri in ciascun pozzetto utilizzando una pipetta multicanale e misurare il diametro esterno 600 con un lettore di micropiastre adatto per confermare la crescita che si verificano in tutti i pozzetti, ma i controlli di sterilità in fila H.
4. Determinazione biofilm
- Utilizzare un lettore di piastre dotato di una camera di incubazione e in grado di prendere letture di fluorescenza cinetici per la rilevazione resazurina conversione. Impostare una misurazione della fluorescenza cinetica 24 ore utilizzando una eccitazione 530 nm e 590 nm di emissione.
- Impostare la temperatura della camera a 37 ° C e ha la piastra letto ogni 20 min. Impostare il lettore di piastre per misurare dal fondo della piastra base alle istruzioni del produttorezioni.
- Preparare Lavare la piastra con l'aggiunta di 200 ml di PBS con una pipetta multicanale ad una sterile 96 pozzetti.
- Preparare mezzo di recupero biofilm con l'aggiunta di 400 ml di 0,8 mg / ml resazurina soluzione madre a 20 ml di terreno CRPMI ad una concentrazione finale di 16 mg / ml resazurina.
Nota: resazurina è irritante per la pelle conosciuta. Uso di un camice, occhiali anti-schizzo, e guanti durante la manipolazione. CRPMI come supporti di ripristino biofilm è stato usato perché fornisce il segnale di fondo più basso, ma può essere sostituito da mezzi di Mueller Hinton, se del caso. - Aggiungere 150 pl di mezzo di recupero biofilm con una pipetta multicanale a ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti fresco.
- Trasferimento piatto sfida da incubatrice in un armadio biosicurezza e con attenzione rimuovere il sacchetto di plastica e la pellicola sigillante.
- Togliere il peg-coperchio dalla piastra sfida e risciacquare le cellule planctoniche in PBS come descritto in 3.4. Mantenere il fondo della piastra sfida per successiva OD 600 analisi (vedi 4.10).
- Dopo il risciacquo, inserire il piolo-coperchio nella piastra inferiore contenente il mezzo di recupero biofilm.
- Avvolgere il lato della piastra con la pellicola di paraffina, facendo attenzione a non ostacolare il fondo dei pozzetti perimetrali. Subito dopo aver terminato la piastra, collocarlo sul lettore di piastre e iniziare una lettura cinetica in un periodo di 24 ore, avviando il già fatto resazurina protocollo cinetica dal punto 4.1.
- Per quantificare la crescita di cellule planctoniche che possono o non possono verificarsi durante sfida, leggere la OD 600 dell'intera piastra inferiore sfida utilizzando un lettore di micropiastre. Seguire le istruzioni riportate al punto 3.8.
Nota: risospendere accuratamente il contenuto di ogni pozzetto come cellule spargimento fuori dal biofilm tendono a crescere in ciuffi sul fondo del pozzo. Eventuali bolle all'interno del pozzo saranno fortemente interferire con OD 600 letture e devono essere evitati o rimossi prima della lettura.
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Representative Results
Il saggio resazurina è abbastanza sensibile per rilevare in modo affidabile pochissime cellule vitali in grado di replicare in terreno privo di droga dopo la sfida. In questa metodologia, definiamo la concentrazione di biofilm sradicare minima come la concentrazione più bassa alla quale nessuna conversione resazurina è visto entro 24 ore. Il test si basa su resazurina molecole ossidanti presenti nelle cellule metabolicamente attivi che convertono il colore della tintura dal blu al rosa. conversione Dye è quindi un indicatore della crescita cellulare, e può essere quantificato utilizzando un lettore di fluorescenza lamiera microforata. In questo lavoro, neocuproina e Cu-neocuproina (neocuproina complessato con rame) sono stati testati per la loro attività verso biofilm associata S. aureus applicando una disposizione che si basa sulla Figura 1. I dati ottenuti durante l'esecuzione del protocollo sono una lettura OD 600 della piastra biofilm iniziazione, che serve come un controllo di qualità (dati non mostrati), Una lettura OD 600 del fondo piatto dopo sfida è stata completata (Figura 2A), ed una registrazione cinetica di conversione resazurina nel suo metabolita fluorescente resorufina della piastra di recupero (Figura 2B). Inoltre, l'immagine finale della piastra sfida può essere utilizzato per l'ispezione visiva di conversione resazurina (Figura 2C) se sì / no la valutazione della conversione resazurina è sufficiente ai fini dell'esperimento. In alternativa, se capacità di registrazione cinetici non sono disponibili o multipla piastre sono in parallelo, la fluorescenza può essere determinato dopo 24 ore da una singola lettura endpoint. Come si vede nella figura 2A, OD letture dalla piastra sfida indicano che neocuproina da sola non inibisce la crescita di cellule planctoniche; tuttavia, Cu-neocuproina inibisce la crescita a 1,3 micron, come previsto 10. Un modello simile è stato osservato dalla cinetica resazurina della piastra biofilm, indicandoche solo Cu-neocuproina è in grado di eliminare le cellule biofilm associata metabolicamente attive (Figura 2B).
Oltre a fornire concentrazioni eradicazione biofilm, il saggio cinetica fornisce informazioni sullo stato metabolico del biofilm che è indicativo del numero di batteri vitali. Quando si confrontano biofilm trattati con gentamicina a concentrazioni crescenti ai controlli non trattati, un ritardo di conversione resazurina è visibile (Figura 3). Per 2,5 ug / ml di gentamicina, c'è un ritardo 13 hr fino pozzo raggiunge la stessa conversione del resazurina come controllo non trattato. Questo ritardo probabile deriva da un ridotto numero di cellule vitali presenti nel biofilm trattati rispetto al non trattato.
Figura layout della piastra 1. Challenge. Example il layout della piastra sfida accogliere test parallelo di quattro composti in triplice copia a sei concentrazioni distinte. sono inclusi anche i controlli non trattati e sterilità. La progettazione del layout supporta conveniente la preparazione in piatto di diluizioni seriali utilizzando una pipetta multicanale. Le concentrazioni sono in micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Determinazione concentrazione minima eradicazione biofilm. Neocuproina e Cu-neocuproina sono stati testati per la potenziale eliminazione biofilm. (A) La OD 600 è stato preso dalla piastra sfida dopo la rimozione del peg-lid per quantificare la crescita delle cellule biofilm dissociato. Conversione (B) resazurina è stata monitorata cineticamente a INDIVIdoppi pozzi per un periodo di 24 ore. minigraphs individuali mostrano fluorescenza (RFU) nel corso del tempo (24 ore). La mancanza di conversione resazurina indica l'assenza di sopravvissuti. conversione resazurina indica la presenza di cellule vitali spargimento fuori dal biofilm e che crescono nel mezzo di recupero. (C) Se una lettura cinetica non è possibile o non è necessario, quindi un semplice sì / no risposta per la presenza di cellule vitali possono essere determinate visivamente dalla conversione colore del resazurina blu per il suo colore rosa, forma ridotta. Cliccate qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. saggio resazurina Kinetic rivela effetti inibitori sui batteri in un biofilm. Composti non può eliminare completamente le cellule biofilm incorporato, ma può ancora ridurre laviabilità ir. Questo può essere visto confrontando il ritardo di resazurina conversione dei pozzetti trattati con diverse concentrazioni di gentamicina. Wells che hanno un ritardo nella conversione resazurin indicano un ridotto numero di cellule vitali. Nero (solo media), Orange (0 mg / ml), Verde (0,3 mg / ml), Blu (0,6 mg / ml), Viola (2,5 mg / ml), e Gray (5 mg / ml). Dt si riferisce al differenziale momento della conversione resazurina esponenziale tra i campioni non trattati e gentamicina trattati al valore massimo la metà approssimativo di fluorescenza. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Qui, abbiamo descritto un saggio biofilm modificato per determinare l'attività di inibitori testati su S. biofilm aureus concentrandosi sullo stato metabolico delle cellule biofilm associato. Mentre il biofilm iniziazione descritto e procedure di contestazione per lo più imitate raccomandazioni del produttore, l'uso di resazurina colorante per rilevare e quantificare le cellule biofilm associato che sopravvivono una sfida inibitore 24 ore semplifica notevolmente la procedura raccomandata di recupero delle cellule (via bagnomaria sonification) e successiva enumerazione di cellule vitali mediante conteggio di CFU. Questa procedura consigliato dal produttore coinvolge almeno 5 fasi di manipolazione aggiuntivi, ognuno dei quali soggetto ad errori, lavoro intensivo, e poco pratico per automatizzare. Il vantaggio di semplificare la procedura di read-out del test piatto piolo aumenta la sua attrattiva per le operazioni ad alto rendimento e applicazioni.
Anche se un lungo protocollo in base al numero di passi, questo immissioe è piuttosto concettualmente semplice, con pochi passaggi critici. Più importante, la capacità di crescere ripetutamente biofilm della stessa qualità è essenziale per ottenere risultati riproducibili. Inoltre, si deve fare attenzione quando rimuovere o sostituire il peg-coperchio. Rivolgersi in qualsiasi punto con la parete di un pozzo potrebbe distruggere il biofilm, inclinazione risultati. Più così, un adeguato lavaggio è cruciale: il fallimento per rimuovere le cellule planctoniche in qualsiasi punto elimina ogni possibilità di misurare i batteri biofilm associati. Al contrario, però, il lavaggio non deve essere troppo rigorosi; fasi di lavaggio aggiuntive possono iniziare a rimuovere il biofilm, producendo risultati inconsistenti.
L'approccio piastra piolo ha molteplici usi, a seconda dei dati risultanti desiderato. Il test è descritto qui come una misurazione cinetica ricco di informazioni della conversione resazurina metabolica in un colorante fluorescente 11. Questa conversione è associato ad un cambiamento di colore dal blu al rosa (Figura 2C), che, in additialla lettura quantitativa di fluorescenza, permette un facile lettura qualitativa iniziale semplicemente osservando la conversione. Dopo aver rimosso il coperchio piolo, questa conversione può anche essere quantificato leggendo l'assorbanza a 600 nm dovrebbe fluorescenza capacità non essere disponibile. Sebbene la fluorescenza casualmente altipiani alla conversione massima colorante in ciascun pozzetto (con sopravvissuti), l'inizio della conversione colorante potrebbe essere utilizzato per stimare la popolazione superstite metabolicamente attiva rispetto al controllo non trattato (figura 3). Nelle nostre mani abbiamo trovato che ogni ~ 100 min ritardo nella comparsa della conversione resazurina corrisponde approssimativamente ad una riduzione di 10 volte il numero di cellule metabolicamente attive nel inoculo iniziando rispetto al controllo non trattato (come determinato in coltura cellulare planctonici serialmente diluito in incrementi di 10 volte con mezzo di recupero biofilm (dati non mostrati)).
Al di là di letture cinetiche, però, il piatto piolo modificatometodo è più suscettibile di progetti di monitoraggio dei farmaci ad alto throughput rispetto al protocollo originale. Misurando resazurin conversione come un endpoint invece di una cinetica, un utente può generare un'analisi binaria dei campioni per monitorare semplice attività di composti (cioè, conversione colorante / no conversione), che elimina la necessità per 24 ore in un lettore di piastre a fluorescenza , permettendo incubazioni convenzionali. Questa metodologia consente di determinare il biofilm minima sradicare concentrazione senza la necessità di sonicazione e placcatura. La lettura cinetica traccia anche lo stato metabolico del biofilm a seconda delle condizioni di trattamento e concentrazione dell'inibitore. Il ridotto numero di passaggi di manipolazione, una maggiore riproducibilità, e il metodo di lettura quantitativa (al contrario di placcatura ogni pozzetto singolarmente 12) consente agli utenti di schermo potenzialmente migliaia di composti al giorno in un'unica schermata concentrazione. In realtà, le piastre peg-stile sono stati precedentemente utilizzati in high-throughput drschermi UG per disperdenti biofilm, anche se resazurina (come quello usato qui) è una scelta molto più economico rispetto al reagente luciferasi proprietaria utilizzati 13.
Mentre un miglioramento generale tramite il protocollo produttore esistente, il test descritto qui non hanno alcune limitazioni si deve tenere a mente. Intrinsecamente, stiamo solo misurando la capacità metabolica delle cellule biofilm associati. Questo test non misura la massa di biofilm o in altro modo indebolire l'architettura o l'integrità biofilm. Tali effetti non sarebbero necessariamente essere rilevati. Metabolicamente inattivi, ma ancora vitale, persister cellule, che hanno dimostrato di esistere in biofilm 14,15 sarà anche inosservato. Inoltre, composti che inducono quiescenza senza effettivamente sterilizzazione di un biofilm potrebbe apparire erroneamente come falsi positivi, in relazione alla durata dello stato indotto. Gli indicatori di redditività sono in ultima analisi surrogati di più ferrea metodi di misurazione come la citometria di flusso o CFUenumerazione, e l'utente finale deve determinare quale metodo è appropriato. Infine, la conversione resazurina invoca NADH endogena, esaurimento di depositi intracellulari potrebbe essere dannoso per i batteri. Anche se non abbiamo osservato effetti deleteri contro S. aureus, altre specie di batteri potrebbe reagire in modo diverso. Gli utenti devono empiricamente testare e convalidare questo protocollo per affidabilità e riproducibilità dato organismi diversi e ambienti di laboratorio.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mueller-Hinton Medium | Oxoid | CM0405 | Follow recommendations of manufacturer |
| RPMI-medium | Corning | 17-105-CV | |
| CRPMI | Ref 9 | RPMI-1640 medium chelexed for 1 hr with Chelex 100 resin and then supplemented with 10% unchelexed RPMI-1640 | |
| Chelex 100 Resin | Bio Rad | 142-2822 | |
| MBEC-plates | Innovotech | 19111 | |
| Resazurin Sodium Salt | Sigma | R7017 | 800 µg/ml in DI water Filter sterile |
| Micro Plate Shaking Platform | Heidolph Titramax 1000 | ||
| Cytation 3 Plate Reader | Biotek | ||
| Gen5 software | Biotek | Recording and analysis of resazurin conversion | |
| Neocuproine | Sigma | N1501 | prepare 10 mM stock in 100% Ethanol, store at -80 ºC |
| Copper sulfate | Acros Organics | 7758-99-8 | prepare a 100 mM stock solution in water, store at 4 ºC |
| Cu-Neocuproine | Self-Made | Generated by mixing equal molarities of neocuproine and copper sulfate. Mix was diluted in CRPMI medium to desired concentration. | |
| Gentamicin | Sigma | G3632-1G |
References
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