Introduction
يمكن الميكروبات المسببة للأمراض تشكل الأغشية الحيوية في الجسم الحي مما يؤدي إلى الالتهابات المزمنة غير الحادة 1. العدوى المرتبطة بيوفيلم هو عامل خطر جدي من الإجراءات الطبية التي تنطوي على زرع أجسام غريبة (على سبيل المثال، استبدال العظام الاصطناعية، ثدي) أو تركيب أنابيب القصبة الهوائية أو القسطرة البولية 2. في هذه السياقات، العلاج المضاد للعدوى هو دائما تقريبا عند الضرورة نادرا ما يتم مسح العدوى القائم على بيوفيلم من تلقاء نفسها، حتى في الأفراد المناعة. المكورات العنقودية الذهبية هي واحدة من مسببات الأمراض الأكثر لوحظ في كثير من الأحيان المتورطين في مضاعفات بيوفيلم التي تحدث أثناء استخدام الأجهزة الطبية الغازية 3.
وللأسف، فإن طبيعة الأغشية الحيوية بمثابة حاجز وقائي يجعلها أكثر مقاومة للعلاج من خلايا العوالق 1،4، وتقييم الفعالية السريرية تنبأ هو جزء هام من كلا الأوليتطوير العقاقير وكذلك مراقبة مقاومة العقاقير. هناك اعتراف متزايد أن الظروف المختبرية، وتركز على ثقافات العوالق، قد لا تمثل بأمانة المرض في العالم الحقيقي 5. مما زاد من تفاقم المشكلة، وتكرار الظواهر بيوفيلم أمر صعب، ونماذج بيوفيلم القائمة ومملة ويعانون من ارتفاع المشترك بين وداخل فحص 6 التباين. وهكذا، كثير من الباحثين، من خلال ضرورة، افتراضية المقايسات خلية العوالق قابلية المخدرات، وبالتالي يحتمل أن إهمال جانب هام من جوانب الفوعة البكتيرية والأمراض.
نحن هنا تصف البروتوكول لمعايرة البكتيريا، وتحديدا س. الذهبية، في الأغشية الحيوية نمت قبل استخدام مقرها 7،8 نظام بيوفيلم جيدا 96. بينما بروتوكول لتشكيل بيوفيلم والتحدي يتبع أساسا على توصية الصانع، ونحن تقديم منهجية غنية بالمعلومات بديلة لقياس جدوى biofILM بعد التحدي. لفترة وجيزة، والبكتيريا يتم تربيتها في لوحة الربط، حيث تشكل الأغشية الحيوية على أوتاد جاحظ تعلق على غطاء لوحة ل. بعد تشكيل بيوفيلم، وانخفض أوتاد بلطف في آبار لوحة جديدة مليئة PBS لإزالة الخلايا العوالق. و-غطاء الوتد، مع الأغشية الحيوية المرفقة، يتم نقلها إلى لوحة التحدي الجديدة، التي تحتوي على تركيزات مختلفة من المضادات الحيوية لأن يعاير. بعد الحضانة الثانية، تتم إزالة الأغطية مرة أخرى، وغسلها، ونقله إلى لوحة الانتعاش التي تحتوي على ريسازورين صبغ، حيث يخضع لعملية حضانة النهائية. تحويل ريسازورين يمكن تسجيل حركيا أو اعتباره قراءة نقطة النهاية بعد فترة نقاهة محددة. هذا الأسلوب القائم على صبغ قياس قابلية الأغشية الحيوية يختلف اختلافا كبيرا من كفو (وحدات تشكيل مستعمرة) مملة منهجية قائمة على العد هو موضح في البروتوكول الأصلي 7. OD 600 القياسات من لوحة التحدي المخدرات وريسازورين حركية تحويل بمثابة قابلية القراءةعموميات من العوالق وبيوفيلم الخلايا، على التوالي، وتقدم موثوق بها، فحص سريع، وبسيط من الناحية الفنية الغنية بالمعلومات من أجل البقاء بيوفيلم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. بيوفيلم بدء
- تنمو ثقافة إنتاج بيوفيلم الكائن في وسط غني بالمغذيات. تطعيم المكورات العنقودية الذهبية سلالة نيومان في 10 مل من مولر هينتون المتوسطة من المخزون الجلسرين. أداء جميع الأعمال التي تنطوي على التعامل مع س. الذهبية مع قفازات وداخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية.
- احتضان لمدة 16 ساعة على 37 درجة مئوية على شاكر دوارة (100-200 دورة في الدقيقة).
- تحديد OD 600 من ثقافة باستخدام مقياس الطيف الضوئي وكفيت القياسية (طول المسار: 1CM).
- حساب حجم (V) الثقافة اللازمة لإعداد 20 مل من اللقاح مع OD 600 (اللقاح) من 0.1 في chelexed سائل الإعلام معهد الحديقة التذكارية روزويل (CRPMI) 9 باستخدام المعادلة التالية: [V = 20 مل * 0.1 / OD 600 (ثقافة )]
ملاحظة: مرجع 9 تفاصيل عن إعداد CRPMI.- إضافة الحجم ثقافة احتساب (من فوق) لأنبوب الطرد المركزي والخلايا بيليه عن طريق الدوران لمدة 1 دقيقة في 10000 ز س. لاستعداداتإعادة اللقاح بيوفيلم، نضح قضى متوسط النمو و resuspend بيليه الخلية في 20 مل CRPMI.
- صب اللقاح في خزان 25 مل.
- بعناية إزالة الغطاء من معقمة 96-جيدا لوحة الربط عن طريق سحبها على التوالي.
ملاحظة: يجب الحرص على عدم تلويث أوتاد تتدلى من الغطاء. غطاء يمكن وضعها رأسا على عقب على سطح نظيف داخل مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية. - باستخدام 200 ميكرولتر ماصة متعدد القنوات، إضافة 125 ميكرولتر اللقاح إلى كل بئر من الصفوف ألف إلى زاي من أسفل لوحة.
- ملء المتوسطة CRPMI 125 ميكرولتر العقيمة في كل بئر من الصف H كعنصر تحكم العقم.
- اتخاذ الربط بين الغطاء والاحتفاظ بها فوق الجزء السفلي لوحة مع أوتاد التي تواجه هبوطا. بعناية محاذاة أوتاد الفردية مع الآبار الخاصة بها. تجنب الاتصال الجسدي بين لوحة وأوتاد. مرة واحدة الانحياز، وانخفاض الغطاء بعناية أسفل. تجنب اختلالات كما تعديلات أجريت بعد أوتاد لمست لوحة أسفل قد تابعضوابط العقم يؤمين في H. التوالي
- ختم غطاء لوحة مع فيلم البارافين لمنع التبخر وضعها في كيس من البلاستيك قابل للغلق، وختم بإحكام. الحفاظ على حجم الهواء في الكيس عند أدنى مستوى ممكن لتقليل التبخر.
- احتضان دون أن تهتز عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة في 5٪ CO 2 الحاضنة.
ملاحظة: لقد تم 48 ساعة من النمو الأمثل لس. الذهبية، ولكن سوف تختلف استنادا إلى كائن المستخدمة.
ملاحظة: على الرغم من الحضانة ثابتة هي نقطة انطلاق جيدة لتحسين الفحص، والهز برفق في 150 دورة في الدقيقة على شاكر صفيحة هو الاختلاف الممكن أن قد يعزز تشكيل بيوفيلم من بعض س. العنقودية الذهبية المعزولة.
2. إعداد لوحة بيوفيلم التحدي
- في يوم التحدي بيوفيلم تأخذ لوحة 96-جيدا الطازجة وإضافة 100 ميكرولتر من CRPMI، معايرتها إلى RT، إلى كل بئر من الصفوف B إلى H. لتجنب نتائج غير متناسقة، واستخدام لوحة 96-جيدا التي يمكن أن تعقد 200 ميكرولتروسائل الإعلام عندما أوتاد هي في الداخل، وتتميز الآبار ذات أبعاد مماثلة لتلك التي من لوحة بيوفيلم بدء.
- تمييع تصل إلى 4 مركبات اختبار على حدة في 1.0 مل من CRPMI إلى 2x التركيز النهائي المطلوب، وذلك لحساب لتخفيف النهائي في الخطوة 2.7.
ملاحظة: نقطة انطلاق جيدة 8 أضعاف أعلى تركيز مثبط للخلايا العوالق. - إضافة 200 ميكرولتر من مركب 1 في الآبار A1 إلى A3، مجمع 2 في الآبار A4 إلى A6، مركب 3 في الآبار A7 إلى A9 ومجمع 4 في الآبار A10 إلى A12.
- مخفف تسلسليا المركبات الاختبار باستخدام ماصة الأقنية ونقل 100 ميكرولتر من الصف ألف إلى صف باء والمزيج.
- على هذا النحو، ومواصلة نقل 100 ميكرولتر جيدا جيدا. خلط بعد كل عملية تحويل ووقف في الصف F.
- بعد الاختلاط، وطرد 100 ميكرولتر من الصف F في حاوية النفايات. لا نقل أي السائل إلى صفوف G و H.
- إضافة 100 ميكرولتر من CRPMI إلى كل بئر من لوحة باستخدام ماصة الأقنية لتبرزي حجم إلى 200 ميكرولتر. انظر الشكل رقم 1 لتخطيط لوحة النهائي.
3. بيوفيلم التحدي
- إضافة 200 ميكرولتر من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) إلى معقمة لوحة 96-جيدا الطازجة التي تتميز الآبار ذات أبعاد مماثلة لتلك التي من لوحة بيوفيلم بدء.
- إزالة كيس من البلاستيك وفيلم البارافين من المحتضنة لوحة بيوفيلم بدء.
- رفع الغطاء على التوالي. تجنب الاتصال بين أوتاد وأسفل لوحة لأن ذلك قد يؤدي إلى تلف بيوفيلم. حافظ على الجزء السفلي لتحليلها لاحقا OD 600 (انظر 3.8).
- شطف خلايا العوالق عن طريق وضع الربط بين غطاء على لوحة تحتوي على برنامج تلفزيوني (من الخطوة 3.1). غمر أوتاد لمدة 5 ثوان، ورفع من برنامج تلفزيوني، ويغرق مرة أخرى، والحرص على عدم ضرب أوتاد ضد الجانبين أيضا.
- وضع تشطف الربط بين غطاء في لوحة التحدي. تجنب الاتصال غير الضرورية بين أوتاد وأسفل اللوحة حيث سيؤدي ذلك إلى تلف بيوفيلم يؤدي إلىنتائج غير متناسقة.
- لوحة ختم مع فيلم البارافين وتضع في كيس من البلاستيك قابل للغلق كما هو موضح في الخطوة 1.10.
- احتضان لوحة دون أن تهتز لمدة 24 ساعة على 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة.
- خذ الجزء السفلي من لوحة بيوفيلم بدء من 3.3. Resuspend والبكتيريا في كل بئر باستخدام ماصة الأقنية وقياس OD 600 مع قارئ صفيحة مناسبة لتأكيد النمو التي تحدث في جميع الآبار ولكن الضوابط العقم في H. التوالي
4. بيوفيلم تحديد
- استخدام قارئ لوحة مجهزة غرفة الحضانة وقادرة على اتخاذ قراءات مضان الحركية للكشف عن ريسازورين التحويل. انشاء 24 ساعة قياس مضان الحركي باستخدام الإثارة 530 نانومتر و 590 نانومتر الانبعاثات.
- ضبط درجة حرارة الغرفة إلى 37 درجة مئوية، ويكون لوحة تقرأ كل 20 دقيقة. تعيين قارئ لوحة لقياس من الجزء السفلي من لوحة وفقا لinstruc الشركة المصنعةستعقد.
- إعداد لوحة غسل بإضافة 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني مع ماصة الأقنية إلى العقيمة 96 لوحة جيدا.
- إعداد بيوفيلم الانتعاش المتوسطة وذلك بإضافة 400 ميكرولتر من 0.8 ملغ / مل ريسازورين حل الأسهم إلى 20 مل من CRPMI المتوسطة إلى تركيز النهائي من 16 ميكروغرام / مل ريسازورين.
ملاحظة: ريسازورين هو أنسجة الجلد المعروفة. استخدام معطف المختبر، نظارات البداية، والقفازات أثناء التعامل مع. وقد استخدم CRPMI باعتبارها وسائط استرداد بيوفيلم لأنه يوفر أدنى إشارة الخلفية، ولكن يمكن استبدال وسائل الاعلام مولر هينتون إذا كان ذلك مناسبا. - إضافة 150 ميكرولتر من بيوفيلم المتوسطة الانتعاش مع ماصة الأقنية إلى كل بئر من لوحة 96-جيدا جديدة.
- لوحة نقل تحد من الحاضنة إلى خزانة السلامة البيولوجية وبعناية إزالة كيس من البلاستيك وختم الفيلم.
- إزالة الربط بين غطاء من لوحة التحدي وشطف خلايا العوالق في برنامج تلفزيوني كما هو موضح في 3.4. الحفاظ على الجزء السفلي من لوحة تحديا للOD لاحق 600 آناتحلل (انظر 4.10).
- بعد الشطف، وضع الربط بين الغطاء في الجزء السفلي لوحة تحتوي على المتوسطة انتعاش بيوفيلم.
- التفاف الجانب من لوحة مع فيلم البارافين، والحرص على عدم عرقلة الجزء السفلي من الآبار المحيطة. مباشرة بعد اختتام لوحة، ووضعه على قارئ لوحة وبدء القراءة الحركية على مدى فترة 24 ساعة قبل بدء التي سبق ريسازورين بروتوكول الحركية من الخطوة 4.1.
- لقياس نمو خلايا العوالق التي قد أو قد لا يحدث خلال التحدي، وقراءة OD 600 من كامل أسفل لوحة التحدي باستخدام قارئ لوحة الجزئي. اتبع الإرشادات الواردة في الخطوة 3.8.
ملاحظة: و resuspend بعناية محتوى كل كذلك خلايا ينفضون بيوفيلم تميل إلى النمو في كتل في أسفل البئر. وأي فقاعات داخل البئر تتداخل بقوة مع OD 600 قراءات ويجب تجنبها أو إزالتها قبل القراءة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
فحص ريسازورين حساسة بما يكفي للكشف موثوق عدد قليل جدا من خلايا قابلة للحياة قادرة على تكرار في مجال مكافحة المخدرات المتوسطة حرة بعد التحدي. في هذه المنهجية، نحدد الحد الأدنى بيوفيلم القضاء على التركيز كما أدنى تركيز الذي يعتبر أي تحويل ريسازورين خلال 24 ساعة. ويعتمد الفحص ريسازورين على جزيئات الأكسدة الموجودة في خلايا نشطة عملية الأيض التي تحول لون صبغة من اللون الأزرق إلى اللون الوردي. تحويل الصبغة وبالتالي مؤشرا على نمو الخلايا، ويمكن أن يكون كميا باستخدام قارئ لوحة الصغير الفلورسنت. في هذه الورقة، تم اختبار neocuproine والنحاس وneocuproine (المعقد neocuproine مع النحاس) لنشاطهم نحو بيوفيلم المرتبطة س. الذهبية تطبيق التخطيط الذي يقوم على أساس الشكل 1، والبيانات التي تم الحصول عليها أثناء تنفيذ البروتوكول هي القراءة OD 600 من لوحة بيوفيلم بدء، والتي هي بمثابة مراقبة الجودة (لا تظهر البيانات)، وقد تم الانتهاء من القراءة OD 600 من أسفل لوحة بعد التحدي (الشكل 2A)، وتسجيل الحركية التحويل ريسازورين إلى resorufin في المستقلب فلوري من لوحة الاسترداد (الشكل 2B). وعلاوة على ذلك، صورة نقطة النهاية لوحة التحدي يمكن أن تستخدم في الفحص البصري من تحويل ريسازورين (الشكل 2C) إذا كان نعم / لا تقييم تحويل ريسازورين كافية لغرض التجربة. بدلا من ذلك، إذا قدرات تسجيل الحركية غير متوفرة أو متعددة يتم تشغيل لوحات في موازاة ذلك، يمكن تحديد مضان بعد 24 ساعة من قبل نقطة النهاية قراءة واحدة. كما رأينا في الشكل 2A، قراءات OD من لوحة التحدي تشير إلى أن neocuproine وحدها لا تمنع نمو خلايا العوالق. ومع ذلك، النحاس وneocuproine يثبط نمو عند 1.3 ميكرومتر، كما هو متوقع 10. لوحظ نمط مماثل من الحركية ريسازورين من لوحة بيوفيلم، مشيرا إلىأن النحاس وneocuproine فقط قادرة على القضاء على الخلايا المرتبطة بيوفيلم عملية الأيض نشطة (الشكل 2B).
وبالإضافة إلى توفير تركيزات القضاء بيوفيلم، يوفر الفحص الحركي معلومات عن حالة التمثيل الغذائي في بيوفيلم الذي يدل على عدد من البكتيريا قادرة على البقاء. عند مقارنة الأغشية الحيوية تعامل مع الجنتاميسين في زيادة تركيزات للضوابط غير المعالجة، وتأخر التحويل ريسازورين يمكن رؤية (الشكل 3). 2.5 ميكروغرام / مل الجنتاميسين، هناك تأخير 13 ساعة حتى تصل إلى البئر تحويل نفسه من ريسازورين باعتبارها ضابطة. هذا التأخر على الأرجح يأتي من انخفاض عدد خلايا قابلة للحياة موجودة في بيوفيلم تعامل مقارنة دون علاج.
الشكل 1. التحدي تخطيط لوحة. الامثلهتخطيط (ه) من لوحة التحدي استيعاب اختبار مواز من أربعة مركبات في ثلاث نسخ في ستة تركيزات مختلفة. كما تشمل الضوابط غير المعالجة والعقم. تصميم تخطيط يدعم مريحة إعداد في لوحة من التخفيفات المسلسل باستخدام الماصة متعدد القنوات. التركيزات في ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تم اختبار الشكل 2. تحديد الحد الأدنى تركيز القضاء بيوفيلم. Neocuproine والنحاس وneocuproine عن إمكانية القضاء على بيوفيلم. وقد اتخذ (أ) OD 600 من لوحة التحدي بعد إزالة الربط بين غطاء لقياس نمو الخلايا بيوفيلم فصلها. تم رصد التحويل (B) ريسازورين حركيا في indiviآبار مزدوجة على مدى 24 ساعة. عرض minigraphs فرد مضان (RFU) مع مرور الوقت (24 ساعة). عدم وجود تحويل ريسازورين يشير إلى عدم وجود ناجين. يشير تحويل ريسازورين وجود خلايا قابلة للحياة ينفضون بيوفيلم ونموا في المتوسط الانتعاش. (ج) إذا قراءات الحركية غير ممكن أو عدم الحاجة إليها، ثم بنعم / لا جواب عن وجود خلايا قابلة للحياة ويمكن تحديد بصريا من تحويل لون ريسازورين الأزرق إلى اللون الوردي، وانخفاض شكله. الرجاء النقر هنا ل عرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. الحركية ريسازورين فحص يكشف الآثار المثبطة على البكتيريا في بيوفيلم. المركبات قد لا القضاء تماما خلايا بيوفيلم جزءا لا يتجزأ، ولكن لا يزال يقلل منالجدوى الأشعة تحت الحمراء. ويمكن ملاحظة ذلك عند مقارنة تأخير ريسازورين تحويل الآبار تعامل مع تركيزات مختلفة من الجنتاميسين. الآبار التي لديها تأخير في تحويل ريسازورين تشير إلى وجود عدد أقل من خلايا قابلة للحياة. أسود (وسائل الاعلام فقط)، أورانج (0 ميكروغرام / مل)، الأخضر (0.3 ميكروغرام / مل)، الأزرق (0.6 ميكروغرام / مل)، البنفسجي (2.5 ميكروغرام / مل)، ورمادي (5 ميكروغرام / مل). يشير Δt إلى الفرق وقت التحويل ريسازورين الهائل بين العينات غير المعالجة والجنتاميسين العلاج في النصف تقريبي قيمة مضان القصوى. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا، التي وصفناها فحص بيوفيلم المعدلة لتحديد نشاط مثبطات اختبارها على س. الأغشية الحيوية الذهبية التركيز على الدولة التمثيل الغذائي للخلايا بيوفيلم المرتبطة بها. في حين الشروع بيوفيلم وصف وإجراءات تحد توصيات الشركة معظمها تحاكي، واستخدام ريسازورين الصبغة لكشف وتحديد الخلايا المرتبطة بيوفيلم التي تعيش تحديا المانع 24 ساعة بشكل كبير على تبسيط الإجراءات الموصى بها من الانتعاش الخلية (عبر صوتنة حمام مائي) وتعداد لاحق من خلايا قابلة للحياة عن طريق فرز CFUs. ويشمل هذا الإجراء الموصى بها من الشركة المصنعة لا يقل عن 5 خطوات التلاعب إضافية، كل منهم عرضة للخطأ، وعمالة كثيفة، وغير عملي لأتمتة. ميزة تبسيط إجراءات تلا مقايسة لوحة ربط زيادة جاذبيتها للعمليات الإنتاجية العالية والتطبيقات.
على الرغم من بروتوكول مطول من قبل عدد من الخطوات، وهذا الاجراءه هو بالأحرى بسيط من الناحية النظرية، مع عدد قليل من الخطوات الحاسمة. والأهم، والقدرة على النمو بشكل متكرر الأغشية الحيوية من نفس النوعية ضرورية للحصول على نتائج يمكن استنساخه. وعلاوة على ذلك، لا بد من توخي الحذر كلما إزالة أو استبدال الربط بين الغطاء. الاتصال في أي لحظة مع جدار البئر سيربك بيوفيلم، انحراف النتائج. أكثر من ذلك، والغسيل المناسب أمر حاسم: عدم إزالة خلايا العوالق في أي لحظة يزيل أي القدرة على قياس البكتيريا المرتبطة بيوفيلم. على العكس من ذلك، على الرغم من أن لا يكون غسل صارم جدا. قد تبدأ خطوات غسل إضافية إزالة بيوفيلم، وتنتج نتائج متضاربة.
النهج لوحة ربط له استخدامات متعددة، اعتمادا على البيانات الناتجة المطلوب. يوصف فحص هنا بمثابة قياس حركية غنية بالمعلومات من تحويل ريسازورين الأيض في صبغة الفلورسنت 11. ويرتبط هذا التحول مع تحول من اللون الأزرق إلى اللون الوردي (الشكل 2C)، والتي، في additiإلى قراءة مضان الكمية، يسمح لقراءات النوعية الأولية سهلة ببساطة من خلال مراقبة التحويل. بعد إزالة الغطاء الربط، وهذا يمكن تحويل أيضا يكون كميا من خلال قراءة الامتصاصية في 600 نانومتر يجب مضان قدرات لا تكون متاحة. على الرغم من أن مضان الهضاب في نهاية المطاف على أقصى تحويل الصبغة في كل بئر (مع الناجين)، بداية من تحويل صبغة يمكن أن تستخدم لتقدير عدد السكان الناجين عملية الأيض نشطة بالنسبة للضابطة (الشكل 3). في أيدينا وجدنا أن كل تأخير دقيقة ~ 100 في بداية تحويل ريسازورين يتوافق مع ما يقرب انخفاضا بنسبة 10 أضعاف في عدد الخلايا النشطة في عملية الأيض في اللقاح بدءا نسبة إلى السيطرة غير المعالجة (كما هو محدد في زراعة الخلايا العوالق متسلسل المخفف بزيادات 10 أضعاف باستخدام المتوسطة انتعاش بيوفيلم (لا تظهر البيانات)).
ما وراء قراءات الحركية، على الرغم من لوحة الربط تعديلالأسلوب هو أكثر قابلية للمشاريع شاشة المخدرات الإنتاجية العالية من البروتوكول الأصلي. عن طريق قياس ريسازورين تحويل بمثابة نقطة النهاية بدلا من الحركية، ويمكن للمستخدم إنشاء تحليل ثنائي من العينات لتتبع نشاط بسيط من مركبات (أي صبغة تحويل / لا يوجد تحويل)، الذي يزيل الحاجة لمدة 24 ساعة في قارئ لوحة مضان ، والسماح حضانات التقليدية. هذه المنهجية تسمح لتحديد الحد الأدنى بيوفيلم القضاء على تركيز دون الحاجة إلى صوتنة والطلاء. كما يتابع القراءة الحركية الدولة التمثيل الغذائي في بيوفيلم تبعا لحالة العلاج وتركيز مثبط. انخفاض عدد الخطوات التلاعب، وزيادة التكاثر، وطريقة قراءات الكمي (بدلا من الطلاء كل بئر على حدة 12) يسمح للمستخدمين شاشة يحتمل آلاف المركبات يوميا في شاشة تركيز واحدة. في الواقع، لوحات على غرار الربط استخدمت سابقا في الدكتور الإنتاجية العاليةشاشات ميكروغرام عن المشتتات بيوفيلم، على الرغم من ريسازورين (كما تستخدم هنا) هو خيار أكثر اقتصادا بكثير من كاشف وسيفيراز الملكية تستخدم 13.
في حين أن التحسن العام عبر بروتوكول الشركة المصنعة القائمة، وفحص واردة هنا لديه بعض القيود واحد يجب أن نأخذ في الاعتبار. بطبيعتها، نحن فقط قياس قدرة التمثيل الغذائي للخلايا المرتبطة بيوفيلم. هذا الاختبار لا يقيس كتلة بيوفيلم أو إضعاف بنية بيوفيلم أو النزاهة. قد لا تكون بالضرورة الكشف عن تلك الآثار. عملية الأيض نشطة، ولكن لا تزال قابلة للحياة، persister الخلايا، والتي ثبت وجودها في الأغشية الحيوية 14،15 كما سيتم كشفها. وعلاوة على ذلك، والمركبات التي تحفز على هدوء دون تعقيم الواقع بيوفيلم قد تظهر خطأ ايجابيات كما كاذبة، اعتمادا على طول الولاية التي يسببها. مؤشرات الجدوى هي الامهات البديلات في نهاية المطاف لمزيد من وسائل قياس حديدية مثل التدفق الخلوي أو كفوالتعداد، والمستخدم النهائي يجب تحديد الأسلوب الذي هو مناسب. وأخيرا، ويعتمد تحويل ريسازورين على NADH الذاتية، ونضوب مخازن داخل الخلايا يمكن أن يكون ضارا للبكتيريا. في حين أننا لم احظ آثار ضارة ضد س. الذهبية، والأنواع البكتيرية الأخرى قد تتفاعل بشكل مختلف. يجب على المستخدمين تجريبيا اختبار والتحقق من صحة هذا البروتوكول للموثوقية واستنساخ الكائنات نظرا متفاوتة والبيئات المختبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mueller-Hinton Medium | Oxoid | CM0405 | Follow recommendations of manufacturer |
| RPMI-medium | Corning | 17-105-CV | |
| CRPMI | Ref 9 | RPMI-1640 medium chelexed for 1 hr with Chelex 100 resin and then supplemented with 10% unchelexed RPMI-1640 | |
| Chelex 100 Resin | Bio Rad | 142-2822 | |
| MBEC-plates | Innovotech | 19111 | |
| Resazurin Sodium Salt | Sigma | R7017 | 800 µg/ml in DI water Filter sterile |
| Micro Plate Shaking Platform | Heidolph Titramax 1000 | ||
| Cytation 3 Plate Reader | Biotek | ||
| Gen5 software | Biotek | Recording and analysis of resazurin conversion | |
| Neocuproine | Sigma | N1501 | prepare 10 mM stock in 100% Ethanol, store at -80 ºC |
| Copper sulfate | Acros Organics | 7758-99-8 | prepare a 100 mM stock solution in water, store at 4 ºC |
| Cu-Neocuproine | Self-Made | Generated by mixing equal molarities of neocuproine and copper sulfate. Mix was diluted in CRPMI medium to desired concentration. | |
| Gentamicin | Sigma | G3632-1G |
References
- Bjarnsholt, T., Ciofu, O., Molin, S., Givskov, M., Hoiby, N. Applying insights from biofilm biology to drug development - can a new approach be developed. Nat Rev Drug Discov. 12, 791-808 (2013).
- Song, Z., et al. Prosthesis infections after orthopedic joint replacement: the possible role of bacterial biofilms. Orthop Rev (Pavia). 5, 65-71 (2013).
- Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases). Nat Rev Microbiol. 2, 95-108 (2004).
- Bordi, C., de Bentzmann, S. Hacking into bacterial biofilms: a new therapeutic challenge. Ann Intensive Care. 1, 19 (2011).
- Fux, C. A., Shirtliff, M., Stoodley, P., Costerton, J. W. Can laboratory reference strains mirror 'real-world' pathogenesis? Trends Microbiol. 13, 58-63 (2005).
- Kwasny, S. M., Opperman, T. J. Static biofilm cultures of Gram-positive pathogens grown in a microtiter format used for anti-biofilm drug discovery. Curr Protoc Pharmacol. Chapter 13, Unit 13A 18 (2010).
- Ceri, H., et al. The MBEC Assay System: multiple equivalent biofilms for antibiotic and biocide susceptibility testing. Methods Enzymol. 337, 377-385 (2001).
- Ceri, H., et al. The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms. J Clinical Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).
- Baker, J., et al. Copper stress induces a global stress response in Staphylococcus aureus and represses sae and agr expression and biofilm formation. Appl Environ Microbiol. 76, 150-160 (2010).
- Haeili, M., et al. Copper complexation screen reveals compounds with potent antibiotic properties against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother. 58, 3727-3736 (2014).
- O'Brien, J., Wilson, I., Orton, T., Pognan, F. Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity. Eur J Biochem. 267, 5421-5426 (2000).
- Mah, T. F. Establishing the minimal bactericidal concentration of an antimicrobial agent for planktonic cells (MBC-P) and biofilm cells (MBC-B). J Vis Exp. (83), e50854 (2014).
- Junker, L. M., Clardy, J. High-throughput screens for small-molecule inhibitors of Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Antimicrob Agents Chemother. 51, 3582-3590 (2007).
- Shah, D., et al. Persisters: a distinct physiological state of E. coli. BMC Microbiol. 6, 53 (2006).
- Lewis, K. Riddle of biofilm resistance. Antimicrob Agents Chemother. 45, 999-1007 (2001).
