Introduction
Patogene mikroorganismer kan danne biofilm in vivo fører til ikke-akutte kroniske infektioner 1. Biofilm-associeret infektion er en alvorlig risikofaktor for medicinske procedurer, der involverer implantation af fremmedlegemer (f.eks kunstige ben udskiftninger brystimplantater) eller installation af luftrør rør eller urinkatetre 2. I disse sammenhænge, antiinfektiva er næsten altid nødvendigt som biofilm-baserede infektioner sjældent blokerede på egen hånd, selv i immunkompetente individer. Staphylococcus aureus er en af de hyppigst forekommende patogener impliceret i biofilm-relaterede komplikationer der opstår under brug af invasive medicinsk udstyr 3.
Desværre er den meget karakter af biofilm som en beskyttende barriere gør dem mere modstandsdygtige over for behandling end planktoniske celler 1,4, og evaluering af forudsagt klinisk effekt er en kritisk del af både indledendeudvikling af lægemidler samt resistens overvågning. Der er stigende erkendelse af, at laboratorieforhold, der fokuserer på planktoniske kulturer, ikke kan trofast repræsentere virkelige verden sygdom 5. Yderligere forværrer problemet, replikering af biofilm fænotyper er vanskelig, og eksisterende biofilm modeller er kedelig og lider høj inter- og intra-assay 6 variabilitet. Således mange forskere gennem nødvendighed, standard til planktoniske celle analyser af narkotika modtagelighed, derved potentielt forsømmer et vigtigt aspekt af bakteriel virulens og sygdom.
Her beskriver vi protokol for analyse bakterier, specielt S. aureus, i præ-dyrket biofilm anvendelse af en 96-brønd baseret biofilm systemet 7,8. Mens protokollen for biofilm dannelse og udfordring følger væsentlige fabrikantens anbefalinger, præsenterer vi en alternativ information-rige metode til kvantificering af levedygtigheden af biofilm efter udfordring. Kort beskrevet bakterier dyrkes i stangen plade, hvor biofilm dannes på de fremspringende tappe fastgjort til pladen låg. Efter biofilmdannelse, er tappene forsigtigt dyppet i brønde i en frisk plade fyldt med PBS for at fjerne planktoniske celler. PEG-låg, med biofilm fastgjort, overføres til en ny udfordring pladen, som indeholdt forskellige koncentrationer af antibiotika, der skal analyseres. Efter en anden inkubation låg fjernes igen, vasket og overført til en genopretning plade indeholdende Resazurinfarvestof, hvor de underkastes en afsluttende inkubation. Resazurin konvertering kan optages kinetisk eller taget som et endepunkt læsning efter en defineret restitutionsperiode. Denne farvestofbaseret metode til kvantificering af levedygtigheden af biofilm adskiller sig væsentligt fra de kedelige CFU (kolonidannende enheder) tælle-metode, der er beskrevet i den oprindelige protokol 7. OD 600 målinger af lægemidlet udfordring plade og tilsætte Resazurin konvertering kinetik tjene som levedygtighed læstouts af planktoniske og biofilm celler henholdsvis tilbyder en hurtig, pålidelig, indholdsrigt og teknisk enkel analyse til biofilm overlevelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Biofilm Indledning
- Dyrk en kultur af biofilm producerende organisme i et næringsstof rigt medium. Inokulere Staphylococcus aureus stamme Newman i 10 ml Mueller-Hinton-medium fra et glycerol-lager. Udfør alt arbejde, der involverer håndtering af S. aureus med handsker og inden for en biosikkerhed kabinet.
- Der inkuberes i 16 timer ved 37 ° C på en roterende ryster (100-200 rpm).
- Bestemme OD600 af kulturen under anvendelse af et spektrofotometer og en standard kuvette (vejlængde: 1 cm).
- Beregn volumen (V), i kultur nødvendige for at forberede 20 ml inokulum med OD600 (inokulum) på 0,1 i chelexed Roswell Park Memorial Institute medium (cRPMI) 9 under anvendelse af formlen: [V = 20 ml * 0.1 / OD600 (kultur )]
Bemærk: Der henvises 9 indeholder oplysninger om cRPMI forberedelse.- Tilsæt beregnede kulturvolumen (fra ovenfor) til et centrifugerør og pellet celler ved centrifugering i 1 min ved 10.000 x g. Til prepare biofilm inokulum, aspireres det brugte vækstmedium og resuspender cellepelleten i 20 ml cRPMI.
- Hæld inokulum i en 25 ml reservoir.
- Fjern forsigtigt låget fra en steril 96-brønd pind plade ved at trække den lige op.
Bemærk: Der skal udvises forsigtighed for ikke at forurene pløkker hængende ned fra låget. Låget kan placeres på hovedet på en ren overflade i et biosikkerhed kabinet. - Ved hjælp af en 200 pi multi-kanal pipette tilsættes 125 pi inokulum til hver brønd i række A til G i bundpladen.
- Fyld 125 pi sterilt cRPMI mediet i hver brønd af række H som et sterilitet kontrol.
- Tag den pind-låget og hold det over pladen bunden med pinde nedad. Ret omhyggeligt de enkelte pinde med deres respektive brønde. Undgå fysisk kontakt mellem pladen og pinde. Når justeret, sænke låget forsigtigt ned. Undgå skævheder som tilpasninger udføres efter stifterne har rørt bundpladen kan contaminere sterilitet kontrol i rækken H.
- Forsegle låget til pladen med paraffin film for at forhindre fordampning og i en forseglet plastikpose, forsegling stramt. Holde luften volumen i posen så lavt som muligt for at minimere fordampning.
- Inkuber uden omrystning ved 37 ° C i 48 timer i en 5% CO2-inkubator.
Bemærk: 48 timers vækst har været optimale for S. aureus, men vil variere baseret på den anvendte organisme.
Bemærk: Selvom statisk inkubation er et godt udgangspunkt for at optimere analysen, forsigtigt rystning ved 150 rpm på en mikropladeryster er en mulig variation, der kan forbedre biofilmdannelse af nogle S. aureus-isolater.
2. Forberedelse af biofilm Challenge Plate
- På dagen for den biofilm udfordring tage en frisk plade med 96 brønde, og der tilsættes 100 pi cRPMI, ækvilibreret til stuetemperatur til hver brønd i række B til H. For at undgå inkonsistente resultater, anvender en 96-brønds plade, der kan rumme 200 piaf medier, når tappene er inde, og har brønde med dimensioner er identiske med dem af biofilmen indledning plade.
- Fortynd op til 4 testforbindelser separat i 1,0 ml cRPMI til 2x den ønskede slutkoncentration, for at udgøre en endelig fortynding i trin 2.7.
Bemærk: Et godt udgangspunkt er 8 gange over den hæmmende koncentration af planktoniske celler. - Tilføj 200 pi forbindelsen 1 i brønde A1 til A3, forbindelse 2 i Wells A4 til A6, forbindelse 3 i Wells A7 til A9 og forbindelsen 4 i brønde A10 til A12.
- Serielt fortynde prøveforbindelserne ved hjælp af en multikanalpipette og overføre 100 pi fra række A til række B og blandes.
- På denne måde, fortsætter med at overføre 100 pi brønd til brønd. Bland efter hver overførsel og stoppe i række F.
- Efter blanding udvise 100 pi fra rækken F ned i en affaldsbeholder. Overfør ikke nogen væske til rækker G og H.
- Tilsæt 100 pi cRPMI til hver brønd i pladen ved hjælp af en multikanalpipette tilbringe volumen til 200 pi. Se figur 1 for endelig plade layout.
3. Biofilm Challenge
- Tilsæt 200 pi phosphatpufret saltvand (PBS) til en frisk steril 96-brønds plade, der indeholder brønde med dimensioner er identiske med dem af biofilmen indledning plade.
- Fjern plastikposen og paraffin film fra inkuberes biofilm indledning plade.
- Løft låget lige op. Undgå kontakt mellem pinde og pladen bunden, da dette kan beskadige biofilmen. Holde bunddelen til efterfølgende OD600 analyse (se 3.8).
- Skylle planktoniske celler ved at anbringe tappen-låg på pladen indeholdende PBS (fra trin 3.1). Sænk pløkker i 5 sek, løft ud af PBS, og dykke igen, og pas på ikke at ramme de pinde mod såvel sider.
- Placer skyllet PEG-låg til udfordringen plade. Undgå unødvendig kontakt mellem pinde og bundpladen da dette vil beskadige biofilm, der fører tilinkonsistente resultater.
- Seal plade med paraffin film og anbringes i en genlukkelig plasticpose, som beskrevet i trin 1.10.
- Inkubér pladen uden omrystning i 24 timer ved 37 ° C i en 5% CO2-inkubator.
- Tag bunden af biofilm indledning plade fra 3,3. Resuspendere bakterierne i hver brønd med en multikanalpipette og måle OD600 med en egnet mikropladelæser at bekræfte vækst forekommer i alle brønde, men steriliteten kontroller i rækken H.
4. Biofilm Bestemmelse
- Brug en pladelæser udstyret med en inkubation kammer og i stand til at tage kinetiske fluorescensaflæsninger til detektering resazurin konvertering. Opsæt en 24 timers kinetisk fluorescens måling med en 530 nm excitation og 590 nm emission.
- Indstil temperaturen i kammeret til 37 ° C og har pladen læse hver 20 min. Indstil pladelæser at måle fra bunden af pladen ifølge producentens instruktioner.
- Forbered vask pladen ved tilsætning af 200 pi PBS med en multikanalpipette til en steril 96 brønds plade.
- Forbered biofilm recovery medium ved tilsætning 400 pi 0,8 mg / ml resazurin stamopløsning til 20 ml cRPMI medium til en slutkoncentration på 16 ug / ml resazurin.
Bemærk: Resazurin er et kendt hudirriterende. Brug en kittel, beskyttelsesbriller og handsker under håndteringen. CRPMI som biofilmen retableringsmedier blev anvendt, fordi det giver den laveste baggrundssignal, men det kan erstattes af Mueller Hinton medium i givet fald. - Tilføj 150 pi biofilm recovery medium med en multikanalpipette til hver brønd i en frisk 96-brønds plade.
- Transfer udfordring plade fra inkubatoren i et biosikkerhed kabinet og fjern forsigtigt plastikpose og forsegling film.
- Fjern stiften-låget fra udfordringen pladen og skylle planktoniske celler i PBS, som beskrevet i 3.4. Hold bunden af udfordringen plade til efterfølgende OD600 analysis (se 4.10).
- Efter skylning placeres peg-låg i pladen bunden indeholder biofilmen retableringsmedie.
- Wrap den side af pladen med paraffin film, pas på ikke at lægge hindringer i vejen bunden af omkredsen brønde. Umiddelbart efter indpakning pladen, placere den på pladen læseren og starte en kinetisk læse over en 24 timers periode ved at indlede den tidligere lavet resazurin kinetisk protokol fra trin 4.1.
- For at kvantificere væksten af planktoniske celler, som kan eller ikke kan forekomme under udfordring, læse OD600 af hele udfordring plade bunden under anvendelse af en mikro-pladelæser. Følg anvisningerne i trin 3.8.
Bemærk: resuspender forsigtigt indholdet af hver brønd som celler kaste off biofilmen tendens til at vokse i klumper i bunden af brønden. Eventuelle bobler i brønden vil kraftigt forstyrre OD 600 aflæsninger og skal undgås eller fjernes forud for læse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den resazurin assayet er følsomme nok til at detektere meget få levedygtige celler i stand til at replikere i stoffri medium efter belastning. I denne metode, definerer vi den minimale biofilm udrydde koncentration som den laveste koncentration, ved hvilken ingen resazurin omdannelse ses indenfor 24 timer. Den resazurin analysen bygger på oxidative molekyler findes i metabolisk aktive celler, som omdanner farvestoffet farve fra blå til pink. Dye konvertering er således en indikator for cellevækst, og kan kvantificeres under anvendelse af en fluorescerende mikro- pladelæser. I dette papir, blev neocuproine og Cu-neocuproine (neocuproine kompleks med kobber) testet for deres aktivitet over biofilm forbundet S. aureus anvender et layout, der er baseret på figur 1. De opnåede under udførelsen af protokollen data er en OD 600 læsning af biofilmen indledning plade, der tjener som en kvalitetskontrol (data ikke vist), En OD600 aflæsning af pladen bunden efter challenge er afsluttet (figur 2A), og en kinetisk registrering af resazurin omregning til dets fluorescerende metabolit resorufin af opsvinget pladen (figur 2B). Endvidere kan et endepunkt billede af udfordringen plade anvendes til visuel inspektion af resazurin konvertering (figur 2C), hvis en ja / nej evaluering af resazurin konvertering er tilstrækkelig til formålet med forsøget. Alternativt, hvis kinetiske optagelse kapaciteter er utilgængelige eller flere plader er parallelt, kan bestemmes fluorescens efter 24 timer med en enkelt endpoint læse. Som det ses i figur 2A, OD aflæsninger fra udfordringen plade indikerer, at neocuproine alene ikke inhiberer væksten af planktoniske celler; dog Cu-neocuproine inhiberer vækst på 1,3 uM, som forventet 10. Et lignende mønster ses fra resazurin kinetiske af biofilmen plade, hvilket indikererat kun Cu-neocuproine er i stand til at eliminere metabolisk aktive biofilm-associerede celler (figur 2B).
Ud over at give koncentrationer udryddelse biofilm, den kinetiske assay tilvejebringer oplysninger om den metaboliske tilstand af biofilmen som indikerer antallet af levedygtige bakterier. Når man sammenligner biofilm behandlet med gentamicin ved stigende koncentrationer til de ubehandlede kontroller, kan en forsinkelse på resazurin omdannelse ses (figur 3). I 2,5 pg / ml gentamicin, der er en 13 timers forsinkelse indtil brønden når den samme omdannelse af resazurin som den ubehandlede kontrol. Denne forsinkelse sandsynligvis kommer fra et reduceret antal levedygtige celler til stede i den behandlede biofilm sammenlignet med den ubehandlede.
Figur 1. Challenge pladelayout. Example layout udfordring plade imødekommende parallel afprøvning af fire forbindelser i tre eksemplarer ved seks forskellige koncentrationer. Ubehandlede og sterilitet kontroller er også inkluderet. Layoutet design understøtter praktisk i-plade forberedelse af seriefortyndinger ved hjælp af en multikanal pipette. Koncentrationerne er i uM. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Bestemmelse koncentration udryddelse biofilm minimum. Neocuproine og Cu-neocuproine blev testet for potentiel udryddelse biofilm. (A) Den OD600 blev taget fra udfordringen plade efter fjernelse af PEG-låget at kvantificere væksten af biofilm dissocierede celler. (B) Resazurin konvertering blev overvåget kinetisk i enkelte kdobbelte brønde over en 24 timers periode. Individuelle minigraphs viser fluorescens (RFU) over tid (24 timer). Manglen på resazurin omdannelse indikerer fravær af overlevende. Resazurin konvertering indikerer tilstedeværelsen af levedygtige celler kaste off biofilmen og vokser i retableringsmedie. (C) Hvis en kinetisk udlæsning ikke er muligt eller nødvendigt, så et simpelt ja / nej svar for tilstedeværelse af levedygtige celler kan bestemmes visuelt fra farven konvertering af det blå resazurin til sin lyserøde, reduceret form. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Kinetic resazurin assay afslører inhiberende virkninger på bakterier i en biofilm. Forbindelser kan ikke helt udrydde biofilm indlejrede celler, men kan stadig reducereir levedygtighed. Dette kan ses ved sammenligning forsinkelsen af resazurin omdannelse af brønde behandlet med forskellige koncentrationer af gentamicin. Brønde, der har en forsinkelse i resazurin omdannelse indikerer et reduceret antal af levedygtige celler. Sort (kun medier), Orange (0 ug / ml), Green (0,3 ug / ml), Blå (0,6 ug / ml), Lilla (2,5 ug / ml), og Gray (5 ug / ml). AT henviser til den tid forskellen af eksponentiel resazurin konvertering mellem ubehandlede og gentamicin behandlet prøver på den omtrentlige halvdel maksimale fluorescens værdi. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her har vi beskrevet et modificeret biofilm assay til bestemmelse af aktivitet af testede inhibitorer på S. aureus biofilm med fokus på den metaboliske tilstand af biofilm forbundet celler. Mens den beskrevne biofilm initierings- og provokationseksponeringen meste efterlignede producentens anbefalinger, anvendelse af Resazurinfarvestof at påvise og bestemme biofilm-associerede celler som overlever en 24 hr inhibitor udfordring dramatisk simplificerer den fremgangsmåde af celleindvinding (via vandbad lydbehandling) og efterfølgende optælling af levedygtige celler via tælling af CFU. Denne producent-anbefalede procedure involverer mindst 5 ekstra manipulation trin, hver af dem risiko for fejl, arbejdskrævende, og upraktisk at automatisere. Fordelen ved at forenkle udlæsning procedure af pind plade analysen øger sin tiltrækningskraft for højt gennemløb operationer og applikationer.
Selvom en lang protokol med antallet af trin, denne procedure er temmelig konceptuelt enkel, med få kritiske trin. Helt afgørende er evnen til gentagne gange at vokse biofilm af samme kvalitet er afgørende for opnåelse reproducerbare resultater. Desuden skal man udvise forsigtighed, når du fjerner eller udskifter den pind-låg. Kontakt på noget tidspunkt med et godt væg ville forstyrre biofilmen, skævvridning resultater. Mere så tilstrækkelig vask er afgørende: manglende fjerne planktoniske celler på noget tidspunkt fjerner enhver evne til at måle biofilm-associerede bakterier. Omvendt imidlertid, vask må ikke være for streng; yderligere vasketrin kan begynde at fjerne biofilm, fremstilling inkonsistente resultater.
Stiften plade fremgangsmåde har flere anvendelser, afhængigt af den ønskede resulterende data. Analysen beskrives her som en informations-rige kinetisk måling af metabolisk resazurin konvertering til et fluorescerende farvestof 11. Denne konvertering er forbundet med en farveskift fra blå til pink (figur 2C), som i additipå den kvantitative fluorescens læse, giver mulighed for en nem indledende kvalitativ udlæsning simpelthen ved at observere omdannelse. Efter fjernelse af pind låg, kan denne omdannelse også kvantificeres ved aflæsning af absorbansen ved 600 nm bør fluorescens kapaciteter ikke tilgængelige. Selv fluorescensen vinder plateauer ved maksimal farvestof konvertering i hver brønd (med overlevende), kunne indtræden af farvestoffet omdannelse anvendes til at estimere den metabolisk aktive overlevende befolkning i forhold til den ubehandlede kontrol (figur 3). I vores hænder har vi fundet, at hver ~ 100 min forsinkelse i indtræden af resazurin konvertering svarer til ca. 10 gange fald i antallet af metabolisk aktive celler i udgangsmaterialet inokulum i forhold til den ubehandlede kontrol (som bestemt på planktoniske cellekultur serielt fortyndet i 10-fold gangen ved brug af biofilm recovery medium (data ikke vist)).
Beyond kinetiske udlæsninger, selv om, det modificerede pind plademetode er mere modtagelig for high-throughput lægemiddel skærm projekter end den oprindelige protokol. Ved at måle resazurin konvertering som et slutpunkt i stedet for en kinetisk, kan en bruger generere en binær analyse af prøverne til at spore simpel aktivitet af forbindelser (dvs. farvestof konvertering / ingen konvertering), hvilket fjerner behovet for 24 timer i en fluorescenspladelæser , tillader konventionelle inkubationer. Denne metode gør det muligt at bestemme den minimale biofilm udrydde koncentration uden brug af akustisk behandling og plating. Den kinetiske read også spor den metaboliske tilstand af biofilmen afhængigt af behandlingstiden tilstand og inhibitorkoncentration. Det reducerede antal af manipulerende trin, øget reproducerbarhed, og kvantitativ udlæsning metode (i modsætning til plettering hver brønd enkeltvis 12) giver brugerne mulighed for at screene potentielt tusindvis af forbindelser pr dag i en enkelt koncentration skærm. Faktisk har PEG-stil plader tidligere er blevet anvendt i high-throughput drug skærme til biofilm dispergeringsmidler, selvom resazurin (som anvendt her) er en langt mere økonomisk valg end den proprietære luciferase reagens udnyttet 13.
Mens en generel forbedring i forhold til eksisterende producent protokol, er analysen featured her har visse begrænsninger man skal huske på. Inherent vi kun måler metaboliske evne af biofilm-associerede celler. Dette assay måler ikke biofilm masse eller på anden måde svække biofilm arkitektur eller integritet. Disse virkninger vil ikke nødvendigvis blive opdaget. Metabolisk inaktive, men stadig levedygtige, persister celler, som har vist sig at eksistere i biofilm 14,15 vil også blive opdaget. Endvidere kan forbindelser, der inducerer hviletilstand uden faktisk at sterilisere en biofilm kan fejlagtigt fremstå som falske positiver, afhængigt af længden af den inducerede tilstand. Levedygtighed indikatorer er i sidste ende surrogater for flere jern-klædte målemetoder såsom flowcytometri eller CFUtælling, og slutbrugeren skal bestemme, hvilken metode er hensigtsmæssig. Endelig, som det resazurin konvertering afhængig endogen NADH, kunne udtømning af intracellulære lagre være til skade for bakterier. Mens vi ikke har observeret skadelige virkninger mod S. aureus, andre bakteriearter kan reagere forskelligt. Brugerne skal empirisk test og validere denne protokol for pålidelighed og reproducerbarhed givet varierende organismer og lab miljøer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mueller-Hinton Medium | Oxoid | CM0405 | Follow recommendations of manufacturer |
| RPMI-medium | Corning | 17-105-CV | |
| CRPMI | Ref 9 | RPMI-1640 medium chelexed for 1 hr with Chelex 100 resin and then supplemented with 10% unchelexed RPMI-1640 | |
| Chelex 100 Resin | Bio Rad | 142-2822 | |
| MBEC-plates | Innovotech | 19111 | |
| Resazurin Sodium Salt | Sigma | R7017 | 800 µg/ml in DI water Filter sterile |
| Micro Plate Shaking Platform | Heidolph Titramax 1000 | ||
| Cytation 3 Plate Reader | Biotek | ||
| Gen5 software | Biotek | Recording and analysis of resazurin conversion | |
| Neocuproine | Sigma | N1501 | prepare 10 mM stock in 100% Ethanol, store at -80 ºC |
| Copper sulfate | Acros Organics | 7758-99-8 | prepare a 100 mM stock solution in water, store at 4 ºC |
| Cu-Neocuproine | Self-Made | Generated by mixing equal molarities of neocuproine and copper sulfate. Mix was diluted in CRPMI medium to desired concentration. | |
| Gentamicin | Sigma | G3632-1G |
References
- Bjarnsholt, T., Ciofu, O., Molin, S., Givskov, M., Hoiby, N. Applying insights from biofilm biology to drug development - can a new approach be developed. Nat Rev Drug Discov. 12, 791-808 (2013).
- Song, Z., et al. Prosthesis infections after orthopedic joint replacement: the possible role of bacterial biofilms. Orthop Rev (Pavia). 5, 65-71 (2013).
- Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases). Nat Rev Microbiol. 2, 95-108 (2004).
- Bordi, C., de Bentzmann, S. Hacking into bacterial biofilms: a new therapeutic challenge. Ann Intensive Care. 1, 19 (2011).
- Fux, C. A., Shirtliff, M., Stoodley, P., Costerton, J. W. Can laboratory reference strains mirror 'real-world' pathogenesis? Trends Microbiol. 13, 58-63 (2005).
- Kwasny, S. M., Opperman, T. J. Static biofilm cultures of Gram-positive pathogens grown in a microtiter format used for anti-biofilm drug discovery. Curr Protoc Pharmacol. Chapter 13, Unit 13A 18 (2010).
- Ceri, H., et al. The MBEC Assay System: multiple equivalent biofilms for antibiotic and biocide susceptibility testing. Methods Enzymol. 337, 377-385 (2001).
- Ceri, H., et al. The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms. J Clinical Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).
- Baker, J., et al. Copper stress induces a global stress response in Staphylococcus aureus and represses sae and agr expression and biofilm formation. Appl Environ Microbiol. 76, 150-160 (2010).
- Haeili, M., et al. Copper complexation screen reveals compounds with potent antibiotic properties against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother. 58, 3727-3736 (2014).
- O'Brien, J., Wilson, I., Orton, T., Pognan, F. Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity. Eur J Biochem. 267, 5421-5426 (2000).
- Mah, T. F. Establishing the minimal bactericidal concentration of an antimicrobial agent for planktonic cells (MBC-P) and biofilm cells (MBC-B). J Vis Exp. (83), e50854 (2014).
- Junker, L. M., Clardy, J. High-throughput screens for small-molecule inhibitors of Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Antimicrob Agents Chemother. 51, 3582-3590 (2007).
- Shah, D., et al. Persisters: a distinct physiological state of E. coli. BMC Microbiol. 6, 53 (2006).
- Lewis, K. Riddle of biofilm resistance. Antimicrob Agents Chemother. 45, 999-1007 (2001).
