מיקוד Associated Biofilm Published: May 5, 2016 doi: 10.3791/53925

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Alex G. Dalecki¹, Cameron L. Crawford¹, Frank Wolschendorf¹

¹Department of Medicine, Division of Infectious Diseases, University of Alabama at Birmingham

Introduction

חיידקים פתוגניים יכולים ליצור biofilms in vivo מוביל לזיהומים כרוניים שאינם חריפים ^1. הזיהום הקשורים biofilm הוא גורם סיכון רציני של פרוצדורות רפואיות שכוללות השתלה של גופים זרים (למשל, מחליף עצם מלאכותי, שתלים בחזה) או באמצעות ההתקנה של צינורות לקנה נשימה או צנתרי שתן ^2. בהקשרים אלה, טיפול אנטי זיהומיות הוא כמעט תמיד הכרחי כמו זיהומים מבוססים ביופילם נמחקים לעתים רחוקות בכוחות עצמם, אפילו אצל אנשים עם מערכת חיסון תקינים. Staphylococcus aureus הוא אחד מגורמי המחלה העיר לעתים הקרוב ביותר המעורבים סיבוכים הקשורים biofilm המתרחשים במהלך השימוש ³ מכשירים רפואיים פולשניים.

למרבה הצער, טבעו של biofilms כמחסום מגן שהופך אותם עמיד יותר לטיפול מאשר תאי planktonic ^1,4, וההערכה של יעילות קלינית חזה היא חלק קריטי של השני ראשוניפיתוח תרופות כמו גם מעקב עמידות לתרופות. יש הכרה גוברת כי בתנאי מעבדה, מתמקדים תרבויות planktonic, לא יכולים לייצג נאמן בעולם האמיתי מחלה ^5. עוד הרכבה את הבעיה, השכפול של פנוטיפים biofilm קשה, ומודלים ביופילם קיימים הם מייגעים סובלים הבנת גבוה ולהבדלי תוך assay ^6. לכן, חוקרים רבים, דרך צורך, כברירת מחדל מבחני תא planktonic רגישות תרופה, ובכך באופן פוטנציאלי הזנחת היבט חשוב של ארסיויות חיידקים ומחלות.

כאן אנו מתארים את הפרוטוקול לחיידקי assaying, במיוחד ס aureus, ב biofilms טרום גדל ניצול ^7,8 מערכת ביופילם מבוסס 96-היטב. בעוד הפרוטוקול להיווצרות ואתגר ביופילם כדלקמן בעצם המלצת היצרן, אנו מציגים מתודולוגיה מידע עשיר חלופית לכימות את הכדאיות של biofILM לאחר אתגר. בקצרה, חיידקים בתרבית צלחת היתד, שם biofilms להיוצר על היתדות הבולטות המצורפות את המכסה של הצלחת. לאחר ההיווצרות ביופילם, את היתדות הם טבלו בעדינות בבארות של צלחת טריה המלאה PBS להסיר תאי planktonic. PEG-מכסה, עם biofilms המצורפת, מועבר צלחת אתגר חדש, המכיל ריכוזים שונים של אנטיביוטיקה להיות assayed. לאחר דגירה שנייה, מכסה שוב מוסרים, שטף, והועברתי צלחת התאוששות המכילה resazurin לצבוע, שם הם עוברים דגירה סופית. מרת Resazurin ניתן להקליט kinetically או נלקחת קריאת הסיום לאחר תקופת החלמה מוגדרת. שיטת צבע מבוסס זה לכימות הכדאי של biofilms שונה באופן משמעותי מן (יחידות המושבה להרכיב) CFU המייגעים מתודולוגיה לספור מבוססת כמתואר בפרוטוקול המקורי ^7. OD ₆₀₀ מדידות של צלחת תרופת אתגר resazurin קינטיקה המר לשמש לקריאה כדאיתקטן של תאי planktonic ו biofilm, בהתאמה, המציע assay מהיר, אמין ועשיר במידע ופשוט טכני להישרדות ביופילם.

Protocol

1. Biofilm ייזום

1. לגדול תרבות של אורגניזם לייצר ביופילם בתווך עשיר מזין. לחסן זן aureus Staphylococcus ניומן ב 10 מ"ל של מדיום מולר-הינטון ממלאי גליצרול. לבצע את כל העבודות שיש בהן טיפול S. aureus עם כפפות בתוך ארון בטיחות ביולוגית.
2. דגירה במשך 16 שעות ב 37 ° C על שייקר רוטרי (100-200 סל"ד).
3. לקבוע OD ₆₀₀ של התרבות באמצעות ספקטרופוטומטר ו קובט סטנדרטי (אורך מסלול: 1cm).
4. חשב את נפח (V) של תרבות צריכה להכין 20 מ"ל של הבידוד עם OD _{600 (הבידוד)} של 0.1 ב chelexed התקשורת מכון ממוריאל פארק Roswell (CRPMI) ⁹ באמצעות הנוסחה: [V = 20 מ"ל * 0.1 / OD _{600 (תרבות )]}
   הערה: Reference 9 מספק פרטים על הכנת CRPMI.
   1. מוסיפים את נפח תרבות מחושב (מלמעלה) לצינור צנטריפוגות ותאי גלולה על ידי ספינינג 1 דקות ב g 10,000 x. כדי prepaמחדש הבידוד ביופילם, לשאוב התא גלולה בינוני ו resuspend צמיחה בילה 20 מ"ל CRPMI.
5. יוצקים הבידוד למאגר 25 מ"ל.
6. מוציאים בזהירות את המכסה מעל צלחת יתד 96-גם סטרילי על ידי משיכתו כלפי מעלה.
   הערה: יש להקפיד לא לזהם את היתדות שמוט מהמכסה. המכסה ניתן להציב במהופך על משטח נקי בתוך ארון בטיחות ביולוגי.
7. בעזרת פיפטה 200 רב ערוצית μl, להוסיף 125 בידוד μl היטב בכל שורות A עד G של הצלחת התחתונה.
8. מלאו 125 μl סטרילי בינוני CRPMI היטב בכל שורה H כביקורת על סטריליות.
9. קח את-מכסה היתד והחזק אותו מעל תחתית הצלחת עם היתדות הפונות כלפי מטה. בזהירות ליישר את יתדות פרט עם הבארות שלהם. יש להימנע ממגע פיזי בין צלחת את היתדות. לאחר מיושר, להוריד את המכסה בזהירות למטה. הימנע misalignments כמו readjustments שבוצע לאחר היתדות נגע הצלחת התחתונה עשויה המשךשולטת עקרות aminate בשורה H.
10. חותם את המכסה לצלחת עם הסרט פרפין כדי למנוע אידוי ומניחים בשקית ניילון סגר, איטום בחוזקה. שמור את נפח האוויר בשקית הנמוכה ככל האפשר על מנת למזער התאדות.
11. דגירה בלי ללחוץ על 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות ₂ באינקובטור 5% CO.
    הערה: 48 שעות של צמיחה היו אופטימליות עבור ס aureus, אך ישתנו בהתבסס על האורגניזם בשימוש.
    הערה: למרות דגירת סטטי היא נקודת התחלה טובה כדי לייעל את assay, רועד בעדינות 150 סל"ד על שייקר microplate היא וריאציה אפשרית כדי להביא להגברת היווצרות ביופילם של כמה ס aureus מבודד.

2. הכנת פלייט אתגר Biofilm

1. ביום האתגר ביופילם לקחת צלחת 96-היטב טרי ולהוסיף 100 μl של CRPMI, equilibrated כדי RT, היטב כל השורות ב 'ח כדי למנוע תוצאות לא עקביות, לנצל צלחת 96-היטב שיכול להכיל 200 μlשל תקשורת כאשר היתדות הן בפנים, כוללות בארות עם ממדים זהים לאלה של הצלחת הייזום ביופילם.
2. לדלל עד 4 תרכובות בדיקה בנפרד 1.0 מיליליטר של CRPMI ל 2x לריכוז הסופי הרצוי, כדי לתת דין וחשבון על דילול סופי בשלב 2.7.
   הערה: נקודת התחלה טובה היא 8 לקפל מעל ריכוז המעכבות של תאי planktonic.
3. הוסף 200 μl של המתחם 1 בבארות A1 ל- A3, מתחם 2 בבארות A4 עד A6, מתחם 3 בבארות A7 כדי A9 מתחם 4 בבארות A10 כדי A12.
4. סדרתי לדלל את תרכובות הבדיקה באמצעות פיפטה רבה ולהעביר 100 μl משורה א 'עד בטור ב ומערבבים.
5. באופן זה, להמשיך להעביר 100 μl לבאר. מערבב אחרי כל העברה ולהפסיק בשורת פ
6. לאחר ערבוב, לגרש 100 μl משורה F לתוך מיכל פסולת. אל תעבירו את כל נוזל אל שורות G ו- H.
7. הוספת 100 μl של CRPMI היטב כל הצלחת באמצעות פיפטה רבה כדילהביא את נפח 200 μl. ראה איור 1 עבור פריסת צלחת סופית.

3. אתגר Biofilm

1. הוסף 200 μl של בופר פוספט (PBS) בצלחת 96-גם סטרילי טרי כי תכונות בארות עם ממדים זהים לאלה של הצלחת ייזום ביופילם.
2. מוציא את שקית פלסטיק סרט פרפין מצלחת הייזום ביופילם מודגרות.
3. הרם את המכסה כלפי מעלה. יש להימנע ממגע בין יתדות והחלק התחתון צלחת כפי שהדבר עלול לגרום נזק ביופילם. שמור חלק תחתון לניתוח שלאחר מכן OD ₆₀₀ (ראה 3.8).
4. לשטוף תאי planktonic על ידי נחת-המכסה יתד לצלחת המכילה PBS (משלב 3.1). לצלול יתדות במשך 5 שניות, להרים מתוך PBS, לצלול שוב, נזהרים שלא לפגוע יתדות נגד הצדדים היטב.
5. מניח את יתד המכסה שטוף לתוך הצלחת האתגר. הימנעו ממגע בלתי נחוץ בין יתדות הצלחת התחתונה כמו זו תגרום נזק ביופילם המובילתוצאות לא עקביות.
6. צלחת חותם עם הסרט פרפין ומקום לתוך שקית ניילון סגר כמתואר בשלב 1.10.
7. דגירת הצלחת ללא רעד במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס חממת ₂ 5% CO.
8. קח בתחתית צלחת biofilm ייזום מ -3.3. Resuspend החיידקים בכל טוב בעזרת פיפטה רבה ערוצים ולמדוד את OD ₆₀₀ עם קורא microplate מתאים כדי לאשר צמיחה המתרחשת כל הבארות אבל שולט עקרות בשורה H.

4. קביעת Biofilm

1. שימוש בקורא צלחת מצויד בתא דגירה ומסוגלים לקחת קריאות הקרינה הקינטית לאיתור resazurin המרה. הגדרת מדידת קרינה הקינטית 24 שעות באמצעות עירור 530 ננומטר 590 פליטת ננומטר.
2. הגדר את הטמפרטורה בתא עד 37 ° C ויש להם את צלחת לקרוא כל 20 דק '. הגדר את קורא הצלחת למדוד מהחלק התחתון של הצלחת פי instruc של היצרןמשא.
3. כן צלחת לשטוף ידי הוספת 200 μl של PBS עם פיפטה רבה לצלחת גם 96 סטרילי.
4. הכן בינוני התאוששות ביופילם על ידי הוספת 400 μl של 0.8 מ"ג / מ"ל ​​resazurin הפתרון המניות 20 מ"ל של מדיום CRPMI לריכוז סופי של resazurin 16 מיקרוגרם / מ"ל.
   הערה: Resazurin הוא מגרה את העור ידוע. השתמש בחלוק מעבדה, משקפים להתיז, וכפפות בזמן הטיפול. CRPMI כמו תקשורת התאוששות ביופילם שמש משום שהוא מספק את אות הרקע הנמוכה ביותר, אבל זה יכול להיות מוחלף על ידי תקשורת מילר Hinton אם מתאים.
5. להוסיף 150 μl של מדיום התאוששות ביופילם עם טפטפת רב היטב בכל צלחת 96-היטב טריה.
6. העברת צלחת אתגר מן החממה לתוך ארון בטיחות ביולוגי ובזהירות להסיר שקית פלסטיק סרט איטום.
7. הסר את מכסת היתד מצלחת האתגר ולשטוף תאי planktonic ב PBS כמתואר 3.4. שמור את החלק התחתון של צלחת אתגר OD עוקבת ₆₀₀ anaתמוגה (ראה 4.10).
8. לאחר השטיפה, למקם את מכסת היתד לתוך התחתון הצלחת המכיל את מדיום ההתאוששות ביופילם.
9. עוטף את הצד של הצלחת עם סרט פרפין, נזהר שלא להכשיל את החלק התחתון של הבארות ההיקפיות. מייד לאחר לעטוף את הצלחת, ומניח אותו על קורא הצלחת ולהתחיל לקרוא הקינטית פני תקופה של 24 שעות על ידי ייזום עשה בעבר resazurin פרוטוקול הקינטית משלב 4.1.
10. כדי לכמת הצמיחה של תאים planktonic שעשוי או עלול לא להתרחש במהלך האתגר, לקרוא את OD ₆₀₀ של תחתית צלחת האתגר כולו באמצעות קורא צלחת מיקרו. פעל בהתאם להוראות שניתנו בשלב 3.8.
    הערה: בזהירות resuspend התוכן של כל אחד גם כתאים משילים את ביופילם נוטים לגדול במקבצים בתחתית הבאר. כל בועות בתוך הבאר תפרענה מאוד עם קריאות OD ₆₀₀ ו יש להימנע או להסיר לפני לקרוא.

Representative Results

את assay resazurin הוא רגיש מספיק כדי לזהות באופן אמין מאוד כמה תאי קיימא יכולת שכפול במדיום נקי מסמים לאחר אתגר. ב מתודולוגיה זו, נגדיר את הריכוז בביעור ביופילם המינימאלי כמו הריכוז הנמוך ביותר בה ללא מרת resazurin נתפסת בתוך 24 שעות. את assay resazurin מסתמך על מולקולות חמצונים נמצאות תאים פעילים מבחינה מטבולית אשר להמיר את הצבע לצבוע מכחול ורוד. המרה דאי הוא ובכך אינדיקטור של צמיחת תאים, וניתן לכמת באמצעות קורא צלחת מיקרו ניאון. במאמר זה, neocuproine ו Cu-neocuproine (ומורכבת neocuproine עם נחושת) נבדקו עבור פעילותם כלפי הקשורים biofilm S. aureus החלת פריסה מבוססת על איור 1. הנתונים המתקבלים במהלך ביצוע של הפרוטוקול מהוות קריאת OD ₆₀₀ של הצלחת הייזום ביופילם, אשר משמשת בקרת איכות (מידע לא מוצג), קריאה OD ₆₀₀ של תחתית צלחת לאחר אתגר הושלמה (איור 2 א), וכן הקלטה הקינטית של המרה resazurin לתוך resorufin המטבוליט פלורסצנטי של הצלחת התאוששות (תרשים 2B). יתר על כן, תמונת נקודת סיום של צלחת האתגר יכולה לשמש בדיקה ויזואלית של מרת resazurin (איור 2 ג) אם כן / לא הערכה של מרת resazurin מספיקה לצורך הניסוי. לחלופין, אם יכול הקלטה הקינטית אינן זמינים או מספר צלחות מנוהלות במקביל, קרינה ניתן לקבוע לאחר 24 שעות על ידי קריאת עמדת קצה. כפי שניתן לראות באיור 2 א, קריאות OD מהצלחת אתגר עולה כי neocuproine לבד לא לעכב צמיחה של תאים planktonic; עם זאת, Cu-neocuproine מעכב צמיחה של 1.3 מיקרומטר, כצפוי ^10. דפוס דומה נצפה מיום הקינטית resazurin של הצלחת ביופילם, המצייןכי Cu-neocuproine רק הוא מסוגל לחסל תאים biofilm הקשורים פעיל מבחינה מטבולית (איור 2 ב).

בנוסף לאספקת ריכוזי מיגור ביופילם, assay הקינטית מספק מידע על המצב מהטבולים של ביופילם אשר מעיד על מספר חיידקי קיימא. בהשוואת biofilms שטופל גנטמיצין להגדיל ריכוזים לקבוצת ביקורת שלא טופלה, בפיגור של מרת resazurin ניתן לראות (איור 3). עבור 2.5 מיקרוגרם / מ"ל ​​גנטמיצין, קיים עיכוב 13 שעות עד הבאר מגיע באותו המרה של resazurin כמו קבוצת הביקורת. פיגור זה מגיע סביר ממספר מופחת של תאי קיימא נוכחים biofilm המטופלים לעומת לא המטופלים.

באיור 1. פריסת צלחת אתגר. Examplפריסת דואר של צלחת אתגר אדיב בדיקות מקבילות של ארבע תרכובות בשלושה עותקים בשש ריכוזי מובהק. שולטת ללא טיפול ועקרות כלולים גם. עיצוב הפריסה תומך הכנת הצלחת נוחה של דילולים סדרו באמצעות pipet רב ערוצית. ריכוזים נמצאים מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2. קביעת ריכוז מיגור biofilm מינימום. Neocuproine ו Cu-neocuproine נבדקו עבור פוטנציאל ביופילם מיגור. (א) OD ₆₀₀ נלקח מהצלחת האתגר לאחר הסרת המכסה יתד לכמת את הצמיחה של תאים ניתק ביופילם. (ב) המרה Resazurin היה פיקוח kinetically ב indiviבארות כפולות על פני תקופת hr 24. minigraphs הפרט להראות קרינה (RFU) לאורך זמן (24 שעות). חוסר מרת resazurin מציין את עדר ניצולים. מרת Resazurin מעידה על קיומו של תאי קיימא משילים את ביופילם וצומחים במדיום ההתאוששות. (ג) אם הודעה הקינטית לא ניתן או לא צריך, אז פשוטה כן / לא לענות על הנוכחות של תאי קיימא ניתן לקבוע חזותי מהמרת הצבע של resazurin הכחול הוורודה שלה, צורה מצומצמת. נא ללחוץ כאן לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3. assay resazurin קינטי מגלה תופעות מעכבות על חיידקים בתוך ביופילם. תרכובות לא לגמרי למגר תאים מוטבע ביופילם, אך עדיין ניתן להפחית אתכדאיות ir. ניתן לראות זאת כאשר משווים העיכוב של resazurin המרה של בארות שטופלו בריכוזים שונים של גנטמיצין. וולס כי יש עיכוב מרת resazurin להצביע על מספר מופחת של תאי קיימא. שחור (מדיה בלבד), אורנג '(0 מיקרוגרם / מ"ל), גרין (0.3 מיקרוגרם / מ"ל), כחול (0.6 מיקרוגרם / מ"ל), סגול (2.5 מיקרוגרם / מ"ל), ו גריי (5 מיקרוגרם / מ"ל). Δt מתייחס ההפרש בעת המרת resazurin מעריכים בין דגימות מטופלי מטופל גנטמיצין לפי שווי הקרינה המרבי חצי למידע. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

הנה, יש לנו תארנו assay biofilm שונה לקביעת פעילות של מעכבים נבדקו על S. biofilms aureus התמקדות מצב מטבולי של תאים הקשורים ביופילם. בעוד נהלים אתגר וייזום ביופילם תיאר בעיקר המלצות היצרן חיקה, השימוש resazurin לצבוע לזהות ולכמת תאים הקשורים biofilm ששורדים אתגר 24 שעות מעכב באופן דרמטי מפשט את הנוהל המומלץ של התאוששות התא (דרך sonification באמבט מים) ו ספירה עוקבות תאי קיימא של דרך ספירת CFUs. הליך יצרן מומלץ זה כרוך לפחות 5 שלבי מניפולציה נוספים, כל אחד מהם לשגיאות, עבודה אינטנסיבית, ולא מעשי להפוך. היתרון של פישוט ההליך לקריאה החוצה של assay צלחת יתד מגביר האטרקטיביות שלה עבור פעולות ויישומי קצב העברת נתונים גבוהות.

למרות פרוטוקול ארוך על ידי מספר צעדים, זה procedurדואר למדי מושגית פשוט, עם כמה שלבים קריטיים. והכי חשוב, את היכולת לגדול biofilms שוב ושוב באותה איכות חיונית להשגת תוצאות לשחזור. כמו כן, יש לנקוט בזהירות בכל פעם הסרה או החלפה של-המכסה יתד. צור בכל נקודה עם הקיר של גם ישבש את ביופילם, מעקם תוצאות. אחת כמה וכמה, כביסה נאותה חיונית: אי להסיר תאי planktonic בכל נקודה מסירה את כל יכולת למדוד חיידקים הקשורים ביופילם. לעומת זאת, אם כי, שטיפה אסורה להיות יותר מדי קפדנית; שלבים לשטוף נוספים עשויים להתחיל הסרת biofilm, הפקת תוצאות לא עקביות.

גישת צלחת היתד לו שימושים מרובים, תלוי את הנתונים המתקבלים הרצויים. Assay הוא מתואר כאן כמו מדידת הקינטית מידע עשיר גיור resazurin מטבולית לתוך צבע פלואורסצנטי ^11. המרה זו קשורה שינוי צבע מכחול ורוד (איור 2 ג), אשר, additiעל מנת לקרוא קרינה כמוני, מאפשר שהוקרא ממחשב איכותי ראשוני קל פשוט על ידי התבוננות המרה. לאחר הסרת מכסת היתד, מרה זו ניתן לכמת ידי קריאה הספיגה ב 600 ננומטר צריך קרינת יכולות לא יהיה זמין. למרות הקרינה בסופו של דבר מישורים בעת מרת צבע מקסימלית בכל טוב (עם ניצולים), תחילתה של מרת צבע יכולה לשמש כדי להעריך את יחסי אוכלוסיית ניצולי שואה פעילים מבחינת מטבולית על קבוצת הביקורת (איור 3). בידיים שלנו מצאנו כי כל עיכוב דקות ~ 100 תחילת ההמרה resazurin תואמת כ ירידה של פי 10 במספר תאים פעילים מבחינה מטבולית ב ביחס הבידוד החל על קבוצת הביקורת (כפי שנקבע על תרבית תאים planktonic סדרתי מדולל במרווחים של פי 10 באמצעות מדיום התאוששות ביופילם (מידע לא מוצג)).

מעבר readouts קינטית, אם כי, הצליח היתד השונהשיטה היא יותר מקובל פרויקטי מסך סמי תפוקה גבוהה יותר הפרוטוקול המקורי. באמצעות מדידת resazurin המרה נקודת הסיום במקום קינטית, משתמש יכול ליצור ניתוח בינארי של דגימות כדי לעקוב אחר פעילות פשוטה של תרכובות (כלומר, המרה לצבוע / ללא המרה), אשר מסיר את הצורך למשך 24 שעות ב קורא צלחת פלואורסצנטי , המתיר incubations קונבנציונאלי. מתודולוגיה זו מאפשרת לקביעת ביופילם מינימלי בביעור ריכוז ללא צורך של sonification ציפוי. קרא הקינטית גם עוקב אחר מצב מטבולי של ביופילם תלוי במצבו טיפול וריכוז מעכב. המספר המופחת של צעדי מניפולציה, השחזור מוגבר, ושיטת הודעה כמותית (להבדיל ציפוי כל טוב בנפרד ¹²⁾ מאפשרים למשתמשים לסנן פוטנציאל אלף תרכובות ליום במסך ריכוז יחיד. למעשה, צלחות בסגנון יתד שימשו בעבר dr תפוקה גבוההמסכי UG עבור dispersants ביופילם, למרות resazurin (כפי שמוצג כאן) הוא בחירה הרבה יותר חסכוני מאשר מגיב בלוציפראז קניינית מנוצל ^13.

בעוד שיפור כללי על פרוטוקול היצרן הקיים, assay הוצג כאן יש מגבלות מסוימות אחד חייב לזכור. מטבעם, אנחנו רק מודדים יכולת מטבולית של תאים הקשורים ביופילם. assay זה אינו מודד מסת ביופילם או אחר להחליש את ארכיטקטורת biofilm או שלמות. אלה תופעות לא תהיינה מזוהות בהכרח. מבחינה מטבולית פעילה, אבל עדיין קיימא, persister תאים, אשר הוכחו להתקיים biofilms ^14,15 יהיה גם מבלי שיבחינו. יתר על כן, תרכובות המשרים קפאון מבלי לסטריליזציה ביופילם עלול להופיע בטעות תוצאות חיוביות שגויות, בהתאם לאורך של המדינה המושרית. אינדיקטורים כדאיים הם בסופו של דבר ממלאי מקום לשיטות מדידות יותר לבוש ברזל כגון cytometry זרימה או CFUספירה, לבין משתמש הקצה חייב לקבוע איזו שיטה מתאימה. לבסוף, כמו מרת resazurin מסתמכת על NADH אנדוגני, הדלדול של חנויות תאיות יכול להיות מזיק עבור חיידקים. בעוד שלא הבחנו בו השפעות מזיקות נגד ס aureus, מיני חיידקים אחרים עשויים להגיב בצורה שונה. משתמשים חייבים אמפיריים לבדוק ולאמת בפרוטוקול זה עבור אורגניזמים שונים וסביבות מעבדה נתונות אמינים שחזור.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mueller-Hinton Medium	Oxoid	CM0405	Follow recommendations of manufacturer
RPMI-medium	Corning	17-105-CV
CRPMI	Ref 9		RPMI-1640 medium chelexed for 1 hr with Chelex 100 resin and then supplemented with 10% unchelexed RPMI-1640
Chelex 100 Resin	Bio Rad	142-2822
MBEC-plates	Innovotech	19111
Resazurin Sodium Salt	Sigma	R7017	800 µg/ml in DI water     Filter sterile
Micro Plate Shaking Platform	Heidolph Titramax 1000
Cytation 3 Plate Reader	Biotek
Gen5 software	Biotek		Recording and analysis of resazurin conversion
Neocuproine	Sigma	N1501	prepare 10 mM stock in 100% Ethanol, store at -80 ºC
Copper sulfate	Acros Organics	7758-99-8	prepare a 100 mM stock solution in water, store at 4 ºC
Cu-Neocuproine	Self-Made		Generated by mixing equal molarities of neocuproine and copper sulfate. Mix was diluted in CRPMI medium to desired concentration.
Gentamicin	Sigma	G3632-1G