Introduction
रोगजनक रोगाणुओं गैर तीव्र पुराने संक्रमण 1 के लिए अग्रणी विवो में biofilms फार्म कर सकते हैं। Biofilm से जुड़े संक्रमण चिकित्सा प्रक्रियाओं है कि विदेशी वस्तुओं (जैसे, कृत्रिम हड्डी प्रतिस्थापन, स्तन प्रत्यारोपण) या सांस की नली ट्यूब या मूत्र कैथेटर 2 की स्थापना का आरोपण शामिल की एक गंभीर जोखिम कारक है। इन संदर्भों में, विरोधी संक्रामक चिकित्सा लगभग हमेशा आवश्यक के रूप में biofilm आधारित संक्रमण को शायद ही कभी अपने दम पर मंजूरी दे दी है, असुरक्षित व्यक्तियों में भी है। स्ताफ्य्लोकोच्चुस सबसे अधिक बार मनाया के उपयोग के दौरान होने वाली biofilm से संबंधित जटिलताओं में फंसा रोगाणुओं की एक है आक्रामक चिकित्सा उपकरणों 3।
दुर्भाग्य से, एक सुरक्षात्मक बाधा के रूप में biofilms के स्वभाव उन्हें और अधिक planktonic कोशिकाओं 1,4 से उपचार के लिए प्रतिरोधी बनाता है, और भविष्यवाणी की चिकित्सीय प्रभावकारिता के मूल्यांकन के दोनों प्रारंभिक का एक महत्वपूर्ण हिस्सा हैदवा के विकास के साथ-साथ दवा प्रतिरोध निगरानी। वहाँ बढ़ती पावती कि प्रयोगशाला की स्थिति, planktonic संस्कृतियों पर केंद्रित है, ईमानदारी से वास्तविक दुनिया की बीमारी 5 प्रतिनिधित्व नहीं हो सकता है। आगे की समस्या और जटिल हो, biofilm phenotypes की प्रतिकृति मुश्किल है, और मौजूदा biofilm मॉडल थकाऊ रहे हैं और उच्च अंतर और इंट्रा-परख 6 परिवर्तनशीलता से पीड़ित हैं। इस प्रकार, कई शोधकर्ताओं, आवश्यकता के माध्यम से, मादक पदार्थों की संवेदनशीलता की planktonic सेल assays के लिए डिफ़ॉल्ट, जिससे संभवतः बैक्टीरियल विषैलापन और रोग का एक महत्वपूर्ण पहलू की उपेक्षा।
यहाँ हम बैक्टीरिया परख करने की क्रिया के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन है, विशेष रूप से एस ऑरियस, एक 96 अच्छी तरह से आधारित biofilm प्रणाली 7.8 का उपयोग पूर्व विकसित biofilms में। biofilm गठन और चुनौती के लिए प्रोटोकॉल अनिवार्य रूप से निर्माता की सिफारिश इस प्रकार है, हम biof की व्यवहार्यता बढ़ाता के लिए एक विकल्प के बारे में जानकारी युक्त कार्यप्रणाली पेशचुनौती के बाद इल्म। संक्षेप में, बैक्टीरिया खूंटी थाली, जहां biofilms प्लेट के ढक्कन से जुड़ी फैला हुआ खूंटे पर फार्म में सुसंस्कृत हैं। biofilm गठन के बाद, खूंटे धीरे एक ताजा पीबीएस के साथ भरा planktonic कोशिकाओं को हटाने के लिए थाली के कुओं में डूबा रहे हैं। खूंटी ढक्कन, संलग्न biofilms के साथ, एक नई चुनौती प्लेट को सौंप दिया है, एंटीबायोटिक दवाओं के विभिन्न सांद्रता वाले यत्न किया जाएगा। एक दूसरे ऊष्मायन के बाद, पलकों फिर से हटा दिया धोया, और डाई, जहां वे एक अंतिम ऊष्मायन से गुजरना resazurin युक्त एक वसूली थाली करने के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं। Resazurin रूपांतरण kinetically दर्ज की गई है या एक परिभाषित वसूली की अवधि के बाद एक समापन बिंदु पढ़ने के रूप में लिया जा सकता है। Biofilms की व्यवहार्यता बढ़ाता का यह डाई आधारित पद्धति थकाऊ CFU (कॉलोनी बनाने इकाइयों) से काफी अलग मूल प्रोटोकॉल 7 में वर्णित गिनती आधारित पद्धति। दवा चुनौती थाली की और रूपांतरण कैनेटीक्स resazurin 600 आयुध डिपो माप व्यवहार्यता पढ़ें के रूप में सेवाplanktonic और biofilm कोशिकाओं, क्रमशः के बहिष्कार, एक तेज, विश्वसनीय, जानकारी से भरपूर और तकनीकी रूप से सरल biofilm अस्तित्व के लिए परख की पेशकश की।
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Protocol
1. Biofilm शुरूआत
- एक पोषक तत्व अमीर मध्यम में biofilm उत्पादन जीव की एक संस्कृति विकसित। एक ग्लिसरॉल स्टॉक से मुलर-हिंटन माध्यम के 10 मिलीलीटर में स्ताफ्य्लोकोच्चुस तनाव न्यूमैन टीका लगाना। एस के निपटने से जुड़े सभी काम करते हैं दस्ताने के साथ और एक जैव सुरक्षा कैबिनेट के भीतर ऑरियस।
- एक रोटरी प्रकार के बरतन (100-200 आरपीएम) पर 37 डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटे के लिए सेते हैं।
- संस्कृति एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर और एक मानक क्युवेट (: 1 सेमी पथ की लंबाई) का उपयोग कर के आयुध डिपो के 600 निर्धारित करते हैं।
- Chelexed रोसवेल पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट ऑफ मीडिया (CRPMI) 9 में 0.1 के आयुध डिपो 600 (inoculum) के साथ inoculum के 20 मिलीलीटर तैयार करने के लिए सूत्र का उपयोग कर की जरूरत संस्कृति की मात्रा (वी) की गणना: [V = 20 मिलीलीटर * 0.1 / 600 आयुध डिपो (संस्कृति )]
नोट: संदर्भ 9 CRPMI तैयारी पर जानकारी प्रदान करता है।- पर 10,000 एक्स जी 1 मिनट के लिए कताई द्वारा गणना की संस्कृति एक अपकेंद्रित्र ट्यूब और गोली कोशिकाओं के लिए (ऊपर से) मात्रा में जोड़ें। prepa करने के लिएbiofilm inoculum फिर, 20 मिलीलीटर CRPMI में खर्च मध्यम विकास और resuspend सेल गोली aspirate।
- एक 25 मिलीलीटर जलाशय में inoculum डालो।
- इसे ध्यान खींच सीधे ऊपर से एक बाँझ 96 अच्छी तरह से थाली से खूंटी ढक्कन हटा दें।
नोट: देखभाल ढक्कन से नीचे लटक खूंटे दूषित करने के लिए नहीं लिया जाना चाहिए। ढक्कन के एक जैव सुरक्षा कैबिनेट के भीतर एक स्वच्छ सतह पर उल्टा रखा जा सकता है। - एक 200 μl मल्टी चैनल पिपेट का प्रयोग, नीचे की थाली के लिए जी पंक्तियाँ एक के प्रत्येक अच्छी तरह से 125 μl inoculum जोड़ें।
- पंक्ति एच के प्रत्येक अच्छी तरह से एक बाँझपन नियंत्रण के रूप में 125 μl बाँझ CRPMI मध्यम भरें।
- खूंटी ढक्कन ले लो और नीचे की ओर का सामना करना पड़ खूंटे के साथ प्लेट नीचे से ऊपर इसे पकड़ो। ध्यान से अपने-अपने कुओं के साथ अलग-अलग खूंटे संरेखित। प्लेट और खूंटे के बीच शारीरिक संपर्क से बचें। एक बार जब गठबंधन, ढक्कन ध्यान से नीचे कम है। misalignments से बचें क्योंकि खूंटे के बाद किया readjustments छुआ है नीचे की थाली cont सकता हैपंक्ति एच में aminate बाँझपन नियंत्रण
- एक sealable प्लास्टिक की थैली में वाष्पीकरण और जगह को रोकने के लिए, कसकर सील आयल फिल्म के साथ थाली करने के ढक्कन सील। वाष्पीकरण कम करने के लिए जितना संभव हो कम बैग में हवा की मात्रा रखें।
- एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 48 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर मिलाते हुए बिना सेते हैं।
नोट: विकास के 48 घंटा एस के लिए इष्टतम किया गया है ऑरियस, लेकिन इस्तेमाल जीव पर आधारित अलग अलग होंगे।
नोट: हालांकि स्थिर ऊष्मायन एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु है परख अनुकूलन करने के लिए, धीरे से एक microplate प्रकार के बरतन पर 150 rpm पर मिलाते हुए एक संभव भिन्नता है कि कुछ एस के biofilm गठन में वृद्धि हो सकती है ऑरियस आइसोलेट्स।
2. Biofilm चैलेंज प्लेट की तैयारी
- biofilm चुनौती के दिन पर एक ताजा 96 अच्छी तरह से थाली ले और असंगत परिणाम से बचने के लिए एच बी CRPMI के 100 μl, आरटी के लिए equilibrated जोड़ने के लिए, पंक्तियों में से प्रत्येक में अच्छी तरह से करने के लिए, एक 96 अच्छी तरह से थाली कि 200 μl पकड़ कर सकते हैं का उपयोगमीडिया की जब खूंटे के अंदर हैं, और biofilm दीक्षा प्लेट के लोगों को समान आयामों के साथ कुओं की सुविधा है।
- CRPMI के 1.0 मिलीलीटर में अलग से 4 परीक्षण यौगिकों के लिए ऊपर पतला वांछित अंतिम एकाग्रता 2x करने के लिए, क्रम में कदम 2.7 में एक अंतिम कमजोर पड़ने के लिए खाते में।
नोट: एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु planktonic कोशिकाओं की निरोधात्मक एकाग्रता ऊपर 8 गुना है। - ए 3, ए 9 के लिए कुओं ए 4 में यौगिक 2 ए 6 को, यौगिक 3 कुओं ए 7 में और मिश्रित 4 कुओं A12 के लिए A10 में कुओं A1 में यौगिक 1 के 200 μl जोड़ें।
- क्रमानुसार एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके परीक्षण यौगिकों पतला और बी पंक्ति और मिश्रण करने के लिए एक पंक्ति से 100 μl हस्तांतरण।
- उस तरीके से, अच्छी तरह से करने के लिए अच्छी तरह से 100 μl हस्तांतरण करने के लिए जारी है। प्रत्येक हस्तांतरण के बाद से मिलाएं और पंक्ति एफ में बंद
- मिश्रण के बाद, बर्बादी कंटेनर में पंक्ति एफ से 100 μl निष्कासित। पंक्तियों जी और एच के लिए किसी भी तरल हस्तांतरण नहीं है
- करने के लिए एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए CRPMI के 100 μl जोड़े200 μl के लिए मात्रा लाने के लिए। अंतिम थाली लेआउट के लिए चित्रा 1 देखें।
3. Biofilm चैलेंज
- एक ताजा बाँझ 96 अच्छी तरह से थाली कि biofilm दीक्षा प्लेट के लोगों को समान आयामों के साथ कुओं की सुविधा के लिए फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के 200 μl जोड़ें।
- प्लास्टिक की थैली और incubated biofilm दीक्षा थाली से आयल फिल्म निकालें।
- ढक्कन सीधे ऊपर उठा। खूंटे और इस रूप में प्लेट नीचे के बीच संपर्क से बचें biofilm नुकसान हो सकता है। (3.8 देखें) बाद में 600 आयुध डिपो के विश्लेषण के लिए नीचे के भाग में रखें।
- (3.1 कदम से) पीबीएस युक्त थाली पर खूंटी ढक्कन रखकर planktonic कोशिकाओं से कुल्ला। 5 सेकंड के लिए खूंटे डूब, पीबीएस के बाहर उठा, और एक बार फिर डूब, अच्छी तरह से पक्ष के खिलाफ खूंटे को हिट करने के लिए सावधान नहीं किया जा रहा है।
- rinsed खूंटी ढक्कन चुनौती प्लेट में रखें। खूंटे और इस रूप में नीचे की थाली के बीच अनावश्यक संपर्क से बचें biofilm के लिए अग्रणी नुकसान होगाअसंगत परिणाम है।
- कदम 1.10 में वर्णित के रूप में पैराफिन फिल्म के साथ सील प्लेट और एक sealable प्लास्टिक की थैली में रख दें।
- एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए मिलाते हुए बिना थाली सेते हैं।
- 3.3 से biofilm दीक्षा प्लेट के नीचे ले लो। अच्छी तरह से एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग कर प्रत्येक में बैक्टीरिया Resuspend और सभी कुओं लेकिन पंक्ति एच में बाँझपन नियंत्रण में होने वाली विकास पुष्टि करने के लिए एक उपयुक्त microplate रीडर के साथ 600 आयुध डिपो को मापने
4. Biofilm निर्धारण
- रूपांतरण resazurin का पता लगाने के लिए एक थाली एक ऊष्मायन चैम्बर और गतिज प्रतिदीप्ति रीडिंग लेने में सक्षम के साथ सुसज्जित पाठक का प्रयोग करें। एक 530 एनएम उत्तेजना और 590 एनएम उत्सर्जन का उपयोग कर एक 24 घंटा गतिज प्रतिदीप्ति माप सेट करें।
- 37 डिग्री सेल्सियस के लिए चैम्बर तापमान सेट और प्लेट हर 20 मिनट में पढ़ा है। निर्माता के instruc के अनुसार प्लेट के नीचे से मापने के लिए प्लेट पाठक सेटमाहौल।
- एक बाँझ 96 अच्छी तरह से थाली करने के लिए एक multichannel विंदुक के साथ पीबीएस के 200 μl जोड़कर धोने की थाली तैयार करें।
- 0.8 मिलीग्राम के 400 μl जोड़कर biofilm वसूली के माध्यम से तैयार / ml 16 माइक्रोग्राम / एमएल resazurin के अंतिम एकाग्रता के लिए CRPMI माध्यम के 20 मिलीलीटर शेयर समाधान resazurin।
नोट: Resazurin एक ज्ञात अड़चन है। जबकि निपटने के लिए एक प्रयोगशाला कोट, छप चश्मे, और दस्ताने का प्रयोग करें। biofilm वसूली मीडिया के रूप में इस्तेमाल किया गया था CRPMI क्योंकि यह सबसे कम पृष्ठभूमि संकेत प्रदान करता है, लेकिन अगर उचित यह मुलर हिंटन मीडिया द्वारा बदला जा सकता है। - एक ताजा 96 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए एक multichannel विंदुक के साथ biofilm वसूली माध्यम के 150 μl जोड़ें।
- एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में स्थानांतरित इनक्यूबेटर से चुनौती प्लेट और सावधानी से प्लास्टिक बैग और सील फिल्म को हटा दें।
- चुनौती थाली से खूंटी ढक्कन निकालें और 3.4 में वर्णित के रूप में पीबीएस में planktonic कोशिकाओं से कुल्ला। बाद में आयुध डिपो के 600 एना के लिए चुनौती प्लेट के नीचे रखेंसेल (4.10 देखें)।
- rinsing के बाद, प्लेट biofilm वसूली मध्यम युक्त तल में खूंटी ढक्कन रखें।
- आयल फिल्म के साथ थाली की ओर लपेटें, परिधि कुओं के तल में बाधा डालती के लिए सावधान नहीं किया जा रहा है। इसके तत्काल बाद प्लेट लपेटकर के बाद, यह प्लेट रीडर पर डाल दिया है और 4.1 कदम से की शुरुआत पहले से गतिज प्रोटोकॉल resazurin बनाया द्वारा एक 24 घंटा अवधि में एक गतिज पढ़ें शुरू करते हैं।
- कि या चुनौती के दौरान हो सकता है और नहीं planktonic कोशिकाओं के विकास को यों, पूरे चुनौती प्लेट एक माइक्रो प्लेट रीडर का उपयोग नीचे के आयुध डिपो के 600 से पढ़ें। 3.8 चरण में दिए गए निर्देशों का पालन करें।
नोट: ध्यान से अच्छी तरह से biofilm बंद बहा कोशिकाओं अच्छी तरह से नीचे गुच्छों में विकसित करने के लिए करते हैं प्रत्येक की सामग्री resuspend। अच्छी तरह से भीतर किसी भी बुलबुले दृढ़ता से 600 आयुध डिपो रीडिंग के साथ हस्तक्षेप करेगा और बचा या पढ़ने से पहले हटा दिया जाना चाहिए।
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Representative Results
resazurin परख काफी संवेदनशील मज़बूती से बहुत कुछ व्यवहार्य चुनौती के बाद दवा मुफ्त माध्यम में नकल करने में सक्षम कोशिकाओं का पता लगाने के लिए है। इस पद्धति में, हम सबसे कम एकाग्रता, जिस पर कोई resazurin रूपांतरण 24 घंटा के भीतर देखा जाता है के रूप में कम से कम biofilm उन्मूलन एकाग्रता को परिभाषित। resazurin परख पाचन सक्रिय कोशिकाओं जो नीले रंग से डाई रंग परिवर्तित करने के लिए गुलाबी में पाया ऑक्सीडेटिव अणुओं पर निर्भर करता है। डाई रूपांतरण इस प्रकार सेल के विकास का सूचक है, और एक फ्लोरोसेंट सूक्ष्म प्लेट रीडर का उपयोग मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। इस पत्र में, neocuproine और घन neocuproine (neocuproine तांबे के साथ complexed) की ओर biofilm जुड़े एस उनकी गतिविधियों के लिए परीक्षण किया गया ऑरियस एक लेआउट है कि चित्रा 1 पर आधारित है आवेदन। डेटा प्रोटोकॉल के निष्पादन के दौरान प्राप्त biofilm दीक्षा प्लेट के एक आयुध डिपो के 600 पढ़ने, जो एक गुणवत्ता नियंत्रण के रूप में कार्य करता है (डेटा नहीं दिखाया गया है), चुनौती के बाद प्लेट नीचे के एक आयुध डिपो के 600 पढ़ने पूरा हो चुका है (2A चित्रा), और वसूली प्लेट (चित्रा 2 बी) के अपने फ्लोरोसेंट मेटाबोलाइट resorufin में resazurin रूपांतरण की एक काइनेटिक रिकॉर्डिंग। इसके अलावा, चुनौती प्लेट की एक छवि के समापन बिंदु resazurin रूपांतरण (चित्रा 2 सी) के दृश्य निरीक्षण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है अगर एक हाँ / resazurin रूपांतरण का कोई मूल्यांकन प्रयोग के प्रयोजन के लिए पर्याप्त है। वैकल्पिक रूप से, अगर गतिज रिकॉर्डिंग क्षमताओं अनुपलब्ध या एकाधिक रहे हैं प्लेटों समानांतर में चलाए जा रहे हैं, प्रतिदीप्ति एक भी समापन बिंदु पढ़ें द्वारा 24 घंटे के बाद निर्धारित किया जा सकता है। जैसा कि चित्र 2A में देखा, चुनौती थाली से आयुध डिपो रीडिंग से संकेत मिलता है कि अकेले neocuproine planktonic कोशिकाओं के विकास को बाधित नहीं करता है; हालांकि, घन neocuproine विकास 1.3 सुक्ष्ममापी पर, उम्मीद के रूप में 10 को रोकता है। एक समान पैटर्न biofilm थाली के resazurin गतिज से मनाया जाता है, यह दर्शाता हैकि केवल घन neocuproine पाचन सक्रिय biofilm से जुड़े कोशिकाओं (चित्रा 2 बी) को खत्म करने में सक्षम है।
biofilm उन्मूलन सांद्रता प्रदान करने के अलावा, काइनेटिक परख biofilm जो व्यवहार्य जीवाणुओं की संख्या का संकेत है की चयापचय राज्य के बारे में जानकारी प्रदान करता है। जब इलाज नियंत्रण करने के लिए सांद्रता बढ़ाने पर जेंटामाइसिन के साथ इलाज किया biofilms की तुलना, resazurin रूपांतरण के एक अंतराल (चित्रा 3) को देखा जा सकता है। 2.5 माइक्रोग्राम / एमएल जेंटामाइसिन के लिए, वहाँ एक 13 मानव संसाधन देरी जब तक अच्छी तरह इलाज नियंत्रण के रूप में resazurin का ही रूपांतरण पहुंचता है। इस अंतराल होने की संभावना इलाज की तुलना में इलाज biofilm में मौजूद व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या कम से आता है।
चित्रा 1. चैलेंज थाली लेआउट। Examplचुनौती थाली के ई लेआउट छह अलग सांद्रता में तीन प्रतियों में चार यौगिकों के समानांतर परीक्षण मिलनसार। इलाज और बाँझपन नियंत्रण भी शामिल किए गए हैं। लेआउट डिजाइन एक मल्टीचैनल pipet का उपयोग धारावाहिक dilutions के सुविधाजनक में प्लेट तैयार करने का समर्थन करता है। सांद्रता सुक्ष्ममापी में हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2. न्यूनतम biofilm उन्मूलन एकाग्रता का निर्धारण। Neocuproine और घन neocuproine biofilm उन्मूलन क्षमता के लिए परीक्षण किया गया। (ए) 600 आयुध डिपो biofilm अलग कोशिकाओं के विकास को यों की खूंटी ढक्कन को हटाने के बाद चुनौती थाली से लिया गया था। (बी) Resazurin रूपांतरण kinetically व्यक्तिगत में नजर रखी थीएक 24 घंटा अवधि में दोहरी कुओं। व्यक्तिगत minigraphs समय (24 घंटे) पर प्रतिदीप्ति (RFU) दिखा। resazurin रूपांतरण की कमी जीवित बचे लोगों के अभाव का संकेत है। Resazurin रूपांतरण biofilm बंद बहा और वसूली के माध्यम में बढ़ रही व्यवहार्य कोशिकाओं की उपस्थिति इंगित करता है। (ग) यदि एक काइनेटिक readout संभव या जरूरत है, तो एक साधारण हाँ / व्यवहार्य कोशिकाओं की उपस्थिति के लिए कोई जवाब नहीं है अपने गुलाबी, कम फार्म के लिए नीले resazurin का रंग रूपांतरण से नेत्रहीन निर्धारित किया जा सकता है नहीं नहीं है। करने के लिए यहाँ क्लिक करें यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।
चित्रा 3. काइनेटिक resazurin परख एक biofilm में बैक्टीरिया पर निरोधात्मक प्रभाव का पता चलता है। यौगिकों पूरी तरह से biofilm एम्बेडेड कोशिकाओं उन्मूलन नहीं हो सकता है, लेकिन अभी भी कम कर सकते हैंआईआर व्यवहार्यता। यह जब जेंटामाइसिन के विभिन्न सांद्रता के साथ इलाज कुओं के रूपांतरण resazurin की देरी की तुलना में देखा जा सकता है। वेल्स resazurin रूपांतरण करने में देरी की है कि व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या कम से संकेत मिलता है। काला (केवल मीडिया), ऑरेंज (0 माइक्रोग्राम / एमएल), ग्रीन (0.3 माइक्रोग्राम / एमएल), ब्लू (0.6 माइक्रोग्राम / एमएल), बैंगनी (2.5 माइक्रोग्राम / एमएल), और ग्रे (5 माइक्रोग्राम / एमएल)। Δt लगभग आधा अधिकतम प्रतिदीप्ति मूल्य पर इलाज और जेंटामाइसिन इलाज के नमूने के बीच घातीय resazurin रूपांतरण के समय अंतर को दर्शाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
यहाँ, हम एस पर परीक्षण अवरोधकों की गतिविधि का निर्धारण करने के लिए एक संशोधित biofilm परख का वर्णन किया है biofilm जुड़े कोशिकाओं की चयापचय राज्य पर ध्यान केंद्रित कर ऑरियस biofilms। जबकि वर्णित biofilm दीक्षा और चुनौती प्रक्रियाओं ज्यादातर मजाक उड़ाया निर्माता सिफारिशों, डाई resazurin के उपयोग का पता लगाने और biofilm से जुड़े कोशिकाओं है कि एक 24 घंटा अवरोध चुनौती जीवित रहने यों को नाटकीय रूप से सेल वसूली (पानी से स्नान sonification के माध्यम से) और बाद में गणन की सिफारिश की प्रक्रिया को सरल CFUs की गिनती के माध्यम से व्यवहार्य कोशिकाओं। इस निर्माता की सिफारिश की प्रक्रिया गहन, और स्वचालित करने के लिए अव्यावहारिक कम से कम 5 अतिरिक्त हेरफेर कदम है, उनमें से प्रत्येक का खतरा त्रुटि, श्रम शामिल है। खूंटी प्लेट परख के पढ़ने के लिए बाहर प्रक्रिया को सरल बनाने का लाभ उच्च throughput संचालन और अनुप्रयोगों के लिए अपने आकर्षण बढ़ जाती है।
हालांकि कदम की संख्या से एक लंबा प्रोटोकॉल, इस procedurई बजाय धारणात्मक सरल, कुछ महत्वपूर्ण कदम के साथ है। सबसे महत्वपूर्ण है, बार बार एक ही गुणवत्ता के biofilms विकसित करने की क्षमता प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक है। इसके अलावा, एक ख्याल जब भी हटाने या खूंटी ढक्कन की जगह व्यायाम करना चाहिए। एक अच्छी तरह से की दीवार के साथ किसी भी बिंदु पर संपर्क करें biofilm बाधित होता है, परिणाम skewing। और हां, तो पर्याप्त कपड़े धोने के लिए महत्वपूर्ण है: किसी भी बिंदु पर planktonic कोशिकाओं को हटाने के लिए विफलता biofilm से जुड़े बैक्टीरिया को मापने के लिए किसी भी क्षमता को हटा। इसके विपरीत, हालांकि, वाशिंग नहीं भी कठोर होना चाहिए; अतिरिक्त धोने कदम असंगत परिणामों के उत्पादन biofilm हटाने शुरू कर सकते हैं।
खूंटी प्लेट दृष्टिकोण वांछित परिणामी डेटा के आधार पर, कई का उपयोग करता है। परख एक फ्लोरोसेंट रंजक 11 में एक जानकारी युक्त चयापचय resazurin रूपांतरण की गतिज माप के रूप में यहाँ वर्णित है। इस रूपांतरण गुलाबी नीले रंग से एक रंग परिवर्तन (चित्रा -2) है, जो, additi में साथ जुड़ा हुआ हैमात्रात्मक प्रतिदीप्ति पढ़ने के लिए, बस रूपांतरण को देख कर एक आसान प्रारंभिक गुणात्मक readout के लिए अनुमति देता है। खूंटी ढक्कन हटाने के बाद, इस रूपांतरण भी 600 एनएम पर absorbance क्षमताओं प्रतिदीप्ति चाहिए उपलब्ध नहीं हो पढ़ने के द्वारा मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। हालांकि प्रतिदीप्ति अंततः अधिकतम डाई रूपांतरण पर प्रत्येक में अच्छी तरह से (जीवित बचे लोगों के साथ) पठारों, डाई रूपांतरण की शुरुआत अनुमान लगाने के लिए अनुपचारित नियंत्रण (चित्रा 3) के लिए पाचन सक्रिय उत्तरजीवी आबादी के सापेक्ष में इस्तेमाल किया जा सकता है। हमारे हाथ में हमने पाया है कि resazurin रूपांतरण की शुरुआत में प्रत्येक ~ 100 मिनट देरी अनुपचारित नियंत्रण करने के लिए शुरू inoculum रिश्तेदार (क्रमानुसार planktonic सेल संस्कृति पर निर्धारित के रूप में पाचन सक्रिय कोशिकाओं की संख्या में लगभग 10 गुना कमी से मेल खाती है 10 गुना वेतन वृद्धि biofilm वसूली माध्यम का उपयोग कर में पतला (डेटा नहीं दिखाया गया है))।
गतिज readouts से परे है, हालांकि, संशोधित खूंटी प्लेटविधि मूल प्रोटोकॉल की तुलना में उच्च throughput दवा स्क्रीन परियोजनाओं के लिए अधिक उत्तरदायी है। एक काइनेटिक के बजाय एक समापन बिंदु के रूप में रूपांतरण resazurin मापने के द्वारा, एक उपयोगकर्ता यौगिकों के सरल गतिविधि ट्रैक करने के लिए नमूनों की एक द्विआधारी विश्लेषण उत्पन्न कर सकते हैं (यानी, डाई रूपांतरण / कोई रूपांतरण) है, जो एक प्रतिदीप्ति प्लेट रीडर में 24 घंटे के लिए आवश्यकता को हटा , पारंपरिक incubations की अनुमति है। इस पद्धति न्यूनतम biofilm sonification और चढ़ाना की आवश्यकता के बिना एकाग्रता उन्मूलन निर्धारण करने के लिए अनुमति देता है। गतिज पढ़ें भी उपचार हालत और अवरोध एकाग्रता पर निर्भर करता है biofilm की चयापचय राज्य पटरियों। हेरफेर के कदम की कम संख्या में वृद्धि हुई, reproducibility, और मात्रात्मक readout विधि (के रूप में प्रत्येक चढ़ाना करने का विरोध अच्छी तरह से व्यक्तिगत 12) उपयोगकर्ताओं को एक एकल एकाग्रता स्क्रीन में संभावित प्रति दिन यौगिकों के हजारों स्क्रीन करने के लिए अनुमति देता है। वास्तव में, खूंटी-शैली प्लेटों पहले उच्च throughput डॉ में इस्तेमाल किया गया हैbiofilm dispersants के लिए स्नातकीय स्क्रीन, हालांकि resazurin (के रूप में यहां इस्तेमाल किया) मालिकाना luciferase अभिकर्मक 13 उपयोग किया तुलना में एक बहुत अधिक किफायती विकल्प है।
मौजूदा निर्माता प्रोटोकॉल पर एक सामान्य सुधार, परख यहाँ विशेष रुप से कुछ सीमाएं हैं, जबकि एक को ध्यान में रखना चाहिए। स्वाभाविक है, हम केवल biofilm से जुड़े कोशिकाओं की चयापचय क्षमता को मापने हैं। इस परख biofilm बड़े पैमाने पर उपाय नहीं है या अन्यथा biofilm वास्तुकला या अखंडता को कमजोर। उन प्रभावों का पता चला जरूरी नहीं होगा। पाचन निष्क्रिय है, लेकिन अभी भी व्यवहार्य, कोशिकाओं है, जो biofilms 14,15 में मौजूद दिखाया गया है persister भी नहीं चल पाता की जाएगी। इसके अलावा, यौगिकों कि वास्तव में एक biofilm ग़लती के रूप में झूठी सकारात्मक प्रकट हो सकता है, प्रेरित राज्य की लंबाई के आधार पर स्टरलाइज़ बिना निष्क्रियता प्रेरित। व्यवहार्यता संकेतक अंततः इस तरह से फ्लो या CFU के रूप में अधिक लोहे पहने माप तरीकों के लिए surrogates हैंगणन, और अंत उपयोगकर्ता निर्धारित करना चाहिए जो विधि उपयुक्त है। अंत में, के रूप में resazurin रूपांतरण अंतर्जात NADH पर निर्भर करता है, intracellular दुकानों की कमी बैक्टीरिया के लिए हानिकारक हो सकता है। हम एस के खिलाफ हानिकारक प्रभाव नहीं देखा गया है, जबकि ऑरियस, अन्य प्रजातियों के जीवाणु अलग तरह से प्रतिक्रिया हो सकती है। उपयोगकर्ताओं को परीक्षण अनुभव से और विश्वसनीयता और reproducibility दिया बदलती जीवों और प्रयोगशाला वातावरण के लिए इस प्रोटोकॉल को मान्य होगा।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mueller-Hinton Medium | Oxoid | CM0405 | Follow recommendations of manufacturer |
| RPMI-medium | Corning | 17-105-CV | |
| CRPMI | Ref 9 | RPMI-1640 medium chelexed for 1 hr with Chelex 100 resin and then supplemented with 10% unchelexed RPMI-1640 | |
| Chelex 100 Resin | Bio Rad | 142-2822 | |
| MBEC-plates | Innovotech | 19111 | |
| Resazurin Sodium Salt | Sigma | R7017 | 800 µg/ml in DI water Filter sterile |
| Micro Plate Shaking Platform | Heidolph Titramax 1000 | ||
| Cytation 3 Plate Reader | Biotek | ||
| Gen5 software | Biotek | Recording and analysis of resazurin conversion | |
| Neocuproine | Sigma | N1501 | prepare 10 mM stock in 100% Ethanol, store at -80 ºC |
| Copper sulfate | Acros Organics | 7758-99-8 | prepare a 100 mM stock solution in water, store at 4 ºC |
| Cu-Neocuproine | Self-Made | Generated by mixing equal molarities of neocuproine and copper sulfate. Mix was diluted in CRPMI medium to desired concentration. | |
| Gentamicin | Sigma | G3632-1G |
References
- Bjarnsholt, T., Ciofu, O., Molin, S., Givskov, M., Hoiby, N. Applying insights from biofilm biology to drug development - can a new approach be developed. Nat Rev Drug Discov. 12, 791-808 (2013).
- Song, Z., et al. Prosthesis infections after orthopedic joint replacement: the possible role of bacterial biofilms. Orthop Rev (Pavia). 5, 65-71 (2013).
- Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases). Nat Rev Microbiol. 2, 95-108 (2004).
- Bordi, C., de Bentzmann, S. Hacking into bacterial biofilms: a new therapeutic challenge. Ann Intensive Care. 1, 19 (2011).
- Fux, C. A., Shirtliff, M., Stoodley, P., Costerton, J. W. Can laboratory reference strains mirror 'real-world' pathogenesis? Trends Microbiol. 13, 58-63 (2005).
- Kwasny, S. M., Opperman, T. J. Static biofilm cultures of Gram-positive pathogens grown in a microtiter format used for anti-biofilm drug discovery. Curr Protoc Pharmacol. Chapter 13, Unit 13A 18 (2010).
- Ceri, H., et al. The MBEC Assay System: multiple equivalent biofilms for antibiotic and biocide susceptibility testing. Methods Enzymol. 337, 377-385 (2001).
- Ceri, H., et al. The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms. J Clinical Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).
- Baker, J., et al. Copper stress induces a global stress response in Staphylococcus aureus and represses sae and agr expression and biofilm formation. Appl Environ Microbiol. 76, 150-160 (2010).
- Haeili, M., et al. Copper complexation screen reveals compounds with potent antibiotic properties against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother. 58, 3727-3736 (2014).
- O'Brien, J., Wilson, I., Orton, T., Pognan, F. Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity. Eur J Biochem. 267, 5421-5426 (2000).
- Mah, T. F. Establishing the minimal bactericidal concentration of an antimicrobial agent for planktonic cells (MBC-P) and biofilm cells (MBC-B). J Vis Exp. (83), e50854 (2014).
- Junker, L. M., Clardy, J. High-throughput screens for small-molecule inhibitors of Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Antimicrob Agents Chemother. 51, 3582-3590 (2007).
- Shah, D., et al. Persisters: a distinct physiological state of E. coli. BMC Microbiol. 6, 53 (2006).
- Lewis, K. Riddle of biofilm resistance. Antimicrob Agents Chemother. 45, 999-1007 (2001).
