Introduction
Patogene mikrober kan danne biofilmer in vivo fører til ikke-akutte kroniske infeksjoner 1. Biofilm-assosiert infeksjon er en alvorlig risikofaktor for medisinske prosedyrer som involverer implantering av fremmedlegemer (f.eks kunstig bein erstatninger, brystimplantater) eller installasjon av trakealtubers eller urinkateter 2. I disse sammenhenger, er anti-infektiv terapi nesten alltid nødvendig som biofilm-baserte infeksjoner er sjelden fjernet på egen hånd, selv i immunkompetente personer. Staphylococcus aureus er en av de mest hyppigst observerte patogener innblandet i biofilm-relaterte komplikasjoner som oppstår under bruk av invasiv medisinsk utstyr 3.
Dessverre, selve innholdet av biofilm som en beskyttende barriere som gjør dem mer motstandsdyktige mot behandling enn planktoniske celler 1,4, og evaluering av forventet klinisk effekt er en viktig del av både innledendelegemiddelutvikling samt resistens overvåking. Det er økende erkjennelse av at laboratorieforhold, fokusert på planktoniske kulturer, kanskje ikke trofast representerer reell sykdom fem. Ytterligere compounding problemet, er replikering av biofilm fenotyper vanskelig, og eksisterende biofilm modeller er kjedelige og lider av høyt inter- og intra-assay 6 variabilitet. Dermed mange forskere, gjennom nødvendighet, som standard planktoniske celleanalyser av resistens, for derved potensielt å neglisjere et viktig aspekt av bakteriell virulens og sykdom.
Her beskriver vi protokollen for analyse av bakterier, spesielt S. aureus, i pre-vokst biofilmer benytte en 96-brønn basert biofilm system 7,8. Mens protokollen for biofilmdannelse og utfordring følger i hovedsak anbefaling fra produsenten, presenterer vi en alternativ informasjonsrikt metodikk for kvantifisering av levedyktighet av biofilm etter utfordring. I korthet bakterier er dyrket i pluggen plate, hvor biofilmer dannes på de utstikkende tapper som er festet til platen lokket. Etter at biofilmdannelse blir pinnene forsiktig dyppet i brønner i en ny plate som er fylt med PBS for å fjerne planktoniske celler. PEG-lokk, med biofilm festet, blir overført til en ny utfordring plate, inneholdende forskjellige konsentrasjoner av antibiotika skal bli analysert. Etter en andre inkubasjon, blir lokkene igjen fjernet, vasket og overført til en plate inneholdende gjenvinning av Resazurin fargestoff, hvor de gjennomgår en endelig inkubering. Resazurin konvertering kan tas opp kinetisk eller tas som et endepunkt lesing etter en definert utvinning perioden. Dette dye-basert metode for å kvantifisere levedyktighet av biofilm avviker betydelig fra de kjedelige CFU (colony forming units) teller basert metodikk beskrevet i den opprinnelige protokollen 7. OD 600 målinger av medikamentet utfordringen platen og resazurin konverteringskinetikk tjene som levedyktighet lestouts av planktoniske og biofilmceller, henholdsvis, og tilbyr en rask, pålitelig, informasjonsrike og teknisk enkel analyse for biofilm overlevelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Biofilm Innvielse
- Dyrk en kultur av biofilm produserende organisme i et næringsrikt medium. Vaksinere Staphylococcus aureus stamme Newman i 10 ml Mueller-Hinton medium fra en glyserol lager. Utføre alt arbeid med håndtering av S. aureus med hansker og innen biosikkerhet skap.
- Inkuber i 16 timer ved 37 ° C på en rotasjonsrister (100-200 rpm).
- Bestemme OD 600 av kulturen ved hjelp av et spektrofotometer, og en standard kuvette (banelengde: 1 cm).
- Beregn volumet (V) av kultur nødvendig for å forberede 20 ml inokulum med OD 600 (podestoff) på 0,1 i chelexed Roswell Park Memorial Institute media (cRPMI) 9 med formelen: [V = 20 ml * 0.1 / OD 600 (kultur )]
Merk: Referanse 9 gir detaljer om cRPMI forberedelse.- Tilsett beregnede kulturvolum (fra ovenfor) til et sentrifugerør og pellet-celler ved å spinne i 1 minutt ved 10.000 x g. til behandling anleggre biofilm inokulum, suge brukt vekstmedium og resuspender cellepelleten i 20 ml cRPMI.
- Hell inokulum i en 25 ml reservoar.
- Fjern forsiktig lokket fra en steril 96-brønners pinne plate ved å trekke den rett opp.
Merk: Det må utvises forsiktighet for ikke å forurense pinnene henger ned fra lokket. Lokket kan plasseres opp ned på en ren overflate i et biosikkerhet skap. - Ved hjelp av en 200 mL flerkanals pipette, tilsett 125 ul inokulum til hver brønn av radene A til G fra bunnplaten.
- Fill 125 ul sterilt cRPMI medium i hver brønn i rad H som en kontroll sterilitet.
- Ta peg-lokket og hold det over platen bunnen med pinnene vendt nedover. Forsiktig justere enkelte knagger med sine respektive brønner. Unngå fysisk kontakt mellom plate og knagger. Når justert, senke lokket forsiktig ned. Unngå forskyvninger som omstillinger utført etter pinnene har rørt bunnplaten kan fortsaminere sterilitet kontroller i rad H.
- Forsegle lokket til platen med parafin film for å forhindre fordampning og sted i en lukkbar pose, tetting tett. Holde luftvolumet i posen så lavt som mulig for å minimalisere fordampning.
- Inkuber uten risting ved 37 ° C i 48 timer i en 5% CO2 inkubator.
Merk: 48 hr av veksten har vært optimal for S. aureus, men vil variere basert på den organismen som benyttes.
Merk: Selv om statisk inkubasjon er et godt utgangspunkt for å optimalisere analysen, forsiktig risting ved 150 rpm på en mikroplaterister er en mulig variant som kan forbedre biofilmdannelse av noen S. aureus isolater.
2. Utarbeidelse av biofilm Challenge Plate
- På dagen for biofilmen utfordring å ta en ny 96-brønners plate og tilsett 100 ul av cRPMI, ekvilibrerte til romtemperatur, til hver brønn av radene B til H. For å unngå inkonsekvente resultater, benytter en 96-brønns plate som kan holde 200 ulav media når tappene er inne i, og har brønner med dimensjoner identiske med de for biofilm initiering plate.
- Fortynn opptil 4 testforbindelser separat i 1,0 ml cRPMI til 2 x den ønskede sluttkonsentrasjon, for å ta høyde for en endelig fortynning i trinn 2,7.
Merk: Et godt utgangspunkt er åtte ganger over den hemmende konsentrasjon av planktoniske celler. - Tilsett 200 ul av forbindelse 1 i brønner A1 til A3, sammensatte 2 i brønner A4 til A6, forbindelse 3 i brønner A7 til A9 og forbindelsen 4 i brønner A10 til A12.
- Serielt fortynnet testforbindelsene ved anvendelse av en multikanal pipette og overføre 100 ul fra rad A til rad B og bland.
- På denne måte fortsetter å overføre 100 ul brønn til brønn. Bland etter hver overføring og stoppe i rad F.
- Etter blanding utvise 100 ul fra rad F inn i en avfallsbeholder. Ikke overføre væske til rader G og H.
- Tilsett 100 cRPMI til hver brønn på platen ved hjelp av en multikanal pipette tilbringe volumet til 200 pl. Se figur 1 for endelig plate layout.
3. Biofilm Challenge
- Tilsett 200 ul av fosfatbufret saltvann (PBS) til en ny steril 96-brønns plate som inneholder brønner med dimensjoner identiske med de for biofilm initiering plate.
- Fjern plastposen og parafin film fra inkuberes biofilm initiering plate.
- Løft lokket rett opp. Unngå kontakt mellom pinnene og platen bunnen da dette kan skade biofilm. Hold nederste delen for påfølgende OD 600 analyse (se 3.8).
- Skyll av planktoniske celler ved å plassere den peg-lokket på platen inneholdende PBS (fra trinn 3.1). Senk knagger i 5 sek, løfte ut av PBS, og senk igjen, være forsiktig med å treffe pinnene mot brønn sider.
- Plasser skylles peg-lokket inn i utfordringen plate. Unngå unødig kontakt mellom pinnene og bunnplate som dette vil skade biofilm som fører tilinkonsistente resultater.
- Tetningsplate med parafin film og plasseres i en plastpose som kan lukkes som beskrevet i trinn 1,10.
- Inkuber platen uten risting i 24 timer ved 37 ° C i en 5% CO2 inkubator.
- Ta bunnen av biofilm initiering plate fra 3.3. Suspender bakterier i hver brønn med en multikanal pipette og måle OD 600 med en passende mikroplateleser for å bekrefte vekst forekommer i alle brønner men sterilitet kontrollene i rad H.
4. Biofilm Fastsettelse
- Bruker en plateavleser utstyrt med en inkubasjon kammer og i stand til å ta kinetiske fluorescens-målinger for deteksjon av resazurin konvertering. Sett opp en 24 timers kinetisk fluorescens måling ved hjelp av en 530 nm eksitasjon og 590 nm emisjon.
- Still kammertemperatur til 37 ° C og har platen lese hvert 20 min. Sett platen leseren til å måle fra bunnen av platen i henhold til produsentens instruksjoner.
- Tilberede vaskeplaten ved tilsetning av 200 ul av PBS med en multikanal pipette til en steril 96-brønners plate.
- Forbered biofilm utvinning medium ved tilsetning av 400 ul 0,8 mg / ml Resazurin stamoppløsning til 20 ml cRPMI medium til en sluttkonsentrasjon på 16 ug / ml Resazurin.
Merk: Resazurin er et kjent hudirriterende. Bruk labfrakk, beskyttelsesbriller og hansker ved håndtering. CRPMI som biofilmen gjenopprettingsmediet ble brukt fordi det gir den laveste bakgrunnssignalet, men det kan erstattes av Mueller Hinton mediet dersom det er hensiktsmessig. - Tilsett 150 ul av biofilm utvinning medium med en multikanal pipette til hver brønn av en frisk 96-brønns plate.
- Transfer utfordring plate fra inkubatoren i en biosikkerhet kabinett og forsiktig fjerne plastpose og forsegle film.
- Ta av peg-lokket fra utfordringen platen og skyll av planktoniske celler i PBS som beskrevet i 3.4. Hold bunnen av utfordringen plate for påfølgende OD 600 analyse (se 4.10).
- Etter skylling, plasserer peg-lokket inn i platen nederst inneholder biofilm gjenopprettingsmedium.
- Pakk siden av platen med parafin film, være forsiktig med å hindre bunnen av omkretsen brønner. Umiddelbart etter innpakning plate, legg den på tallerkenen leseren og starte en kinetisk lese over en 24 timers periode ved å initiere tidligere gjort resazurin kinetic protokoll fra trinn 4.1.
- For å kvantifisere vekst av planktoniske celler som kan eller ikke kan forekomme under utfordring, les OD 600 av hele utfordringen platen bunnen ved hjelp av en mikroplateleser. Følg instruksjonene i trinn 3.8.
Merk: resuspender forsiktig innholdet i hver brønn som celler shedding av biofilmen tendens til å vokse i klumper på bunnen av brønnen. Eventuelle bobler i brønnen vil sterkt påvirke OD 600 avlesninger og må unngås eller fjernes før lese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resazurin-analysen er følsom nok til å detektere meget pålitelig måte få levedyktige celler som er i stand til å replikere i medikamentfritt medium etter utfordring. I denne metoden, definerer vi den minimale biofilmen utrydd konsentrasjon som den laveste konsentrasjon ved hvilken ingen resazurin omdannelse sees innen 24 timer. Den resazurin analysen er avhengig av oksidative molekyler som finnes i metabolsk aktive celler som omdanner fargestoff farge fra blått til rosa. Dye omdannelse er således en indikator på cellevekst, og kan kvantifiseres ved bruk av en fluorescerende mikroplateleser. I denne utredningen, ble neocuproine og Cu-neocuproine (neocuproine kompleks med kobber) testet for sin aktivitet mot biofilm forbundet S. aureus påføring av et oppsett som er basert på figur 1. Resultatene oppnådd under utførelse av protokollen data er en OD 600 avlesning av biofilm initiering plate, som tjener som en kvalitetskontroll (data ikke vist), En OD avlesning 600 av platen bunnen etter utfordring er fullført (figur 2A), og en kinetisk opptak av resazurin omdannelse til sin fluorescerende metabolitt resorufin av oppsamlingsplaten (figur 2B). Videre kan et endepunkt bilde av utfordringen platen skal brukes for visuell inspeksjon av resazurin konvertering (figur 2C) dersom et ja / nei evaluering av resazurin konvertering er tilstrekkelig for formålet av forsøket. Alternativt, hvis kinetiske opptaksmuligheter er utilgjengelig eller fler platene blir kjørt i parallell, kan bestemmes fluorescens etter 24 timer ved en enkelt endepunkt lese. Som vist i figur 2A, OD-avlesninger fra utfordringen plate indikerer at neocuproine alene ikke hemmer veksten av planktoniske celler; inhiberer imidlertid Cu-neocuproine vekst på 1,3 uM, som forventet 10. Et lignende mønster er observert fra den kinetiske resazurin av biofilm plate, noe som indikererat bare Cu-neocuproine er i stand til å eliminere metabolsk aktive biofilm-assosierte celler (figur 2B).
I tillegg til å gi biofilm utryddelseskonsentrasjon, gir den kinetisk undersøkelse informasjon om den metabolske tilstand av biofilm som er en indikasjon på antallet levedyktige bakterier. Når man sammenligner biofilmer behandlet med gentamicin ved økende konsentrasjoner til de ubehandlede kontroller, kan et lag av resazurin konvertering bli sett (figur 3). For 2,5 ug / ml gentamicin, er det en 13 timers forsinkelse inntil brønnen har nådd den samme omdanning av resazurin som den ubehandlede kontroll. Dette lag kommer sannsynligvis fra et redusert antall av levedyktige celler som er til stede i den behandlede biofilm sammenlignet med den ubehandlede.
Figur 1. Challenge plate layout. Example layout utfordring plate imøtekommende parallell testing av fire forbindelser i tre eksemplarer på seks forskjellige konsentrasjoner. Ubehandlede og sterilitet kontroller er også inkludert. Layout design støtter praktisk in-plate utarbeidelse av serielle fortynninger ved hjelp av en flerkanals pipette. Konsentrasjoner er i mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Bestemmelse minimum biofilm utrydding konsentrasjon. Neocuproine og Cu-neocuproine ble testet for biofilm utrydding potensial. (A) OD 600 ble tatt fra utfordringen platen etter fjerning av peg-lokk for å kvantifisere vekst av biofilm dissosierte celler. (B) Resazurin konverteringen ble overvåket kinetisk i indivito brønner i løpet av en 24 timers periode. Individuelle minigraphs viser fluorescens (RFU) over tid (24 timer). Mangelen på resazurin omdannelse indikerer fravær av overlevende. Resazurin konvertering indikerer tilstedeværelse av levedyktige celler Shedding av biofilm og vokser i gjenopprettingsmedium. (C) Hvis en kinetisk avlesning ikke er mulig eller ikke nødvendig, da et enkelt ja / nei svar på tilstedeværelsen av levedyktige celler kan bestemmes visuelt fra fargen konvertering av det blå resazurin til sin rosa, redusert form. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3. Kinetisk resazurin analysen avslører hemmende virkning på bakterier i en biofilm. Forbindelser kan ikke fullt ut utrydde biofilm innebygde celler, men kan likevel redusereir levedyktighet. Dette kan sees ved sammenligning av forsinkelsen av Resazurin omdannelse av brønnene ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av gentamicin. Brønner som har en forsinkelse i resazurin omdannelse indikere et redusert antall av levedyktige celler. Svart (bare medium), Orange (0 ug / ml), grønn (0,3 ug / ml), blå (0,6 ug / ml), fiolett (2,5 ug / ml), og Gray (5 ug / ml). At refererer til tidsforskjellen fra eksponensiell resazurin konvertering mellom ubehandlet og gentamicin behandlet prøvene på omtrentlig halv maksimal fluorescens verdi. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her har vi beskrevet en modifisert biofilm-assay for bestemmelse av aktiviteten av testede inhibitorer på S. aureus biofilmer med fokus på den metabolske tilstand av biofilm forbundet celler. Mens den beskrevne biofilm initiering og duell prosedyrer for det meste etterlignet produsentens anbefalinger, bruk av Resazurin fargestoff for å påvise og kvantifisere biofilm-assosierte celler som overlever en 24-timers-inhibitor utfordring forenkler dramatisk den anbefalte fremgangsmåten i cellegjenvinning (via vannbad ultralydbehandling) og etterfølgende opplisting av levedyktige celler via telling av CFU. Denne produsenten anbefalte prosedyren innebærer minst 5 ekstra manipulasjon trinn, hver av dem feil utsatt, arbeidskrevende og upraktisk å automatisere. Fordelen med å forenkle utlesning Måten i tappen skålmetoden øker attraktiviteten for høy gjennomstrømning drift og anvendelser.
Selv om en lang protokoll med antall skritt, dette procedure er ganske konseptuelt enkelt, med få kritiske trinn. Mest avgjørende, evnen til gjentatte ganger å vokse biofilmer av samme kvalitet er vesentlig for å oppnå reproduserbare resultater. Videre må man utvise forsiktighet når du bytter den peg-lokket. Kontakt på noe punkt med et godt mur ville forstyrre biofilm, forvrenger resultater. Mer så, er tilstrekkelig vasking avgjørende: unnlatelse av å fjerne planktoniske celler på noe punkt fjerner muligheten til å måle biofilm-assosierte bakterier. Omvendt skjønt, vasking må ikke være for streng; flere vasketrinn kan begynne å fjerne biofilm, produsere inkonsistente resultater.
Tappen plate tilnærmingen har flere bruksområder, avhengig av den ønskede resulterende data. Analysen er beskrevet her som et informasjonsrikt kinetisk måling av metabolsk resazurin omdannelse til et fluorescerende fargestoff 11. Denne omdannelse er forbundet med en fargeforskyvning fra blått til rosa (figur 2C), som i additipå den kvantitative fluorescens lest, gir mulighet for en enkel innledende kvalitativ utlesning simpelthen ved å observere konverteringen. Etter fjerning av pinnen lokket, kan denne konverteringen også kvantifiseres ved å avlese absorbans ved 600 nm bør fluorescens funksjoner som ikke er tilgjengelige. Selv om fluorescens slutt platåer ved maksimal omdannelse fargestoff i hver brønn (med overlevende), kan den begynnende fargestoff omdannelse brukes til å estimere den metabolsk aktive overlevende populasjon i forhold til den ubehandlede kontroll (figur 3). I våre hender har vi funnet at hver ~ 100 min forsinkelse i begynnelsen av resazurin omdannelse tilsvarer omtrent en 10 gangers nedgang i antallet av metabolsk aktive celler i startpodestoff i forhold til den ubehandlede kontroll (bestemt på planktoniske cellekultur serielt fortynnet i 10-gangers inkrementer ved bruk av biofilm gjenvinning medium (data ikke vist)).
Utover kinetiske avlesninger, men den modifiserte pinne plateFremgangsmåten er mer mottagelig for high-throughput medikament skjermen projiseres enn den opprinnelige protokoll. Ved å måle resazurin omdannelse som et sluttpunkt i stedet for et kinetisk, kan en bruker generere en binær analyse av prøvene for å spore enkel aktivitet av forbindelser (dvs. fargestoff omdannelse / ingen konvertering), noe som fjerner behovet for 24 timer i en fluorescens plateleser , tillater konvensjonell inkubasjoner. Denne metoden gjør det mulig å bestemme den minimale biofilmen utrydde konsentrasjon uten behov for lydbehandling og platekledning. Den kinetiske lese sporer også den metabolske tilstand av biofilm, avhengig av behandlingstilstand og inhibitorkonsentrasjon. Det reduserte antall av manipulerende skritt, økt reproduserbarhet, og kvantitativ avlesning fremgangsmåte (i motsetning til plating hver brønn individuelt 12) gjør det mulig for brukerne å screene potensielt tusenvis av forbindelser per dag i en enkel konsentrasjon skjerm. Faktisk har peg-stil plater tidligere blitt brukt i high-throughput drug skjermer for biofilm dispergeringsmidler, men resazurin (som brukes her) er en mye mer økonomisk valg enn proprietær luciferase reagens benyttes 13.
Mens en generell forbedring i forhold til eksisterende produsent protokollen, analysen omtalt her har visse begrensninger man må huske på. Naturlig, er vi bare måle metabolsk evne biofilm-assosierte celler. Dette assay måler ikke biofilmmassen eller på annen måte svekke biofilm-arkitekturen eller integritet. Disse effektene vil ikke nødvendigvis bli oppdaget. Metabolsk inaktive, men fortsatt levedyktig, persister celler, som har vist seg å eksistere i biofilmer 14,15 vil også bli uoppdaget. Videre er forbindelser som induserer quiescence uten faktisk å sterilisere en biofilm kan feilaktig vist som falske positiver, avhengig av lengden av den induserte tilstand. Levedyktighet indikatorer er slutt surrogater for flere jern-kledd målemetoder som flowcytometri eller CFUopplisting, og sluttbrukeren må avgjøre hvilken metode som er hensiktsmessig. Til slutt, som det resazurin omdannelse er avhengig av endogen NADH, utarming av intracellulære lagre kan være skadelig for bakterier. Selv om vi ikke har observert skadelige effekter mot S. aureus, andre bakterielle arter kan reagere annerledes. Brukere må empirisk test og validere denne protokollen for pålitelighet og reproduserbarhet gitt varierende organismer og laboratoriemiljøer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mueller-Hinton Medium | Oxoid | CM0405 | Follow recommendations of manufacturer |
| RPMI-medium | Corning | 17-105-CV | |
| CRPMI | Ref 9 | RPMI-1640 medium chelexed for 1 hr with Chelex 100 resin and then supplemented with 10% unchelexed RPMI-1640 | |
| Chelex 100 Resin | Bio Rad | 142-2822 | |
| MBEC-plates | Innovotech | 19111 | |
| Resazurin Sodium Salt | Sigma | R7017 | 800 µg/ml in DI water Filter sterile |
| Micro Plate Shaking Platform | Heidolph Titramax 1000 | ||
| Cytation 3 Plate Reader | Biotek | ||
| Gen5 software | Biotek | Recording and analysis of resazurin conversion | |
| Neocuproine | Sigma | N1501 | prepare 10 mM stock in 100% Ethanol, store at -80 ºC |
| Copper sulfate | Acros Organics | 7758-99-8 | prepare a 100 mM stock solution in water, store at 4 ºC |
| Cu-Neocuproine | Self-Made | Generated by mixing equal molarities of neocuproine and copper sulfate. Mix was diluted in CRPMI medium to desired concentration. | |
| Gentamicin | Sigma | G3632-1G |
References
- Bjarnsholt, T., Ciofu, O., Molin, S., Givskov, M., Hoiby, N. Applying insights from biofilm biology to drug development - can a new approach be developed. Nat Rev Drug Discov. 12, 791-808 (2013).
- Song, Z., et al. Prosthesis infections after orthopedic joint replacement: the possible role of bacterial biofilms. Orthop Rev (Pavia). 5, 65-71 (2013).
- Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases). Nat Rev Microbiol. 2, 95-108 (2004).
- Bordi, C., de Bentzmann, S. Hacking into bacterial biofilms: a new therapeutic challenge. Ann Intensive Care. 1, 19 (2011).
- Fux, C. A., Shirtliff, M., Stoodley, P., Costerton, J. W. Can laboratory reference strains mirror 'real-world' pathogenesis? Trends Microbiol. 13, 58-63 (2005).
- Kwasny, S. M., Opperman, T. J. Static biofilm cultures of Gram-positive pathogens grown in a microtiter format used for anti-biofilm drug discovery. Curr Protoc Pharmacol. Chapter 13, Unit 13A 18 (2010).
- Ceri, H., et al. The MBEC Assay System: multiple equivalent biofilms for antibiotic and biocide susceptibility testing. Methods Enzymol. 337, 377-385 (2001).
- Ceri, H., et al. The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms. J Clinical Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).
- Baker, J., et al. Copper stress induces a global stress response in Staphylococcus aureus and represses sae and agr expression and biofilm formation. Appl Environ Microbiol. 76, 150-160 (2010).
- Haeili, M., et al. Copper complexation screen reveals compounds with potent antibiotic properties against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother. 58, 3727-3736 (2014).
- O'Brien, J., Wilson, I., Orton, T., Pognan, F. Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity. Eur J Biochem. 267, 5421-5426 (2000).
- Mah, T. F. Establishing the minimal bactericidal concentration of an antimicrobial agent for planktonic cells (MBC-P) and biofilm cells (MBC-B). J Vis Exp. (83), e50854 (2014).
- Junker, L. M., Clardy, J. High-throughput screens for small-molecule inhibitors of Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Antimicrob Agents Chemother. 51, 3582-3590 (2007).
- Shah, D., et al. Persisters: a distinct physiological state of E. coli. BMC Microbiol. 6, 53 (2006).
- Lewis, K. Riddle of biofilm resistance. Antimicrob Agents Chemother. 45, 999-1007 (2001).
