Introduction
Micróbios patogênicos podem formar biofilmes in vivo que levam a infecções crónicas não agudos 1. Infecções associadas aos biofilmes é um fator de risco grave de procedimentos médicos que envolvem a implantação de objetos estranhos (por exemplo, substitutos ósseos artificiais, implantes de mama) ou a instalação de tubos traqueais ou cateteres urinários 2. Nestes contextos, a terapia anti-infecciosa é quase sempre necessário, como infecções baseados em biofilme raramente são apuradas por conta própria, mesmo em indivíduos imunocompetentes. Staphylococcus aureus é um dos patógenos mais frequentemente observadas implicados em complicações relacionadas com o biofilme que ocorrem durante o uso de dispositivos médicos invasivos 3.
Infelizmente, a própria natureza do biofilme como uma barreira de protecção torna-as mais resistentes ao tratamento do que as células planctônicas de 1,4, e a avaliação da eficácia clínica predito é uma parte crítica de ambos inicialdesenvolvimento de medicamentos, bem como a vigilância da resistência de droga. Há um crescente reconhecimento de que condições de laboratório, com foco em culturas planctônicas, podem não representar fielmente a doença no mundo real 5. Para agravar ainda mais o problema, a replicação de fenótipos de biofilme é difícil, e os modelos de biofilmes existentes são tediosos e sofrem de elevada variabilidade inter- e intra-ensaio de seis. Assim, muitos pesquisadores, por necessidade, o padrão para ensaios de células planctônicas de sensibilidade às drogas, assim potencialmente negligenciar um aspecto importante da virulência bacteriana e doenças.
Aqui descrevemos o protocolo para o ensaio de bactérias, especificamente S. aureus, em biofilmes pré-cultivadas utilizando uma base 7,8 sistema biofilme de 96 poços. Enquanto o protocolo para a formação de biofilme e desafio segue essencialmente a recomendação do fabricante, apresentamos uma metodologia alternativa rico em informações para quantificar a viabilidade do BIOFilm após o desafio. Em resumo, as bactérias são cultivadas na placa de PEG, onde formam biofilmes sobre as cavilhas salientes ligados a tampa da placa. Após a formação do biofilme, os pinos são suavemente mergulhado em poços de uma placa fresca cheio com PBS para remover as células planctônicas. O PEG-tampa, com biofilmes em anexo, é transferido para uma nova placa de desafio, contendo várias concentrações de antibiótico a ser ensaiado. Após uma segunda incubação, as tampas são novamente removidos, lavados e transferidos para uma placa de recuperação de corante contendo resazurina, onde são submetidos a uma incubação final. conversão resazurina pode ser gravado cineticamente ou tomado como uma leitura nó de extremidade após um período de recuperação definido. Este método à base de corantes de quantificação da viabilidade do biofilme difere consideravelmente de CFU (unidades formadoras de colónias) tediosas metodologia baseada em contar descrito no protocolo original 7. OD 600 medições da placa desafio de drogas e resazurina cinética de conversão servir como leitura viabilidadeouts de células planctônicas e biofilme, respectivamente, oferecendo um ensaio rápido, confiável e tecnicamente simples rico em informações para a sobrevivência do biofilme.
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Protocol
1. biofilme Iniciação
- Crescer uma cultura de biofilme organismo produtor num meio rico em nutrientes. Inocular Staphylococcus aureus estirpe Newman, em 10 ml de meio de Mueller-Hinton a partir de um stock de glicerol. Realizar todos os trabalhos envolvendo a manipulação de S. aureus com luvas e dentro de um gabinete de biossegurança.
- Incubar durante 16 horas a 37 ° C num agitador rotativo (100-200 rpm).
- Determinar DO600 da cultura utilizando um espectrofotómetro e uma cuvete padrão (comprimento do caminho: 1 centímetro).
- Calcular o volume (V) de cultura necessário para preparar 20 ml de inoculo com a DO600 (inoculo) de 0,1 em chelexed meios de Roswell Park Memorial Institute (cRPMI) 9 utilizando a fórmula: [V = 20 ml * 0,1 / OD 600 (cultura )]
Nota: Referência 9 fornece detalhes sobre a preparação cRPMI.- Adicionar o volume calculado de cultura (de acima) a um tubo de centrífuga e as células de pelotas por centrifugação durante 1 min a 10.000 x g. para prepare inoculo biofilme, aspirar o sedimento de células e meio de crescimento gasto ressuspender em 20 ml de cRPMI.
- Pour inoculo para um reservatório de 25 ml.
- Remova cuidadosamente a tampa de uma placa de peg 96 poços estéril, puxando-o para cima.
Nota: É preciso ter cuidado para não contaminar os pinos de suspensão para baixo da tampa. A tampa pode ser colocado de cabeça para baixo em uma superfície limpa dentro de uma cabine de segurança biológica. - Usando uma pipeta de 200 uL de multi-canal, adicionar 125 uL de inoculo em cada cavidade de filas A a G da placa de fundo.
- Encha meio cRPMI 125 ul estéril em cada poço de uma fila H como o controle de esterilidade.
- Leve o peg-tampa e mantenha-o acima da parte inferior da placa com os pinos voltados para baixo. Alinhe cuidadosamente os pinos individuais com seus respectivos poços. Evitar o contacto físico entre a placa e as estacas. Uma vez alinhadas, abaixe a tampa com cuidado para baixo. Evitar distorções como reajustes realizados após as estacas ter tocado a placa de fundo pode contcontroles de esterilidade aminar em H. linha
- Selar a tampa para a placa com película de parafina para evitar a evaporação e coloque em um saco plástico lacrado, selando firmemente. Manter o volume de ar dentro do saco o mais baixo possível para minimizar a evaporação.
- Incubar sem agitação a 37 ° C durante 48 horas numa incubadora de CO2 a 5%.
Nota: 48 horas de crescimento tem sido óptimo para S. aureus, mas irá variar com base no organismo utilizado.
Nota: Embora incubação estática é um bom ponto de partida para optimizar o ensaio, agitando a 150 rpm num agitador de microplacas é uma variação possível que pode aumentar a formação de biofilme de alguns S. aureus.
2. Preparação da placa de biofilme Desafio
- No dia do desafio biofilme tomar uma placa de 96 poços frescas e adicionar 100 ul de cRPMI, equilibrada à temperatura ambiente, a cada poço de linhas B de H. A fim de evitar resultados inconsistentes, utilizar uma placa de 96 poços que pode conter 200 uldos meios de comunicação, quando as cavilhas são para dentro, e apresenta cavidades com dimensões idênticas às da placa de iniciação biofilme.
- Diluir até 4 compostos de teste separadamente em 1,0 ml de cRPMI para 2x a concentração final desejada, de modo a representar uma diluição final no passo 2.7.
Nota: Um bom ponto de partida é de 8 vezes acima da concentração inibitória das células planctônicas. - Adicionar 200 mL de composto 1 em poços A1 para A3, composto 2 em poços A4 a A6, composto 3 em poços A7 a A9 e composto 4 em poços A10 a A12.
- Diluir em série os compostos de teste, utilizando uma pipeta de canais múltiplos e transferir 100 ul da linha A para a linha B e misturar.
- Desse modo, continuam a transferir 100 ul poço a poço. Misturar após cada transferência e parar na linha F.
- Após a mistura, expulsar 100 ul de linha F em um recipiente de resíduos. Não transferir qualquer líquido linhas G e H.
- Adicionar 100 ul de cRPMI a cada poço da placa utilizando uma pipeta de canais múltiplos paraperfazer o volume de 200 uL. Veja a Figura 1 para o layout final da placa.
3. biofilme Desafio
- Adicionar 200 ul de solução salina tamponada com fosfato (PBS) a uma placa de 96 poços estéril fresco que apresenta cavidades com dimensões idênticas às da placa de iniciação biofilme.
- Retire o saco de plástico e filme de parafina a partir de chapa de iniciação biofilme incubadas.
- Levante a tampa para cima. Evitar o contacto entre as estacas e parte inferior da placa, pois isso pode danificar o biofilme. Manter parte inferior para posterior análise de OD 600 (ver 3.8).
- Enxaguar as células planctônicas, colocando o PEG-tampa sobre a placa contendo PBS (do passo 3.1). Submergir estacas por 5 segundos, levante fora da PBS, e submergir mais uma vez, tomando cuidado para não bater as estacas contra os lados também.
- Coloque a tampa peg-lavado na placa de desafio. Evite contato desnecessário entre pinos e placa de fundo, pois isso irá danificar o biofilme levando aresultados inconsistentes.
- placa de vedação com filme de parafina e coloque em um saco plástico lacrado como descrito no passo 1.10.
- Incubar a placa sem agitação durante 24 h a 37 ° C numa incubadora de CO2 a 5%.
- Tome parte inferior da placa de iniciação biofilme de 3,3. Ressuspender as bactérias em cada poço utilizando uma pipeta de canais múltiplos e medir a OD 600 com um leitor de microplacas adequado para confirmar o crescimento ocorre em todos os poços mas os controlos de esterilidade em linha H.
4. Determinação de biofilme
- Usar um leitor de placa equipado com uma câmara de incubação e capaz de tomar leituras de fluorescência para a detecção de resazurina cinéticas de conversão. Defina-se uma medição da fluorescência cinética 24 h usando uma excitação de 530 nm e 590 nm de emissão.
- Definir a temperatura da câmara para 37 ° C e tem a placa lida a cada 20 min. Definir o leitor de placas para medir a partir do fundo da placa de acordo com as instruções de fabricanteções.
- Prepare a placa de lavagem através da adição de 200 ul de PBS com uma pipeta de canais múltiplos para uma placa de 96 cavidades estéreis.
- Preparar o meio de recuperação de biofilme pela adição de 400 ul de 0,8 mg / ml de solução stock de resazurina para 20 ml de meio cRPMI a uma concentração final de 16 ug / mL de resazurina.
Nota: resazurina é um irritante da pele conhecido. Use uma bata de laboratório, óculos contra respingos e luvas durante o manuseio. CRPMI como os meios de recuperação de biofilme foi usado porque ele proporciona o menor sinal de fundo, mas pode ser substituído por meios de Mueller Hinton se for caso disso. - Adicionar 150 ul de meio de recuperação de biofilme com uma pipeta de canais múltiplos para cada poço de uma placa de 96 poços frescas.
- Transferir a placa desafio da incubadora em uma cabine de segurança biológica e remova cuidadosamente saco de plástico e filme de vedação.
- Remover o peg-tampa da placa de desafio e enxaguar células planctônicas em PBS, conforme descrito no ponto 3.4. Manter a parte inferior da placa de desafio subsequente por OD 600 analise (ver 4.10).
- Após a lavagem, coloque o peg-tampa na parte inferior da placa contendo o meio de recuperação do biofilme.
- Enrole a lado da placa com película de parafina, tendo o cuidado de não obstruir o fundo dos poços de perímetro. Imediatamente após o término do prato, coloque-o no leitor de placas e começar uma leitura cinética durante um período de 24 horas iniciando a feita anteriormente resazurina protocolo cinética a partir do passo 4.1.
- Para quantificar o crescimento das células planctônicas que podem ou não podem ocorrer durante o desafio, ler a OD 600 de toda a parte inferior da placa desafio usando um leitor de microplacas. Siga as instruções dadas no passo 3.8.
Nota: ressuspender cuidadosamente o conteúdo de cada poço como células derramamento fora do biofilme tendem a crescer em aglomerados na parte inferior do poço. Quaisquer bolhas dentro do bem irá interferir fortemente com leituras OD 600 e deve ser evitado ou removidos antes da leitura.
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Representative Results
O ensaio resazurina é sensível o suficiente para detectar com segurança muito poucas células viáveis, capazes de se replicar em meio livre de drogas após o desafio. Nesta metodologia, define-se a concentração mínima de biofilme erradicação como a concentração mais baixa à qual nenhuma conversão resazurina é observada após 24 h. O ensaio baseia-se resazurina em moléculas oxidativos encontrados em células metabolicamente activas, que convertem a cor do corante de azul para rosa. conversão de corante é assim um indicador de crescimento celular, e pode ser quantificada utilizando um leitor de microplacas fluorescente. Neste trabalho, neocuproína e Cu-neocuproína (neocuproína complexado com o cobre) foram testados para a sua actividade em direção biofilme associado S. aureus aplicação de uma disposição que se baseia na Figura 1. Os dados obtidos durante a execução do protocolo são um OD 600 de leitura da placa de iniciação de biofilme, que serve como um controlo de qualidade (dados não mostrados), Uma leitura de OD 600 da placa de fundo após o desafio foi concluída (Figura 2A), e uma gravação cinética de conversão resazurina em resorufina seu metabolito fluorescente da placa de recuperação (Figura 2B). Além disso, uma imagem ponto de extremidade da placa de desafio pode ser utilizado para inspecção visual da conversão resazurina (Figura 2C), se sim / não avaliação da conversão resazurina é suficiente para o objectivo da experiência. Em alternativa, se a capacidade de gravação de cinéticos não estão disponíveis ou múltipla placas são executados em paralelo, a fluorescência pode ser determinada após 24 horas por uma única leitura endpoint. Como pode ser visto na Figura 2A, as leituras de DO a partir da placa de desafio neocuproína indicam que por si só não inibir o crescimento de células planctônicas; No entanto, Cu-neocuproína inibe o crescimento em 1,3 uM, 10 como esperado. Um padrão similar é observado a partir da cinética de resazurina a placa de biofilme, indicandoque apenas Cu-neocuproína é capaz de eliminar células associada-biofilme metabolicamente activas (Figura 2B).
Além de proporcionar concentrações de erradicação de biofilme, o ensaio cinético fornece informação sobre o estado metabólico do biofilme, que é indicativo do número de bactérias viáveis. Ao comparar biofilmes tratados com gentamicina em concentrações crescentes para os controlos não tratados, um desfasamento de conversão pode ser visto resazurina (Figura 3). Para 2,5 ug / ml de gentamicina, existe um atraso de 13 horas até que o poço atinge a mesma conversão de resazurina como o controlo não tratado. Este atraso provavelmente vem a partir de um número reduzido de células viáveis presentes no biofilme tratados em comparação com o não tratado.
Figura 1. Desafio layout da placa. Example layout da placa desafio acomodar testes em paralelo de quatro compostos em triplicado em seis concentrações distintas. controlos não tratados e de esterilidade também estão incluídos. O projeto de layout suporta conveniente preparação na placa de diluições em série utilizando uma pipeta multicanal. As concentrações são em? M. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Determinação concentração mínima erradicação de biofilme. Neocuproína e Cu-neocuproína foram testadas para potencial erradicação de biofilme. (A) A DO600 foi feita a partir da placa de desafio após a remoção da cavilha de tampa para quantificar o crescimento das células do biofilme dissociado. Conversão (B) resazurina foi monitorizada cineticamente em indivipoços dupla ao longo de um período de 24 horas. minigraphs individuais mostram fluorescência (RFU) ao longo do tempo (24 h). A falta de conversão resazurina indica a ausência de sobreviventes. Resazurina conversão indica a presença de células viáveis derramamento fora do biofilme e que crescem no meio de recuperação. (C) Se uma leitura cinética não é possível ou não é necessário, então um simples resposta sim / não para a presença de células viáveis pode ser determinado visualmente a partir da conversão de cores da resazurina azul para a sua rosa, forma reduzida. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Ensaio resazurina cinética revela efeitos inibidores sobre bactérias num biofilme. Os compostos podem não erradicar completamente incorporado células de biofilme, mas ainda pode reduzir oviabilidade IR. Isto pode ser visto quando se comparam o atraso de resazurina conversão de poços tratados com diferentes concentrações de gentamicina. Wells que têm um atraso na conversão resazurina indicam uma redução do número de células viáveis. Preto (apenas meio), Laranja (0 ug / ml), verde (0,3 ug / ml), azul (0,6 ug / ml), roxa (2,5 ug / ml), e Gray (5 ug / ml). Dt refere-se ao diferencial de tempo de conversão resazurina exponencial entre as amostras não tratadas e gentamicina tratada na metade aproximada valor máximo de fluorescência. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aqui, nós descrevemos um ensaio de biofilme modificado para determinar a actividade de inibidores testados em S. biofilmes aureus com foco no estado metabólico das células do biofilme associado. Enquanto a iniciação biofilme descritos e procedimentos de desafio recomendações do fabricante principalmente imitava, a utilização de resazurina corante para detectar e quantificar células associada-biofilme que sobrevivem a um desafio inibidor 24 h simplifica significativamente o procedimento recomendado de recuperação de células (por sonificação banho de água) e contagem posterior de células viáveis através de contagem de UFC. Este procedimento recomendado pelo fabricante envolve, pelo menos, 5 passos de manipulação adicionais, cada um deles sujeito a erros, de trabalho intensivo, e impraticável para automatizar. A vantagem de simplificar o procedimento de leitura fora do ensaio de placa de peg aumenta a sua atractividade para as operações de alto rendimento e aplicações.
Embora um protocolo extenso pelo número de etapas, este Procedure é bastante conceitualmente simples, com poucos passos críticos. Mais importante, a capacidade de crescer repetidamente biofilmes da mesma qualidade é essencial para a obtenção de resultados reprodutíveis. Além disso, deve-se ter cuidado quando remover ou substituir a peg-tampa. Entre em contato a qualquer momento com a parede de um poço iria perturbar o biofilme, distorcendo os resultados. Mais ainda, a lavagem adequada é crucial: a falha para remover as células planctônicas em qualquer ponto remove qualquer capacidade de medir as bactérias associadas ao biofilme. Por outro lado, no entanto, a lavagem deve não ser muito rigorosa; as etapas de lavagem adicionais podem iniciar a remoção do biofilme, produzindo resultados inconsistentes.
A abordagem placa PEG tem múltiplas utilizações, dependendo dos dados resultante desejado. O ensaio é descrito aqui como uma medida cinética rico em informações da conversão resazurina metabólica em um corante fluorescente 11. Esta conversão está associado com uma mudança de cor de azul para rosa (Figura 2C), o que, em additipara a leitura de fluorescência quantitativa, permite uma leitura inicial qualitativa fácil simplesmente observando a conversão. Depois de retirar a tampa de PEG, esta conversão também pode ser quantificado por leitura da absorvância a 600 nm deverá fluorescência capacidades de não estar disponível. Embora a fluorescência, eventualmente planaltos após a conversão máxima de corante a cada poço (com sobreviventes), o início da conversão de corante pode ser usada para estimar a população sobrevivente metabolicamente activa em relação ao controlo não tratado (Figura 3). Nas nossas mãos, descobrimos que cada min atraso ~ 100 no início da conversão de resazurina corresponde aproximadamente a uma diminuição de 10 vezes no número de células metabolicamente activas no inoculo de partida em relação ao controlo não tratado (tal como determinado em cultura de células planctônicas serialmente diluiu-se em incrementos de 10 vezes utilizando meio de recuperação do biofilme (dados não mostrados)).
Além leituras cinéticas, no entanto, a placa peg modificadométodo é mais passível de projectos tela de drogas de alto rendimento do que o protocolo original. Ao medir resazurina conversão como um ponto final em vez de uma cinética, um utilizador pode gerar uma análise binária das amostras para controlar a atividade simples de compostos (isto é, a conversão de corante / sem conversão), o que elimina a necessidade de 24 horas em um leitor de placas de fluorescência , permitindo incubações convencionais. Esta metodologia permite determinar o biofilme mínima erradicar a concentração, sem necessidade de sonificação e revestimento. A leitura cinética também controla o estado metabólico do biofilme, dependendo das condições de tratamento e da concentração de inibidor. A redução do número de passos de manipulação, o aumento da reprodutibilidade, e método de leitura quantitativa (em oposição a cada poço individualmente plaqueamento 12) permite que os utilizadores tela milhares de compostos por dia, potencialmente, numa concentração única tela. De facto, as placas de estilo de PEG têm sido anteriormente utilizados em DR-alto rendimentotelas ug para dispersantes biofilme, embora resazurina (como usado aqui) é uma escolha muito mais econômico do que o reagente luciferase proprietária utilizada 13.
Enquanto uma melhoria geral sobre o protocolo existente fabricante, o ensaio apresentado aqui tem certas limitações é preciso ter em mente. Inerentemente, estamos apenas medindo a capacidade metabólica das células associada ao biofilme. Este ensaio não medir a massa de biofilme ou não enfraquecer a arquitectura ou a integridade do biofilme. Estes efeitos não seria, necessariamente, ser detectada. Metabolicamente inactiva, mas ainda viável, persister células, que tenham sido comprovada a existência de biofilmes 14,15 também vai deixar de ser detectada. Além disso, os compostos que induzem a quiescência sem realmente esterilização de um biofilme pode aparecer erroneamente como falsos positivos, em função da duração do estado induzido. indicadores de viabilidade são em última análise substitutos para mais métodos de medição de ferro-folheados, tais como citometria de fluxo ou CFUenumeração, eo usuário final deve determinar qual método é apropriado. Finalmente, como a conversão resazurina depende NADH endógeno, depleção dos estoques intracelulares pode ser prejudicial para as bactérias. Embora não tenhamos observado efeitos deletérios contra S. aureus, outras espécies bacterianas pode reagir de forma diferente. Os usuários devem empiricamente testar e validar este protocolo para a confiabilidade e reprodutibilidade dada organismos diferentes e ambientes de laboratório.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mueller-Hinton Medium | Oxoid | CM0405 | Follow recommendations of manufacturer |
| RPMI-medium | Corning | 17-105-CV | |
| CRPMI | Ref 9 | RPMI-1640 medium chelexed for 1 hr with Chelex 100 resin and then supplemented with 10% unchelexed RPMI-1640 | |
| Chelex 100 Resin | Bio Rad | 142-2822 | |
| MBEC-plates | Innovotech | 19111 | |
| Resazurin Sodium Salt | Sigma | R7017 | 800 µg/ml in DI water Filter sterile |
| Micro Plate Shaking Platform | Heidolph Titramax 1000 | ||
| Cytation 3 Plate Reader | Biotek | ||
| Gen5 software | Biotek | Recording and analysis of resazurin conversion | |
| Neocuproine | Sigma | N1501 | prepare 10 mM stock in 100% Ethanol, store at -80 ºC |
| Copper sulfate | Acros Organics | 7758-99-8 | prepare a 100 mM stock solution in water, store at 4 ºC |
| Cu-Neocuproine | Self-Made | Generated by mixing equal molarities of neocuproine and copper sulfate. Mix was diluted in CRPMI medium to desired concentration. | |
| Gentamicin | Sigma | G3632-1G |
References
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