Introduction
Patojen mikropların olmayan akut kronik enfeksiyonlara 1 giden in vivo biyofilm oluşturabilir. Biyofilm ilişkili enfeksiyon yabancı cisimler (örneğin, suni kemik değişimleri, meme implantları) veya trakea tüpler veya üriner kateterlerin 2 kurulumu implantasyonu içeren tıbbi prosedürler ciddi bir risk faktörüdür. Biyofilm tabanlı enfeksiyonlar nadiren kendi temizlenir olarak bu bağlamlarda, anti-enfektif tedavi bile immün sistemi sağlıklı bireylerde, hemen hemen her zaman gereklidir. Staphylococcus aureus kullanımı sırasında ortaya çıkan biyofilm ilişkili komplikasyon karıştığı En sık görülen patojenlerden biridir invazif tıbbi cihazlar 3.
Ne yazık ki, koruyucu bir bariyer olarak biyofilm doğası planktonik hücreler 1,4 den tedaviye onları daha dirençli hale getirir ve tahmin klinik etkinliği değerlendirilmesi hem ilk kritik bir parçasıdırilaç geliştirme yanı sıra ilaç direnç gözetim. Planktonik kültürler üzerinde duruldu laboratuvar koşulları, sadakatle gerçek dünya hastalığı 5 temsil olmayabilir artan bildirim yoktur. Sorunu daha bileşik, biyofilm fenotipleri çoğaltma zordur ve mevcut biyofilm modelleri sıkıcı ve yüksek içi ve tahlil değişkenliği 6 muzdarip. Böylece, birçok araştırmacı, zorunluluk yoluyla, böylece potansiyel bakteriyel virulans ve hastalığın önemli bir yönünü ihmal, uyuşturucu duyarlılık planktonik hücre deneyleri için varsayılan.
Burada özellikle, bakteri tahlil için S. protokolü açıklamak aureus, 96 oyuklu bir göre biyofilm sistemi 7,8 kullanarak önceden büyümüş Biyofilmlererde. biyofilm oluşumu ve meydan okuma için protokol esas üreticinin tavsiye takip ederken, biz biof canlılığı ölçülmesi için alternatif bir bilgi açısından zengin bir metodoloji sunmakmücadeleden sonra ilm. Kısaca, bakteriler, biyofilm levhanın kapak takılı çıkıntı yapan mandal üzerinde oluşan mandal plakası, kültürlenir. biyofilm sonra mandal yavaşça planktonik hücrelerini uzaklaştırmak için PBS ile dolu yeni bir levhanın gözleri içine daldırılır. PEG kapaklı ekli biyofilm ile deneye tabi antibiyotik çeşitli konsantrasyonlarını içeren, yeni bir meydan okuma plakasına aktarılır. ikinci bir inkübasyondan sonra, kapaklar daha çıkarılır, yıkanır ve son bir inkübasyon maruz boya, resazurin ihtiva eden bir geri kazanma plakasına aktarılır. Resazurin dönüşüm kinetik kaydedilmiş veya tanımlanmış bir iyileşme döneminden sonra bir bitiş noktası okuma olarak alınabilir. Biyofilm canlılığını nicel Bu boya temelli yöntem sıkıcı CFU (koloni oluşturan birim) önemli ölçüde orijinal protokolde 7'de tarif saymak tabanlı bir metodoloji farklıdır. İlaç meydan plaka ve dönüşüm kinetiği resazurin OD 600 ölçümler canlılığı okundu olarak hizmetbiyofilm hayatta kalmak için hızlı, güvenilir, bilgi açısından zengin ve teknik basit tahlil sunan sırasıyla planktonik ve biyofilm hücrelerinin çıkışları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Biyofilm Başlatma
- bir besleyici zengin ortam içinde biyofilm üreten bir organizmanın bir kültürü büyütün. Bir gliserol stokundan Mueller-Hinton ortamı, 10 ml Staphylococcus aureus suşu Newman inoküle. S. taşıma ile ilgili tüm çalışmaları gerçekleştirmek eldiven ve bir biyogüvenlik kabini içinde aureus.
- bir döner sallayıcı (100-200 rpm) ile 37 ° C'de 16 saat süreyle inkübe edilir.
- Bir spektrofotometre ve standart bir küvet (: 1cm yol uzunluğu) ile kültür OD 600 belirleyin.
- Formül kullanılarak chelexed Roswell Park Memorial Institute ortam (cRPMI) 9, 0.1 OD 600 (inokulum) ile inokulum 20 mi hazırlamak için gerekli kültür hacmi (V) hesaplayın: [V = 20 mi x 0.1 / OD 600 (kültür )]
Not: Referans 9 cRPMI hazırlanması ayrıntıları sağlar.- 10.000 x g'de 1 dakika için iplik, bir santrifüj tüpüne ve topak hücrelere (yukarıdan) hesaplanan kültür hacim. hazırlık aşamasında içinbiyofilm inokulum yeniden 20 ml cRPMI harcanan büyüme ortamı ve tekrar süspansiyon hücre pelletini aspire.
- 25 ml'lik bir hazne içine inokulum dökün.
- Dikkatle yukarı doğru çekerek steril 96-yuvalı peg plaka kapağı çıkarın.
Not: Bakım aşağı kapağın sarkan mandal kirletmesine dikkat edilmelidir. kapak bir biyogüvenlik kabini içinde temiz bir yüzeyin üstünde ters yerleştirilebilir. - 200 ul çok kanallı pipet kullanarak, taban plakasının G sıraları her oyuğuna 125 ul inokulum ekleyin.
- sterilite kontrolü olarak H sırası, her oyuk 125 ul steril cRPMI orta doldurun.
- peg-kapağı atın ve aşağı bakacak şekilde mandal ile plaka alt yukarıda tutun. Dikkatle kendi kuyuları ile bireysel mandal aynı hizaya getirin. plaka ve mandal arasındaki fiziksel temastan kaçının. hizalanmış sonra, dikkatlice aşağı kapağı indirin. mandal sonra gerçekleştirilen yeniden düzenlemeler alt plaka devam edebilir dokundu olarak misalignments kaçınınSatır H. aminat kısırlık kontrolleri
- sıkı sızdırmazlık, bir yapışmalı plastik bir torba içinde buharlaşmasını ve yer önlemek için parafin film ile plaka kapağı kapatılmalıdır. buharlaşmasını en aza indirmek için mümkün olduğunca düşük çantada hava hacmini tutun.
- % 5 CO2 inkübatöründe 48 saat süreyle 37 ° C'de çalkalanmadan inkübe edin.
Not: büyüme 48 saat S. için optimal olmuştur aureus, ancak değişir kullanılan organizmaya göre.
Not: Statik inkübasyon iyi bir başlangıç noktası olmasına rağmen hafifçe bir mikro-çalkalayıcı üzerinde 150 rpm'de sallayarak, tahlil optimize etmek için bazı S. biyofilm oluşumunu artırabilir olası bir varyasyon aureus izole eder.
Biyofilm Mücadelesi Plate 2. Hazırlık
- tutarsız sonuçlar önlemek için biyofilm meydan okumanın yapıldığı gün taze 96-yuvalı plaka almak ve H. B sıranın her çukuruna, oda sıcaklığına dengelendi cRPMI 100 ul, ilave 200 ul tutabilecek bir 96 oyuklu plaka kullanılmasıortam mandal içinde, ve biyofilm başlangıç plakasının özdeş boyutlara sahip kuyu olduğu takdirde,.
- Aşama 2.7 nihai bir seyreltme için hesaba katmak için, arzu edilen nihai konsantrasyonu 2x cRPMI 1.0 ml ayrı 4 test bileşiklerine kadar seyreltilir.
Not: İyi bir başlangıç noktası planktonik hücreler inhibitör konsantrasyonun üzerinde 8 kat daha fazladır. - A3, kuyu A12 A10 A9 kuyu A7 A6 kuyu A4 bileşik 2, bileşik 3 ve 4 bileşiği için kuyu A1 bileşik 1 200 ul ekle.
- Seri, çok kanallı pipet kullanarak test bileşiklerinin sulandırmak ve B satır ve karıştırmak için satır A 100 ul aktarın.
- Bu şekilde, iyi iyi 100 ul transfer devam etmektedir. Her aktarımdan sonra karıştırın ve satır F durdurmak
- karıştırıldıktan sonra, bir atık kabı içine satır F 100 ul sınırdışı. satırlar G ve H. herhangi bir sıvı transferi yapmayın
- Bir çok kanallı pipet kullanılarak plakanın her oyuğuna cRPMI 100 ul ekle200 ul hacim getirmek. Nihai plaka düzeni için Şekil 1'e bakınız.
3. Biyofilm Mücadelesi
- biyofilm başlangıç plakasının özdeş boyutlara sahip kuyu özellikleri taze, steril 96 gözlü plaka, fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 200 ul ekle.
- kuluçkaya biyofilm başlatma plakadan plastik torba ve parafin filmi çıkarın.
- yukarı doğru kapağını kaldırın. biyofilm zarar verebilir, bu kadar mandal ve plaka alt kısmı arasındaki temastan kaçının. (3.8 bakınız) sonraki OD 600 analiz için alt kısmını tutun.
- (Adım 3.1) PBS içeren plaka üzerine tahta kapağı koyarak planktonik hücreler durulayın. PBS üzerinden kaldırın, 5 sn mandal Batmak ve iyi tarafı karşı mandal vurmak için dikkatli olmak, bir kez daha daldırın.
- meydan plakası içine durulanır topaç kapağı yerleştirin. biyofilm giden zarar verecek bu kadar mandal ve alt plaka arasında gereksiz temastan kaçınıntutarsız sonuçlar.
- Adım 1.10 açıklandığı gibi mühür parafin film ile plaka ve yapışmalı plastik torbaya koyun.
- % 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C'de 24 saat boyunca çalkalamadan plaka inkübe edin.
- 3.3 ile biyofilm başlangıç plakanın alt alın. Iyi, çok kanallı pipet kullanarak her bakteri tekrar süspansiyon ve satır H. tüm kuyulara ama sterilite kontrolü meydana gelen büyüme onaylamak için uygun bir mikroplaka okuyucu ile OD 600 ölçmek
4. Biyofilm Belirlenmesi
- dönüşüm resazurin tespit etmek için bir kuluçka odası ve kinetik floresan okumaları alma yeteneğine sahip ile donatılmış bir plaka okuyucu kullanın. 530 nm uyarma ve 590 nm emisyon kullanarak 24 saat kinetik floresan ölçümü ayarlayın.
- 37 ° C oda sıcaklığını ayarlamak ve plaka her 20 dakikada okudum. üreticinin Okt. göre plaka tabanından ölçmek için plaka okuyucusu ayarlamaleri.
- Bir steril 96 oyuklu bir plaka çok kanallı bir pipet ile 200 ul PBS ilave edilerek Plakayı hazırlayın.
- 0.8 mg, 400 ul ekleyerek biyofilm geri orta hazırlayın / 16 ug / ml resazurin nihai bir konsantrasyona kadar cRPMI ortamı 20 ml stok çözeltisi resazurin ml.
Not: Resazurin bilinen bir cilt tahriş edicidir. işlenirken bir laboratuvar önlüğü, gözlük sıçrama ve eldiven kullanın. biyofilm kurtarma ortamı olarak cRPMI en düşük arka plan sinyali sağlar, çünkü kullanılan, ancak uygun eğer Mueller Hinton medya tarafından değiştirilebilir. - taze 96-yuvalı plakanın her oyuğuna çok kanallı bir pipet ile biyofilm geri kazanım aracına 150 ul ekle.
- Bir biyogüvenlik kabini içine inkübatör transfer meydan plakası ve dikkatle plastik torba ve mühürleme filmi çıkarın.
- meydan plaka tahta kapağını çıkarın ve 3.4 açıklandığı gibi PBS içinde planktonik hücreler durulayın. Sonraki OD 600 ana için zorluk plakanın alt tutunerimesi (4.10 bakınız).
- duruladıktan sonra, biyofilm kurtarma ortamı içeren plaka dibine tahta kapağı yerleştirin.
- çevre kuyuların dibine engel için dikkatli olmak, parafin film ile plakanın yan sarın. Hemen plaka tamamlamasından sonra, plaka okuyucusu üzerine yerleştirin ve adım 4.1 daha önce kinetik protokol resazurin yapılan başlatarak 24 saatlik bir süre boyunca, bir kinetik okuma başlar.
- Ya da zorlukla sırasında meydana olmayabilir planktonik hücrelerin büyümesini ölçmek için, bir mikro-plaka okuyucusu kullanılarak, tüm zorluk plakası alt OD 600 oku. Adım 3.8'de verilen talimatları izleyin.
Not: Dikkatle iyi biyofilm kapalı dökülme hücreler kuyunun dibinde yığınlarda büyürler her içeriğini tekrar süspansiyon. Kuyunun içinde herhangi bir baloncuklar kuvvetle OD 600 okuma engeller ve kaçınılması veya okuma öncesinde çıkarılmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
resazurin deney güvenilir mücadeleden sonra, ilaç barındırmayan ortam içinde replike edebilen çok az canlı hücreleri saptamak için yeterince hassastır. Bu metodoloji, biz hiçbir resazurin dönüşüm 24 saat içinde görülür ki en düşük konsantrasyon olarak en az biyofilm ortadan kaldırılması konsantrasyonunu tanımlar. resazurin tahlil pembe maviden boya rengi dönüştürmek metabolik olarak aktif hücrelerde bulunan oksidatif moleküller dayanır. Boya dönüşümü, bundan ötürü hücre büyümesinin bir göstergesidir ve bir flüoresan mikro plaka okuyucusu kullanılarak belirlenebilir. Bu yazıda, neocuproine ve Cu-neocuproine (neocuproine bakır ile kompleks) biyofilm ilişkili S. karşı olan aktivite için test edildi aureus, Şekil 1 'göre bir düzen uygulanması. protokol yürütülmesi sırasında elde edilen veriler, bir kalite kontrol olarak hizmet biyofilm başlangıç plakasının OD 600 okuma olan (veriler gösterilmemiştir), Mücadeleden sonra plaka alt bir OD 600 okuma (Şekil 2A) tamamlandı ve kurtarma plakası (Şekil 2B) onun floresan metaboliti resorufine içine resazurin dönüşüm kinetik kayıt edilmiştir. Bundan başka, zorluk plakasının uç görüntüsü evet / resazurin dönüşüm bir değerlendirme deney amaç için yeterli ise, resazurin dönüşüm (Şekil 2C) görsel inceleme kullanılabilir. Alternatif olarak, kinetik kayıt yetenekleri kullanılamaz veya birden fazla varsa plakalar paralel olarak işletilmektedir, floresan, tek bir uç nokta okuma ile 24 saat sonra tespit edilebilir. Şekil 2A'da görüldüğü gibi, meydan plakadan OD okumaları, tek başına neocuproine planktonik hücrelerinin büyümesini inhibe etmediğini gösterir; 10 Ancak, beklendiği gibi, Cu-neocuproine, 1.3 uM'de büyümesini engeller. Benzer bir model gösteren, biyofilm plakasının resazurin kinetik gelen görülmektedirsadece Cu neocuproine metabolik olarak aktif biyofilm ile ilişkili hücreler (Şekil 2B) ortadan kaldırmak mümkün değildir.
biyofilm eradikasyon konsantrasyonları sağlamasına ek olarak kinetik deney canlı bakteri sayısını göstermektedir biyofilm metabolik durumu hakkında bilgi verir. Muamele edilmemiş kontrollere Artan konsantrasyonlarda gentamisin ile muamele biyofilm karşılaştırıldığında, resazurin dönüşümün bir gecikme (Şekil 3) görülmektedir. iyi tedavi edilmemiş kontrol olarak resazurin aynı dönüşüm ulaşıncaya kadar 2.5 ug / ml gentamisin için, 13 saat gecikme vardır. Bu gecikme muhtemelen muamele edilmemiş ile karşılaştırıldığında tedavi edilen biyofilm içinde mevcut canlı hücre sayısı azaltılmış gelir.
Şekil 1. Mücadelesi plakası düzeni. Examplaltı farklı konsantrasyonlarda triplikat olarak dört bileşiğin paralel olarak test barındıran meydan plakasının e düzeni. Tedavi edilmeyen ve sterilite kontrolleri de dahil edilmiştir. düzen tasarım çok kanallı pipet kullanarak seri dilüsyonları uygun olarak plaka hazırlanmasını destekler. Konsantrasyonları uM bulunmaktadır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. az biyofilm eradikasyon konsantrasyonunun belirlenmesi. Neocuproine Cu-neocuproine biyofilm eradikasyon potansiyeli için test edilmiştir. (A), OD 600 biyofilm ayrışmış hücrelerin büyümesini ölçmek için tahta kapağın çıkarılmasından sonra meydan levhadan alınmıştır. (B) Resazurin dönüşüm Indivi kinetik olarak gözlenmiş24 saatlik bir süre boyunca ikili kuyular. Bireysel minigraphs zaman (24 saat) boyunca floresan (RFU) göstermektedir. resazurin dönüşüm eksikliği kurtulanların yokluğunu gösterir. Resazurin dönüşüm biyofilm kapalı tutan ve geri ortamda gelişen canlı hücrelerin varlığını gösterir. Bir kinetik okuma, daha sonra basit bir evet / canlı hücrelerin varlığı için hiçbir cevap onun pembe, indirgenmiş forma, mavi resazurin renk dönüşüm görsel tespit edilebilir gerekli mümkün ya da değil değilse (C). Için tıklayınız Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek.
Şekil 3. Kinetik resazurin tahlil Bileşikler tam biyofilm gömülü hücrelerini yok değil. Bir biyofilm bakteriler üzerinde inhibitör etkilere ortaya, ama yine de azaltabilirir canlılığı. gentamisin farklı konsantrasyonları ile muamele edilmiş kuyu dönüşüm resazurin gecikme karşılaştırıldığında bu durum görülebilir. resazurin dönüşüm bir gecikme kuyularda canlı hücre, daha az sayıda işaret etmektedir. Siyah (yalnızca ortam), turuncu (0 ug / ml), yeşil (0.3 ug / ml), mavi (0.6 ug / ml), Menekşe (2.5 ug / ml) ve gri (5 ug / ml). ¨t yaklaşık yarım maksimum floresan değerde işlenmemiş ve gentamisin tedavisi örnekler arasında üstel resazurin dönüşüm zamanı farkı ifade eder. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, S. üzerinde test inhibitörlerinin aktivitesinin belirlenmesi için bir tadil edilmiş biyofilm tahlili tarif etmişlerdir biyofilm ilişkili hücrelerin metabolik durumuna odaklanan aureus biyofilm. açıklanan biyofilm başlatma ve meydan prosedürleri çoğunlukla taklit üretici tavsiyelerine rağmen, 24 saat inhibitörü meydan hayatta biyofilm ilişkili hücreleri tespit ve ölçmek için boya resazurin kullanımı dramatik hücre (su banyosu sonification aracılığıyla) kurtarma ve sonraki numaralandırma önerilen prosedürü kolaylaştırır CFU sayma via canlı hücreler. Bu üreticinin önerdiği prosedür yoğun ve otomatikleştirmek için pratik en az 5 ek manipülasyon adımları, her biri eğilimli hata, emek gerektirir. peg plaka tahlil okuma-out prosedürü basitleştirilmesi avantajı yüksek verimli operasyonlar ve uygulamalar için cazibesini artırmaktadır.
adım sayısı ile uzun bir protokol bu prosedüründe rağmene birkaç kritik adımda, oldukça kavramsal olarak basittir. En önemlisi, tekrar tekrar aynı kalitede biyofilm büyüme yeteneği tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için önemlidir. kaldırma veya PEG-kapağı yerine her Ayrıca, bir özen göstermelidirler. sonuçları çarpıtan, biyofilm bozacak bir kuyunun duvarı ile herhangi bir noktada kurun. Daha çok, yeterli yıkama çok önemlidir: herhangi bir noktada planktonik hücreleri çıkarmak için başarısızlık biyofilm ilişkili bakteriler ölçmek için herhangi bir yeteneği kaldırır. Tersine, olsa da, yıkama çok titiz olmamalıdır; Ek yıkama adımlar tutarsız sonuçlar üreten, biyofilm yapısını yok başlayabilir.
peg plaka yaklaşımı istenen elde edilen verilere bağlı olarak, birden çok kullanım alanı vardır. Deney, bir floresan boya 11 metabolik resazurin dönüşüm bilgi açısından zengin bir kinetik ölçümleri burada tarif edilmektedir. Bu dönüşüm, pembe mavi bir renk değişimi (Şekil 2C), Additi olarak ilişkilidirkantitatif floresan okuma üzerine, sadece dönüşüm gözlemleyerek kolay bir başlangıç nitel okuma için izin verir. PEG kapak çıkarıldıktan sonra, bu dönüşüm de mevcuttur vermeye yetenekleri floresan gereken 600 nm'de absorbans okunarak ölçülebilir. Floresan sonunda (kurtulan) her maksimum boya dönüştürülmesi üzerine düzleşir rağmen, boya dönüşüm başlangıcı muamele edilmemiş kontrol (Şekil 3), metabolik olarak aktif kalanlar popülasyon göreceli tahmin etmek için kullanılabilir. Elimizde olanlar, biz resazurin dönüşüm başlangıcı her ~ 100 dakika sonra görüntüleme seri planktonik hücre kültürü üzerinde belirlenen muamele edilmemiş kontrol ile başlayarak inokulum nisbetle (metabolik olarak aktif hücrelerin sayısında yaklaşık 10 kat azalma tekabül bulduk biyofilm geri ortamı kullanılarak 10 kat artışlar halinde seyreltilmiş) (veriler gösterilmemiştir).
kinetik okumalarla ötesinde olsa da, modifiye peg plakayöntem, orijinal protokole göre yüksek verimli ilaç ekran projelerine daha müsait. Yerine kinetik bir son nokta olarak dönüşüm resazurin ölçerek, bir kullanıcı bileşiklerinin basit etkinliği izlemek için örneklerin bir ikili analizini üretebilir (yani, boya dönüşüm / dönüşüm yok) bir floresan plaka okuyucu 24 saat ihtiyacını ortadan kaldırır, geleneksel inkübasyonlar olanak tanımaktadır. Bu metodoloji, sonifikasyon ve kaplama gerek kalmadan konsantrasyonu ortadan kaldırılması az biyofilm saptanması için izin verir. kinetik okuma da tedavi durumuna ve inhibitör konsantrasyonuna bağlı olarak biyofilm metabolik durumunu izler. Manipülasyon adım sayısında azalma, artan tekrarlanabilirlik ve kantitatif okuma yöntemi (her kaplama karşı da ayrı ayrı 12), kullanıcıların tek bir konsantrasyon ekranda potansiyel günde bileşiklerin binlerce ekran sağlar. Aslında, PEG tarzı plakalar, daha önce yüksek verimli dr kullanılmaktadırbiyofilm dağıtıcılar için ug ekranlar, (burada kullanıldığı gibi) resazurin 13 kullanılan tescilli lusiferaz reaktifi çok daha ekonomik bir seçenek olsa da.
Mevcut üretici protokolü üzerinden genel bir iyileşme, burada yer tahlil bazı sınırlamalar var iken bir akılda tutmak gerekir. Doğası gereği, sadece biyofilm ilişkili hücrelerin metabolik yeteneği ölçüyoruz. Bu tahlil biyofilm kütlesini ölçmek veya başka biyofilm mimarisi veya bütünlüğünü zayıflatmak değildir. Bu etkiler mutlaka tespit olmaz. Biyofilm 14,15 varolduğu gösterilmiştir hücreleri persister, metabolik olarak inaktif, ama yine de uygulanabilir da tespit edilemez olacaktır. Dahası, aslında bir biyofilm yanlışlıkla kaynaklı devletin uzunluğuna bağlı olarak, yanlış pozitif olarak görünebilir sterilize etmeden sessizliğini neden bileşikler. Canlılık göstergeleri sonuçta böyle bir akış sitometri veya CFU olarak daha fazla demir kaplı ölçüm yöntemleri için Suretler vardırnumaralandırma ve uygun yöntemi belirlemeleri gerekir son kullanıcı. resazurin dönüşüm endojen NADH dayanır Son olarak, hücre içi mağaza tükenmesi bakteriler için zararlı olabilir. Biz S. karşı zararlı etkileri görülmez olsa da aureus, diğer bakteri türleri farklı tepki olabilir. Kullanıcılar testi deneysel olarak ve güvenilirlik ve uyarlık verilen değişen organizmalar ve laboratuar ortamları için bu protokolü doğrulamak gerekir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mueller-Hinton Medium | Oxoid | CM0405 | Follow recommendations of manufacturer |
| RPMI-medium | Corning | 17-105-CV | |
| CRPMI | Ref 9 | RPMI-1640 medium chelexed for 1 hr with Chelex 100 resin and then supplemented with 10% unchelexed RPMI-1640 | |
| Chelex 100 Resin | Bio Rad | 142-2822 | |
| MBEC-plates | Innovotech | 19111 | |
| Resazurin Sodium Salt | Sigma | R7017 | 800 µg/ml in DI water Filter sterile |
| Micro Plate Shaking Platform | Heidolph Titramax 1000 | ||
| Cytation 3 Plate Reader | Biotek | ||
| Gen5 software | Biotek | Recording and analysis of resazurin conversion | |
| Neocuproine | Sigma | N1501 | prepare 10 mM stock in 100% Ethanol, store at -80 ºC |
| Copper sulfate | Acros Organics | 7758-99-8 | prepare a 100 mM stock solution in water, store at 4 ºC |
| Cu-Neocuproine | Self-Made | Generated by mixing equal molarities of neocuproine and copper sulfate. Mix was diluted in CRPMI medium to desired concentration. | |
| Gentamicin | Sigma | G3632-1G |
References
- Bjarnsholt, T., Ciofu, O., Molin, S., Givskov, M., Hoiby, N. Applying insights from biofilm biology to drug development - can a new approach be developed. Nat Rev Drug Discov. 12, 791-808 (2013).
- Song, Z., et al. Prosthesis infections after orthopedic joint replacement: the possible role of bacterial biofilms. Orthop Rev (Pavia). 5, 65-71 (2013).
- Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases). Nat Rev Microbiol. 2, 95-108 (2004).
- Bordi, C., de Bentzmann, S. Hacking into bacterial biofilms: a new therapeutic challenge. Ann Intensive Care. 1, 19 (2011).
- Fux, C. A., Shirtliff, M., Stoodley, P., Costerton, J. W. Can laboratory reference strains mirror 'real-world' pathogenesis? Trends Microbiol. 13, 58-63 (2005).
- Kwasny, S. M., Opperman, T. J. Static biofilm cultures of Gram-positive pathogens grown in a microtiter format used for anti-biofilm drug discovery. Curr Protoc Pharmacol. Chapter 13, Unit 13A 18 (2010).
- Ceri, H., et al. The MBEC Assay System: multiple equivalent biofilms for antibiotic and biocide susceptibility testing. Methods Enzymol. 337, 377-385 (2001).
- Ceri, H., et al. The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms. J Clinical Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).
- Baker, J., et al. Copper stress induces a global stress response in Staphylococcus aureus and represses sae and agr expression and biofilm formation. Appl Environ Microbiol. 76, 150-160 (2010).
- Haeili, M., et al. Copper complexation screen reveals compounds with potent antibiotic properties against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother. 58, 3727-3736 (2014).
- O'Brien, J., Wilson, I., Orton, T., Pognan, F. Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity. Eur J Biochem. 267, 5421-5426 (2000).
- Mah, T. F. Establishing the minimal bactericidal concentration of an antimicrobial agent for planktonic cells (MBC-P) and biofilm cells (MBC-B). J Vis Exp. (83), e50854 (2014).
- Junker, L. M., Clardy, J. High-throughput screens for small-molecule inhibitors of Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Antimicrob Agents Chemother. 51, 3582-3590 (2007).
- Shah, D., et al. Persisters: a distinct physiological state of E. coli. BMC Microbiol. 6, 53 (2006).
- Lewis, K. Riddle of biofilm resistance. Antimicrob Agents Chemother. 45, 999-1007 (2001).
