Summary
Retinal pigment epitelet (RPE) erstatning strategier og gen-basert terapi anses for flere retinal degenerative forhold. For klinisk oversettelse blir store øyne dyremodeller som kreves for å studere kirurgiske teknikker som gjelder hos pasienter. Her presenterer vi en kanin modell for subretinal kirurgi rettet mot RPE transplantasjon, som er allsidig og kostnadseffektiv.
Abstract
Aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD), retinitis pigmentosa, og andre RPE relaterte sykdommer er de vanligste årsakene til irreversible synstap hos voksne i industrielt utviklede land. RPE transplantasjon synes å være en lovende behandling, da det kan erstatte dysfunksjonelle RPE, gjenopprette dens funksjon, og derved syn.
Her beskriver vi en metode for å transplantere en kultivert RPE monolag på et stillas inn i subretinal plass (SRS) av kaniner. Etter vitrectomy xenotransplants ble levert inn i SRS ved hjelp av en spesiallaget skytespill som består av en 20-gauge metallic munnstykke med en polytetrafluoretylen (PTFE) belagt stempelet. Den nåværende teknikk utviklet seg i over 150 kanin operasjoner over 6 år. Postoperativ oppfølging kan oppnås ved hjelp av ikke-invasiv og repeterende in vivo avbildning slik som spektral domene optisk koherens tomografi (SD-oktober) etterfulgt av perfusjon fiksert histologi.
the metoden har veldefinerte trinn for enkel læring og høy suksessrate. Kaniner er ansett som en stor øye dyremodell nyttige i prekliniske studier for klinisk oversettelse. I denne sammenheng kaniner er en kostnadseffektiv og kanskje praktisk alternativ til andre store øyne dyremodeller.
Introduction
Aldersrelatert macula degenerasjon (AMD) er den vanligste årsaken til synshemming hos voksne i alderen 50 år eller eldre i industrielt utviklede land, da det fører til tap av sentral visjon. Omtrent 15% av disse pasientene lider av "våt" form av sykdommen, hvor neovaskularisering stammer fra årehinnen og forstyrrer retinal funksjon 1. Denne varianten kan bli behandlet av en meget effektiv terapi med gjentatt intra vitreal injeksjoner av antiangiogene midler 2. Men det store flertallet av pasientene (~ 85%) lider av tørr form, som er preget av ekstracellulære avleiringer (f.eks drusen) under retinal pigment epitel (RPE). Disse forekomstene føre RPE dysfunksjon fører til retinal atrofi i makula. Gitt mangelen på noen helbredende behandlingsalternativer, AMD utviklet seg til et intensivt utvikle forskningsfeltet, hvor mange ulike kurative terapeutiske tilnærminger blir testet. Kirurgisk RPE erstatning eren attraktiv fremtidig mulighet for å bekjempe denne ødeleggende sykdommen 3.
Autolog subretinal RPE transplantasjon erstatter dysfunksjonell eller tapt RPE i makula, og har potensial til å gjenopprette sin fysiologiske funksjon 4-9. Denne kirurgiske teknikken hadde et gjennombrudd med utvikling av RPE differensiering protokoller fra humane embryonale stamceller (hESC) og induserte pluripotente stamceller (IPSC), noe som gir forskeren et ubegrenset celle kilde til RPE for transplantasjon 10. RPE transplantasjon er nå anerkjent som en attraktiv først-i-menneske program for stamcelle avledet therapeutics. Øyet tilbyr utmerket kirurgisk tilgang og sofistikert in vivo overvåkingsverktøy 11-13.
For å transplantere RPE, er en måte med en minimal invasiv levering ved hjelp av en cellesuspensjon, alternativt, for å bedre bevare RPE egenskaper og transplantasjon funksjon, arti fi sielle bære substrAtes (stillas) for RPE erstatning blir vurdert 4,14,15. Store dyremodeller er nødvendig for preklinisk validering, men detaljert teknisk informasjon om dyr håndtering og kirurgisk teknikk mangler hittil 16-23.
Vi og andre 11,24 til tross for noe bevis på det motsatte 25, foreslår bruken av en stiv, men elastisk bæresubstrat som det gir sikrere håndtering, bevarer monolaget integritet og funksjonalitet. Over tid har vi testet flere spesialdesignede instrumenter og tilhørende teknikker for implantering av celle-carrier støttes RPE transplantasjoner inn i subretinal plass (SRS). Vi utnyttet intra videoopptak, in vivo scanning laser ophthalmoscopy kombinert med spektral domene optisk koherens tomografi (SLO / SD-oktober), og histologi å evaluere implantasjon suksess 14,26,27. Her gir vi vår nåværende anbefaling for subretinal RPE implantater i kaniner,som ble testet i 5 forskjellige stammer kanin, 7 celle bærermaterialer og 4 RPE cellekilder i over 150 prosedyrer.
Protocol
Etikk dyr håndtering i oftalmisk forskning: Vi har fått godkjenning fra etikkomiteen ved det medisinske fakultet, Universitetet i Bonn, og holder seg til de retningslinjer som fremgår av Foreningen for forskning i Vision og Ophthalmology (ARVO). Videre ble alle prosedyrer godkjent av statlige regulerende myndigheter i Nordrhein-Westfalen. Dyrene ble holdt innendørs i et spesialisert anlegg i en luftkondisjonerte rom med temperaturer mellom 18 - 20 ° C, eksponering til vanlig dagslys, i standardiserte individuelle bur med fri tilgang til mat og vann.
Merk: For å sikre dyrene operativ tilhørighet, er et dyr helse poengsum ark fulgt som inkluderer følgende definitive dyreeksklusjonskriterier: 20% vekttap i forhold til vekt på opptak; tilsynelatende cyanose av dyret; dyr fryser, har kramper eller ikke kan bevege seg i koordinasjon; . ataksi / parestesi, f.eks lammer; apati; ekstrem auto lemlestelse (hudskader, avkuttede lemmer).
</ P>
1. Instrument Sterilisering
- Plasser gjenbrukbare instrumenter i ultralydbad.
- Legg 500 ml destillert vann og 2 ml instrument desinfeksjonsmiddel.
- Rengjør instrumenter som bruker sweep funksjon i 15 min.
- Fjern instrumenter fra ultralydbadet og skyll grundig med destillert vann i 5 min.
- Sett instrumenter i autoklav og bruke standardprogrammet (sterilisering av instrumenter i henhold til 121 ºC i 20 min).
2. Instrument Forberedelse
- Etablere og vedlikeholde et sterilt felt, ved å arbeide i et lukket rom, iført kirurgiske skrubber, maske og hår dekke. Desinfisere hendene før bruk sterile kirurgiske hansker. For detaljert tilnærming se 28.
- Plasser steriliserte instrumenter på en steril drapere.
- Plasser en ml sprøyte fylt med 40 mg triamcinolon festet til en 27 G nål til injeksjon, 10 ml sprøyte med Balance salt løsning (BSS), og 5 ml sprøyte of smøremiddel på drapere.
- Plasser 3-0 silke, 7-0 Vicryl, okulær pinner (for å stoppe konjunktival / scleral blødning), twister gasbind svamper, lukking av sår strimler (til fiksere vitrectomy tips tubing), og lysekrone endoillumination fiber ledningen på en drape.
- Pakk 25 G lysekrone endoilluminator og koble til lys maskin ved hjelp av sterile teknikker (se trinn 2.1). Koble vitrectomy sett inkludert høyhastighets vitrector og Venturi kassett til vitrectomy maskin ved hjelp av sterile teknikker (se trinn 2.1).
- Åpne 500 ml BSS flaske og koble løsning Venturi kassett ifølge produsentens instruksjoner.
3. Utarbeidelse av anestesi og posisjonering av Animal
- Vei dyr for å sikre nøyaktig medisinering dosering.
- Forbered intramuskulær (IM) bedøvelse bruker en sprøyte med 27 G nål som inneholder 0,35 mg / kg ketamin og 0,25 mg / kg medetomidin for start. Vend sprøyten å blande.
- Forbered 2 sprøyter med 1/3 than doser for å opprettholde anestesi under operasjonen.
- Forbered sprøyte inneholder 20 ml 5% glukoseoppløsning og 18 G nål til subkutan injeksjon som intravenøs infusjon alternativ.
- Gi 3 x 1 dråpe mydriatic øyedråper før vitrectomy for elev dilatasjon.
- Cover kanin med teppe å roe før anestesi injeksjon, sprøyte i bakbenet (setemuskelen) og massasje rundt injeksjonsstedet i 30 sekunder.
Merk: Første skudd av IM anestesi varer ca 1-2 timer. avhengig av kaninens størrelse, medikamenttoleranse, fettlaget, stress og kroppstemperatur. De første tegn på anestesi filtrert bort er en nystagmus (må overvåkes av kirurgen), påfølgende injeksjoner siste ca 30 - 45 min. - Bekrefte riktig bedøvelse, ved å verifisere hypnose, hyporeflexia, analgesi og muskelavslapning av dyret.
- Gi subkutan injeksjon (Pt. 3.3) i nakken hudfolden, når kaninen er bevisstløs.
- Legg methylcellulose smøremiddel hver 5-10 minutter i opererte øyne, legge smøremiddel og tape lokk i ikke-opererte øyet.
- Plasser dekket kanin på operasjonsbordet drapert med et deksel slik som et bomulls teppe i en optimal posisjon (nese litt forhøyet gjennom en støpeform av teppet, slik at den er på nivå med okulær overflate) under kirurgisk mikroskop. Rett øye vinkelrett mikroskop objektiv.
- Sikre riktig kroppstemperaturen ved hjelp av rektal termometer (normothermia 39 ± 1 ºC) 29.
- Cut øyevipper bruker saks (noen salve på blad) for å redusere postoperative infeksjoner.
- Desinfiser øyet med 2 - 3 dråper 0,1 g / ml povidonjodid lokalt i 1 minutt og skyll med sterilt BSS.
- Dekk øye med steril drapere med pre-cut åpning i midten for øyet og deretter dekke med (klebrig) kirurgisk innsnitt drapere 12 x 17 cm.
4. vitrectomy
- Proptose og sikkert øye med 3-0 silke hjelp inverted caliper og utføre en konjunktival peritomy.
- Incise conjunctiva med en Vannas sakse nær limbus, men langt nok fra blodkar (~ 1 mm avstand).
- Dissekere conjunctiva ved å opprette en "T-cut". Først forstørre peritomy med sakse parallell til limbus og deretter innsnittet conjunctiva vertikalt i form av en "T" i ca. 6 - 7 mm. Løsne forsiktig conjunctiva rett ut.
- Utfør en sclerotomy ved hjelp av en 23 G microvitreoretinal (MVR) blad på 8:00 på høyre øye / OD (fire på venstre øye / OS) ved forsiktig å sette inn den skarpe spissen av bladet i retning mot synsnerven. Sakte trekke bladet i samme retning og unngå å utvide sclerotomy.
- Sett og sutur skreddersydde side port-infusjon kanyle 27 bruker 7-0 silke sutur og satt intraokulært trykk (IOP) 24 mmHg.
- Utfør en sclerotomy med 25 G flatt hode troakarnål på to på OD (10 o '; Klokke på OS) ligner til trinn 4.2.
- Sett 25 G lysekrone lys i flatt hode troakar, fiksere med tape og slå på lyskilden på ca 30%.
- Hvis det er nødvendig, fjerner ødem cornealepitelets bruker en # 20 skalpell for bedre intraokulært visualisering.
- Utfør en sclerotomy ligner på trinn 4,2 på ti på OD (to på OS), (pre-) sted u-formet 7-0 sting rundt sclerotomy uten å binde knuten, og sett vitrectomy kutter tips.
- Begynn vitrectomy 30 rundt inngangs port, og deretter fortsette over papillen og fibrae medullares med høy hastighet vitrector ved å kutte glasslegemet i små biter på maks. 2000 - 3000 kutt / min, suger på maks. 200 mmHg ved hjelp av angitt parameter oppsettet av vitrectomy maskin (tabell 1)
- Utfør en glasslegemeavløsning (PVD) ved å skille glasslegemet fra netthinnen ved å holde den høye hastigheten vitrector over bakre pol ennd (hvis mulig forsiktig) overlegen på platen 31 mens aspirere bare på maks. 200 mmHg uten kutting.
- Injiser ca. 50 ul (20 mg) triamcinolon eller fortynnet fluorescein (ca. 0,1 mg / ml) intravitrealt å visualisere og forenkle (nær total) fjerning av den flytende glasslegemet over bakre pol og midperiphery under vitrektomi. Unngå krysset over under linsen. Innrykk for å barbere perifer glasslegemet med en (dyktig) assistent anbefales dersom gass tamponade er ønsket.
- Tilsett 20 enheter / ml heparin og 0,5 mg epinefrin til sluttkonsentrasjon på 0,001 mg / ml til BSS infusjonsoppløsningen i parallell eller etter trinn 4,10.
Merk: Som heparin / adrenalin ikke injiseres intraokulært deres effekter er forsinket avhengig av infusjonsstrømningshastighet.
5. Laster Shooter
Merk: Arbeidet beskrevet her ikke faller inn under prinsippene i Helsinkideklarasjonen; det gjorde ikke involvere menneskelige pasienter. Her standard RPE celler ble isolert fra fosterets menneskelige øyne, kultiverte og differensiert på ubestrøket 10-mikrometer tykk polyester (PET) setter inn i henhold til vår tidligere utgitt protokoll 14. En tillatelse til å arbeide med den menneskelige fetal materiale ble hentet fra etisk komité ved Universitetet i Bonn. Alternativt ble HMS-RPE levert fra Skottman lab (manuskript in prep.), Hvor de ble dyrket i henhold til teknikken beskrevet av Vaajasaari et al 32.; for disse cellene en tillatelse er innhentet fra R. Koch Institute, Berlin, Tyskland.
- Skyll cellekultur før utarbeidelse av implantatet 3x med oftalmisk klasse BSS.
- Fyll en standard cellekultur fatet (100 x 20 mm) med 10 ml oftalmisk klasse BSS.
- Tilsett cellekultur innsatsen i BSS og sentrere fatet under et lysmikroskop.
- Punch ut en 2,4 x 1,1 mm implantat med en sløv, oval, skreddersydde nål for å få en flat, bønneformet substratmed to langsider og to runde kanter.
- Forsiktig flom nålen gjennom den andre porten med BSS å skylle ut implantatet inn i BSS fylt skreddersydde lastestasjonen (figur 1).
- Eventuelt kan skjære en rund ende av implantatet (<0,5 mm), bare for å oppnå en tredje kant.
- Sørg for at implantatet er i riktig retning ved å sikre at enkeltlaget er oppsiden på cellen transportør. For å endre posisjonering nøye bruke to skalpeller.
- Skyve implantatet og forsiktig helt inn i skytteren instrumentet ved hjelp av nåleholderen inntil alt av implantatet er festet på innsiden av spissen. Stempelet skal forbli tilbaketrukket.
- Hold "loaded" shooter tips i lastestasjonen etter BSS inntil det øyeblikk av implantasjon.
6. Implantasjon
- Approach nevrale netthinnen med uttrekkbart 41 G subretinal kanyle koblet til en gasstett sprøyte (sikre at alle luftbobler er evakuertfra røret!).
- Injisere BSS (med kalsium og magnesium / CM) subretinally og dermed skape en bleb netthinneavløsning (BRD) på ca. 2-3 disc diameter (DD). To BRD per øye kan heves trygt.
- Enlarge retinotomy til 1,5 mm med vertikal 23 G VR-saks. Den subretinal plass er nå tilgjengelig for implantering eller videre manøvrering.
- Utvid sclerotomy (presist) med en 1,4 mm snitt kniv til 20 G tilnærming.
- Forsøk passerer gjennom sclerotomy bruke en 20 G skytespill dummy, forstørre som nødvendig for å sikre jevn, men koselig overgang av lastet skytespill.
- Pass med lastet skytteren 27 gjennom sclerotomy ideelt ved 24 mmHg.
- Approach retinotomy kanten og ta ut implantatet subretinally fra en epiretinal posisjon.
- Juster implantat med halvlukkede 23 G saks, pinsett eller 41 G nål for å sørge for at det er plassert godt under retina- rimelig unna retinotomy.
7.Avslutte Drift
- Fjern 25 G lysekrone og infusjons kanyle.
- Suturer alle sclerotomies.
- Injiser 25 mL (10 mg) triamcinolon av 8 o'clock sclerotomy (før suturering siste sclerotomy).
- Kontroller / juster IOP ved palpasjon og injisere BSS via 30 G nål / sprøyte, om nødvendig.
- Sutur conjunctiva med 7-0 Vicryl.
- Fjern proptosing 3-0 silke slynge sakte (Unngå dyp orbital venous plexus!).
- Legg deksametason / antibiotisk salve med lokket på.
- Posisjon for en time dekket med teppe med operert øye vendt opp (w / o gass), eller ned (med luft / gass).
- Ikke la dyr uten tilsyn til det gjenvinner tilstrekkelig bevissthet for å opprettholde sternal recumbence.
- Ikke transporter kanin før bedøvelsen forsvinner helt, kan dette skje raskere ved å injisere medetomidin reversere middel lik mengden av medetomidin gitt.
8. Postoperativ Animal Care
- Beholdekaniner under passende forhold (temperatur, lys, mat, vann, plass, osv.) og tett oppfølging i et spesialisert anlegg.
- Pass på at dyret er godt uthvilt, altså., Ingen lengre perioder mat eller vann deprivasjon.
- Se etter eventuelle sår eller skader, spesielt på injeksjonssteder.
- Hold sår tørr å hindre infeksjoner. Gi antibiotika når det er mistanke om infeksjon: deksametason 1 mg / g, neomycin sulfate 3500 IU / g, polymyxin B sulfat 6000 IU / g salve ble påført to ganger daglig i en uke postoperativ på okulær overflate.
- Legg deksametason / antibiotisk salve for neste 7 dager postoperativ to ganger daglig for bedre okulær overflate regenerering og redusert postoperativ smerte.
- Gi systemiske smertestillende (Carprofene 4 mg / kg to ganger daglig) for første 48 timer.
- Ikke la et dyr uten tilsyn før det har gjenvunnet nok bevissthet til å opprettholde sternal recumbence.
- Ikke returner et dyr somhar gjennomgått kirurgi i selskap med andre dyr før fullt restituert.
- Utsett ikke dyr for unødig lidelse.
9. SLO / SD-oktober Veiledning
- Forbered og injisere intramuskulær (IM) bedøvelse bruker en sprøyte med 27 G nål som inneholder 0,175 mg / kg ketamin og 0,125 mg / kg medetomidin for start. Vend sprøyten å blande.
- Legg et smøremiddel på minst hvert 5. min for å fukte øye og opprettholde klare SD-oktober avbildning, eventuelt et tilpasset kontaktlinse kan anvendes.
- Feste en stålplattform til hodestøtten for å stabilisere dyret i ønsket stilling.
- Plasser kanin på stålplattform, plassere sine øyne vinkelrett på sonden.
- Hold kanin hode fra den nedre kinnet bein (underkjeven) unngå luftrøret.
- Tilt dyrets hode etter omtrent 45º mot SD-oktober sonde for å optimalisere visningsvinkelen på implantatet.
- Bruk en 30-graders linse og følgende parametere for optimal oktober bildebehandling [HS]: 30 grader innstillinger for enkelt linje skanner med ART modus satt til 100 (gjennomsnitts) og 20 x 20 graders innstillinger for volum skanninger med ART-modus satt til 15; høyoppløsningsmoden er ikke nødvendig.
- Bruk SLO infrarød reflektans avbildning for å finne fokalplanet av implantatet (figur 2A.); optimal fokus er nådd når (alle) implantatet kantene er skarpe 14.
- Legg deksametason 1 mg / g, neomycin sulfate 3500 IU / g, polymyxin B sulfat 6000 IE / g salve med lokket når du er ferdig.
Representative Results
Resultatene fra den beskrevne fremgangsmåte for subretinal implantering er vist i tabell 2. innpoding under netthinnen hadde en suksessrate på ca. 61% når en kjerne vitrektomi ble utført og steg opp til 76%, når glasslegemeavløsning ble indusert. Disse tallene omfatter ca 21% av dyrene som døde enten intraoperativt eller i de første 3 postoperative dager. Denne teknikken kan brukes til å implantere to stillaser på forskjellige retinal områder i det ene øyet samtidig.
Kaninene gikk postoperative in vivo følge opp ved hjelp av SD-oktober og histologisk behandling som beskrevet av Stanzel et al. 27 (figur 2). Fig. 2A viser scanning laser oftalmoskop infrarød reflektans bilde av implantert dyrket RPE på en polyestermembran (PET) etter en ukomplisert transplantasjon. Dehalo rundt implantatet tilsvarer fotoreseptoren atrofi. Fig. 2B viser tilsvarende SD-oktober, varsel retinal, hovedsakelig ytre kjernefysiske lag (onl) tynning, hyper refleksbånd på SD-oktober ovenfor implantat, mens det nevrale netthinnen ved siden av implantatet viser nær-normal refleksjon band. Disse resultatene tyder på en atraumatisk levering. Fig. 2C viser Hematoxiline / eosin (H / E) flekk av implantatet som viser subretinal arrdannelse og onl atrofi rundt retinotomy området sannsynligvis som et resultat av iatrogen manipulasjon, en sammenhengende men uregelmessig pigmenterte sjikt over PET. Bruch membran under implantatet syntes også å være sammenhengende, og choriocapillaris inneholder noen spredte erytrocytter. Disse morfologiske resultat er sammenlignbart med SD-oktober og styrke tesen om en atraumatisk levering.
fig ure 1: Laster Shooter med menneskelige IPSC-RPE Cultured på PET Cell Carrier. A) Viser stanse ut et implantat ved hjelp av skreddersydde nål. B) Bean formet implantat kuttet fra cellekultur. C) Plassering av implantatet før lasting. D) Loading av skytespill med implantatet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet .
Figur 2: dyrkede humane HMS-RPE på PET Cell Carrier 4 uker i Rabbit subretinal Space. A) viser SLO infrarød reflektans bilde, den grønne linje avgrenser tverrsnittet vist på fig. 2B. B) Tilsvarende SD-oktober C) H / E flekken, se tekst eller 26,27 for detaljer.ove.com/files/ftp_upload/53927/53927fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Parameter | Brukte innstillinger |
| vitrectomy | 6000 kutt / min |
| vakuum~~POS=TRUNC | 200 mmHg |
| Rise tid | 1 sek |
| Luft | 24 mmHg |
| Irrigasjon | 24 CMH 2 O |
| Diathermy | 30% |
Tabell 1: Parameter Oppsett av vitrectomy Machine.
| vitrectomy | Implant | kaniner operert | vellykket implantat | Mislykket implantat | Død | Suksess rate% |
| kjerne~~POS=TRUNC vitrectomy | KJÆLEDYR | 30 | 19 | 4 | 7 | 63.33 |
| PET + RPE | 70 | 42 | 12 | 16 | 60 | |
| PVD, ± plasmin m / PPV | KJÆLEDYR | 28 | 21 | 2 | 5 | 75 |
| PET + RPE | 22 | 17 | 2 | 3 | 77.27 |
Tabell 2: Oversikt over de siste 150 operasjoner, inkludert Metode og Implant Type.
Discussion
Ved hjelp av en kanin modell, er en trygg og reproduserbar metode presenteres for transvitreal levering av dyrket RPE på cellebærere inn i subretinal plass med en spesialdesignet skytespill instrument. Den beskrevne metoden gir en kort / optimalisert kirurgisk teknikk for enkel læring, som det innebærer standardteknikker i vitrectomy med subretinal manøvrer. Resultatet er sterkt tilrettelagt av en ren vitreoretinal grensesnitt, og intraokulært infusjon som unngår væske turbulens over implantasjonsstedet, indusere bleb netthinneavløsning (BRD) ved lav IOP, hindre netthinnen og sclera skader gjennom tørrhet, og hensiktsmessig plassering av kaninen.
Vi advarer imidlertid som flere intra-operative komplikasjoner kan oppstå når som helst, hindrer suksess for implantasjon, for eksempel intra okulær blødninger, anestesi falming av under viktige skritt som implantasjon, skjuling av BRD grunn instrument manipulering eller okulær hypotoni, rabbit død på grunn av høye doser av anestesi, lavt blodtrykk under lang operasjon forårsaker hypoksisk hjerneskade, eller hypertermi. Men disse komplikasjoner reduseres over tid etter hvert som de blir raskt håndtert og løst ved å øke opplevelsen av det kirurgiske teamet.
Noen komplikasjoner kan reduseres ved å følge noen enkle, men viktige skritt. Smøremiddel bør legges hvert 5. - 10 min for å forhindre hornhinnen, senehinne og konjunktival skade under operasjonen, og for å opprettholde en klar intraokulære media, kan så tørket / svertet sklera være en årsak til sårdehiscens, som i sin tur fører til okulær hypotoni og / eller intraoperativ lekkasje fra sclerotomies. Heparin bør legges for å forhindre dannelsen av et fibrin film som gjør spesielt subretinal implantasjon utfordrende og samtidig legge adrenalin for å redusere blødning etter heparin 16. For lang heparin / adrenalin eksponeringstider (> 1 time) bør unngås for å hindre hornhinnen Edema av endothelial dekompensasjon 33, hypertensiv krise eller intraoperativ dødsfall. Nitid glasslegemet fjerning bør utføres ved instrument (entry) port for å unngå retinal og / eller koroidal avdelinger. Intraokulære instrumenter bør pekte mot bakre pol unngå linse touch (forårsaker iatrogen katarakt) eller (entry stedet) retinal skade. En intraokulær side-port infusjonskanyle bør brukes, som det demper jet stream rundt implantering området, og dermed hindre ukontrollert riving av retinotomy, og kollaps av BRD. BRD induksjon i midtlinjen (vertikal akse fra synsnerven) eller nær optiske medullar fibre bør unngås for å hindre omfattende iatrogenisk retinal avdelinger. Til slutt, sist men ikke minst BRD bør induseres ved lav IOP, for å unngå subretinal BSS injeksjon bruke store strømningsrater som kan føre til en retinal skade (f.eks. Ved å strekke).
Mange studie variabler som celle carrier varianter, foster, voksen eller stamcelle avledet RPE cellekilder, valg for immundempende, osv., kan utforskes 14,26,27,34. Ytterligere forbedring som serumfritt RPE kultur metoder, karakterisering av xenoRPE i subretinal plass, fjerning av verts RPE lag 14 eller strategier for implantat forankring er aktuelle i arbeid.
Hittil de beskrevne teknikker har vært brukt på 5 forskjellige kanin stammer, inkludert chinchilla drittsekk, Chinchilla drittsekk / KBL hybrider, New Zealand Hvit / Røde Kors, New Zealand hvit (albino) og nederlandsk belte. Både mannlige og kvinnelige kaniner ble operert, med kaniner minst 1,5 kg eller 2 måneders alder (avhengig av art). De fleste operasjoner var på pigment kaniner (chinchilla uekte eller chinchilla Bastard hybrider) med en vekt på mellom 2,5 til 3 kg.
Alle kanin stammer vi har hatt muligheten til å jobbe med synes å ha noen særegenheter. Gitt den eksklive tilgjengeligheten av pigmenterte kaniner av chinchilla drittsekk belastningen i Tyskland i 2009-13, har vi samlet de mest erfaring med disse dyrene. Dessverre er det ikke lenger tilgjengelig, siden avl har blitt avviklet, men sammenligner godt til New Zealand Hvit / Røde Kors med unntak av mer fordelaktig tykkere sclera og større øye volumer i det siste. Chinchilla Bastard hybrider har betydelig intraoperativ fibrin dannelse og krever heparin / adrenalin bruk som skissert ovenfor for å sikre vellykkede subretinal manøvrer. Denne protokollen er også utført i ikke-pigmenterte albino kaniner (New Zealand hvite), men spesielt BRD etablering og subretinal implantasjon er mer utfordrende gitt redusert kontrast takknemlighet. Muligheten for å fremkalle et glasslegemeavløsning synes ikke kanin belastning avhengige i våre hender.
Transvitreal subretinal levering er sannsynlig fremtidig kirurgisk strategiske valget gitt det er den mest comm på vei i dag klinisk for å få tilgang til netthinnen. Som et resultat av mange andre grupper har presentert slike teknikker for kultivert RPE på bære støtter i dyre arbeid 11,15,23,35. Aramant et al. 36 har et instrument, som plasserer i stedet skyver deres hydrogel-innkapslet myk implantat til sin subretinal målområdet. Utformingen av Thumann et al. Benytter en hul slikkepott, som frigjør carrier-støttet pode av flytende den av gjennom væske injeksjon 19. Begge tidligere strategier krever subretinal innsetting av instrumentet, som etter vårt syn er mer utsatt for komplikasjoner, sammenlignet med et epiretinally appositioned instrument. Montezuma et al. 22 beskrevet en subretinal inserter instrument for levering av subretinal chip implantater hos gris, men ikke lenger arbeidet har vært utgitt siden til vår beste kunnskap. Vi har vært i stand til å forlenge den beskrevne teknikken med noen modifikasjon av gris.
jove_content "> Vårt foretrukne cellebærerne er 10 mikrometer tykke polyester-tereftalat (PET) membraner. Fra et operasjonsperspektiv, har dette materialet gunstige stivhet og elastisitets parametre, i tillegg til sin brede anvendelighet under cellekultur eksperimenter. Vi fant lignende erfaringer med utvidet tetrafluoretylen (ePTFE) 37 eller nanofiber-membraner elektrospunnede fra PET, poly-melkesyre / capronolactic syre (PLCL) eller poly -. melke-ko-glykolsyre (PLGA), så vel som komposittnanofiber (PLGA eller PET), og ultratynne PET 26 Når PET membraner brukes med vår metallic skytespill instrument, de har en annen tendens til å stille ut statisk elektrisitet, som utfordrer deres utstøting fra skytteren 27. ultratynne polyimide membraner kan i våre hender ikke implanteres i subretinal plass med protokollen skissert ovenfor ( manuskript under forberedelse).Marmor et al. har systematisk studert spontan resorption av subretinal væske i iatrogenisk lokaliserte retinal avdelinger 38-41. Selv etter manipulasjon i subretinal plass disse ble funnet å være absorbert av postoperative dag 4 i begivenhetsløse operasjoner. Laser retinopeksi er ikke utført for å feste kantene av retinotomy. Selv om counterintuitive i forhold til menneskelig kirurgi, er luft / gass tamponade ikke nødvendig. Med mindre grundig fjerning av perifere glasslegemet kan oppnås, spesielt i den overlegne kvadrant, dette kan i virkeligheten resultere i store retinale tårer som stammer fra retinotomy området. Det anbefales kun å utføre væske luftgjennomgang med påfølgende 20% SF6 gass tamponade å berge intra iatrogenisk netthinneløsning eller i tilfelle en bestemt implantat stilling må sikres.
Selv om mekanisk indusert ablasjon av det nevrale netthinnen kan føre RPE og fotoreseptoren skader hos kaniner 42,43, varierer sin utstrekning i stor grad (selv med vanlig BSS) depåvente av faktorer som IOP, sprøytetypen som brukes, injeksjonsvolum med og dermed indusert retinal stretching, osv. Vi har også testet ofte anbefalt Ca / Mg-fri BSS lettere løsgjøring 42-44, men fant at den forårsaker intraoperativ linse opasifisering (spesielt ved forhøyet temperatur), og i betydelig grad forsinker eller forstyrrer retinal re-festing 27. Slow subretinal injeksjon av 20-30 pl volum vanlig BSS med en 100 mL sprøyte anbefales derfor; kanyle bevegelser bør være minimal så retinotomy selene rundt det og hindre Bruch membran skade. Noe av feilbehandling- kan løses ved RPE sårheling, og den observerte relative bevaring av onl tykkelse etter reattachment, tyder på at RPE / fotoreseptoren komplekset kan tolerere dette funksjon, som også beskrevet av andre 45.
Cell-baserte terapeutiske eller retinal proteser krever preklinisk animal testing før myndighetsgodkjennelse og begynner menneskelige sikkerhetsstudier. Den tidligere varierer fra land til land. Kaninen modellen beskrevet her, kan tjene som en kostnadseffektiv og mindre utfordrende plattform for å etablere eller utføre alle kravene til forvaltningsmyndighetene. Videre kan det i ettertid tjene for opplæring av kirurger i eventuelle multisenter kliniske studier eller ytterligere forbedringer av teknikken underveis.
Disclosures
RB, BVS, ZL, NE og Geuder AG har innlevert en europeisk patentsøknad på skytteren. NB er ansatt i Geuder AG. Publiserings avgifter for denne video-artikkelen ble betalt av Geuder AG.
Acknowledgments
Støttet av Rüdiger Foundation tilskudd i 2008 og 2010 (BVS), BONFOR / Gerok Scholarship O-137,0015 (BVS), BONFOR / Gerok Scholarship O-137,0019 (FT), Deutsche Forschungsgemeinschaft / DFG (BVS) STA 1135 / 2-1, kinesisk Scholarship Council No. 2008627116 (ZL) og en ubegrenset tilskudd av Geuder AG, Heidelberg (fig. 2). Medlemmer av H. Skottman laboratorium, er Universitetet i Tampere Finland takknemlig anerkjent for å gi HMS avledet RPE vist i figur 2.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| s30 ultrasonic cleaning unit | Elmasonic | 100 4631 | 2.75 L |
| DE-23 autoclave | Systec | C 2209 | 23 L |
| Syringe | BD | 300013 300995 301285 300294 300330 |
1 ml x3 2 ml x3 5 ml x1 10 ml x1 20 ml x1 |
| Needle | BD | 305196 305136 |
18 G x1 27 G x5 |
| Scalpel | Feather | 2975#20 | blade#20 x3 |
| Surgical drape | HARTMANN LOHMANN & RAUSCHER |
277 502 25 440 |
60 x 40 cm x2 12 x 17 cm |
| Ocular sticks | LOHMANN & RAUSCHER | 16 516 | 66 x 5 mm |
| Twister gauze sponges | HARTMANN | 481 274 | x2 |
| Closure strips | HARTMANN | 540 686 | x4 |
| Opmi Visu CS Microscope | Zeiss | N/a | incl. fundus imaging system BIOM II |
| Chandelier endoillumination | Geuder | G-S03503 + G-S03504 |
25 G incl. trocar |
| Light machine | Geuder | G-26033 | Xenotron III |
| Vitrectomy machine | Geuder | G-60000 | MegaTRON S4 S4/ HPS |
| Vitrector | Geuder | G-46301 | MACH2 vitreous cutter 23 G |
| Venturi cassette | Geuder | G-60700 | |
| Sideport-infusion cannula | Geuder | custom | 23 G x1 |
| 3-0 silk suture | ETHICON | V546G | x1 |
| Caliper | Geuder | G-19135 | x2 |
| Vannas scissors | Geuder | G-19777 | x1 |
| Sclerotomie blade | Ziemer | 21-2301 | 1x 23 G 1x 20 G |
| 7-0 silk suture | ETHICON | EH6162H | x1 |
| Needle holder | Geuder | G-32320 | x2 |
| Iris forceps | Geuder | G-18910 | x1 |
| Colibri forceps | Geuder | G-18950 | x1 |
| Extendible subretinal injection needle | DORC | 1270.EXT | 41 G |
| VR scissor | Geuder | G-36542 | 25 G |
| Grieshaber forceps holder | Alcon | 712.00.41 | 23 G |
| Curved scissor forceps tips | Alcon | 723.52 | 23 G |
| Implant loading station | Dow Corning | 3097358-1004 | SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit |
| Blunt oval implant trephine | Geuder | custom-made | 2.4 x 1.1 mm |
| Shooter dummy | Geuder | G-32227 | x1 |
| Shooter | Geuder | G-S03443 | x1 |
| Flute needle | DORC | 1281.SD | 20 G (Vacuum) |
| Manual microliter syringe | Hamilton | 24535 | 100 µl |
| Tissue culture plates | Greiner bio-one | 664160 | 100 x 20 mm |
| Spectralis Multi-Modality Imaging System |
Heidelberg Engineering |
N/a | Spectralis HRA + OCT |
| Drugs and solutions | |||
| Name | Company | Active agent | Comments |
| Mucadont-IS | Merz Hygiene | virucidal instrument disinfectant | 2 L |
| Mucocit T | Merz Hygiene | Aldehyde-free instrument disinfectant | 2 L |
| Ketamin 10% | WDT | Ketamine | 10 ml (100 mg/ml) |
| Domitor | Orion Pharma | Medetomidine hydrochloride | 10 ml (1 mg/ml) |
| Antisedan | Orion Pharma | Atipamezole hydrochloride | 10 ml (5 mg/ml) |
| Neosynephrin POS 10% | URSAPHARM | Phenylephrine HCl | 10 ml |
| Mydriacyl | Alcon | Tropicamid | 10 ml (5 mg/ml) |
| Methocel 2% | Omni Vision | hydroxypropyl methylcellulose | 10 g |
| PURI CLEAR | ZEISS | Balance salt solution (BSS) | 500 ml |
| Glucose 5% | B.Braun | Glucose 5% solution | 100 ml |
| Heparin-Natrium-25,000 | Ratiopharm | Heparin | 5 ml (2,500 unit/ml) |
| Suprarenin | SANOFI | Epinephrine | 1 ml (1 mg/ml) |
| Triamcinolone | University of Bonn pharmacy | preservative-free Triamcinolone | 1 ml (40 mg/ml) |
| Isoptomax eye ointment | Alcon | dexamethasone 1 mg/g neomycin sulfate 3,500 IU/g polymyxin B sulfate 6,000 IU/g |
10 ml |
| Betaisodona | Mundipharma | Povidon-Iod | 30 ml (1 g/10 ml) |
| Optive | ALLERGAN | sodium carboxymethylcellulose glycerol | 10 ml |
References
- Fine, A. M., et al. Earliest symptoms caused by neovascular membranes in the macula. Arch Ophthalmol. 104, 513-514 (1986).
- Lim, L. S., Mitchell, P., Seddon, J. M., Holz, F. G., Wong, T. Y. Age-related macular degeneration. Lancet. 379, 1728-1738 (2012).
- Holz, F. G., Strauss, E. C., Schmitz-Valckenberg, S., van Lookeren Campagne, M. Geographic Atrophy: Clinical Features and Potential Therapeutic Approaches. Ophthalmology. 121, 1079-1091 (2014).
- Binder, S., Stanzel, B. V., Krebs, I., Glittenberg, C. Transplantation of the RPE in AMD. Prog Retin Eye Res. Prog Retin Eye Res. 26, 516-554 (2007).
- da Cruz, L., Chen, F. K., Ahmado, A., Greenwood, J., Coffey, P. RPE transplantation and its role in retinal disease. Prog Retin Eye Res. 26, 598-635 (2007).
- Del Priore, L. V., Tezel, T. H., Kaplan, H. J. Maculoplasty for age-related macular degeneration: reengineering Bruch's membrane and the human macula. Prog Retin Eye Res. 25, 539-562 (2006).
- Gouras, P. The retinal pigment epithelium. Marmor, M. F., Wolfensberger, T. J. , University Press. Oxford. 492-507 (1998).
- Lund, R. D., et al. Cell transplantation as a treatment for retinal disease. Prog Retin Eye Res. 20, 415-449 (2001).
- Blenkinsop, T. A., Corneo, B., Temple, S., Stern, J. H. Ophthalmologic stem cell transplantation therapies. Regen Med. 7, 32-39 (2012).
- Hirami, Y., et al. Generation of retinal cells from mouse and human induced pluripotent stem cells. Neurosci Lett. 458, 126-131 (2009).
- Carr, A. J., et al. Development of human embryonic stem cell therapies for age-related macular degeneration. Trends in neurosciences. 36, 385-395 (2013).
- Schwartz, S. D., et al. Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt's macular dystrophy: follow-up of two open-label phase 1/2 studies. Lancet. 385, 509-516 (2015).
- Jha, B. S., Bharti, K. Regenerating Retinal Pigment Epithelial Cells to Cure Blindness: A Road Towards Personalized Artificial Tissue. Curr Stem Cell Rep. , 1-13 (2015).
- Stanzel, B. V., et al. Human RPE Stem Cells Grown into Polarized RPE Monolayers on a Polyester Matrix Are Maintained after Grafting into Rabbit Subretinal Space. Stem Cell Reports. 2, 64-77 (2014).
- Hynes, S. R., Lavik, E. B. A tissue-engineered approach towards retinal repair: scaffolds for cell transplantation to the subretinal space. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 248, 763-778 (2010).
- Szurman, P., et al. Experimental implantation and long-term testing of an intraocular vision aid in rabbits. Arch Ophthalmol. 123, 964-969 (2005).
- Bhatt, N. S., et al. Experimental transplantation of human retinal pigment epithelial cells on collagen substrates. Am J Ophthalmol. 117, 214-221 (1994).
- Nicolini, J., et al. The anterior lens capsule used as support material in RPE cell-transplantation. Acta Ophthalmol Scand. 78, 527-531 (2000).
- Thumann, G., et al. The in vitro and in vivo behaviour of retinal pigment epithelial cells cultured on ultrathin collagen membranes. Biomaterials. 30, 287-294 (2009).
- Del Priore, L. V., Tezel, T. H., Kaplan, H. J. Survival of allogeneic porcine retinal pigment epithelial sheets after subretinal transplantation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45, 985-992 (2004).
- Pritchard, C. D., Arner, K. M., Langer, R. S., Ghosh, F. K. Retinal transplantation using surface modified poly(glycerol-co-sebacic acid) membranes. Biomaterials. 31, 7978-7984 (2010).
- Montezuma, S. R., Loewenstein, J., Scholz, C., Rizzo, J. F. Biocompatibility of Materials Implanted into the Subretinal Space of Yucatan Pigs. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 47, 3514-3522 (2006).
- Brantfernandes, R. A., et al. Safety study in Mini Pigs of transplanted Human Embryonic Stem Cell Derived Retinal Pigment Epithelium (hESC-RPE). Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53, 312 (2012).
- Lu, B., Zhu, D., Hinton, D., Humayun, M. S., Tai, Y. C. Mesh-supported submicron parylene-C membranes for culturing retinal pigment epithelial cells. Biomed Microdevices. 14, 659-667 (2012).
- Boochoon, K. S., Manarang, J. C., Davis, J. T., McDermott, A. M., Foster, W. J. The influence of substrate elastic modulus on retinal pigment epithelial cell phagocytosis. Journal of biomechanics. 47, 3237-3240 (2014).
- Liu, Z., Yu, N., Holz, F. G., Yang, F., Stanzel, B. V. Enhancement of retinal pigment epithelial culture characteristics and subretinal space tolerance of scaffolds with 200 nm fiber topography. Biomaterials. 35, 2837-2850 (2014).
- Stanzel, B. V., et al. Subretinal delivery of ultrathin rigid-elastic cell carriers using a metallic shooter instrument and biodegradable hydrogel encapsulation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 490-500 (2012).
- AORN Recommended Practices Committee. Recommended practices for maintaining a sterile field. AORN J. 83 (2), 402 (2006).
- Hong, S. B., et al. Physiologic characteristics of cold perfluorocarbon-induced hypothermia during partial liquid ventilation in normal rabbits. Anesth Analg. 94, 157-162 (2002).
- Machemer, R. The development of pars plana vitrectomy: a personal account. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 233, 453-468 (1995).
- Los, L. I., van Luyn, M. J., Nieuwenhuis, P. Organization of the rabbit vitreous body: lamellae, Cloquet's channel and a novel structure, the 'alae canalis Cloqueti'. Exp Eye Res. 69, 343-350 (1999).
- Vaajasaari, H., et al. Toward the defined and xeno-free differentiation of functional human pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelial cells. Mol Vis. 17, 558-575 (2011).
- Iverson, D. A., Katsura, H., Hartzer, M. K., Blumenkranz, M. S. Inhibition of intraocular fibrin formation following infusion of low-molecular-weight heparin during vitrectomy. Arch Ophthalmol. 109, 405-409 (1991).
- Thieltges, F., et al. Subretinal implantation of human embryonic stem cell derived RPE on ultrathin polyester carriers in rabbits. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56, 1824 (2015).
- Kamao, H., et al. Characterization of human induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium cell sheets aiming for clinical application. Stem Cell Reports. 2, 205-218 (2014).
- Seiler, M. J., Aramant, R. B. Intact sheets of fetal retina transplanted to restore damaged rat retinas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 39, 2121-2131 (1998).
- Stanzel, B. V., et al. SD-OCT Complements Histology in Evaluation of Potential Bruch's Membrane Prosthetics. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 5241 (2010).
- Marmor, M. F., Abdul-Rahim, A. S., Cohen, D. S. The effect of metabolic inhibitors on retinal adhesion and subretinal fluid resorption. Invest Ophthalmol Vis Sci. 19, 893-903 (1980).
- Frambach, D. A., Marmor, M. F. The rate and route of fluid resorption from the subretinal space of the rabbit. Invest Ophthalmol Vis Sci. 22, 292-302 (1982).
- Kita, M., Negi, A., Marmor, M. F. Lowering the calcium concentration in the subretinal space in vivo loosens retinal adhesion. Invest Ophthalmol Vis Sci. 33, 23-29 (1992).
- Marmor, M. F. Control of subretinal fluid: experimental and clinical studies. Eye. 4 (Pt 2), 340-344 (1990).
- Faude, F., et al. Facilitation of artificial retinal detachment for macular translocation surgery tested in rabbit. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42, 1328-1337 (2001).
- Szurman, P., et al. Ultrastructural Changes after Artificial Retinal Detachment with Modified Retinal Adhesion. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 47, 4983-4989 (2006).
- Fang, X. Y., et al. Effect of Ca(2+)-free and Mg(2+)-free BSS Plus solution on the retinal pigment epithelium and retina in rabbits. Am.J.Ophthalmol. 131, 481-488 (2001).
- Ivert, L., Kjeldbye, H., Gouras, P. Long-term effects of short-term retinal bleb detachments in rabbits. Graefes Arch.Clin.Exp.Ophthalmol. 240, 232-237 (2002).
