Summary
Retina epitélio pigmentar (RPE) estratégias de substituição e terapia baseada em gene são considerados para várias condições degenerativas da retina. Para a tradução clínica, o olho dos modelos animais de grande porte são obrigados a estudar técnicas cirúrgicas aplicáveis em pacientes. Aqui nós apresentamos um modelo de coelho para a cirurgia sub-retiniana voltada para o transplante de EPR, que é versátil e eficiente.
Abstract
Degeneração macular relacionada com a idade (AMD), retinite pigmentosa, e outras doenças relacionadas com RPE são as causas mais comuns para a perda irreversível de visão em adultos em países industrialmente desenvolvidos. transplante de EPR parece ser uma terapia promissora, uma vez que podem substituir EPR disfuncional, restaurar a sua função, e desse modo a visão.
Descrevemos aqui um método de transplante de uma monocamada RPE cultivadas sobre um andaime para o espaço sub-retiniano (SRS) de coelhos. Depois de xenotransplantes de vitrectomia foram entregues para o SRS usando um atirador feito à medida que consiste em um bico metálico de calibre 20 com um êmbolo revestido de politetrafluoretileno (PTFE). A técnica atual evoluiu em mais de 150 cirurgias de coelho ao longo de 6 anos. Pós-operatório de seguimento pode ser obtido usando não-invasivo e repetitivo imagiologia in vivo, tais como domínio espectral tomografia de coerência óptica (SD-OCT) seguido por histologia fixa-perfusão.
ºE Método tem passos bem definidos para facilitar a aprendizagem e elevada taxa de sucesso. Coelhos são considerados um grande modelo animal olho útil em estudos pré-clínicos para a tradução clínica. Neste contexto os coelhos são uma alternativa de custo eficiente e talvez conveniente para outros modelos de olho animais de grande porte.
Introduction
degeneração macular relacionada à idade (DMRI) é a causa mais comum de deficiência visual em adultos com 50 anos ou mais velhos nos países desenvolvidos industrialmente, uma vez que provoca perda da visão central. Cerca de 15% destes doentes sofrem da forma "húmida" da doença, em que a neovascularização origina a partir da coróide e impede a função da retina 1. Esta variante pode ser tratada por uma terapia altamente eficaz com injecções intra-vítreas repetido de drogas anti-angiogénicos 2. No entanto, a grande maioria dos pacientes (~ 85%) sofrem da forma seca, que é caracterizada por depósitos extracelulares (por exemplo, drusas) sob o epitélio pigmentado da retina (RPE). Estes depósitos causar disfunção RPE levando à atrofia da retina na mácula. Dada a falta de opções terapêuticas curativas, AMD evoluiu para um campo de pesquisa intensiva em desenvolvimento, onde muitas abordagens terapêuticas curativas diferentes estão sendo testados. substituição RPE cirúrgica éum atraente possibilidade futura para derrotar esta doença debilitante 3.
Transplante autólogo EPR sub-retiniano substitui EPR disfuncional ou perdido na mácula, e tem o potencial para restaurar a sua função fisiológica 4-9. Esta técnica cirúrgica teve um avanço com o desenvolvimento de protocolos de diferenciação do EPR a partir de células estaminais embrionárias humanas (células estaminais embrionárias humanas) e células estaminais pluripotentes induzidas (IPSC), dando o cientista uma fonte ilimitada de células EPR para transplante 10. transplante de RPE é agora reconhecida como uma aplicação atraente first-in-humana para a terapêutica derivadas de células-tronco. O olho oferece excelente acesso cirúrgico e sofisticada em ferramentas de monitoramento vivo 11-13.
Transplantar o RPE, uma maneira é com uma entrega minimamente invasiva utilizando uma suspensão de células, em alternativa, para melhor preservar as características do EPR e função do transplante, arti fi cial substr transportadoraates (andaimes) para a substituição RPE estão sendo consideradas 4,14,15. Modelos animais de grande porte são necessários para a validação pré-clínica, mas informações técnicas detalhadas sobre manipulação de animais e técnica cirúrgica está faltando a data de 16-23.
Nós e outros 11,24 apesar de algumas provas em contrário 25, sugerem a utilização de um substrato de suporte rígida ainda elástica, uma vez que proporciona uma manipulação mais segura, preserva a integridade da monocamada e funcionalidade. Ao longo do tempo nós testamos vários instrumentos de design personalizado e técnicas auxiliares para a implantação de células-transportadora transplantes RPE suportados no espaço sub-retiniano (SRS). Nós utilizamos gravações de vídeo intra-operatórias, in vivo oftalmoscopia de varredura a laser combinada com espectral de tomografia de coerência óptica (SLO / SD-OCT), e histologia para avaliar o sucesso de implantação 14,26,27. Aqui nós fornecemos a nossa recomendação atual de implantes sub-retinianos RPE em coelhos,que foram testados em 5 linhagens de coelhos diferentes, 7 materiais de suporte de células e fontes de células RPE 4 em mais de 150 procedimentos.
Protocol
Ética de movimentação de animais na investigação oftalmológica: Obtivemos a aprovação do comitê de ética da Faculdade de Medicina da Universidade de Bonn, e aderir às diretrizes estabelecidas pela Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia (ARVO). Além disso, todos os procedimentos foram aprovados pelas autoridades reguladoras estaduais de North Rhine-Westphalia. Os animais foram mantidos dentro de casa em um centro especializado em um quarto com ar condicionado, com temperaturas entre 18-20 ° C, a exposição à luz do dia regular, em gaiolas individuais padronizados com livre acesso a comida e água.
Nota: Para garantir os animais afinidade operatório, uma folha de pontuação da saúde animal é seguido que inclui os seguintes critérios de exclusão animais definitiva: perda de peso de 20% em relação ao peso no momento da admissão; aparente cianose do animal; arrepios animais, tem cólicas ou não pode se mover em coordenação; . ataxia / parestesia, por exemplo, paralisa; apatia; mutilação extrema auto (feridas na pele, membros decepados).
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1. Esterilização Instrument
- Coloque os instrumentos reutilizáveis em banho ultra-sônico.
- Adicionar 500 ml de água destilada e 2 ml de instrumento desinfectante.
- instrumentos limpos utilizando a função de varredura por 15 min.
- Retirar instrumentos de banho ultra-sônico e enxaguar abundantemente com água destilada por 5 min.
- Insira instrumentos em autoclave e usar o programa padrão (esterilização de instrumentos sob 121 ºC durante 20 min).
2. Preparação Instrumento
- Estabelecer e manter um campo esterilizado, trabalhando em uma sala fechada, usando uniformes cirúrgicos, máscara e tampa do cabelo. Desinfectar as mãos antes de usar luvas cirúrgicas estéreis. Para abordagem detalhada ver 28.
- Coloque instrumentos esterilizados em uma cortina estéril.
- Coloque 1 ml cheia com 40 mg de triamcinolona ligado a uma agulha de 27 G para a injecção, seringa de 10 ml com solução de sal de Equilíbrio (BSS), e 5 ml de seringa ólubrificante f em cortina.
- Coloque seda 3-0, 7-0 vicryl, varas oculares (para parar a hemorragia conjuntival / escleral), esponjas de gaze twister, tiras de fechamento da ferida (para fixar o tubo de ponta vitrectomia) e fio de fibra candelabro endoillumination em um pano.
- Desembrulhar 25 G candelabro endoilluminator e se conectar a máquina a luz utilizando técnicas estéreis (veja o passo 2.1). Ligue set vitrectomia incluindo vitreófago alta velocidade e Venturi cassete para máquina de vitrectomia usando técnicas estéreis (veja o passo 2.1).
- Abrir 500 ml garrafa de BSS e ligar solução para Venturi cassete de acordo com as instruções do fabricante.
3. Preparação de Anestesia e Posicionamento do animal
- Pesar animal para garantir a dosagem da medicação precisa.
- Prepare anestesia intramuscular (IM) usando uma seringa com 27 agulha G contendo 0,35 mg / kg de ketamina e 0,25 mg / kg medetomidine para arrancar. Virar a seringa para misturar.
- Prepare 2 seringas com 1/3 de tque as doses para manter a anestesia durante a operação.
- Preparar seringa contendo 20 ml de solução de glucose a 5% e 18 g de agulhas para injecção subcutânea como uma alternativa a infusão intravenosa.
- Dê 3 x 1 gota de olho mydriatic cai antes de vitrectomia para a dilatação da pupila.
- coelho tampa com cobertor para acalmar antes da injeção de anestesia, injectar no membro posterior (músculo glúteo) e massagem em torno do local da injecção durante 30 segundos.
Nota: O primeiro tiro de anestesia IM dura cerca de 1-2 horas. dependendo do tamanho do coelho, tolerância a drogas, a camada de gordura, o stress e a temperatura do corpo. O primeiro signo do anestesia desaparecendo é uma nistagmo (deve ser monitorado pelo cirurgião), injecções subsequentes duram cerca de 30 - 45 min. - Confirmar a anestesia adequada, verificando hipnose, hiporreflexia, analgesia e relaxamento muscular do animal.
- Dê a injecção subcutânea (Pt. 3.3) na dobra da pele do pescoço, uma vez que o coelho é inconsciente.
- Adicionar metilClubrificante ellulose cada 5 - 10 min no olho operado, adicione lubrificante e fita tampas de olho não operado.
- Coloque o coelho coberto na mesa cirúrgica coberto com uma tampa, como uma manta de algodão em posição ideal (nariz ligeiramente elevada através de um molde do cobertor, por isso é nível com a superfície ocular) sob o microscópio cirúrgico. Alinhar olho perpendicular ao microscópio objetivo.
- Garantir a temperatura adequada núcleo do corpo usando termômetro retal (normotermia 39 ± 1 ºC) 29.
- cílios cortados com tesouras (alguma pomada na lâmina) para reduzir infecções pós-operatórias.
- Desinfectar o olho utilizando 2 - 3 gotas de 0,1 g / ml de iodo-povidona topicamente durante 1 min e lavar com BSS esterilizado.
- Cobrir os olhos com cortina estéril com a abertura pré- corte no meio do olho e, em seguida, cubra com (pegajosa) incisão cirúrgica cortina 12 x 17 cm.
4. A vitrectomia
- Proptose e olho seguro com seda 3-0 utilizando invcaliper erted e, executar uma peritomia conjuntival.
- Faça uma incisão na conjuntiva com uma tesoura Vannas perto de limbo, mas distante o suficiente dos vasos sanguíneos (~ 1 mm Distância).
- Dissecar a conjuntiva através da criação de um "T-cut". Primeiro ampliar a peritomia com a tesoura paralela ao limbo e, em seguida, uma incisão na conjuntiva verticalmente em forma de um "T" para cerca de 6 - 7 mm. Separe cuidadosamente a conjuntiva sem rodeios.
- Executar uma esclerotomia usando uma lâmina de 23 G microvitreoretinal (MVR) às 8 horas no olho direito / OD (04:00 em olho esquerdo / OS), inserindo cuidadosamente a ponta afiada da lâmina em direcção ao nervo óptico. Lentamente retrair a lâmina no mesmo sentido e evitar o alargamento da esclerotomia.
- Inserir e lateral costume sutura porta-infusão de cânula 27 com sutura de seda 7-0 e definir pressão intraocular (PIO) em 24 mmHg.
- Executar uma esclerotomia com 25 G cabeça chata trocar a 2 horas de OD (10 o '; Relógio no OS) semelhante ao passo 4.2.
- Insira 25 G lustre luz para trocar cabeça chata, fixar com fita adesiva e ligue fonte de luz a cerca de 30%.
- Se necessário, remova epitélio corneano edematoso usando um # 20 bisturi para melhor visualização intra-ocular.
- Executar uma esclerotomia semelhante ao passo 4.2 em 10 horas em OD (02:00 em OS), (pré-) lugar 7-0 suturas ao redor esclerotomia sem amarrar o nó em forma de u, e inserir vitrectomia ponta de corte.
- Comece vitrectomia 30 à volta da porta de entrada, em seguida, continuar ao longo do disco óptico e os medullares fibrae usando vitreófago alta velocidade, cortando o humor vítreo em pequenos pedaços no máximo. 2.000 - 3.000 cortes / min, aspirando no máximo. 200 mmHg utilizando a configuração do parâmetro declarado da máquina de vitrectomia (Tabela 1)
- Executar um descolamento do vítreo posterior (PVD), separando o humor vítreo da retina, segurando a vitreófago alta velocidade sobre o pólo posterior and (se possível delicadamente) superior do disco 31, enquanto a aspiração única no máximo. 200 mmHg, sem corte.
- Injectar cerca de 50 ul (20 mg) de triamcinolona ou fluoresceína diluído (cerca de 0,1 mg / ml) por via intravítrea de visualizar e facilitar (quase total) a remoção do vítreo que flutua sobre o pólo posterior e média periferia durante a vitrectomia. Evite cruzar sob a lente. Recuo de fazer a barba vítreo periférico por um assistente (qualificados) é recomendada se tamponamento gás é desejada.
- Adicionar 20 unidades / ml de heparina e 0,5 mg de epinefrina a concentração final de 0,001 mg / ml para a solução de perfusão BSS em paralelo ou após o passo 4.10.
Nota: A heparina / epinefrina não são injectados intra-ocular seus efeitos são retardada dependendo da taxa do fluxo da infusão.
5. carregando Shooter
Nota: O trabalho aqui descrito não cai sob os princípios da Declaração de Helsinki; não envolvia pacientes humanos. Aqui, stacélulas ndard RPE foram isolados dos olhos humanos fetais, cultivadas e diferenciadas em não revestido de poliéster de 10 mm de espessura (PET) insere de acordo com nosso protocolo publicado anteriormente 14. A permissão para trabalhar com o material fetal humano foi obtido a partir da comissão de ética da Universidade de Bonn. Alternativamente, HES-RPE foram enviados do laboratório Skottman (manuscrito, em prep.), Onde foram cultivadas de acordo com a técnica descrita por Vaajasaari et al 32.; por estas células uma permissão tenha sido obtido a partir do Instituto Koch R., Berlim, Alemanha.
- Lavar cultura de células antes da preparação do 3x implante com BSS grau oftálmica.
- Encha uma placa de cultura de células padrão (100 x 20 mm) com 10 ml BSS grau oftálmica.
- Adicionar a inserção de cultura de célula para o BSS e centrar o prato sob um microscópio de luz.
- Perfurar um implante de 2,4 x 1,1 mm, com um oval, agulha romba, feitos sob medida para obter um substrato plano, em forma de feijãocom duas arestas longas e duas bordas arredondadas.
- Gentilmente inundar a agulha através da segunda porta com BSS para expulsar o implante no BSS preenchido estação de carregamento feito sob medida (Figura 1).
- Opcionalmente cortar uma extremidade redonda do implante (<0,5 mm), apenas para se obter um terceiro bordo.
- Certifique-se de que o implante é na orientação correcta, assegurando que a monocamada é de cabeça sobre o transportador de células. Para alterar o posicionamento usar com cuidado dois bisturis.
- Empurrar o implante suavemente e completamente para dentro do instrumento atirador usando o suporte de agulha até que todo o implante é presa ao interior da ponta. O êmbolo deve permanecer retraída.
- Mantenha a ponta shooter "carregado" na estação de carga em BSS até o momento da implantação.
6. Implantação
- Aproximar retina neural com extensível 41 G agulha de injeção subretinal conectado a uma seringa estanque (garantir que as bolhas de ar foram evacuadasa partir de tubos!).
- Injectar BSS (com cálcio e magnésio / CM) subretinally e, assim, criar um descolamento de retina bolha (BRD) de cerca de 2-3 diâmetro do disco (DD). Dois BRD por olho pode ser elevada com segurança.
- Ampliar retinotomia a 1,5 mm com verticais 23 g VR-tesoura. O espaço sub-retiniano está agora acessível para implantação ou mais manobras.
- Estender esclerotomia (precisamente) com uma incisão faca 1,4 mm a 20 abordagem G.
- Tentativa passando pelo esclerotomia usando um 20 G atirador manequim, ampliar, conforme necessário para garantir a transição suave, mas confortável do atirador carregado.
- Passe com o atirador carregado 27 a esclerotomia idealmente a 24 mmHg.
- Abordagem retinotomia borda e ejetar o implante subretinally de uma posição epiretinal.
- Ajuste o implante com semicerrados 23 g tesouras, fórceps ou 41 G agulha para se certificar de que está bem posicionada sob o retina- razoavelmente longe da retinotomia.
7.terminando Operação
- Retirar 25 G candelabro e cânula de infusão.
- Suturar todos esclerotomias.
- Injecte 25 ul (10 mg) triamcinolona pelo esclerotomia 08:00 (antes da sutura passado esclerotomia).
- Verifique / ajuste IOP por palpação e injetar BSS através de 30 agulha G / seringa, se necessário.
- conjuntiva sutura com 7-0 vicryl.
- Remover proptosing 3-0 estilingue seda lentamente (Evite plexo venoso orbital profunda!).
- Adicionar dexametasona / pomada antibiótica sob tampa.
- Posição durante 1 h coberto com o cobertor com olho operado voltado para cima (w / o de gás), ou para baixo (com ar / gás).
- Não deixe animais sem vigilância até que ele recupera a consciência suficiente para manter decúbito esternal.
- Não transporte de coelho antes da anestesia desaparece completamente, isso pode ser acelerado através da injeção de medetomidine agente igual revertendo a uma quantia de medetomidine dado.
8. Pós-operatório Animal Care
- Guardacoelhos em condições adequadas (temperatura, luz, comida, água, espaço, etc.) e um acompanhamento rigoroso em um centro especializado.
- Certifique-se que animal está bem descansado, ie., Há longos períodos de alimentos ou a privação de água.
- Procure por quaisquer ferimentos ou lesões, especialmente em locais de injecção.
- Mantenha feridas seco para evitar infecções. Dê antibióticos quando há suspeita de infecção: dexametasona a 1 mg / g, neomicina sulfato de 3.500 Ul / g, sulfato de polimixina B 6000 UI / g unguento foi aplicado duas vezes por dia durante 1 semana pós-operatória sobre a superfície ocular.
- Adicionar dexametasona / pomada antibiótica para o próximo 7 dias de pós-operatório duas vezes por dia para uma melhor regeneração da superfície ocular e dor pós-operatória reduzida.
- Dê analgésicos sistémicos (Carprofene 4 mg / kg duas vezes por dia) durante 48 h inicial.
- Não deixe um animal sem supervisão até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter decúbito esternal.
- Não devolva um animal quefoi submetido a uma cirurgia para a companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado.
- Não expor animais a sofrimento desnecessário.
9. SLO / SD-OCT Orientação
- Preparar e injetar intramuscular (IM) a anestesia utilizando uma seringa com 27 G agulha contendo 0,175 mg / kg de ketamina e 0,125 mg / kg medetomidine para arrancar. Virar a seringa para misturar.
- Adicionar um lubrificante pelo menos a cada 5 minutos para hidratar os olhos e manter-SD outubro de imagem clara, opcionalmente, pode ser utilizada uma lente de contacto personalizado.
- Anexar uma plataforma de aço para o encosto de cabeça para estabilizar o animal na posição desejada.
- Coloque coelho na plataforma de aço, colocando seu olho perpendicular à sonda.
- Segure a cabeça do coelho do osso da bochecha inferior (mandíbula), evitando a traqueia.
- inclinação da cabeça do animal em cerca de 45º para o SD-OCT sonda para otimizar o ângulo de visão sobre o implante.
- Use uma lente de 30 graus e os seguintes parâmetros para optimal outubro de imagem [HS]: 30 graus configurações para uma única linha verifica com o modo ART definido para 100 (média) e 20 x 20 configurações de graduação para verificações de volume com o modo ART definido para 15; o modo de alta resolução não é necessária.
- Use SLO imagiologia reflectância de infravermelhos para encontrar o plano focal do implante (Fig. 2A); foco ideal é alcançado quando (todas) as bordas do implante são nítidas 14.
- Adicionar dexametasona 1 mg / g, neomicina sulfato de 3.500 UI / g, B sulfato de polimixina 6.000 UI / g pomada em tampa quando terminar.
Representative Results
Os resultados do método descrito para o implante sub-retiniano são mostrados na Tabela 2. Enxerto sob a retina teve uma taxa de sucesso de cerca de 61% quando uma vitrectomia de núcleo foi realizada e aumentou até 76%, quando foi induzida descolamento posterior do vítreo. Estes números incluem cerca de 21% dos animais que morreram, quer intra-operatório ou nos 3 primeiros dias do pós-operatório. Esta técnica pode ser usada para implantar dois suportes em diferentes áreas da retina de um olho simultaneamente.
Os coelhos foram submetidos no pós-operatório in vivo acompanhamento usando SD-OCT e processamento histológico como descrito por Stanzel et al. 27 (Figura 2). Fig. Imagem de refletância infravermelho oftalmoscópio de varredura a laser de RPE cultivadas implantado sobre uma membrana de poliéster (PET) 2A mostra após um transplante simples. ohalo ao redor do implante corresponde a fotoreceptoras atrofia. Fig. 2B mostra afinamento correspondente SD-OCT, aviso da retina, a camada nuclear principalmente exterior (ONL), faixa reflexiva hiper na SD-OCT acima implante, enquanto a retina neural adjacente ao implante mostra quase normais bandas de reflexão. Estes resultados sugerem uma entrega atraumática. Fig. 2C mostra Hematoxilina / eosina (H / E) do implante, que mostra cicatrizes sub-retiniana e atrofia ONL em torno do local retinotomia provavelmente como resultado da manipulação iatrogênica, uma camada pigmentada ainda irregular contígua ao longo PET. membrana de Bruch debaixo do implante também pareceu ser contígua, e a camada coreocapilar contém algumas eritrócitos dispersos. Estes resultam morfológicas são comparáveis ao SD-OCT e reforçar a tese de uma entrega atraumática.
FIG ure 1: Carregando Shooter com a Human iPSC-RPE cultivadas em PET celular portador. A) mostra perfurando um implante usando custom made agulha. B) implante em forma de feijão cortado a partir de cultura de células. C) Posicionamento do implante antes do carregamento. D) Carregamento de shooter com implante. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura .
Figura 2: humanas cultivadas HES-RPE em PET celular Transportador 4 semanas de coelho Subretinal espaço. A) Mostra a imagem de reflectância de infravermelho SLO, a linha verde demarca a secção transversal mostrada na Fig. 2B. B) Correspondente SD-OCT. C) mancha de H / E, consulte texto ou 26,27 para mais detalhes.ove.com/files/ftp_upload/53927/53927fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Parâmetro | definições utilizadas |
| vitrectomia | 6.000 cortes / min |
| Vácuo | 200 mmHg |
| Tempo de subida | 1 segundo |
| Ar | 24 mmHg |
| Irrigação | 24 cmH2O |
| DIATHErmy | 30% |
Tabela 1: Configuração dos parâmetros do Vitrectomy máquina.
| vitrectomia | Implantar | coelhos operado | implante com sucesso | implante falhou | Morte | Taxa de sucesso% |
| vitrectomia de núcleo | PET | 30 | 19 | 4 | 7 | 63.33 |
| PET + RPE | 70 | 42 | 12 | 16 | 60 | |
| PVD, ± plasmina W / PPV | PET | 28 | 21 | 2 | 5 | 75 |
| PET + RPE | 22 | 17 | 2 | 3 | 77,27 |
Tabela 2: Resumo dos últimos 150 operações, incluindo Método e Implant Type.
Discussion
Usando um modelo de coelho, um método seguro e reprodutível é apresentada para entrega transvitreal de RPE cultivadas em operadoras de telefonia móvel para o espaço sub-retiniano com um instrumento atirador de design personalizado. O método descrito oferece uma técnica cirúrgica a curto / otimizado para a aprendizagem fácil, uma vez que envolve técnicas padrão em vitrectomia com manobras de sub-retinianas. Resultado é grandemente facilitada por uma interface vitreorretiniana limpo, e infusão intra-ocular que evita a turbulência do fluido ao longo do local de implantação, induzindo o descolamento da retina bolha (BRD) a baixa pressão intra-ocular, impedindo retina e danos esclerótica através secura, e o posicionamento apropriado do coelho.
Nós cautela no entanto, como várias complicações intra-operatório pode ocorrer a qualquer momento, o que dificulta o sucesso da implantação, por exemplo intra hemorragias oculares, anestesia desvanecimento fora durante os passos vitais, tais como o implante, o colapso da BRD devido à manipulação do instrumento ou hipotonia ocular, rmorte abbit devido a doses excessivas de anestesia, pressão arterial baixa durante a operação de longo causando lesão cerebral isquêmica, ou hipertermia. No entanto, essas complicações diminuem com o tempo à medida que são rapidamente abordados e resolvidos através do aumento da experiência da equipe cirúrgica.
Algumas complicações poderia ser reduzida seguindo algumas simples, mas cruciais etapas. Lubrificante deve ser adicionado a cada 5-10 minutos para evitar a córnea, danos de esclerótica e conjuntival durante a operação, e para manter uma clara meios intra-oculares, como seco / esclera enegrecida pode ser uma causa de deiscência da ferida, o que por sua vez leva a hipotonia ocular e / ou vazamento intra-operatória de esclerotomias. Heparina deve ser adicionado para evitar a formação de uma película de fibrina que torna o implante sub-retiniana particularmente desafiante e, simultaneamente, a adição de epinefrina para reduzir o sangramento sob heparina 16. vezes demasiado longo heparina / epinefrina de exposição (> 1 hora) deve ser evitado para impedir Ede córneama por descompensação endotelial 33, crise hipertensiva ou morte intra-operatório. de remoção do vítreo meticulosa deve ser realizada pelo instrumento (de entrada) do porto para evitar a retina e / ou destacamentos coróide. instrumentos intraoculares deve ser apontado para pólo posterior para evitar contato lente (provoca a formação de catarata iatrogênica) ou (local de entrada) danos na retina. Uma porta lateral cânula de infusão intra-ocular deve ser utilizado, uma vez que atenua a corrente de ar ao redor da área do implante, impedindo assim o rasgamento descontrolado de retinotomia, e colapso da BRD. indução da RFA na linha média (eixo vertical do nervo óptico) ou perto de fibras ópticas medulares devem ser evitados para evitar extensas descolamentos de retina iatrogênica. Finalmente, mas não menos BRD deve ser induzida a baixa pressão intra-ocular, para evitar a injecção sub-retiniana utilizando BSS caudais excessivas que podem conduzir a um dano da retina (por exemplo., Por estiramento).
Muitas variáveis de estudo, tais como Carrie celularvariantes r, fetal, adulto ou caule fontes de células epiteliais pigmentares derivadas de células, opções de imunossupressores, etc., podem ser exploradas 14,26,27,34. Mais melhorias, tais como métodos de cultura RPE isentos de soro, caracterização de xenoRPE no espaço sub-retiniano, remoção da camada de RPE de acolhimento 14 ou estratégias para a fixação do implante são de trabalho atual em andamento.
Até à data, as técnicas descritas têm sido utilizados em 5 linhagens de coelhos diferentes, incluindo bastardo chinchila, Chinchilla bastardo / híbridos KBL, Nova Zelândia Branco / Cruz Vermelha, New Zealand White (albino) e holandês cinto. Ambos os coelhos masculinos e femininos foram operados, com coelhos pelo menos 1,5 kg ou 2 meses de idade (dependendo da espécie). A maioria das cirurgias estavam em coelhos pigmentados (bastardos chinchila ou híbridos bastardos chinchila), com pesos entre 2,5-3 kg.
Todas as cepas de coelho que tivemos a oportunidade de trabalhar com parecem ter algumas peculiaridades. Dada a exclusdisponibilidade ive de coelhos pigmentados da estirpe chinchila bastardo na Alemanha em 2009-13, reunimos mais experiência com estes animais. Infelizmente, já não está disponível, uma vez que reprodução foi interrompido, mas compara-se muito bem a New Zealand White / Cruz Vermelha, excepto para a esclerótica mais espessa e mais vantajosa volumes olho maior no último. Chinchilla híbridos bastardos têm formação de fibrina intra-operatória significativa e requer o uso de heparina / epinefrina, conforme descrito acima para garantir manobras sub-retinianas sucesso. Este protocolo também foi realizado em coelhos albinos não pigmentados (New Zealand White), criação contudo especialmente BRD e implantação sub-retiniana é mais desafiador dado reduzida apreciação contraste. A viabilidade de induzir um descolamento do vítreo posterior não parecia coelho estirpe dependente em nossas mãos.
entrega sub-retiniana Transvitreal é provável que a futura estratégia cirúrgica de escolha dado que é o mais comm na rota hoje clinicamente para acessar a retina. Como resultado, muitos outros grupos apresentaram tais técnicas de RPE cultivadas em transportadora apoia em 11,15,23,35 trabalho animal. Aramant et al. 36, de um instrumento, que coloca em vez empurra o implante macio encapsulado-hidrogel para o seu local de destino sub-retiniano. O design do Thumann et al. Utiliza uma espátula oca, que libera o enxerto suportado-carrier, flutuando-lo por meio de injeção de fluido 19. Ambas as estratégias anteriores exigir a inserção sub-retiniana do instrumento, o que na nossa opinião é mais propenso a complicações, quando comparado a um instrumento epiretinally appositioned. Montezuma et al. 22 descreveram um instrumento de inserção sub-retiniana para o fornecimento de implantes de chips sub-retinianas em suínos, mas nenhum trabalho adicional é publicada desde o melhor de nosso conhecimento. Temos sido capaz de estender a técnica descrita com alguma modificação ao porco.
jove_content "> nossos transportadores celulares preferenciais são 10 micron tereftalato de poliéster com uma espessura (PET) membranas. A partir de uma perspectiva cirúrgica, este material tem os parâmetros de rigidez e elasticidade favoráveis, para além da sua ampla versatilidade durante as experiências de cultura de células. Encontrámos experiências semelhantes com tetrafluoroetileno expandido (ePTFE) ou de nanofibras 37 electrospun membranas a partir de PET, poli-láctico / ácido capronolactic (PLCL) ou poli -. láctico-co-glicólico (PLGA), bem como nanofibras compósito (PLGA ou PET) e ultrafinos PET 26 Quando membranas de PET são usados com o nosso instrumento atirador metálico, eles têm uma tendência ocasional para expor carga eletrostática, que desafia a sua expulsão do atirador 27. membranas de poliimida ultrafinos poderia em nossas mãos não ser implantado no espaço sub-retiniano com o protocolo descrito acima ( manuscrito em preparação).Marmor et ai. ter estudado sistematicamente reso espontânearption de fluido sub-retiniano na iatrogênica descolamentos de retina localizadas 38-41. Mesmo após a manipulação no espaço sub-retiniano estes foram encontrados para ser reabsorvido pelo dia pós-operatório 4 em cirurgias sem intercorrências. retinopexia laser não é realizada para proteger as bordas do retinotomia. Embora contra-intuitivo quando comparado com a cirurgia humana, tamponamento de ar / gás não é necessária. A menos que a remoção meticulosa do vítreo periférico pode ser conseguida, particularmente no quadrante superior, este pode, de facto, resultar em lágrimas da retina gigantes originários a partir do local de retinotomia. só é recomendada a realização de troca de ar fluida com posterior tamponamento gás SF6 20% para salvar descolamentos de retina iatrogênica intra-operatórias ou no caso uma posição do implante particular, precisa ser protegido.
Embora a ablação induzida mecanicamente da retina neural pode causar RPE e fotorreceptores danos em coelhos 42,43, sua extensão varia muito (mesmo com BSS regular) dependente de fatores tais como o tipo de IOP, seringa usada, o volume de injeção com retinal induzida, assim, alongamento, etc. Também testamos o frequentemente recomendada Ca / Mg-livre BSS facilitado descolamento 42-44, mas descobriu que ele faz com que a opacificação da lente intra-operatória (em particular com temperatura elevada), e significativamente atrasa ou até mesmo prejudica retinal re-attachment 27. injeção sub-retiniana lenta de 20 - volume de 30 ul de BSS regular com uma seringa de 100 ul é recomendado; movimentos agulha de injeção deve ser mínima para que os selos retinotomia em torno dele e evitar danos a membrana de Bruch. Alguns dos danos iatrogênica pode ser resolvida por RPE cicatrização de feridas, e para a preservação relativa observada da espessura ONL após o reatamento, sugere que o complexo / fotorreceptor RPE pode tolerar esta deficiência, como também descrito por outros 45.
terapias à base de células ou próteses de retina requer anima pré-clínicol testes antes da aprovação regulamentar e iniciar estudos de segurança humanos. O antigo pode variar de país para país. O modelo de coelho descrito aqui pode servir como uma plataforma de custo-eficiente e menos desafiador para estabelecer ou mesmo a realização de todos os requisitos das autoridades regulatórias. Além disso, pode posteriormente servir para o treinamento de cirurgiões em eventuais ensaios clínicos multicêntricos ou outras melhorias da técnica ao longo do caminho.
Disclosures
RB, BVS, ZL, NE e Geuder AG ter apresentado um pedido de patente Europeu sobre o atirador. NB é um funcionário da Geuder AG. taxas de publicação do video-artigo foram pagos pela Geuder AG.
Acknowledgments
Apoiada por doações Rüdiger Fundação em 2008 e 2010 (BVS), BONFOR / Gerok Scholarship O-137,0015 (BVS), BONFOR / Gerok Scholarship O-137,0019 (FT), Deutsche Forschungsgemeinschaft / DFG (BVS) STA 1135 / 2-1, Chinês scholarship Council No. 2008627116 (ZL) e um donativo incondicional por Geuder AG, Heidelberg (Fig. 2). Os membros do laboratório de H. Skottman, Universidade de Tampere na Finlândia são Agradecemos por fornecer hES RPE mostrado na Figura 2 derivados.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| s30 ultrasonic cleaning unit | Elmasonic | 100 4631 | 2.75 L |
| DE-23 autoclave | Systec | C 2209 | 23 L |
| Syringe | BD | 300013 300995 301285 300294 300330 |
1 ml x3 2 ml x3 5 ml x1 10 ml x1 20 ml x1 |
| Needle | BD | 305196 305136 |
18 G x1 27 G x5 |
| Scalpel | Feather | 2975#20 | blade#20 x3 |
| Surgical drape | HARTMANN LOHMANN & RAUSCHER |
277 502 25 440 |
60 x 40 cm x2 12 x 17 cm |
| Ocular sticks | LOHMANN & RAUSCHER | 16 516 | 66 x 5 mm |
| Twister gauze sponges | HARTMANN | 481 274 | x2 |
| Closure strips | HARTMANN | 540 686 | x4 |
| Opmi Visu CS Microscope | Zeiss | N/a | incl. fundus imaging system BIOM II |
| Chandelier endoillumination | Geuder | G-S03503 + G-S03504 |
25 G incl. trocar |
| Light machine | Geuder | G-26033 | Xenotron III |
| Vitrectomy machine | Geuder | G-60000 | MegaTRON S4 S4/ HPS |
| Vitrector | Geuder | G-46301 | MACH2 vitreous cutter 23 G |
| Venturi cassette | Geuder | G-60700 | |
| Sideport-infusion cannula | Geuder | custom | 23 G x1 |
| 3-0 silk suture | ETHICON | V546G | x1 |
| Caliper | Geuder | G-19135 | x2 |
| Vannas scissors | Geuder | G-19777 | x1 |
| Sclerotomie blade | Ziemer | 21-2301 | 1x 23 G 1x 20 G |
| 7-0 silk suture | ETHICON | EH6162H | x1 |
| Needle holder | Geuder | G-32320 | x2 |
| Iris forceps | Geuder | G-18910 | x1 |
| Colibri forceps | Geuder | G-18950 | x1 |
| Extendible subretinal injection needle | DORC | 1270.EXT | 41 G |
| VR scissor | Geuder | G-36542 | 25 G |
| Grieshaber forceps holder | Alcon | 712.00.41 | 23 G |
| Curved scissor forceps tips | Alcon | 723.52 | 23 G |
| Implant loading station | Dow Corning | 3097358-1004 | SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit |
| Blunt oval implant trephine | Geuder | custom-made | 2.4 x 1.1 mm |
| Shooter dummy | Geuder | G-32227 | x1 |
| Shooter | Geuder | G-S03443 | x1 |
| Flute needle | DORC | 1281.SD | 20 G (Vacuum) |
| Manual microliter syringe | Hamilton | 24535 | 100 µl |
| Tissue culture plates | Greiner bio-one | 664160 | 100 x 20 mm |
| Spectralis Multi-Modality Imaging System |
Heidelberg Engineering |
N/a | Spectralis HRA + OCT |
| Drugs and solutions | |||
| Name | Company | Active agent | Comments |
| Mucadont-IS | Merz Hygiene | virucidal instrument disinfectant | 2 L |
| Mucocit T | Merz Hygiene | Aldehyde-free instrument disinfectant | 2 L |
| Ketamin 10% | WDT | Ketamine | 10 ml (100 mg/ml) |
| Domitor | Orion Pharma | Medetomidine hydrochloride | 10 ml (1 mg/ml) |
| Antisedan | Orion Pharma | Atipamezole hydrochloride | 10 ml (5 mg/ml) |
| Neosynephrin POS 10% | URSAPHARM | Phenylephrine HCl | 10 ml |
| Mydriacyl | Alcon | Tropicamid | 10 ml (5 mg/ml) |
| Methocel 2% | Omni Vision | hydroxypropyl methylcellulose | 10 g |
| PURI CLEAR | ZEISS | Balance salt solution (BSS) | 500 ml |
| Glucose 5% | B.Braun | Glucose 5% solution | 100 ml |
| Heparin-Natrium-25,000 | Ratiopharm | Heparin | 5 ml (2,500 unit/ml) |
| Suprarenin | SANOFI | Epinephrine | 1 ml (1 mg/ml) |
| Triamcinolone | University of Bonn pharmacy | preservative-free Triamcinolone | 1 ml (40 mg/ml) |
| Isoptomax eye ointment | Alcon | dexamethasone 1 mg/g neomycin sulfate 3,500 IU/g polymyxin B sulfate 6,000 IU/g |
10 ml |
| Betaisodona | Mundipharma | Povidon-Iod | 30 ml (1 g/10 ml) |
| Optive | ALLERGAN | sodium carboxymethylcellulose glycerol | 10 ml |
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