Introduction
Borstkanker is de meest voorkomende kwaadaardige aandoeningen die de vrouwelijke bevolking over de hele wereld. Meer dan 1,3 miljoen gevallen van borstkanker worden elk jaar wereldwijd 1,2 gemeld. Hoewel tumorcellen worden traditioneel als biologisch homogeen en hoog proliferatieve beschouwd, is het duidelijk geworden dat borstkanker genetisch en klinisch heterogeen. Resistentie tegen heersende antikankergeneesmiddelen is een kenmerk van gevorderde borstkanker, wat leidt tot de sterfte in de meerderheid van patiënten via de facilitering van kankerprogressie en afstand metastase 3.
MicroRNAs (miRNAs) zijn een klasse kleine RNA- moleculen ongeveer 22 nucleotiden lang die genexpressie reguleren door mRNA translatie te blokkeren of bemiddelen mRNA afbraak 4. Meer dan 2000 verschillende miRNAs dusver geïdentificeerd in de mens, die verband houden met menselijke ziekten 5. Een groeiend scala aan studies have aangetoond dat miRNAs kan functioneren als oncogenen en tumor suppressors en worden vaak verstoord bij tumoren 6. miRNAs aanzienlijke invloed hebben alle primaire tumorigenese door regeling van de belangrijkste regulatoren van celcyclusprogressie, senescentie, apoptose en autofagie, samen met die van tumorcel beweeglijkheid, invasie en metastase 7.
Afwijkende miRNA expressie is ook geassocieerd met klinische implicaties zoals stadium, differentiatie, prognose en respons adjuvante 8. Vooral een groter miR-146 expressie is gecorreleerd met slechte prognose bij longkankerpatiënten 9. Een andere studie heeft aangetoond dat verloren expressie van miRNA-let7b samenhangt met kwaadaardige fenotypes en derhalve slechte overleving 6. Inzicht in de typen cellen en structuren die miRNAs expressie is een belangrijk onderdeel van het begrijpen van de mechanismen waarmee veranderingen in miRNA expressie beïnvloeden cel enweefsel fenotypen 10. Bepaalde miRNAs gevonden te worden uitgescheiden in stromale cellen worden in genomen door epitheelcellen en specifiek inwerken op hun doelen. In dezelfde geest, miR-212 en miR-132 worden uitgescheiden door stroma en reguleren van de epitheliale-stromale interacties die nodig is voor ductaal uitgroei tijdens de ontwikkeling van de borstklier 11. De algemene doelstelling van dit document is een gedetailleerd protocol om miRNA expressie in borstkanker weefsels op te sporen door middel van miRNA in situ hybridisatie uit te leggen. We hebben alle omstandigheden geoptimaliseerd om de niveaus van miRNA-489 expressie in borstkanker patiëntenmonsters testen. Hiervoor gebruikten we een DIG gemerkte vergrendeld nucleïnezuur (LNA) probe in ons experiment. Sommige van de nucleotiden had een LNA modificatie, dat wil zeggen een methyleen brug tussen het 2 'zuurstofatoom en het 4' koolstofatoom van het ribose ruggengraat die de nucleotide zodat het blijft "vergrendeld" na hybridisatie vastgesteld. Daardoor is het veel moeilijkerhet gehybridiseerde complex te denatureren 12,13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deze studie werd goedgekeurd door de Institutional Review Board van de Chonnam National University Hwasun Hospital en Universiteit van South Carolina. TMA monsters bestaande uit borstkanker en afgestemd aangrenzend normaal borstweefsel werden verstrekt door de Biobank van Chonnam National University Hwasun Hospital, een lid van de Korea Biobank Network.
1. Oplossing Voorbereiding
- Bereid 1 liter DNase en RNase vrij water. Maak alle chemische oplossingen met behulp van diethylpyrocarbonaat (DEPC) behandeld water. Behandel 1 liter water met 500 pi DEPC en incubeer gedurende 3 uur bij kamertemperatuur geroerd. Autoclaaf het water naar DEPC inactiveren.
Let op: Adem geen DEPC omdat het bekend carcinogeen. - Bereid 1x PBS van 10x PBS met behulp van DEPC behandeld water.
- Bereid 20x SSC (ontbinden 175,3 g NaCl en 88,2 g natriumcitraat in 800 ml water, breng de pH op 7,0 met een paar daling van 14 N oplossing van HCl en het volume aan te passen tot 1 L met water), 4% paraformaldehyde, 95% ethanol, 80% ethanol met behulp DEPC behandeld water.
- Voeg 8 ml triethanolamine en 1,05 ml HCl in 590 ml DEPC-behandeld water en voeg 1,5 ml azijnzuuranhydride voor acetylering.
- Bereid 50 pg / pl proteinase K in buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,0 in DEPC behandeld water).
- Bereid hybridisatiebuffer bestaande uit 500 pl formamide, 250 pl 20x SSC, 100 gl 50x Denhardt's oplossing, 12,5 ui t-RNA, 2,5 ul haringsperma DNA, 30 ui RVC, 0,02 g blokkerende reagens en 50 pi DEPC water. Vers bereid.
2. Breast Tissue Secties
- Snijd 5 urn in formaline gefixeerde in paraffine ingebedde secties met microtoom en de sectie op dia 14 in rekening te brengen.
Opmerking: De borstweefsel hier gebruikt is eerder bereid uit de Korea Biobank Network.
3. Tissue Voorbereiding
- Verwijderen paraffine weerm het weefsel door onderdompeling glijdt in Coplin jar 2x in verse xyleen gedurende 10 min elk en hydrateren de weefselsectie van 5 min incubaties afnemende concentraties ethanol (100%, 95% en 80%) in DDH 2 O. Voer deze stap in een zuurkast.
- Dompel het weefsel in DEPC behandeld water gedurende 5 minuten. Op dit moment maken de grenzen rond weefselsectie met hydrofobe barrière pen.
- Bevestigen van het weefsel met 4% PFA gedurende 15 minuten gevolgd door een wassing met PBS.
- Dompel het weefsel in 0,3% Triton X-100 / PBS gedurende 10 minuten gevolgd door een wassing met PBS.
- Incubeer monster met 50 ug / ul proteïnase K-oplossing gedurende 15 minuten bij 37 ° C. incubeer weefselcoupes vervolgens met triethanolamine en azijnzuuranhydride gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door een wassing met PBS. Nr PBS wassing nodig tussen Proteinase K behandeling en triëthanolamine / azijnzuuranhydride behandeling.
4. hybridisatie
- Was het weefsel grondig en Incuverminder de weefselsectie hybridisatie buffer gedurende 2-3 uur bij kamertemperatuur. Meestal 120 pl hybridisatie buffer is genoeg om de weefselsectie dekken.
- Verdun 5'-DIG gemerkte probe LNA eindconcentratie van 3:00 in 120 ul hybridisatieoplossing. De voorraad concentratie gewoonlijk 40 ng / ul, 3 ul voeg leverbaar tot 120 gl hybridisatiebuffer en incuberen mengsel bij 95 ° C gedurende 5 minuten.
- Incubate weefselsectie met probe 's nachts bij 54 ° C (Tm) in een vochtige kamer. Meestal 120 pl is genoeg om een gedeelte bevatten. Maak luchtvochtigheid met behulp van twee natte papieren handdoeken. De ideale grootte van de kamer is 10 inch bij 8 inch.
- Opmerking: Tm kan verschillend zijn voor verschillende miRNA zijn. 54 ° C is vermelding voor miR-489.
5. wassing
- Was het weefsel met 5x SSC gedurende 7 min (na de hybridisatie stap, RNase vrije omstandigheden niet meer nodig).
- Was het weefsel sectie with 1x SSC gedurende 7 min tweemaal bij 57 ° C.
- Was de weefselsectie met 0,2X SSC gedurende 7 minuten bij 57 ° C.
- Was de weefselsectie met 0,2X SSC gedurende 7 minuten bij kamertemperatuur.
- Incubeer weefselsectie in PBS gedurende 10 min.
6. Blocking
- Incubeer de weefselsectie met blokkerende buffer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur in een vochtige kamer (Om blokkeerbuffer voeg 2 ml FBS, 10 ul Tween-20 en 3 gl BSA in PBS 18 m. Store blokkerende buffer bij 4 ° C).
7. Primary Antibody Incubation en Development
- Verdun 1: 300 anti-DIG-AP antilichamen in blokkeerbuffer en incubeer de weefselsectie met antilichaam bij 4 ° C overnacht.
- Was de secties met wasbuffer 3 keer, gedurende 5 minuten elk (buffer geleverd door development kit).
- Ontwikkelen van het weefsel gedeelte met een commerciële kit voor alkalische fosfatase dat CY-3 tl-licht produceert. <li> Was de sectie met wasbuffer gedurende 5 minuten. Vlek sectie met 100 ul van 2,5 ng / ul Hoechst kleurstof gedurende 5 minuten, gevolgd door 5 minuten wassen met wasbuffer.
- Monteer de sectie met montage buffer volgens het protocol van de fabrikant. Gebruik 15 ul per weefsel sectie en veeg overmatige montage oplossing met een tissue af te vegen. Sluit de dia met duidelijke nagellak om lekkage te voorkomen.
- Houd u aan de sectie tl-microscoop met met 10x lens, zodat totale vergroting is 100X.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Menselijke borstkanker weefsel werd gebruikt om miRNA-489 expressie te bepalen. Borstklier duct en epitheelcellen bleken significant hoger miRNA-489 levels dan aangrenzend tumorweefsel bij twee patiënten (Figuur 1A en 1B) uit te drukken. Hieruit blijkt duidelijk dat miRNA-489 expressie verloren is gegaan in tumorweefsel, wat suggereert tumor onderdrukkende activiteit van miRNA-489. Om verder te bevestigen deze resultaten, tumorweefsel en aangrenzend normaal weefsel van dezelfde patiënt werd vergeleken. Zoals in Figuur 2A en 2B, werd normaal weefsel ervan meer miRNA-489 tot expressie dan de aangrenzende tumorweefsel. 10 pm in de beelden geeft schaal bar. Beelden werden genomen met behulp van 10X lens.
Figuur 1: Expressie van miR-489 in normaal borstweefsel. Beide normale duct structuur en de tumorcellen worden weergegeven op dezelfde afdeling. Weefsels uit verschillende borstkankerpatiënten. Normaal door de melkklieren duct en borstklier uiten miRNA-489, terwijl afwezig in tumorweefsel. Schaal bar = 10 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2:. Expressie van miR-489 in Breast Cancer Patient Pair Een weefsel micro-array werd gebruikt voor miR-489 expressie te bestuderen in een borstkanker patiënt. Een vertegenwoordiger patiënt pair wordt hier getoond. Schaal bar = 10 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het doel van deze studie was het niveau van miRNA expressie in borstkanker weefsels met behulp miRNA in situ hybridisatie bepalen. Er zij op gewezen dat in dit experiment alle omstandigheden werden geoptimaliseerd voor borstkankerweefsel. Verdere optimalisatie kan het nodig zijn andere weefseltypes. Alle oplossingen moeten worden gemaakt met DEPC water en alle containers worden gebruikt moet worden gespoeld met DEPC behandeld water en vervolgens geautoclaveerd. Zelfs kleine RNase vervuiling kunnen interfereren met het uiteindelijke resultaat van het experiment. Als miRNA is een zeer korte sequentie, moet een LNA sonde betere hybridisatie met het doel te vergemakkelijken. Verder na fixatie van het weefsel, behandeld met RNase-vrij proteïnase K absoluut noodzakelijk anders eiwitten kunnen interfereren met hybridisatie van de probe met het endogene miRNA. Bovendien, voordat incuberen van het weefsel deel met de sonde, moet deze worden gekookt tot 95 ° C aan een ontvouwensecundaire structuren.
Na incubatie gedurende de nacht, is het belangrijk te wassen met variërende concentraties SSC bij bovengenoemde temperatuur in protocol niet-specifieke binding te verminderen. Voor de ontwikkeling van fluorescentie, incubeer weefselsectie substraat met ten minste 1 uur. Het is raadzaam om de sectie onderhoudende in incubatie zodat overontwikkeling kan worden vermeden. Zorg ervoor dat u het gedeelte met de montage media die bij de kit te monteren.
Er is een beperkende factor die men moet nemen in overweging. Als doel miRNA expressie is lager in weefsel zal het moeilijk zijn om de expressie te detecteren met behulp van deze techniek. Het is altijd raadzaam om dit protocol met een positieve controle uit te voeren, zoals U6 zodat de techniek kan worden bevestigd en alle reagentia worden gewaarborgd om samen te werken en ze zijn RNase vrij.
Het is mogelijk om biotine gemerkte probe in plaats van DIG gemerkte probe bij zwakke signal met DIG gemerkte probe. Signaalversterking is mogelijk met biotine-avidine systeem. Avidine heeft een sterke affiniteit voor biotine. Door gebruik te maken van deze verwantschap kan men biotineprobe labelen met avidine-biotine duplex die vast met alkalische fosfatase. Via deze strategie is het mogelijk voor Low- overvloedige miRNA amplificeren ook.
Het veld van miRNA is sterk in opkomst, omdat miRNAs cruciale rol spelen in de belangrijkste cellulaire processen en zijn sterk verbonden met de ontwikkeling van kanker. Bovendien kunnen deze miRNAs ook als biomarker kankerdiagnose. Verschillende studies hebben aangetoond een sterke correlatie tussen miRNA expressie en klinische parameters zoals tumor stadium waarin mogelijke toepassing van miRNA expressie in kanker prognose. Deze techniek kan ook gebruikt worden voor miRNA expressie analyse andere kankersoorten. Bijvoorbeeld, de expressie van miR-182 en miR-503 werden geanalyseerd in colonkanker patiënt weefsels met behulp van in situ hybridisatie 15.
Traditionele genexpressie analyse kan onthullen miRNA expressie in weefsel, maar het kan de locatie van waaruit de structuur miRNA wordt uitgedrukt niet onthullen. Door het gebruik van deze techniek, kan men gemakkelijk vinden van de miRNA expressie niveau als locatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ELF-97 | Life technology | E6604 | |
| 50x Denhard't | Life technology | 750018 | |
| t-RNA | Roche | 109541 | Reconstitute in DEPC water |
| Herring Sperm DNA | Promega | D1815 | |
| Roche Blocking | Roche | 11096176001 | |
| RVC | Fisher | 50-812-650 | Before use spin down it at 16.1 RCF and take supernatant |
| miR-489 probe | Exiqon | 38599-01 | |
| Nuclease free BSA | Roche | 711454 | |
| Primary antibody-anti DIG | Roche | 11093274910 | |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma | 1609478 |
References
- Shah, N. R., Chen, H. MicroRNAs in pathogenesis of breast cancer: Implications in diagnosis and treatment. World J Clin Oncol. 5, 48-60 (2014).
- Tang, H., et al. miR-185 suppresses tumor proliferation by directly targeting E2F6 and DNMT1 and indirectly upregulating BRCA1 in triple-negative breast cancer. Mol Cancer Ther. 13, 3185-3197 (2014).
- Ye, X. M., et al. Epigenetic silencing of miR-375 induces trastuzumab resistance in HER2-positive breast cancer by targeting IGF1R. BMC Cancer. 14, 134 (2014).
- Oneyama, C., et al. MicroRNA-mediated downregulation of mTOR/FGFR3 controls tumor growth induced by Src-related oncogenic pathways. Oncogene. 30, 3489-3501 (2011).
- McGuire, A., Brown, J. A., Kerin, M. J. Metastatic breast cancer: the potential of miRNA for diagnosis and treatment monitoring. Cancer Metastasis Rev. 34, 145-155 (2015).
- Quesne, J. L., et al. Biological and prognostic associations of miR-205 and let-7b in breast cancer revealed by in situ hybridization analysis of micro-RNA expression in arrays of archival tumour tissue. J Pathol. 227, 306-314 (2012).
- Fernandez, S., et al. miR-340 inhibits tumor cell proliferation and induces apoptosis by targeting multiple negative regulators of p27 in non-small cell lung cancer. Oncogene. 34, 3240-3250 (2015).
- Yu, L., Zhang, J., Guo, X., Li, Z., Zhang, P. MicroRNA-224 upregulation and AKT activation synergistically predict poor prognosis in patients with hepatocellular carcinoma. Cancer Epidemiol. 38, 408-413 (2014).
- Li, J., et al. microRNA-146 up-regulation predicts the prognosis of non-small cell lung cancer by miRNA in situ hybridization. Exp Mol Pathol. 96, 195-199 (2014).
- Kriegel, A. J., Liang, M. MicroRNA in situ hybridization for formalin fixed kidney tissues. J Vis Exp. , e50785 (2013).
- Ucar, A., et al. miR-212 and miR-132 are required for epithelial stromal interactions necessary for mouse mammary gland development. Nat Genet. 42, 1101-1108 (2010).
- Nuovo, G. J. In situ detection of microRNAs in paraffin embedded, formalin fixed tissues and the co-localization of their putative targets. Methods. 52, 307-315 (2010).
- Kierzek, E., et al. The influence of locked nucleic acid residues on the thermodynamic properties of 2'-O-methyl RNA/RNA heteroduplexes. Nucleic Acids Res. 33, 5082-5093 (2005).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Li, L., et al. Sequential expression of miR-182 and miR-503 cooperatively targets FBXW7, contributing to the malignant transformation of colon adenoma to adenocarcinoma. J Pathol. 234, 488-501 (2014).
