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Immunology and Infection

Induction of Experimental encéphalomyélite allergique chez la souris et l'évaluation de la distribution des maladies dépendant des cellules immunitaires dans divers tissus

Published: May 8, 2016 doi: 10.3791/53933
* These authors contributed equally

Abstract

La sclérose en plaques est présumée être une maladie inflammatoire auto-immune qui se caractérise par la formation de lésions dans le système nerveux central (SNC), résultant en une déficience cognitive et motrice. encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) est un modèle animal utile de la sclérose en plaques, car elle est aussi caractérisée par la formation de lésions dans le système nerveux central, un trouble moteur et est également entraîné par des réactions auto-immunes et inflammatoires. L' un des modèles EAE est induite par un peptide dérivé de la protéine de myéline oligodendrocyte (MOG) 35-55 chez la souris. Les souris EAE développent un cours de maladie progressive. Ce cours est divisé en trois phases: la phase préclinique (jour 0-9), l'apparition de la maladie (jour 10 - 11) et la phase aiguë (jour 12-14). Sclérose en plaques et l'EAE sont induites par les lymphocytes T autoréactifs qui infiltrent le système nerveux central. Ces cellules T sécrètent des chimiokines et des cytokines qui conduit au recrutement d'autres cellules immunitaires. Par conséquent, la distribution des cellules immunitaires dans la moelle épinière dendant les trois phases de la maladie a été étudiée. Pour mettre en évidence le point de la maladie à laquelle l'activation / prolifération / accumulation de cellules T, les cellules B et les monocytes commence le temps, la distribution des cellules immunitaires dans les ganglions lymphatiques, la rate et le sang a également été évaluée. En outre, les niveaux de plusieurs cytokines (IL-1, IL-6, IL-23, TNFa, IFNy) dans les trois phases de la maladie ont été déterminées, afin de mieux comprendre les processus inflammatoires de la maladie. En conclusion, les données fournissent un aperçu du profil fonctionnel des cellules immunitaires au cours EAE pathologie.

Introduction

la sclérose en plaques (MS) et son modèle d'animal correspondant, encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE), présentent des changements de la neuroinflammation auto-immunes du système nerveux central (SNC). Les lésions précoces de sclérose en plaques et EAE actives sont caractérisées par la présence de cellules immunitaires infiltrés. L'étiologie de la SEP demeure inconnue, mais est largement considérée comme impliquant la destruction de la myéline médiée par les cellules T autoréactives. Ces cellules T autoréactives sécrètent des cytokines pro-inflammatoires et des chimiokines qui attirent d'autres cellules immunitaires telles que les cellules B, les monocytes et les neutrophiles de la circulation. Les monocytes se différencient en macrophages. Interferon gamma (IFNy) sécrétée par la cellule T autoréactifs polarise les macrophages dans les macrophages pro-inflammatoires. Les cytokines pro-inflammatoires macrophages de libération et les espèces réactives de l'oxygène qui favorisent l'apoptose dans les oligodendrocytes. La mort des oligodendrocytes conduit à une démyélinisation. En outre, les cellules B se différencient en pcellules Lasma et autoanticorps de libération contre la gaine de myéline, en fin de compte résultant de la dégradation de la myéline. La perte de myéline entraîne une dégradation des axones et des neurones et ainsi à la formation de sites de lésion du SNC , qui représentent la principale caractéristique de la SP 1. Dans la périphérie, les cellules T et les cellules B sont activées dans les ganglions lymphatiques, ils prolifèrent dans la rate et migrent à travers la circulation dans le système nerveux central. Prolifèrent monocytes et neutrophiles dans la moelle osseuse et migrent également à travers la circulation dans le système nerveux central.

Extravasation des leucocytes de la moelle osseuse, la rate et les ganglions lymphatiques dans le sang ou de la circulation sanguine dans le système nerveux central est un processus en plusieurs étapes qui dépend de plusieurs facteurs, y compris les interactions moléculaires entre les leucocytes et l'endothélium médiées par des chimiokines et des récepteurs de chimiokines. La production de chimiokines par divers types de cellules peut être induit pendant le reactio immunitairen par des cytokines telles que le facteur onconécrosant-α (TNF), IFN - y et d' interleukine-6 ​​(IL-6), qui recrute ensuite les cellules immunitaires vers le site de l' inflammation 2,3. les cellules immunitaires présentent un sous-ensemble de récepteurs de chimiokine sur leur surface, en fonction du type de cellule et la voie de migration vers le site inflammatoire. Ainsi, CXCR2, CCR1 et CXCR1 sont exprimés sur les neutrophiles matures dans la moelle osseuse et le sang 4 et la liaison de ses ligands, CXCL2, CCL5 ou CXCL6, respectivement, active les neutrophiles et favorise leur adhérence à l'endothélium et par la suite, la migration des cellules dans les tissus 5-9. CCL2 et CCL20 attirent les monocytes et les cellules Th1 / Th17 10, qui expriment CCR2 11 et CCR6 12, respectivement. CCR1 et CCR5 exprimés par différents types cellulaires, notamment les cellules T, les monocytes et les macrophages 13, se lient CCL3, CCL5 et CCL7 et qui sont régulés à la hausse au cours de MS 14. CXCR3 est exprimé sur les lymphocytes T et se lie CCL9, CCL10 etCCL11 15.

Une stratégie principale dans le traitement de la SEP est la diminution des cellules du système immunitaire ou à la prévention de l'infiltration des cellules immunitaires dans le système nerveux central. Par conséquent, le blocage des récepteurs de chimiokines spécifiques a été étudiée dans l'EAE. Antagonisme ou délétion génétique de 16 CCR1, CCR2 , 17, 18 CCR7 ou CXCR2 19 réduit EAE pathologie, alors que l' antagonisme ou la deletion génétique de 20 CCR1, CXCR3 ou CCR5 20 21 ne réduisaient pas la pathologie. Par conséquent, l'expression des récepteurs de chimiokine sur les leucocytes spécifiques est essentielle pour l'infiltration de ce dernier dans le système nerveux central et dicte au cours de l'EAE.

L'appauvrissement des cellules immunitaires est une stratégie de traitement efficace pour les patients atteints de SEP, puisque les cellules immunitaires infiltrés libèrent des cytokines, telles que TNFa, IL-6 et IL-1β, qui, à leur tour, favorisent le processus inflammatoire ou la dégradation des neurones 22. En outre, auto-les cellules Th1 réactives libèrent IFNy, qui à son tour stimule les macrophages à libérer TNFa, IL-1β et de l'IL-23.

Ce manuscrit décrit l'induction de l'EAE, la détermination de la distribution des cellules immunitaires et les niveaux de cytokines (ARNm) dans divers tissus chez des souris atteintes d'EAE. Les cellules ont été isolés à différents moments au cours de la maladie afin de fournir une vue d'ensemble en fonction du temps des processus inflammatoires qui conduisent finalement à la formation de lésions dans le SNC.

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Protocol

ÉTHIQUE DÉCLARATION: Nos procédures expérimentales sont approuvées par le Comité d'éthique du Regierungspräsidium Darmstadt (Allemagne) et confirment les réglementations nationales et européennes. Tous les efforts ont été faits pour minimiser les souffrances des animaux et de réduire le nombre d'animaux utilisés.

1. EAE Modèle

  1. Induction du modèle EAE
    1. Utilisez 10 à 13 semaines d'âge 129S4 femme / SvJae × C57BL / 6 pour l'induction de l'EAE.
    2. Donner à la souris une injection sous - cutanée, dans la partie supérieure et le bas du dos, de la MOG 35 encéphalitogénique - 55 (myéline oligodendrocyte glycoprotéine) peptide (200 ug), émulsionné dans 200 pi d' adjuvant complet Freund`s (CFA) contenant 400 ug de Mycobacterium tuberculosis.
      Remarque: Comme, un contrôle négatif non-maladie induisant imposture, l'adjuvant de Freund incomplet contenant Mycobacterium tuberculosis, dans le même volume et par la même voie, peut être utilisé.
    3. TherEAprès, et de nouveau 24 heures plus tard, donne les souris une injection intrapéritonéale de toxine de la coqueluche (au total 0,2 pg, dilués dans 200 ul de solution saline tamponnée au phosphate, PBS). Utilisez les souris non traitées comme le groupe de contrôle, pour être en mesure de comparer les malades avec des animaux sains.
      Remarque: Il est également possible d'induire l' EAE avec 200 - 300 pg MOG 35 - 55 peptide, à 300 - 500 ug de Mycobacterium tuberculosis dans le CFA et 0,2 - 0,3 pg toxine pertussis dans un volume de 0,1 - 0,2 ml par injection.
    4. A partir d'une semaine après l'injection, les souris examinent tous les jours pour les symptômes cliniques (voir étape 1.2.1)
      Remarque: Le jour de l'apparition de la maladie varie selon les expériences, mais dans les conditions de notre laboratoire, c'est d'environ 11 jours et donc, ici le jour 14 est définie comme 3 jours après l'apparition de la maladie. Toutes les souris dans la présente étude ont développé des symptômes cliniques.
  2. La notation des souris
    1. Classez symptômes cliniques par des scores cliniques comme suit:0) aucun signe, 0,5) paralysie distale de la queue, 1) paralysie complète de la queue, 1,5) queue molle et légère faiblesse des pattes arrières, 2) la queue molle et la faiblesse sévère des pattes postérieures, 2.5) queue molle et la paralysie de une patte arrière, 3) la queue molle et la paralysie des deux jambes de derrière, 3,5) paralysie des deux membres postérieurs et de la faiblesse d'un membre antérieur (souris obtenant ce score ont été euthanasiés, conformément aux directives éthiques locales).

2. Préparation des cellules simples pour l'analyse de cytométrie en flux

Remarque: Le mélange d'anticorps se compose de 1 pl CD45-Vioblue, 2 pl CD8-eFluor650, 0,5 ul CD11b-eFluor605, 0,5 ul F4 / 80-PE-Cy7, 1 pl CD3-PE-CF594, CD4-V500, 0,5 ul CD11c -AlexaFluor700, 1 pl CD19-APC-H7 et 1 ul Ly6G-APC-Cy7.

Remarque: Si vous prenez le sang, les ganglions lymphatiques, la rate et la moelle épinière, la procédure est la suivante: Les souris sont profondément anesthésiés avec une combinaison de isoflurane (2% en carbogène par minute) et la kétamine (100 mg / kg de poids corporel). Suivant ouvrir le thorax, retirer le sang avec un bâton intracardiaque et perfuser les souris intracardiaque avec du PBS froid. Ensuite, retirer les ganglions lymphatiques suivis par la rate et, enfin, la moelle épinière. Si vous ne devez perfuser les souris intracardiaque puis euthanasier les souris sous anesthésie profonde par luxation du cou.

  1. L'isolement des splénocytes
    1. Anesthésier les souris avec une combinaison de l'isoflurane (2% en carbogène par minute) et de kétamine (100 mg / kg de poids corporel).
    2. zone d'incision humide avec 80% d'isopropanol afin d'éviter toute contamination par des poils et ouvrir le thorax longitudinalement, sans perforer les tissus plus profonds, en utilisant des ciseaux.
    3. Perfuser souris intracardiaque de froid pH PBS 7,0 23.
      Remarque: La rate est située dans le quadrant supérieur gauche de l'abdomen sous la cage thoracique. Si seulement la rate est à étudier, cet organe peut être retiré avant la perfusion afin de Retain tous les types cellulaires d'intérêt.
    4. Retirer la rate et couper environ 1/8 et le peser. Conserver l'échantillon dans PBS sur la glace.
    5. Presser le tissu de la rate à travers un tamis à mailles de 70 pm (placé au-dessus d'un tube de 50 ml), en utilisant le piston d'une seringue de 2 ml.
    6. Laver la maille avec 5 ml de PBS. Centrifuger à 1800 xg pendant 3 min. Reprendre le culot dans 500 ul solution de lyse.
      Remarque: A ce stade, il peut être nécessaire de faire compter une cellule différentielle si, plus tard, une méthode d'analyse de FACS alternative est utilisée qui n'utilise pas des perles (voir section 3).
    7. Incuber pendant 10 min à température ambiante (RT) et ajouter 500 ul de PBS. Centrifuger pendant 6 minutes à 650 xg à la température ambiante (RT).
    8. Répéter l'étape de lavage avec 500 ul de PBS. Jeter le surnageant, remettre en suspension le culot cellulaire dans 100 pi de 0,2% de sérum albumine bovine (BSA) / PBS, ajouter 2 ul de Fc receptor-1 (FcRI) du tampon de blocage et incuber pendant 15 min à température ambiante dans l'obscurité.
    9. Ajouter 13 ul unmélange tibody, incuber 15 min à température ambiante dans l'obscurité, ajouter 500 ul de PBS et centrifuger pendant 6 min à 650 xg à température ambiante. Jeter le surnageant.
      Remarque: La procédure de coloration du fabricant recommande un seul lavage, mais une réduction supplémentaire de la coloration de fond peut être obtenue par répéter éventuellement l'étape de lavage une ou deux fois de plus.
    10. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 500 pi de PBS (tampon ou éventuellement en cours d'exécution pour la séparation des protéines, afin de réduire potentiellement l'agglutination des cellules) et le transférer à la cytométrie en flux tube. Gardez les cellules sur la glace.
  2. L'isolement des cellules de ganglions lymphatiques
    1. Anesthésier les souris avec une combinaison de l'isoflurane (2% en carbogène par minute) et de kétamine (100 mg / kg de poids corporel).
    2. zone d'incision humide avec 80% d'isopropanol et d'ouvrir le thorax longitudinalement avec des ciseaux. Perfuser souris intracardiaque de froid pH PBS 7,0 23.
    3. Pour isoler le ganglion lymphatique inguinal, retirez soigneusement la peau dans la région du salutp et ramasser les ganglions lymphatiques soigneusement du tissu adipeux avec une pince. Peser le ganglion lymphatique inguinal et stocker l'échantillon dans du PBS sur la glace.
      Remarque: Nous avons utilisé les ganglions lymphatiques inguinaux dans nos études parce O`Connor et al. ont constaté que le nombre élevé de monocytes activés, les macrophages, les neutrophiles et les lymphocytes T étaient présentes dans les ganglions lymphatiques inguinaux après l' induction de l' EAE 24.
    4. Presser le ganglion lymphatique à travers un tamis à mailles de 70 pm (placé au-dessus d'un tube de 50 ml) en utilisant le piston d'une seringue de 2 ml.
    5. Laver la maille avec 5 ml de PBS. Centrifuger à 2400 xg pendant 8 min. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 100 pi de 0,2% de BSA / PBS, ajouter 2 ul de tampon de blocage FcRI et laisser incuber pendant 15 min à température ambiante dans l'obscurité.
    6. Ajouter 13 ul mélange d'anticorps, incuber 15 min à température ambiante dans l'obscurité, ajoutez 500 pi de PBS et centrifuger pendant 6 min à 650 xg à température ambiante.
    7. Jeter le surnageant, remettre en suspension le culot cellulaire dans 300 pi de PBS (ou d'un tampon approprié de roulement) et le transférerdans un tube de cytométrie de flux.
  3. L'isolement des cellules sanguines
    1. Ajouter 50 pi 20 mM HEPES à 50 ul de sang (stabilisé avec de l'EDTA) et ajouter 500 ul solution de lyse. Incuber pendant 10 min à température ambiante et ajouter 500 ul de PBS. Centrifuger pendant 6 minutes à 650 xg à température ambiante. Rejeter le surnageant et répéter l'étape de lavage.
    2. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 100 pi de 0,2% de BSA / PBS, ajouter 2 ul de tampon de blocage FcRI et laisser incuber pendant 15 min à température ambiante dans l'obscurité.
    3. Ajouter 13 ul mélange d'anticorps, incuber 15 min à température ambiante dans l'obscurité, ajoutez 500 pi de PBS et centrifuger pendant 6 min à 650 xg à température ambiante. Jeter le surnageant, remettre en suspension le culot cellulaire dans 300 pi de PBS et transférer dans le tube de cytométrie en flux.
  4. L'isolement des cellules de moelle épinière
    1. Anesthésier les souris avec une combinaison de l'isoflurane (2% en carbogène par minute) et de kétamine (100 mg / kg de poids corporel).
    2. zone d'incision humide avec 80% d'isopropanol et d'ouvrir le thorax longitudinalementen utilisant des ciseaux. Perfuser souris intracardiaque de froid pH PBS 7,0 23.
    3. Mouiller la zone d'incision sur le dos et faire à nouveau une coupe longitudinale avec un scalpel et enlever la peau.
    4. Découpez la partie lombaire de la colonne vertébrale (qui innerve les membres postérieurs) et le rincer avec une seringue PBS-rempli pour extraire la moelle épinière. Découpez environ 1/3 de la moelle lombaire, peser cela et stocker l'échantillon dans du PBS sur la glace.
    5. Centrifuger à 250 g pendant 2 min à 4 ° C. Jeter le surnageant, ajouter 500 ul solution de détachement cellulaire et HBSS (1: 1). Ajouter 3 mg / ml de collagénase A et 1 unité / ml d'ADNase I, Decollato les cellules par répétées pipetage de haut en bas et incuber pendant 30 min avec agitation par secousses à 37 ° C, à 400 tours par minute.
      Remarque: Si l'on préfère, la suspension cellulaire peut être débarrassé de contaminer la myéline et des débris cellulaires par centrifugation à gradient de densité qui peut améliorer la sensibilité de la mesure par cytométrie en flux, par conséquent, la réduction d'un fond d'autofluorescenceD le nombre d'événements qui doivent être acquises (voir section 3.5).
    6. Centrifuger à 250 g pendant 2 min à température ambiante. Jeter le surnageant, remettre en suspension le culot dans 1 ml de 10% de sérum de veau foetal (FCS) / milieu essentiel minimum de Dulbecco (DMEM) et Decollato les cellules à nouveau en haut et en bas répété pipetage.
    7. Centrifuger à 250 g pendant 2 min à température ambiante. Répéter l'étape de lavage.
    8. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml de PBS et comprimer la moelle épinière à travers un tamis à mailles de 70 pm (placé au-dessus d'un tube de 50 ml) en utilisant le piston d'une seringue de 2 ml.
    9. Laver la maille avec 4 ml de PBS. Centrifuger à 1800 xg pendant 3 min à température ambiante. Jeter le surnageant, resuspendre le culot cellulaire dans 100 ul de 0,2% de BSA / PBS, ajouter 2 pi FcRI réactif de blocage et incuber pendant 15 min à température ambiante dans l'obscurité.
    10. Ajouter 13 ul mélange d'anticorps, incuber 15 min à température ambiante dans l'obscurité, ajoutez 500 pi de PBS et centrifuger pendant 6 min à 650 xg à température ambiante.
    11. Jeter le surnageant, resuspendre le pelle cellulairet dans 500 ul de PBS (ou d'un tampon approprié de roulement) et le transférer à la cytométrie en flux tube.

3. Analyse par cytométrie en flux

  1. Titrer tous les anticorps au préalable pour déterminer les concentrations optimales comme décrit par Olesch et al. 25.
  2. Utilisez des perles de compensation d'anticorps de capture pour la compensation d'une seule couleur pour créer multi-couleurs des matrices de compensation selon les instructions du fabricant.
  3. Contrôler l'étalonnage de l'instrument à l'aide quotidienne perles spécifiques selon les instructions du fabricant.
  4. Directement avant la cytométrie en flux mesure, ajouter 30 ul cytométrie de débit standard de comptage absolu des cellules (pour l'isolement voir la section 2.1, 2.2, 2.3, 2.4) pour déterminer le nombre de cellules absolues. Au lieu d'utiliser des billes de comptage des cellules peuvent être comptées.
  5. Prenez des échantillons (cellules de la rate, les ganglions lymphatiques et le sang: 100.000 événements, la moelle épinière: 500.000 événements) dans un cytomètre unnd analyser en utilisant un logiciel spécifique de cytométrie de flux.
    1. Ouvrez le logiciel de cytométrie de flux et ajoutez fcs 3.0 fichiers en appuyant sur le bouton "ajouter des échantillons".
    2. Ouvrez le fichier ajouté en double-cliquant. Ajuster les canaux pour l'axe X et l'axe des y. Pour sélectionner les populations de cellules d'intérêt créent une porte (voir la figure 4).

Analyse quantitative par PCR 4.

  1. L'isolement de l'ARNm et la transcription en ADNc
    1. Extraire l'ARNm à partir de la moelle épinière lombaire (1/3), de la rate (1/8) et les ganglions lymphatiques inguinaux par le phénol-chloroforme et précipité avec de l' éthanol à 26.
      1. Pour ce faire, l'homogénéisation du tissu dans 1 ml de mélange de guanidinium thiocyanate-phénol, incuber pendant 10 min. Ajouter 200 ul de chloroforme et on incube à nouveau pendant 10 minutes.
      2. Après une étape de centrifugation (18 000 g pendant 15 min à 4 ° C), laver la phase aqueuse supérieure est avec 500 ul d'isopropanol et de centrifugation (18 000 g pendant 8 min à 4° C).
      3. Laver le culot avec 500 ul d'éthanol et, après une étape de centrifugation (18 000 x g pendant 5 min à 4 ° C), on sèche le culot dans le concentrateur sous vide (5 min à 30 ° C). Par la suite, resuspendre le culot dans 30 ul d'eau.
    2. Pour extraire l'ARNm à partir de sang, centrifuger 500 ul d'EDTA-sang stabilisé (300 x g 10 min 4 ° C).
      1. Prenez la couche leucocytaire, contenant des globules blancs, et diluer dans 1 ml de solution (150 mM NH 4 Cl, 100 mM NaHCO 3, 0,1 mM Na-EDTA pH 7,4) lyser.
      2. Après 10 minutes d'incubation à la température ambiante, centrifuger les cellules à 650 g pendant 6 min et ensuite laver deux fois avec PBS.
      3. Extraire l'ARNm à partir de cellules de globules blancs (WBC) en utilisant un kit d'extraction d'ARN selon les instructions du fabricant.
    3. Effectuer la synthèse d'ADNc en utilisant un kit de synthèse d'ADNc comprenant des hexamères aléatoires selon les instructions du fabricant. Utilisez 200 ng d'ARNm pour le cdnUne synthèse.
  2. PCR quantitative
    1. Pour quantifier la quantité d'un ARNm spécifique, utiliser 1 ul d' ADNc, 1 uM avant / arrière amorce et un colorant de liaison selon les instructions du fabricant 27 ADN fluorescent. Voir le tableau 1 pour les séquences des jeux d'amorces. Mesurer les valeurs de CT de l'IL-1β, IL-6, IL-23, IFNy, TNFa et PPIA (peptidyl prolyl isomérase) en utilisant un système de PCR quantitative.
    2. Pour déterminer l'expression relative de l' ARNm utiliser la méthode comparative CT (cycle seuil) 27.
      1. Pour ce faire , normaliser les valeurs Ct des gènes cibles aux niveaux de PPIA d'expression en soustrayant la moyenne CT valeur de PPIA du gène cible, comme décrit dans les études précédentes (Barthelmes et al. , 28, Schiffmann et al. , 29, Schiffmann et al. 30). Par la suite, calculer les ΔΔCT valeurs que l'on appelle, à l'aide qui, à normaliser les ACt valeursdes gènes cibles provenant des souris EAE au niveau des gènes cibles des souris non traitées de l'expression, de nouveau en soustrayant la moyenne ACt valeur chez les souris non traitées à partir de la valeur ACt chez des souris atteintes d'EAE.
      2. Pour obtenir l'expression d'ARNm relative du gène cible, calculer le taux à l' aide de la formule suivante: 2 - ΔΔct.
  3. Testez la spécificité de chaque amorce. Déterminer la taille du fragment amplifié en utilisant un gel d'agarose à 2% 31. La taille du fragment est représentée dans le tableau 1.

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Representative Results

La figure 1 donne un aperçu schématique des différentes méthodes décrites dans cet article. 1) Les souris reçoivent une injection de MOG antigène 35-55 et développent des symptômes cliniques initiales après 10,7 ± 0,3 jours 28. Une évolution de la maladie représentant des souris EAE est représenté sur la figure 1. 2) Divers tissus (rate, ganglions lymphatiques, de la moelle épinière lombaire) et le sang sont extraits de souris témoins et EAE à différents moments au cours de la phase préclinique (jour 2 jours 4 , jour 6), lors de l'apparition de la maladie (jour 10) et au cours de la phase aiguë de la maladie (jour 12, jour 14). 3) le profil d'expression de l' ARNm de cytokines, qui régulent le développement de l' EAE, est déterminée dans les différents tissus extraits à différents moments au cours de la maladie, en utilisant une PCR quantitative. 4) les cellules individuelles sont isolées à partir de divers tissus extraitsà différents points de temps durant le cours de la maladie et la distribution des cellules immunitaires déterminée en utilisant la cytométrie de flux.

Dans les ganglions lymphatiques et la rate, les lymphocytes T et les cellules B sont observés en tant que type de la cellule la plus importante. Par contraste avec les ganglions lymphatiques, la rate, en outre, un nombre élevé de monocytes et neutrophiles sont présents. Toutes les cellules immunitaires présentent une augmentation transitoire dans les ganglions lymphatiques au cours de la phase aiguë, alors que seuls les macrophages, les lymphocytes B, les lymphocytes T et les cellules neutrophiles augmentation de la rate. Dans le sang, les cellules immunitaires augmentent transitoirement pendant la phase préclinique. Dans la moelle épinière lombaire, on observe une augmentation de la maladie dépendante de toutes les cellules du système immunitaire, en dehors des monocytes, qui se différencient sans doute pour les macrophages après leur entrée dans la moelle épinière (figure 2). Les cellules CD4 + et CD8 + T montrent des changements comparables dans la rate, les ganglions lymphatiques et le sang au cours des différents cours de la maladie. Un mcellules ong infiltrant la moelle épinière, l'augmentation des cellules T CD4 + a été le plus prononcé (figure 3). Sur la figure 4, l'ouverture de porte-stratégie pour la détermination des différentes populations de cellules est représenté. Dans le détail, les populations cellulaires décrites dans ce manuscrit ont été identifiés comme suit: monocytes (CD45hi, CD3, Ly6G-, CD19, CD11c-, CD11b +), les macrophages (CD45hi, CD3, Ly6G-, CD11c-, CD11b +, F4 / 80hi), les neutrophiles (CD45hi, CD3, CD11b +, Ly6G +), les cellules dendritiques (CD45hi, CD3, Ly6G-, CD19, CD11c +), les cellules B (CD45hi, CD3, CD19 +), les cellules T (CD45hi, CD3 +) , les cellules T CD4 + (CD45hi, CD3 +, CD4 +) et les cellules T CD8 + (CD45hi, CD3 +, CD8 +). Les nombres de cellules sont liées à la quantité de tissu (masse de la rate, les ganglions lymphatiques, la moelle épinière lombaire) ou le volume de sang, reflétant ainsi la numération cellulaire absolue. Il est cependant possible d'exprimer les types de cellules en pourcentage des cellules totales mesurées.

Dans lymles noeuds de pH, l'expression de l'ARNm de l'IL-23 est augmenté de manière transitoire au cours de la phase préclinique, alors que l'expression de l'ARNm de l'IL-6 est augmentée d'une manière dépendante de la maladie. Dans la rate, l'expression d'ARNm d'IL-6 et IL-23 augmente transitoirement dans la phase préclinique, tandis qu'à l'apparition de la maladie, l'expression de l'ARNm de l'IL-1β est soulevée. Dans le sang, l'expression de l'ARNm de TNFa est augmentée d'une manière dépendante de la maladie. Dans la moelle épinière lombaire, TNFa, IL-1β et de l' augmentation IFNy pendant la phase aiguë, alors que l' IL-6 est régulée positivement pendant la phase de déclenchement (figure 5).

Figure 1

Figure 1: Schéma du flux de travail pour l' induction et l' évaluation immunologique de l' EAE. 1) L' EAE est induite chez la souris conduisant à l'apparition de symptômes cliniques. Les symptômes cliniques sont clased par des scores cliniques, comme suit: 0) aucun signe, 0,5) paralysie distale de la queue, 1) paralysie complète de la queue, 1,5) queue molle et légère faiblesse des pattes arrières, 2) la queue molle et la faiblesse sévère des pattes postérieures , 2,5) queue molle et la paralysie d'une patte arrière, 3) la queue molle et la paralysie des deux pattes arrière. Le nombre de souris utilisées dans la figure ci était 7. Le chiffre a été modifié depuis Barthelmes et al. 28 2). Les souris sont sacrifiées à différents moments au cours de la maladie, de la rate, les ganglions lymphatiques inguinaux, du sang et de la moelle épinière lombaire cellules extraites et simples isolées à partir de ces tissus. 3) distribution de cellules immunitaires dans divers tissus, tel que déterminé par cytométrie de flux. 4) expression de l' ARNm pour diverses cytokines dans les différents tissus, tel que déterminé par PCR quantitative. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce figure.

Figure 2
Figure 2:. Des cellules immunitaires Distribution, Déterminée par FACS (Fluorescence-tri cellulaire activé) Analyse en Spleen, ganglionnaire, sang et la moelle épinière Les échantillons provenant de EAE souris à différents stades de la maladie dans l'expérience présentée, le nombre de souris par groupe était 2 - 10. la distribution des neutrophiles / monocytes dans le sang et les neutrophiles / macrophages dans la moelle épinière sont adaptées et modifiées de Barthelmes et al 28.. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3: cellules T CD4 + et CD8 cellules T Distribution dans des échantillons de EAE souris à différents stades de la maladie, déterminée par analyse FACS. A) des ganglions lymphatiques, B) de la rate, C) , le sang et D) , la moelle épinière. Dans l'expérience présentée, le nombre de souris par groupe était de 2 - 10. Les résultats sont présentés en moyenne ± erreur - type (SEM). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4: Stratégie Gating pour cytométrie en flux Analyse des cellules T, les cellules B, neutrophiles, monocytes, cellules dendritiques et les macrophages de la moelle épinière de souris EAE le jour 12. A) Une parcelle de SSC / CD45 de toutes les cellules. Gate:. CD45 + cellules B) Une parcelle de FSC-H / FSC-W de la cellule CD45 +s. Gate: cellules individuelles C) Une parcelle de SSC-A / FSC-A à partir de cellules individuelles.. Gate: cellules viables. D) Une parcelle de FSC-H / CD3 de cellules viables. Gate: CD3 + et CD3 - cellules E) Une parcelle de CD4 / CD8 de cellules CD3 +.. Gate: CD4 + CD8 - (cellules T CD4 +) et CD4 - CD8 + (cellules CD8 + T) F) Une parcelle de CD19 et Ly6G / CD11b de CD3 - cellules.. Gate: CD19 + CD11b - cellules (cellules B), Ly6G + CD11b + cellules (neutrophiles) et CD19 - cellules Ly6G - cellules G) Une parcelle de cellules CD11c / CD11b de CD19 - - Ly6G: cellules dendritiques Porte CD11c + cellules (. ) et CD11c - cellules H) Une parcelle de SSC / F4 / 80 fr.om CD11c - cellules. Gate: F4 / 80 - cellules (monocytes) et F4 / 80 + cellules (macrophages). Un graphique représentatif de 9 est affiché. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5:. Profil de cytokine (IL-1β, IL-6, IL-23, TNFa, IFNy) dans des échantillons de EAE souris à différents stades de la maladie A) des ganglions lymphatiques, B) la rate, C) sang et D) de la moelle épinière. les niveaux d'expression d'ARNm ont été normalisées à peptidyl propyl isomérase A (LPRP) et ont été calculées en utilisant le niveau de souris non traitées du même âge de l'ARNm. Les mesures ont été effectuées en triple. Le nombre de souris par groupe était de 2 - 3. Les résultats sont présentés sous forme de moyennes ± staerreurs ndard (MEB). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Gène vers l'avant sens inverse taille fragement (Bp)
IL-1β CTGGTGTGTGACGTTCCCATTA CCGACAGCACGAGGCTTT 76
IL-6 TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC 76
IL-23 GAGCAGCAACTCTGACTGAGCC GAACAGCACAAGTCCTAATGGGTTA 127
IFNy CACGGCACAGTCATTGAAAGC CACCATCCTTTTGCCAGTTCC 118
TNFa TGACAAGCCTGTAGCCCACG GCCTTGTCCCTTGAAGAGAACC 178
PPIA GCTGGACCAAACACAAACGG GCCATTCCTGGACCCAAAAC 144

Tableau 1: Les paires d' amorces.

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Discussion

Le modèle EAE décrit ici a reçu le plus d' attention comme un modèle de sclérose en plaques et est couramment utilisé pour tester des stratégies thérapeutiques pour MS 32. La maladie de la souris présente de nombreuses caractéristiques cliniques et histologiques de la sclérose en plaques et est provoquée par l'induction d'une auto-immunité à des antigènes neuronaux. La sensibilisation aux antigènes de la myéline est associée à un dysfonctionnement du cerveau du sang barrière et, par conséquent, l'infiltration des cellules immunitaires dans le système nerveux central. Nos résultats montrent que les cellules immunitaires augmentent transitoirement dans les ganglions lymphatiques dans la phase aiguë. les cellules T spléniques et les cellules B diminuent dans la phase préclinique de la maladie. Dans le sang circulant, les lymphocytes T, les lymphocytes B, les cellules dendritiques et les monocytes augmentent transitoirement dans la phase pré-clinique, alors que les neutrophiles augmentent la maladie dépendante. Enfin, dans la moelle épinière, une augmentation des cellules du système immunitaire peut être détectée (figure 2). Ces données indiquent que les lymphocytes T et les cellules B migrent de la rate, qui agitun réservoir pour ces cellules, vers les ganglions lymphatiques où elles sont activées et proliférer. Par la suite, ils migrent par la circulation dans la moelle épinière. Les neutrophiles, les monocytes et les cellules dendritiques, d'autre part, migrent de la moelle osseuse dans la circulation dans le système nerveux central.

Nos données montrent que, dans la moelle épinière, IFNy, TNFa et l'IL-1β sont régulées d'une manière dépendant de la maladie, alors que l'IL-6 est régulée à la hausse transitoirement au début de la maladie. Ces données soutiennent l'hypothèse que l'EAE pathologie est entraînée par les cellules Th1 et Th17. Les cellules Th1 libèrent IFNy, ce qui à son tour active les macrophages pour libérer le TNFa et l' IL-1β 33. En outre, l' IL-6 est connu pour conduire la différenciation des cellules Th1 et Th17 et ainsi favoriser le développement de l' EAE 34.

Le jour de l'apparition des symptômes cliniques et la gravité de la maladie est variable chez les souris atteintes d'EAE. Sur la base de notre expérience, il y a plusieurs reasons pour cela. Les souris exposées au stress durant la phase préclinique montrent une gravité réduite de la maladie et un retard dans l'apparition de la maladie. Le boîtier de la souris influe également sur la gravité de l'EAE et aussi le jour de début. Récemment, il a été montré que le microbiote commensal de souris influencent le développement de l' EAE 35 et différentes situations de logement peuvent influer sur le microbiome et ainsi, la pathologie EAE. En outre, il est très important d'utiliser toujours la toxine de pertussis fraîchement préparé. La toxine pertussis endommage le cerveau de barrière sanguine qui est une condition préalable pour le développement de l'EAE. Ne pas utiliser émulsionnée MOG 35-55 peptide après la date d' expiration. L'âge des souris influe également sur EAE pathologie. Ainsi, il y a des règles qui doivent être respectées afin de générer un modèle EAE reproductible. Utilisez la souris âgés de 10 à 13 semaines et les souris du même fournisseur, si possible. Si les souris sont commandées auprès d'un fournisseur externe, permettre aux souris de s'acclimater pour deuxsemaines dans la maison des animaux. Manipuler les souris doucement avant induction de l'EAE de sorte qu'ils se habituer à la manipulation. Éviter les manipulations inutiles après induction de l'EAE. Fournir les souris avec de la nourriture et de l'eau dont ils peuvent facilement atteindre dès qu'ils présentent des symptômes cliniques. Si les souris doivent être traités avec un médicament, il est préférable de le mélanger à l'eau alimentaire ou à boire, afin d'éviter de confondre les effets du stress. Si gavage ou une injection est essentielle pour l'administration de médicaments, il est important d'utiliser le même itinéraire pour le véhicule.

En plus du modèle EAE progressive primaire décrit ici, les modèles EAE rémittente existent également. Au cours de la maladie différente est induite par l'administration d'antigènes différents dans différentes souches de souris. Ainsi, l'application de MOG 35 - 55 dans des souches de souris, tels que C57BL / 6, Sv129, B10, NOD et souris Biozzi, conduit à une forme de maladie progressive primaire. Fait intéressant, le jour de début est différente dans les différentes souches de souris. Tandis queC57BL / 6, SV129 et souris B10 développent les premiers symptômes cliniques d'environ 11 jours à 12, les souris Biozzi montrent les premiers symptômes cliniques après 21 jours 36. Dans une étude précédente, il a été montré que 129S4 / SvJae × C57BL / 6 hybrides présentent premiers symptômes cliniques d'environ 11 jours 28. L'injection de la protéine protéolipidique (PLP) 131-151 conduit chez la souris SJL à l'induction d'une forme rémittente évolution de la maladie 37. Le meilleur modèle de EAE à utiliser dépendra de l'objet de la recherche. Ainsi, si la phase de rechute est d'intérêt, le modèle de rechute-remission devrait être utilisée que si l'apparition de la maladie est l'objectif principal, le modèle progressif doit être utilisé. Si le rôle d'une protéine spécifique doit être étudié dans le modèle EAE, en utilisant des souris knock-out, il est important de garder à l'esprit que toutes les souches peuvent être utilisées pour induire l'EAE et éventuellement rétrocroisement de la souche knock-out sur un souche sensible est nécessaire.

Les trois t le plus utiliséypes des modèles animaux de la SEP sont (1) l'EAE induite par l'auto-antigène; (2) induite par un virus, une maladie démyélinisante chronique spontanée, et (3) 38 démyélinisation induite par la toxine. Les modèles EAE sont caractérisés par l'induction de l' inflammation et de réponses auto - immunes par l'application d'un peptide autoantigène telle que la protéine de myéline oligodendrocyte ou protéine protéolipidique 38. L' EAE se développe spontanément chez des souris transgéniques qui surexpriment un récepteur des cellules T contre un peptide de la protéine de myéline oligodendrocyte 39. Pour induire une inflammation chronique d'origine virale induite par une infection neurotrophique du système nerveux central peut être induite, par exemple, avec Theiler`s virus de l'encéphalomyélite murine. Les cellules infectées par le virus sont attaqués par les lymphocytes T et une réponse humorale et conduisent ainsi à une démyélinisation chronique 40,41. Induite par la toxine de démyélinisation peut être induite par exemple par le cuivre chélateur cuprizone 42. Ce modèle conduit spécifiquement à demyelination parce cuprizone attaque les oligodendrocytes et conduit, de ce fait, à l'activation des astrocytes et la microglie, alors que les processus inflammatoires ne jouent qu'un rôle mineur. Après dégagement de la toxine, de nouveaux oligodendrocytes sont générées et une nouvelle gaine de myéline est formée. L'utilisation de ces trois modèles, de manière complémentaire, permet d'évaluer les effets des médicaments sur les différents aspects de la pathogenèse de la sclérose en plaques, parce que les modèles diffèrent en ce qui concerne les processus inflammatoires et immunitaires et démyélinisantes. Et dans l'EAE induite par le virus de modèle, une inflammation et des processus auto-immuns principalement conduire la maladie, alors que dans le modèle induit par une toxine, les processus de démyélinisation et remyélinisation sont prédominants. Pour les essais précliniques de médicaments potentiels pour le traitement MS, au moins trois modèles, un modèle induit par la toxine, une EAE de rechute-rémittente et un EAE progressive primaire ou un modèle viralement induite devrait être utilisé pour vérifier l'efficacité du médicament.

Le modèle EAE a décritee peut être utilisé pour mieux comprendre dans le mécanisme de l'évolution du processus de la maladie semblable à la SP, identifier les conducteurs cellulaires clés de la maladie, tels que les Th1, Th17 et des cellules B 43,44. La meilleure est la compréhension des processus inflammatoires et immunitaires impliqués dans le développement de la SEP et des processus qui favorisent et résolvent les lésions, plus il est probable que de nouvelles stratégies de traitement peuvent être développées.

Néanmoins, le modèle EAE décrit ici a seulement quelques caractéristiques en commun avec MS, et dispose quelques différences claires de la maladie humaine. La différence la plus importante est que les patients atteints de sclérose en plaques varient considérablement dans la présentation de la maladie, qui ne figure pas dans le modèle EAE. Ceci peut être dû aux différentes configurations de lésion chez les patients atteints de sclérose en plaques et des souris EAE et du fait que les souris sont des souches consanguines. Chez les souris EAE, lésions homogènes sont les plus importants dans la moelle épinière, alors que chez les patients atteints de sclérose en plaques, les lésions principalement hétérogènes sonttrouvée dans le cerveau 45,46. En outre, les États membres et l'EAE partagent la contribution cruciale des cellules Th1 et les cellules Th17 pour leur développement, mais contrairement à MS, les cellules T CD8 + jouent un rôle mineur dans l' EAE pathologie 33. En conclusion, le modèle EAE se concentre principalement sur les effets combinés de l'auto-immunité, les processus inflammatoires et de la neurodégénérescence alors que les processus de démyélinisation se prêtent moins à une évaluation sélective. Par conséquent, d' autres modèles animaux , tels que le modèle de cuprizone peuvent être utilisés pour l'étude des processus distincts de démyélinisante 47. Le modèle EAE est imparfaite, mais néanmoins, un modèle utile de MS 33.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
ABI Prism 7500 Sequence Detection System  Applied Biosystems, Austin, USA quantitative PCR system
Accutase Sigma Aldrich Munich, Germany A6964 cell detachment solution
CD3-PE-CF594 BD, Heidelberg, Germany 562286
CD4-V500 BD, Heidelberg, Germany 560782
CD8-eFluor650 eBioscience, Frankfurt, Germany 95-0081-42
CD11b-eFluor605 eBioscience, Frankfurt, Germany 93-0112-42
CD11c-AlexaFluor700 BD, Heidelberg, Germany 560583
CD19-APC-H7  BD, Heidelberg, Germany 560143
CD45-Vioblue  Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany 130-092-910
CompBeads BD, Heidelberg, Germany 552843 compensation beads
Collagenase A Sigma Aldrich Munich, Germany C0130
Cytometric absolute count standard  Polyscience, Eppelheim, Germany BLI-580-10
Cytometer Setup and Tracking beads  BD, Heidelberg, Germany 642412
DNase I Sigma Aldrich Munich, Germany D5025
EAE Kit Hooke Laboratories, Lawrence, USA EK2110
F4/80-PE-Cy7  BioLegend, Fell, Germany 123114
First Strand cDNA-Synthesis kit  Thermo Scientific, Schwerte, Germany K1612
Fc receptor-1 blocking buffer  Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany 130-092-575
Flow cytometric absolute count standard Polyscience, Eppelheim, Germany 580
FlowJo software v10  Treestar, Ashland, USA flow cytometry software
LSRII/Fortessa  BD, Heidelberg, Germany flow cytometer
Ly6G-APC-Cy7  BD, Heidelberg, Germany 560600
Lysing solution  BD, Heidelberg, Germany 349202
Maxima SYBR Green  Thermo Scientific, Schwerte, Germany K0221 fluorescent DNA binding dye 
RNeasy Mini Kit  Qiagen, Hilden, Germany 74104 RNA extraction kit

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Induction of Experimental encéphalomyélite allergique chez la souris et l'évaluation de la distribution des maladies dépendant des cellules immunitaires dans divers tissus
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Barthelmes, J., Tafferner, N., Kurz, More

Barthelmes, J., Tafferner, N., Kurz, J., de Bruin, N., Parnham, M. J., Geisslinger, G., Schiffmann, S. Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues. J. Vis. Exp. (111), e53933, doi:10.3791/53933 (2016).

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