Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Induktion af Experimental Autoimmune Encephalomyelitis i mus og evaluering af sygdommen-afhængige Fordeling af immunceller i forskellige væv

Published: May 8, 2016 doi: 10.3791/53933
Automatic Translation
*1, *2, 2, 2, 2, 1, 2
1Institute of Clinical Pharmacology, Goethe University Hospital Frankfurt, 2Project Group for Translational Medicine & Pharmacology, Fraunhofer IME
* These authors contributed equally

Abstract

Multipel sklerose formodes at være en inflammatorisk autoimmun sygdom, som er karakteriseret ved læsion dannelse i centralnervesystemet (CNS) resulterer i kognitiv og motorisk svækkelse. Eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE) er en nyttig dyremodel af MS, fordi den også er kendetegnet ved læsion dannelse i CNS, motorisk svækkelse og er også drevet af autoimmune og inflammatoriske reaktioner. En af EAE-modeller induceres med et peptid afledt fra myelin oligodendrocyt protein (MOG) 35-55 i mus. EAE-mus udvikler en fremadskridende sygdomsforløb. Dette kursus er opdelt i tre faser: den prækliniske fase (dag 0 - 9), at sygdommen debut (dag 10 - 11) og den akutte fase (dag 12 - 14),. MS og EAE induceres af autoreaktive T-celler, infiltrerer CNS. Disse T-celler udskiller chemokiner og cytokiner, der fører til ansættelse af yderligere immunceller. Derfor immuncellen fordeling i rygmarven dnder de tre sygdomsområder faser blev undersøgt. At fremhæve tidspunkt af sygdommen, hvor aktiveringen / proliferation / akkumulering af T-celler, B-celler og monocytter starter, blev immuncellen fordeling i lymfeknuder, milt og blod også vurderet. Endvidere blev niveauerne af adskillige cytokiner (IL-1p, IL-6, IL-23, TNFa, IFNy) i de tre sygdomstilstande faser bestemmes, at få indsigt i de inflammatoriske processer af sygdommen. Som konklusion, dataene giver et overblik over den funktionelle profil immunceller under EAE patologi.

Introduction

Multipel sklerose (MS) og dets tilsvarende dyremodel, eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE), viser autoimmune neuroinflammation ændringer i centralnervesystemet (CNS). Tidlig aktive MS og EAE-læsioner er kendetegnet ved tilstedeværelsen af ​​infiltrerede immunceller. Ætiologien af ​​MS er fortsat ukendt, men er almindeligt anset for at involvere ødelæggelse af myelin medieret af autoreaktive T-celler. Disse autoreaktive T-celler udskiller pro-inflammatoriske cytokiner og kemokiner, som tiltrækker andre immunceller såsom B-celler, monocytter og neutrofiler fra cirkulationen. Monocytter differentierer til makrofager. Interferon gamma (IFNy) udskilt af autoreaktive T-celle polariserer makrofagerne til pro-inflammatoriske makrofager. De proinflammatoriske cytokiner makrofager frigivelse og reaktive oxygenspecies der fremmer apoptose i oligodendrocytter. Død af oligodendrocytter fører til demyelinisering. Endvidere B-celler differentierer til pLasma celler og release autoantistoffer mod myelinskeden, i sidste ende resulterer i nedbrydning af myelin. Tabet af myelin fører til nedbrydning af axoner og neuroner og derved til dannelsen af læsionsområder i CNS som repræsenterer den vigtigste egenskab ved MS 1. I periferien, T-celler og B-celler aktiveret i lymfeknuderne, de prolifererer i milten og migrere gennem omsætning i centralnervesystemet. Monocytter og neutrofiler formere i knoglemarven og også vandrer gennem omsætning i centralnervesystemet.

Leukocyt-ekstravasation fra knoglemarv, milt og lymfeknuder i blodet eller fra blodbanen til CNS er en flertrinsproces, der afhænger af flere faktorer, herunder molekylære vekselvirkninger mellem leukocytter og endotel medieret af kemokiner og kemokinreceptorer. Produktion af kemokiner ved forskellige celletyper kan induceres under immune reaction af cytokiner såsom tumornekrosefaktor-α (TNF), IFNy og interleukin-6 (IL-6), som efterfølgende får immunsystemets celler til stedet for inflammation 2,3. Immunceller præsentere en delmængde af kemokinreceptorer på deres overflade, afhængig af celletype og migration pathway til det inflammatoriske sted. Således CXCR2, CCR1 og CXCR1 udtrykkes på modne neutrofiler i knoglemarv og blod 4, og binding af dens ligander, CXCL2, CCL5 eller CXCL6 henholdsvis aktiverer neutrofiler og fremmer deres adhæsion til endotelet og efterfølgende migrering af cellerne i væv 5-9. CCL2 og CCL20 tiltrække monocytter og Th1 / Th17 celler 10, som udtrykker CCR2 11 og CCR6 12, hhv. CCR1 og CCR5, udtrykt ved forskellige celletyper, herunder T-celler, monocytter og makrofager 13, binder CCL3, CCL5 og CCL7 og opreguleres under MS 14. CXCR3 udtrykkes på T-celler og binder CCL9, CCL10 ogCCL11 15.

Én vigtigste strategi i MS behandling er nedbrydningen af ​​immunceller eller forebyggelse af immuncelle infiltration i CNS. Derfor har blokade af specifikke kemokinreceptorer blevet undersøgt i EAE. Antagonisme eller genetisk sletning af CCR1 16, CCR2 17, CCR7 18 eller CXCR2 19 reducerer EAE patologi, mens antagonisme eller genetisk sletning af CCR1 20, gjorde CCR5 20 eller CXCR3 21 ikke reducere patologi. Derfor ekspressionen af ​​specifikke kemokinreceptorer på leukocytter er afgørende for infiltreringen af ​​sidstnævnte i CNS og dikterer forløbet af EAE.

Udtømningen af immunceller er en effektiv behandling mod MS-patienter, fordi infiltrerede immunceller frigive cytokiner, såsom TNFa, IL-6 og IL-1β, hvilket på sin side fremme den inflammatoriske proces eller nedbrydningen af neuroner 22. Endvidere auto-reaktive Th1-celler frigiver IFNy, som igen stimulerer makrofager til at frigive TNFa, IL-1β og IL-23.

Dette håndskrift beskriver induktionen af ​​EAE, bestemmelse af immun celle fordeling og cytokinniveauer (mRNA) i forskellige væv i EAE-mus. Celler blev isoleret på forskellige tidspunkter i løbet af sygdomsforløbet at tilvejebringe en tidsafhængig overblik over de inflammatoriske processer, der til sidst fører til læsionsdannelse i CNS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ETIK ERKLÆRING: Vores eksperimentelle procedurer er godkendt af den etiske komité af Regierungspräsidium Darmstadt (Tyskland) og bekræft til nationale og europæiske regler. blev gjort alt for at minimere dyrenes lidelser og reducere antallet af anvendte dyr.

1. EAE Model

  1. Induktion af EAE model
    1. Brug 10- til 13-uger gamle 129S4 / SvJae × C57BL / 6-mus til induktion af EAE.
    2. Giv musene en subkutan injektion i den øvre og nedre ryg på den encephalitogene MOG 35 - 55 år (myelin oligodendrocyt glycoprotein) peptid (200 ug), emulgeret i 200 pi komplet Freund`s adjuvans (CFA) indeholdende 400 ug Mycobacterium tuberculosis.
      Bemærk: Som en negativ, ikke-sygdomsinducerende fingeret kontrol, ukomplet Freunds adjuvans indeholdende Mycobacterium tuberculosis, i det samme volumen og ad samme vej, kan anvendes.
    3. TherENår, og igen 24 timer senere, giver musene en intraperitoneal injektion af pertussis toksin (i alt 0,2 ug, fortyndet i 200 pi phosphatpufret saltvand, PBS). Brug ubehandlede mus som kontrolgruppen, for at kunne sammenligne syge med sunde dyr.
      Bemærk: Det er også muligt at inducere EAE med 200 - 300 mikrog MOG 35 - 55 peptid, 300 - 500 ug af Mycobacterium tuberculosis i CFA og 0,2 - 0,3 ug pertussis toksin i et volumen på 0,1 - 0,2 ml pr injektion.
    4. Begyndende en uge efter injektionen, undersøge mus dagligt for kliniske symptomer (se trin 1.2.1)
      Bemærk: Dagen for sygdommens debut varierer i forskellige eksperimenter, men under betingelserne i vores laboratorium, det er omkring dag 11, og dermed, her dag 14 er defineret som 3 dage efter sygdomsdebut. Alle mus i den foreliggende undersøgelse udviklede kliniske symptomer.
  2. Scoring af mus
    1. Klassificere kliniske symptomer ved kliniske scoringer som følger:0) ingen tegn, 0,5) distal lammelse af halen, 1) fuldstændig lammelse af halen, 1.5) slatne hale og mild svaghed af bagbenene, 2) slatne hale og svær svaghed af bagbenene, 2,5) slatne hale og lammelse af ene bagben, 3) slap hale og lammelse af begge bagben, 3.5) lammelse af både bagben og svaghed én Forlemmet (mus opnå denne score blev aflivet, i overensstemmelse med de lokale etiske retningslinjer).

2. Udarbejdelse af enkelte celler til flowcytometri analyse

Bemærk: blanding Antistoffet består af 1 pi CD45-Vioblue, 2 pi CD8-eFluor650, 0,5 pi CD11-eFluor605, 0,5 pi F4 / 80-PE-Cy7, 1 pi CD3-PE-CF594, CD4-V500, 0,5 pi CD11c -AlexaFluor700, 1 pi CD19-APC-H7 og 1 pi Ly6G-APC-Cy7.

Bemærk: Hvis du tager blod, lymfeknude, milt og rygmarv så er proceduren som følger: Mus er dybt bedøvet med en kombination af isoflurane (2% i carbogen per minut) og ketamin (100 mg / kg legemsvægt). Næste åbne brystkassen, fjerne blod med en intracardial stok og perfundere musene intracardialt med kold PBS. Derefter fjerne lymfeknuderne fulgt af milt og endelig rygmarven. Hvis du ikke behøver at perfundere musene intracardialt derefter aflive musene under dyb anæstesi ved ledskred af halsen.

  1. Isolering af splenocytter
    1. Bedøve musene med en kombination af isofluran (2% i carbogen per minut) og ketamin (100 mg / kg legemsvægt).
    2. Våd snit område med 80% isopropanol for at undgå smitte med hår og åbne thorax på langs, uden at punktere dybere væv, ved hjælp af en saks.
    3. Perfundere mus intracardialt med kold PBS pH 7,0 23.
      Bemærk: Milten er placeret i den venstre overlegen abdominal kvadrant under brystkassen. Hvis kun milten, der skal undersøges, kan dette organ fjernes før perfusion for at Retain alle celletyper af interesse.
    4. Fjern milt og afskære ca. 1/8 og vejes. Prøven opbevares i PBS på is.
    5. Klem milten væv gennem en 70 um mesh sigte (placeret over en 50 ml rør) ved anvendelse af stemplet i en 2 ml sprøjte.
    6. Vask masken med 5 ml PBS. Centrifuger ved 1.800 xg i 3 min. Pellet resuspenderes i 500 pi lyserende opløsning.
      Bemærk: I denne fase, kan det være nødvendigt at foretage en differentieret celletal hvis senere er en alternativ FACS-analyse anvendte metode, der ikke anvender perler (se afsnit 3).
    7. Inkuber i 10 minutter ved stuetemperatur (RT) og tilsæt 500 pi PBS. Centrifugeres i 6 minutter ved 650 xg ved stuetemperatur (RT).
    8. Gentag vasketrinet med 500 pi PBS. Supernatanten fjernes, resuspender cellepelleten i 100 pi 0,2% bovint serumalbumin (BSA) / PBS, tilsættes 2 pi Fc-receptor-1 (FcRI) blokeringspuffer og inkuberes i 15 minutter ved stuetemperatur i mørke.
    9. Tilføj 13 pi entibody blanding, inkuberes 15 minutter ved stuetemperatur i mørke, tilsættes 500 pi PBS og centrifugeres i 6 minutter ved 650 xg ved stuetemperatur. Supernatanten kasseres.
      Bemærk: Fabrikantens farvningsprocedure anbefaler en enkelt vask, men yderligere reduktion af baggrundsfarvning kan opnås ved eventuelt gentagelse vasketrinnet en eller to gange mere.
    10. Resuspender cellepelleten i 500 pi PBS (eller eventuelt løbende buffer for protein separation, til potentielt reducere celle sammenklumpning), som overføres til flowcytometri røret. Hold celler på is.
  2. Isolering af lymfeknudeceller
    1. Bedøve musene med en kombination af isofluran (2% i carbogen per minut) og ketamin (100 mg / kg legemsvægt).
    2. Våd snit område med 80% isopropanol og åbne brystkassen på langs med en saks. Perfundere mus intracardialt med kold PBS pH 7,0 23.
    3. For at isolere lyskelymfeknuder lymfeknude, forsigtigt fjerne huden i området af hip og vælge den lymfeknude forsigtigt ud af fedtvæv med en pincet. Vejes lyskelymfeknuder lymfeknude og gemme prøven i PBS på is.
      Bemærk: Vi brugte lysken lymfeknuder i vores studier, fordi O`Connor et al. konstateret, at høje antal af aktiverede monocytter, makrofager, neutrofiler og T-celler var alle til stede i de inguinale lymfeknuder efter EAE-induktion 24.
    4. Klem lymfeknuderne gennem en 70 um mesh sigte (placeret over en 50 ml rør) ved anvendelse af stemplet i en 2 ml sprøjte.
    5. Vask masken med 5 ml PBS. Centrifuger ved 2400 xg i 8 min. Resuspender cellepelleten i 100 pi 0,2% BSA / PBS, tilsættes 2 pi FcRI blokerende buffer og inkuberes i 15 minutter ved stuetemperatur i mørke.
    6. Tilsæt 13 pi antistofblanding, inkuberes 15 minutter ved stuetemperatur i mørke, tilsættes 500 pi PBS og centrifugeres i 6 minutter ved 650 xg ved stuetemperatur.
    7. Supernatanten fjernes, resuspender cellepelleten i 300 pi PBS (eller en egnet kører buffer) og overføre dentil et flowcytometri rør.
  3. Isolering af blodceller
    1. Der tilsættes 50 pi 20 mM HEPES og 50 pi blod (stabiliseret med EDTA) og tilsæt 500 pi lyserende opløsning. Inkuber i 10 minutter ved stuetemperatur, og der tilsættes 500 pi PBS. Centrifuger i 6 min ved 650 xg ved stuetemperatur. Supernatanten kasseres og gentag vasketrinnet.
    2. Resuspender cellepelleten i 100 pi 0,2% BSA / PBS, tilsættes 2 pi FcRI blokerende buffer og inkuberes i 15 minutter ved stuetemperatur i mørke.
    3. Tilsæt 13 pi antistofblanding, inkuberes 15 minutter ved stuetemperatur i mørke, tilsættes 500 pi PBS og centrifugeres i 6 minutter ved 650 xg ved stuetemperatur. Supernatanten fjernes, resuspender cellepelleten i 300 pi PBS og overføre den til flowcytometri røret.
  4. Isolering af rygmarv celler
    1. Bedøve musene med en kombination af isofluran (2% i carbogen per minut) og ketamin (100 mg / kg legemsvægt).
    2. Våd snit område med 80% isopropanol og åbne thorax på langsmed en saks. Perfundere mus intracardialt med kold PBS pH 7,0 23.
    3. Fugt indsnit område på bagsiden og gøre igen et langsgående snit med en skalpel og fjern skindet.
    4. Skåret ud lumbal del af rygsøjlen (som innerverer bagbenene) og skylle den med en PBS-fyldt sprøjte til at udtrække rygmarven. Klip ca. 1/3 af den lumbale ledningen, vejer dette og gemme prøven i PBS på is.
    5. Centrifuger ved 250 xg i 2 min ved 4 ° C. Supernatanten fjernes, tilsættes 500 pi Cellefrigørelse opløsning og HBSS (1: 1). Tilsæt 3 mg / ml collagenase A og 1 enhed / ml DNase I, decollate cellerne ved gentagen op og ned pipettering og inkuberes i 30 minutter under omrystning ved 37 ° C ved 400 rpm.
      Bemærk: Hvis det foretrækkes, kan cellesuspensionen ryddes for kontaminerende myelin og cellerester ved densitetsgradientcentrifugering som kan forbedre følsomheden af ​​flowcytometri måling derved reducere baggrund autofluorescens end antallet af hændelser, der skal erhverves (se afsnit 3.5).
    6. Centrifuger ved 250 xg i 2 minutter ved stuetemperatur. Supernatanten fjernes, pellet resuspenderes i 1 ml 10% føtalt kalveserum (FCS) / Dulbeccos minimale essentielle medium (DMEM) og decollate cellerne igen ved gentagen op og ned pipettering.
    7. Centrifuger ved 250 xg i 2 minutter ved stuetemperatur. Gentag vasketrinet.
    8. Resuspender cellepelleten i 1 ml PBS og presse rygmarven gennem en 70 um mesh sigte (placeret over en 50 ml rør) ved anvendelse af stemplet i en 2 ml sprøjte.
    9. Vask masken med 4 ml PBS. Centrifuger ved 1.800 xg i 3 minutter ved stuetemperatur. Supernatanten fjernes, resuspender cellepelleten i 100 pi 0,2% BSA / PBS, tilsættes 2 pi FcRI blokerende reagens og inkuberes i 15 minutter ved stuetemperatur i mørke.
    10. Tilsæt 13 pi antistofblanding, inkuberes 15 minutter ved stuetemperatur i mørke, tilsættes 500 pi PBS og centrifugeres i 6 minutter ved 650 xg ved stuetemperatur.
    11. Supernatanten fjernes, resuspender cellen pellet i 500 pi PBS (eller en egnet kører buffer) og overføre den til flowcytometri røret.

3. flowcytometrisk analyse

  1. Titrer alle antistoffer på forhånd at bestemme optimale koncentrationer som beskrevet af Olesch et al. 25.
  2. Brug antistof-opfange kompensation perler for enkelt-farve kompensation for at skabe flerfarvede kompensation matricer i henhold til fabrikantens anvisninger.
  3. Styr instrumentkalibrering daglige brug af bestemte perler i henhold til fabrikantens anvisninger.
  4. Direkte for flowcytometri måling, tilsættes 30 pi flowcytometrisk absolut tælling standard til cellerne (for isolation se afsnit 2.1, 2.2, 2.3, 2.4) for at bestemme absolutte celletællinger. Stedet for at bruge optælling perler cellerne kan tælles.
  5. Tag prøver (celler fra milt, lymfeknude og blod: 100.000 begivenheder, rygmarv: 500.000 hændelser) i et flowcytometer ennd analysere via bestemte flowcytometri software.
    1. Åbn flowcytometri software og tilføje FCS 3,0 filer ved at trykke på knappen "tilføj prøver".
    2. Åbn den tilføjede fil ved at dobbeltklikke. Juster kanalerne til x- og y-aksen. For at vælge den celle populationer af interesse skaber en port (se figur 4).

4. Kvantitativ PCR-analyse

  1. Isolering af mRNA og transkription til cDNA
    1. Ekstraher mRNA fra lumbale rygmarv (1/3), milt (1/8) og inguinale lymfeknuder ved phenol-chloroform og udfældes med ethanol 26.
      1. Til dette, homogenisere vævet i 1 thiocyanat-phenol-blanding ml guanidinium, inkuberes i 10 min. Der tilsættes 200 pi chloroform og inkuberes igen i 10 minutter.
      2. Efter et centrifugeringstrin (18.000 xg i 15 minutter ved 4 ° C), vaskes den øvre vandige fase med 500 pi isopropanol og centrifugeres (18.000 xg i 8 minutter ved 4° C).
      3. Vask pelleten med 500 pi ethanol, og efter centrifugering (18.000 x g i 5 min ved 4 ° C), tør pellet i vakuumkoncentrator (5 min ved 30 ° C). Derefter pellet resuspenderes i 30 pi vand.
    2. For at ekstrahere mRNA fra blod, centrifugen 500 pi EDTA-stabiliseret blod (300 xg 10 min 4 ° C).
      1. Tag buffy coat, der indeholder hvide blodlegemer, og fortyndes i 1 ml lyserende opløsning (150 mM NH4CI, 100 mM NaHCO3, 0,1 mM Na-EDTA, pH 7,4).
      2. Efter 10 minutters inkubation ved stuetemperatur, centrifugeres cellerne ved 650 x g i 6 min og derefter vaskes to gange med PBS.
      3. Ekstraher mRNA fra hvide blodlegemer (WBCs) under anvendelse af et kit til RNA-ekstraktion ifølge producentens anvisninger.
    3. Udfør cDNA syntese under anvendelse af et kit til cDNA syntese, herunder vilkårlige hexamerer ifølge producentens anvisninger. Brug 200 ng mRNA for CDNEn syntese.
  2. kvantitativ PCR
    1. At kvantificere mængden af en specifik mRNA, anvendes 1 pi cDNA, 1 uM fremad / revers primer og et fluorescerende DNA-bindende farvestof ifølge producentens anvisninger 27. Se Tabel 1 for sekvenserne for de primersæt. Mål CT-værdierne for IL-1β, IL-6, IL-23, IFNy, TNFa og PPIA (peptidylprolylisomerasen) under anvendelse af en kvantitativ PCR-system.
    2. For at bestemme den relative mRNA-ekspression bruge komparativ CT (tærskel cyklus) metode 27.
      1. Til dette, normalisere CT-værdier af målgener til ekspressionsniveauerne af PPIA ved at subtrahere middelværdien CT-værdi PPIA fra målgenet, som beskrevet i tidligere undersøgelser (Barthelmes et al. 28, Schiffmann et al. 29, Schiffmann et al. 30). Efterfølgende beregne de såkaldte ΔΔCT-værdier, ved hjælp af hvilken, normalisere ACt-værdieraf target gener fra EAE-mus til ekspressionsniveauet for de målgener af ubehandlede mus, igen ved at subtrahere middelværdien ACt-værdi i ubehandlede mus fra ACt-værdi i EAE-mus.
      2. For at få den relative mRNA ekspressionen af målgenet, beregne forholdet ved hjælp af følgende formel: 2 - ΔΔct.
  3. Test specificiteten af ​​hver primer. Bestem den amplificerede fragment størrelse under anvendelse af en 2% agarosegel 31. Fragmentet størrelse er vist i tabel 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 giver en skematisk oversigt over de forskellige metoder, der er beskrevet i denne artikel. 1) Mus modtager en injektion af MOG 35-55 antigen og udvikle indledende kliniske symptomer efter 10,7 ± 0,3 dage 28. Et repræsentativt sygdomsforløb af EAE mus er vist i figur 1. 2) Forskellige væv (milt, lymfeknuder, lumbale rygmarv) og blod er udvundet af kontrol- og EAE mus på forskellige tidspunkter i løbet af den prækliniske fase (dag 2, dag 4 , dag 6), under sygdommens opståen (dag 10) og under den akutte fase af sygdommen (dag 12, dag 14). 3) mRNA-ekspression profil af cytokiner, som regulerer EAE udvikling, bestemmes i de forskellige væv ekstraheret på forskellige tidspunkter i løbet af sygdomsforløbet, ved brug af kvantitativ PCR. 4) Enkelte celler isoleres fra forskellige væv udvundetpå forskellige tidspunkter i løbet af sygdomsforløbet og immuncelle fordeling bestemt ved anvendelse af flowcytometri.

I milt og lymfeknuder, er T-celler og B-celler observeret som den mest fremtrædende celletype. I modsætning til lymfeknuder, i milten, derudover et stort antal monocytter og neutrofiler er til stede. Alle immunceller viser en forbigående stigning i lymfeknuderne i den akutte fase, mens kun makrofager, B-celler, T-celler og neutrofiler stigning i milten. I blod, alle immunceller stige forbigående under den prækliniske fase. I den lumbale rygmarv, observeres en sygdom-afhængig stigning i alle immunceller, bortset fra monocytter, som formentlig differentierer til makrofager efter deres indgang ind i rygmarven (Figur 2). CD4 + og CD8 + T-celler viser sammenlignelige ændringer i milt, lymfeknude og blod under de forskellige sygdomstilstande kurser. ErOng celler infiltrerer rygmarven, stigningen i CD4 + T-celler var mest udtalt (figur 3). I figur 4 er den gating-strategi til bestemmelse af de forskellige cellepopulationer vist. I detaljer blev cellepopulationer beskrevet i dette manuskript identificeret som følger: monocytter (CD45hi, CD3-, Ly6G-, CD19-, CD11c-, CD11 +), makrofager (CD45hi, CD3-, Ly6G-, CD11c-, CD11 +, F4 / 80hi), neutrofiler (CD45hi, CD3-, CD11 +, Ly6G +), dendritiske celler (CD45hi, CD3-, Ly6G-, CD19-, CD11 +), B-celler (CD45hi, CD3-, CD19 +), T-celler (CD45hi, CD3 +) CD4 + T-celler (CD45hi, CD3 +, CD4 +) og CD8 + -T-celler (CD45hi, CD3 +, CD8 +). Antallet af celler er relateret til mængden af ​​væv (vægt af milt, lymfeknuder, lumbale rygmarv) eller mængde blod, hvilket afspejler den absolutte celletal. Det er imidlertid muligt at udtrykke de celletyper som procentdele af det totale antal celler målt.

I LYMph knudepunkter er ekspressionen af ​​IL-23-mRNA transient steg i den prækliniske fase, hvorimod ekspressionen af ​​IL-6-mRNA er forøget i en sygdom-afhængig måde. I milten, IL-6 og IL-23 mRNA-ekspression øges kortvarigt i den prækliniske fase, mens på sygdommens opståen, er IL-1β-mRNA-ekspression rejst. I blodet er udtryk for TNF mRNA forøget i en sygdom-afhængig måde. I den lumbale rygmarv, TNFa, IL-1β og IFNy stigning i den akutte fase, hvorimod IL-6 opreguleres under indtræden fase (figur 5).

figur 1

Figur 1: Ordning af workflow for induktion og Immunologisk Vurdering af EAE. 1) EAE induceres i mus fører til udviklingen af kliniske symptomer. Kliniske symptomer er klassified af kliniske scoringer, som følger: 0) ingen tegn, 0,5) distal lammelse af halen, 1) fuldstændig lammelse af halen, 1.5) slatne hale og mild svaghed af bagbenene, 2) slatne hale og svær svaghed af bagbenene , 2,5) slap hale og lammelse af den ene bagben, 3) slap hale og lammelse af begge bagben. Antallet af mus anvendt i figuren vist var 7. Figuren er modificeret fra Barthelmes et al. 28. 2) Musene aflives på forskellige tidspunkter i løbet af sygdomsforløbet, milt, inguinale lymfeknuder, blod og lumbale rygmarv udtrukket og enkelte celler isoleret fra disse væv. 3) Immun celle fordeling i forskellige væv, som bestemt ved flowcytometri. 4) mRNA ekspression af forskellige cytokiner i de forskellige væv, som bestemt ved kvantitativ PCR. klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2
Figur 2:. Immune Cell Distribution, Bestemt af FACS (Fluorescens-cellesortering) Analyse i Spleen, Lymfeknude, Blod og rygmarven Prøver fra EAE Mus på forskellige sygdom Stages I eksperimentet viste, at antallet af mus per gruppe var 2 - 10. fordelingen af neutrofiler / monocytter i blodet og neutrofile / makrofager i rygmarven er tilpasset og modificeret fra Barthelmes et al 28.. klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3: CD4 + T-celle og CD8 T-celle Distribution i Prøver fra EAE Mus på forskellige Sygdom Stages, bestemt ved FACS-analyse. A) lymfeknude, B) milt, C) blod og D) rygmarv. I det viste forsøg antallet af mus per gruppe var 2 - 10. Resultaterne er præsenteret som betyder ± standardafvigelser (SEM). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4: Strategi for gating flowcytometrisk analyse af T-celler, B-celler, neutrofiler, monocytter, dendritiske celler og makrofager fra rygmarv fra EAE Mus på dag 12. A) Et plot af SSC / CD45 fra alle celler. Gate:. CD45 + celler B) Et plot af FSC-H / FSC-W fra CD45 + celles. Gate: enkeltceller C) Et plot af SSC-A / FSC-A fra enkelte celler.. Gate: levedygtige celler. D) En plot af FSC-H / CD3 fra levedygtige celler. Gate: CD3 + og CD3 - celler E) Et plot af CD4 / CD8 fra CD3 + celler.. Gate: CD4 + CD8 - (CD4 + T-celler) og CD4 - CD8 + (CD8 + T-celler) F) Et plot af CD19 og Ly6G / CD11b fra CD3 - celler.. Gate: CD19 + CD11 - celler (B-celler), Ly6G + CD11b + celler (neutrofiler) og CD19 - Ly6G - celler G) Et plot af CD11c / CD11b celler fra CD19 - Ly6G - celler:. Gate CD11c + celler (dendritiske celler ) og CD11c - celler H) et plot af SSC / F4 / 80 fr.om CD11c - celler. Gate: F4 / 80 - celler (monocytter) og F4 / 80 + -celler (makrofager). En repræsentant plot af 9 vises. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5:. Cytokinprofil (IL-1β, IL-6, IL-23, TNFa, IFNy) i Prøver fra EAE mus ved forskellige sygdomssituationer Stages A) lymfeknude, B) milt, C) blod og D) rygmarv. mRNA-ekspressionsniveauer blev normaliseret peptidyl propyl isomerase A (PPIA) og blev beregnet under anvendelse af mRNA-niveauet af ubehandlede mus på samme alder. Målinger blev udført tre gange. Antallet af mus pr gruppe var 2 - 3. Resultater er præsenteret som gennemsnit ± standard fejl (SEM). Klik her for at se en større version af dette tal.

Gene forward bagside fragement størrelse (BP)
IL-1β CTGGTGTGTGACGTTCCCATTA CCGACAGCACGAGGCTTT 76
IL-6 TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC 76
IL-23 GAGCAGCAACTCTGACTGAGCC GAACAGCACAAGTCCTAATGGGTTA 127
IFNy CACGGCACAGTCATTGAAAGC CACCATCCTTTTGCCAGTTCC 118
TNF TGACAAGCCTGTAGCCCACG GCCTTGTCCCTTGAAGAGAACC 178
PPIA GCTGGACCAAACACAAACGG GCCATTCCTGGACCCAAAAC 144

Tabel 1: Primerpar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

EAE-modellen beskrevet her har fået mest opmærksomhed som en model for MS og anvendes rutinemæssigt at teste terapeutiske strategier til MS 32. Musen sygdom udviser mange kliniske og histologiske træk ved MS og skyldes induktion af autoimmunitet til neuronale antigener. Sensibiliseringen til myelinantigener er associeret med blod-hjerne-barriere-dysfunktion og derved, immuncelle infiltration i CNS. Vores resultater viser, at immunceller stige forbigående i lymfeknuderne i den akutte fase. Milt-T-celler og B-celler falde i den prækliniske fase af sygdommen. I cirkulerende blod, T-celler, B-celler, dendritiske celler og monocytter øges transient i den prækliniske fase, hvorimod neutrofiler øge sygdom-afhængigt. Endelig i rygmarven, en stigning i immunceller detekteres (figur 2). Disse data indikerer, at T-celler og B-celler migrerer fra milten, som virkeret reservoir for disse celler, til lymfeknuderne, hvor de aktiveres og formere sig. Efterfølgende de vandrer via omsætning i rygmarven. Neutrofiler, monocytter og dendritiske celler, på den anden side, vandrer fra knoglemarven gennem omsætning i CNS.

Vore data viser, at IFNy, TNFa og IL-1β i rygmarven, er reguleret i en sygdom afhængig måde, hvorimod IL-6 er transient opreguleres i begyndelsen af ​​sygdommen. Disse data understøtter den hypotese, at EAE patologi er drevet af Th1 og Th17 celler. Th1-celler frigiver IFNy, som igen aktiverer makrofager til at frigive TNFa og IL-1β 33. Desuden er IL-6 vides at drive differentiering af Th1 og Th17 celler og derved fremme udviklingen af EAE 34.

Dagen for indtræden af ​​kliniske symptomer og sværhedsgraden af ​​sygdommen er variabel i EAE-mus. Baseret på vores erfaringer, er der flere reasons for dette. Mus udsat for stress under den prækliniske fase viser en reduceret sværhedsgrad af sygdom og en forsinkelse i sygdomsdebut. Huset af musene påvirker også sværhedsgraden af ​​EAE og også dagen for sygdommens udbrud. For nylig blev det vist, at kommensale mikrobiota af mus påvirke udviklingen af EAE 35 og forskellige boliger situationer kan påvirke microbiome og derved, at EAE patologi. Endvidere er det meget vigtigt altid at bruge frisk fremstillede pertussis toxin. Pertussistoksin skader blodhjernebarrieren, som er en forudsætning for udviklingen af ​​EAE. Brug ikke emulgeret MOG 35-55 peptid efter udløbsdatoen. Alderen af ​​musene også indflydelse EAE patologi. Der er således nogle regler, der skal være opfyldt for at generere en reproducerbar EAE model. Brug mus hvis det er muligt i alderen mellem 10 og 13 uger og mus fra samme leverandør,. Hvis musene bestilt fra en ekstern leverandør, tillade musene at akklimatisere til touger i dyret huset. Håndter mus forsigtigt før EAE induktion, så de vænner sig til håndteringen. Undgå unødvendig håndtering efter EAE induktion. Give musene med mad og vand, som de let kan nå så snart de udviser kliniske symptomer. Hvis musene skal behandles med et lægemiddel, er det bedst at blande det til fødevaren eller drikkevand, for at undgå confounding stresspåvirkninger. Hvis sondeernæring eller en injektion er afgørende for lægemiddelindgivelse, er det vigtigt at bruge den samme rute for køretøjet.

Ud over den primære progressive EAE model beskrives her, findes også recidiverende-remitterende EAE-modeller. De forskellige sygdomsforløb induceres ved administration af forskellige antigener i forskellige musestammer. Således er anvendelsen af MOG 35 - 55 musestammer, såsom C57BL / 6, Sv129, B10, NOD og Biozzi mus, fører til en primær progressiv sygdom formular. Interessant dagen for indtræden er forskelligt i musestammer. ud fra følgende betragtningerC57BL / 6, SV129 og B10 mus udvikler første kliniske symptomer fra omkring dag 11 til 12, Biozzi mus viser første kliniske symptomer efter 21 dage 36. I en tidligere undersøgelse blev det vist, at 129S4 / SvJae × C57BL / 6 hybrider først udviser kliniske symptomer fra ca. dag 11 28. Injektion af proteolipidprotein (PLP) 131-151 fører i SJL-mus til induktion af en recidiverende-remitterende sygdomsforløbet 37. Den bedste EAE model til at bruge, vil afhænge af fokus for forskningen. Så hvis tilbagefald fase er af interesse, at tilbagefald-remitterende model bør anvendes hvorimod hvis sygdomsdebut er hovedfokus, bør anvendes den progressive model. Hvis der skal undersøges i EAE-modellen ved anvendelse knock-out mus rolle et specifikt protein, er det vigtigt at huske på, at ikke alle stammer kan anvendes til at inducere EAE og muligvis tilbagekrydsning af den udpressede stamme på en følsom stamme er nødvendig.

De tre mest anvendte types af dyremodeller af MS er (1) autoantigen induceret EAE; (2) viralt induceret spontan, kronisk demyeliniserende sygdom, og (3) toksin-induceret demyelinisering 38. EAE-modeller er karakteriseret ved induktion af inflammation og autoimmune reaktioner ved anvendelse af et autoantigent peptid, såsom myelin oligodendrocyt protein eller proteolipidprotein 38. Spontan EAE udvikles i transgene mus, som overudtrykker en T-cellereceptor mod et peptid af myelin oligodendrocyt protein 39. For at inducere viralt induceret kronisk inflammation, kan en neurotrofisk infektion af centralnervesystemet induceres, for eksempel med Theiler`s murine encephalomyelitis virus. Celler inficeret med viruset angribes af både T-celler og et humoralt respons og føre derved kronisk demyelinisering 40,41. Toksin-induceret demyelinisering kan induceres for eksempel med kobber chelator cuprizone 42. Denne model fører specifikt til demyelination fordi cuprizone angriber oligodendrocytter og kundeemner, derved, at aktivering af astroglia og mikroglia, mens inflammatoriske processer spiller kun en mindre rolle. Efter clearance af toksinet, er nye oligodendrocytter genereret og en ny myelinskeden dannes. Brugen af ​​disse tre modeller, på en komplementær måde, tillader evaluering af narkotika effekter på forskellige aspekter af patogenesen af ​​MS, fordi modellerne er forskellige med hensyn til inflammatoriske og immune og demyeliniserende processer. I EAE og virus-induceret model, inflammation og autoimmune processer primært drev sygdommen, hvorimod i toksinet-inducerede model, demyeliniserende og remyelinating processer er fremherskende. Præklinisk afprøvning af potentielle lægemidler til MS behandling, mindst tre modeller, et toksin-induceret model, et tilbagefald-remitterende EAE og en primær progressiv EAE eller et viralt induceret model skal bruges til at kontrollere effektiviteten af ​​lægemidlet.

Den EAE model beskrev hendee kan bruges til at opnå yderligere indsigt i mekanismen for udviklingen af MS-lignende sygdom proces, identificere de vigtigste cellulære førere af sygdommen, såsom Th1, Th17 og B-celler 43,44. Jo bedre forståelse af de inflammatoriske og immune processer involveret i udviklingen af ​​MS og de processer, der fremmer og løse læsioner, jo mere sandsynligt er det, at der kan udvikles nye behandlingsstrategier.

Ikke desto mindre EAE model her beskrevne blot har nogle karakteristika til fælles med MS, og har et par klare forskelle fra sygdom hos mennesker. Den mest fremtrædende forskel er, at MS-patienter varierer meget i sygdom præsentation, som ikke er gengivet i EAE-modellen. Dette kan skyldes forskellige læsioner mønstre i MS-patienter og EAE-mus og til den kendsgerning, at mus er indavlede stammer. I EAE-mus, homogene læsioner er mest fremtrædende i rygmarven, mens det i MS-patienter, primært heterogene læsioner erfindes i hjernen 45,46. Desuden MS og EAE deler afgørende bidrag Th1 celler og Th17 celler for deres udvikling, men i modsætning til MS, CD8 + T-celler spiller en mindre rolle i EAE patologi 33. Afslutningsvis EAE model fokuserer primært på de kombinerede effekter af autoimmunitet, inflammatoriske processer og neurodegeneration mens demyeliniserende processer er mindre modtagelige for selektiv vurdering. Derfor kan andre animalske modeller såsom cuprizone model anvendes til særskilt undersøgelse af demyeliniserende processer 47. Den EAE model er ufuldkommen, men ikke desto mindre, en nyttig model af MS 33.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ABI Prism 7500 Sequence Detection System  Applied Biosystems, Austin, USA quantitative PCR system
Accutase Sigma Aldrich Munich, Germany A6964 cell detachment solution
CD3-PE-CF594 BD, Heidelberg, Germany 562286
CD4-V500 BD, Heidelberg, Germany 560782
CD8-eFluor650 eBioscience, Frankfurt, Germany 95-0081-42
CD11b-eFluor605 eBioscience, Frankfurt, Germany 93-0112-42
CD11c-AlexaFluor700 BD, Heidelberg, Germany 560583
CD19-APC-H7  BD, Heidelberg, Germany 560143
CD45-Vioblue  Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany 130-092-910
CompBeads BD, Heidelberg, Germany 552843 compensation beads
Collagenase A Sigma Aldrich Munich, Germany C0130
Cytometric absolute count standard  Polyscience, Eppelheim, Germany BLI-580-10
Cytometer Setup and Tracking beads  BD, Heidelberg, Germany 642412
DNase I Sigma Aldrich Munich, Germany D5025
EAE Kit Hooke Laboratories, Lawrence, USA EK2110
F4/80-PE-Cy7  BioLegend, Fell, Germany 123114
First Strand cDNA-Synthesis kit  Thermo Scientific, Schwerte, Germany K1612
Fc receptor-1 blocking buffer  Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany 130-092-575
Flow cytometric absolute count standard Polyscience, Eppelheim, Germany 580
FlowJo software v10  Treestar, Ashland, USA flow cytometry software
LSRII/Fortessa  BD, Heidelberg, Germany flow cytometer
Ly6G-APC-Cy7  BD, Heidelberg, Germany 560600
Lysing solution  BD, Heidelberg, Germany 349202
Maxima SYBR Green  Thermo Scientific, Schwerte, Germany K0221 fluorescent DNA binding dye 
RNeasy Mini Kit  Qiagen, Hilden, Germany 74104 RNA extraction kit

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McFarland, H. F., Martin, R. Multiple sclerosis: a complicated picture of autoimmunity. Nat Immunol. 8, 913-919 (2007).
  2. Proudfoot, A. E. Chemokine receptors: multifaceted therapeutic targets. Nat Rev Immunol. 2, 106-115 (2002).
  3. Mihara, M., Hashizume, M., Yoshida, H., Suzuki, M., Shiina, M. IL-6/IL-6 receptor system and its role in physiological and pathological conditions. Clin Sci (Lond). 122, 143-159 (2012).
  4. Strydom, N., Rankin, S. M. Regulation of circulating neutrophil numbers under homeostasis and in disease. J Innate Immun. 5, 304-314 (2013).
  5. Kerstetter, A. E., Padovani-Claudio, D. A., Bai, L., Miller, R. H. Inhibition of CXCR2 signaling promotes recovery in models of multiple sclerosis. Exp Neurol. 220, 44-56 (2009).
  6. Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13, 159-175 (2013).
  7. Fan, X., et al. Murine CXCR1 is a functional receptor for GCP-2/CXCL6 and interleukin-8/CXCL8. J Biol Chem. 282, 11658-11666 (2007).
  8. Hartl, D., et al. Infiltrated neutrophils acquire novel chemokine receptor expression and chemokine responsiveness in chronic inflammatory lung diseases. J Immunol. 181, 8053-8067 (2008).
  9. Barcelos, L. S., et al. Role of the chemokines CCL3/MIP-1 alpha and CCL5/RANTES in sponge-induced inflammatory angiogenesis in mice. Microvasc Res. 78, 148-154 (2009).
  10. Wojkowska, D. W., Szpakowski, P., Ksiazek-Winiarek, D., Leszczynski, M., Glabinski, A. Interactions between neutrophils, Th17 cells, and chemokines during the initiation of experimental model of multiple sclerosis. Mediators Inflamm. , 590409 (2014).
  11. Bose, S., Cho, J. Role of chemokine CCL2 and its receptor CCR2 in neurodegenerative diseases. Arch Pharm Res. 36, 1039-1050 (2013).
  12. Mony, J. T., Khorooshi, R., Owens, T. Chemokine receptor expression by inflammatory T cells in EAE. Front Cell Neurosci. 8, 187 (2014).
  13. Katschke, K. J. Jr, et al. Differential expression of chemokine receptors on peripheral blood, synovial fluid, and synovial tissue monocytes/macrophages in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 44, 1022-1032 (2001).
  14. Trebst, C., et al. CCR1+/CCR5+ mononuclear phagocytes accumulate in the central nervous system of patients with multiple sclerosis. Am J Pathol. 159, 1701-1710 (2001).
  15. Karin, N., Wildbaum, G. The role of chemokines in adjusting the balance between CD4+ effector T cell subsets and FOXp3-negative regulatory T cells. Int Immunopharmacol. , (2015).
  16. Rottman, J. B., et al. Leukocyte recruitment during onset of experimental allergic encephalomyelitis is CCR1 dependent. Eur J Immunol. 30, 2372-2377 (2000).
  17. Izikson, L., Klein, R. S., Charo, I. F., Weiner, H. L., Luster, A. D. Resistance to experimental autoimmune encephalomyelitis in mice lacking the CC chemokine receptor (CCR)2. J Exp Med. 192, 1075-1080 (2000).
  18. Kuwabara, T., et al. CCR7 ligands are required for development of experimental autoimmune encephalomyelitis through generating IL-23-dependent Th17 cells. J Immunol. 183, 2513-2521 (2009).
  19. Liu, L., et al. Myelin repair is accelerated by inactivating CXCR2 on nonhematopoietic cells. J Neurosci. 30, 9074-9083 (2010).
  20. Matsui, M., et al. Treatment of experimental autoimmune encephalomyelitis with the chemokine receptor antagonist Met-RANTES. J Neuroimmunol. 128, 16-22 (2002).
  21. Liu, L., et al. Severe disease, unaltered leukocyte migration, and reduced IFN-gamma production in CXCR3-/- mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol. 176, 4399-4409 (2006).
  22. Lee, M., Suk, K., Kang, Y., McGeer, E., McGeer, P. L. Neurotoxic factors released by stimulated human monocytes and THP-1 cells. Brain Res. 1400, 99-111 (2011).
  23. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. , (2012).
  24. O'Connor, R. A., et al. Adjuvant immunotherapy of experimental autoimmune encephalomyelitis: immature myeloid cells expressing CXCL10 and CXCL16 attract CXCR3+CXCR6+ and myelin-specific T cells to the draining lymph nodes rather than the central nervous system. J Immunol. 188, 2093-2101 (2012).
  25. Olesch, C., et al. MPGES-1-derived PGE2 suppresses CD80 expression on tumor-associated phagocytes to inhibit anti-tumor immune responses in breast cancer. Oncotarget. 6, 10284-10296 (2015).
  26. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem. 162, 156-159 (1987).
  27. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25, 402-408 (2001).
  28. Barthelmes, J., et al. Lack of ceramide synthase 2 suppresses the development of experimental autoimmune encephalomyelitis by impairing the migratory capacity of neutrophils. Brain Behav Immun. 46, 280-292 (2015).
  29. Schiffmann, S., et al. Ceramide synthase 6 plays a critical role in the development of experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol. 188, 5723-5733 (2012).
  30. Schiffmann, S., et al. PGE2/EP4 signaling in peripheral immune cells promotes development of experimental autoimmune encephalomyelitis. Biochem Pharmacol. 87, 625-635 (2014).
  31. Giglio, S., Monis, P. T., Saint, C. P. Demonstration of preferential binding of SYBR Green I to specific DNA fragments in real-time multiplex PCR. Nucleic Acids Res. 31, e136 (2003).
  32. Vesterinen, H. M., et al. Improving the translational hit of experimental treatments in multiple sclerosis. Mult Scler. 16, 1044-1055 (2010).
  33. 't Hart, B. A., Gran, B., Weissert, R. EAE: imperfect but useful models of multiple sclerosis. Trends Mol Med. 17, 119-125 (2011).
  34. Serada, S., et al. IL-6 blockade inhibits the induction of myelin antigen-specific Th17 cells and Th1 cells in experimental autoimmune encephalomyelitis. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 9041-9046 (2008).
  35. Berer, K., et al. Commensal microbiota and myelin autoantigen cooperate to trigger autoimmune demyelination. Nature. 479, 538-541 (2011).
  36. Shetty, A., et al. Immunodominant T-cell epitopes of MOG reside in its transmembrane and cytoplasmic domains in EAE. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 1, 22-22 (2014).
  37. Schmitz, K., et al. R-flurbiprofen attenuates experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. EMBO Mol Med. 6, 1398-1422 (2014).
  38. Procaccini, C., De Rosa, V., Pucino, V., Formisano, L., Matarese, G. Animal models of Multiple Sclerosis. Eur J Pharmacol. 759, 182-191 (2015).
  39. Pollinger, B., et al. Spontaneous relapsing-remitting EAE in the SJL/J mouse: MOG-reactive transgenic T cells recruit endogenous MOG-specific B cells. J Exp Med. 206, 1303-1316 (2009).
  40. Rodriguez, M., Oleszak, E., Leibowitz, J. Theiler's murine encephalomyelitis: a model of demyelination and persistence of virus. Crit Rev Immunol. 7, 325-365 (1987).
  41. Lipton, H. L. Theiler's virus infection in mice: an unusual biphasic disease process leading to demyelination. Infect Immun. 11, 1147-1155 (1975).
  42. Matsushima, G. K., Morell, P. The neurotoxicant, cuprizone, as a model to study demyelination and remyelination in the central nervous system. Brain Pathol. 11, 107-116 (2001).
  43. El-behi, M., Rostami, A., Ciric, B. Current views on the roles of Th1 and Th17 cells in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neuroimmune Pharmacol. 5, 189-197 (2010).
  44. Mann, M. K., Ray, A., Basu, S., Karp, C. L., Dittel, B. N. Pathogenic and regulatory roles for B cells in experimental autoimmune encephalomyelitis. Autoimmunity. 45, 388-399 (2012).
  45. Lassmann, H., Bruck, W., Lucchinetti, C. F. The immunopathology of multiple sclerosis: an overview. Brain Pathol. 17, 210-218 (2007).
  46. Simmons, S. B., Pierson, E. R., Lee, S. Y., Goverman, J. M. Modeling the heterogeneity of multiple sclerosis in animals. Trends Immunol. 34, 410-422 (2013).
  47. Praet, J., Guglielmetti, C., Berneman, Z., Vander Linden, A., Ponsaerts, P. Cellular and molecular neuropathology of the cuprizone mouse model: clinical relevance for multiple sclerosis. Neurosci Biobehav Rev. 47, 485-505 (2014).

Tags

Immunologi eksperimentel autoimmun encephalomyelitis MOG dissemineret sklerose flowcytometri T-celle B-celle neutrofil monocyt makrofag
Induktion af Experimental Autoimmune Encephalomyelitis i mus og evaluering af sygdommen-afhængige Fordeling af immunceller i forskellige væv
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Barthelmes, J., Tafferner, N., Kurz, … More

Barthelmes, J., Tafferner, N., Kurz, J., de Bruin, N., Parnham, M. J., Geisslinger, G., Schiffmann, S. Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues. J. Vis. Exp. (111), e53933, doi:10.3791/53933 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter