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Immunology and Infection

La inducción de la encefalomielitis autoinmune experimental en ratones y evaluación de la distribución de la enfermedad dependiente de las células inmunes en diversos tejidos

Published: May 8, 2016 doi: 10.3791/53933
Automatic Translation
*1, *2, 2, 2, 2, 1, 2
1Institute of Clinical Pharmacology, Goethe University Hospital Frankfurt, 2Project Group for Translational Medicine & Pharmacology, Fraunhofer IME
* These authors contributed equally

Abstract

La esclerosis múltiple se presume que es una enfermedad autoinmune inflamatoria, que se caracteriza por la formación de lesiones en el sistema nervioso central (CNS) que resulta en el deterioro cognitivo y motor. la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es un modelo animal útil de la EM, debido a que también se caracteriza por la formación de lesiones en el SNC, el deterioro motor y también es impulsado por reacciones autoinmunes e inflamatorias. Uno de los modelos de EAE se induce con un péptido derivado de la proteína de mielina de oligodendrocitos (MOG) 35 a 55 en ratones. Los ratones con EAE desarrollar un curso de la enfermedad progresiva. Este curso se divide en tres fases: la fase preclínica (día 0 - 9), la aparición de la enfermedad (día 10 - 11) y la fase aguda (día 12 - 14). MS y EAE son inducidas por las células T autorreactivas que se infiltran en el SNC. Estas células T secretan citocinas y quimiocinas que conducen al reclutamiento de más células inmunes. Por lo tanto, la distribución de células inmunes en la médula espinal durante las tres fases de la enfermedad fue investigada. Para poner de relieve el punto de la enfermedad a la que empieza la activación / proliferación / acumulación de células T, células B y monocitos tiempo, se evaluó también la distribución de células inmunes en los nódulos linfáticos, el bazo y la sangre. Además, se determinaron los niveles de varias citoquinas (IL-1, IL-6, IL-23, TNF, IFN) en las tres fases de la enfermedad, para profundizar en los procesos inflamatorios de la enfermedad. En conclusión, los datos proporcionan una visión general del perfil funcional de células inmunes durante la patología EAE.

Introduction

La esclerosis múltiple (MS) y su modelo animal correspondiente, la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE), muestran cambios de neuroinflamación autoinmunes en el sistema nervioso central (SNC). Early lesiones de la EM y la EAE activos se caracterizan por la presencia de células inmunes infiltradas. La etiología de la EM se desconoce, pero se considera ampliamente implicar la destrucción de la mielina mediada por las células T autorreactivas. Estas células T autorreactivas secretan citoquinas pro-inflamatorias y quimiocinas que atraen otras células inmunes tales como células B, monocitos y neutrófilos de la circulación. Los monocitos se diferencian en macrófagos. El interferón gamma (IFN) secretado por las células T autorreactivas polariza los macrófagos en los macrófagos pro-inflamatorios. Las citoquinas pro-inflamatorias de liberación de los macrófagos y las especies reactivas de oxígeno que promueven la apoptosis en oligodendrocitos. La muerte de los oligodendrocitos conduce a la desmielinización. Además, las células B se diferencian en pLasma células y autoanticuerpos contra la liberación de la vaina de mielina, en última instancia resulta en la degradación de la mielina. La pérdida de la mielina conduce a la degradación de los axones y las neuronas y por lo tanto a la formación de sitios de lesión en el SNC cuales representan la principal característica de 1 MS. En la periferia, las células T y células B se activan en los ganglios linfáticos, que proliferan en el bazo y migran a través de la circulación en el sistema nervioso central. Los monocitos y neutrófilos proliferan en la médula ósea y también migran a través de la circulación en el sistema nervioso central.

La extravasación de leucocitos desde la médula ósea, el bazo y los ganglios linfáticos en la sangre o de la circulación sanguínea en el SNC es un proceso de múltiples etapas que depende de varios factores, incluyendo las interacciones moleculares entre leucocitos y endotelio mediadas por quimiocinas y receptores de quimiocinas. La producción de quimiocinas por diversos tipos de células puede ser inducida durante la Reactio inmunen por citoquinas como factor de necrosis tumoral-α (TNF), IFN y la interleucina-6 (IL-6), que posteriormente se recluta células inmunitarias al sitio de la inflamación 2,3. Las células inmunes presentan un subconjunto de receptores de quimioquinas en su superficie, dependiendo del tipo celular y vía de migración al sitio de la inflamación. Por lo tanto, CXCR2, CCR1 y CXCR1 se expresan en los neutrófilos maduros de la médula ósea y la sangre 4, y la unión de sus ligandos, CXCL2, CCL5 o CXCL6, respectivamente, activa neutrófilos y promueve su adherencia al endotelio y, posteriormente, la migración de las células en los tejidos 5-9. CCL2 y CCL20 atraen monocitos y células Th1 / Th17 10, que expresan CCR2 11 y CCR6 12, respectivamente. CCR1 y CCR5, expresada por diferentes tipos de células, incluyendo las células T, monocitos y macrófagos 13, se unen CCL3, CCL5 y CCL7 y se upregulated durante MS 14. CXCR3 se expresa en las células T y se une CCL9, CCL10 yCCL11 15.

Una estrategia principal en el tratamiento de MS es el agotamiento de las células inmunes o la prevención de la infiltración de células inmunes en el SNC. Por lo tanto, el bloqueo de los receptores de quimiocinas específicos ha sido investigado en EAE. El antagonismo o la eliminación genética de CCR1 16, CCR2 17, CCR7 18 o CXCR2 19 reduce la patología EAE, mientras que el antagonismo o la eliminación genética de CCR1 20, CCR5 20 o CXCR3 21 no redujo la patología. Por lo tanto, la expresión de receptores específicos de quimioquinas en leucocitos es crucial para la infiltración de este último en el SNC y dicta el curso de la EAE.

El agotamiento de las células inmunes es una estrategia de tratamiento eficaz para los pacientes con EM, porque las células inmunes infiltradas liberan citoquinas, tales como TNF, IL-6 y IL-1β, que, a su vez, promueve el proceso inflamatorio o la degradación de las neuronas 22. Además, auto-Las células Th1 reactivas liberan IFN, que a su vez estimula los macrófagos para liberar TNF, IL-1β y IL-23.

Este manuscrito describe la inducción de la EAE, la determinación de la distribución de las células inmunes y los niveles de citoquinas (ARNm) en diversos tejidos en ratones EAE. Las células se aislaron en diferentes momentos durante el curso de la enfermedad para proporcionar una visión general dependiente del tiempo de los procesos inflamatorios que finalmente conducen a la formación de lesiones en el SNC.

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Protocol

DECLARACIÓN DE ÉTICA: Nuestros procedimientos experimentales son aprobados por el Comité de Ética del Regierungspräsidium Darmstadt (Alemania) y confirmar con las regulaciones nacionales y europeas. Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento de los animales y reducir el número de animales utilizados.

EAE 1. Modelo

  1. La inducción de la EAE modelo
    1. Utilice / SvJae × C57BL / 6 ratones 129S4 femenina de 10 a 13 semanas de edad para la inducción de la EAE.
    2. Dar a los ratones una inyección subcutánea, en la parte superior e inferior de la espalda, de la encefalitogénico MOG 35 - péptido 55 (mielina de los oligodendrocitos glicoproteína) (200 mg), emulsionado en adyuvante completo de 200 l Freund`s (CFA) que contiene 400 mg de Mycobacterium tuberculosis.
      Nota: Como control negativo simulado, la inducción de la enfermedad no-, adyuvante incompleto de Freund que contiene Mycobacterium tuberculosis, en el mismo volumen y por la misma ruta, se puede utilizar.
    3. TherEDespués, y de nuevo 24 horas más tarde, dar a los ratones una inyección intraperitoneal de toxina pertussis (en total 0,2 g, diluido en 200 buffer fosfato salino-l, PBS). Usa los ratones no tratados como el grupo de control, para poder comparar enferma con animales sanos.
      Nota: También es posible inducir EAE con 200-300 mg MOG 35 - 55 péptido, 300-500 g de Mycobacterium tuberculosis en el CFA y 0,2-0,3 g de toxina pertussis en un volumen de 0,1 - 0,2 ml por inyección.
    4. Comenzando una semana después de la inyección, los ratones examinan todos los días para los síntomas clínicos (ver paso 1.2.1)
      Nota: El día de inicio de la enfermedad varía en diferentes experimentos, pero en las condiciones en nuestro laboratorio, esto es alrededor del día 11 y por lo tanto, aquí el día 14 se define como 3 días después del inicio de la enfermedad. Todos los ratones en el presente estudio desarrollaron síntomas clínicos.
  2. La puntuación de los ratones
    1. Clasificar los síntomas clínicos de las puntuaciones clínicas de la siguiente manera:0) no hay signos, 0,5) parálisis distal de la cola, 1) parálisis completa de la cola, 1.5) cola flácida y debilidad leve de las patas traseras, 2) cola flácida y debilidad severa de las patas traseras, 2.5) de la cola cojera y parálisis de una pata trasera, 3) la cola cojera y parálisis de ambas patas traseras, 3,5) parálisis de ambas patas traseras y la debilidad de una extremidad delantera (ratones han alcanzado esta puntuación fueron sacrificados, de acuerdo con las pautas éticas locales).

2. Preparación de las células individuales para el análisis de citometría de flujo

Nota: La mezcla de anticuerpo consiste en 1 l CD45-Vioblue, 2 l CD8-eFluor650, 0,5 l CD11b-eFluor605, 0,5 l F4 / 80-PE-Cy7, 1 l CD3-PE-CF594, CD4-V500, 0,5 l CD11c -AlexaFluor700, 1 l CD19-APC-H7 y 1 l Ly6G-APC-Cy7.

Nota: Si se toma la sangre, los ganglios linfáticos, el bazo y la médula espinal, entonces el procedimiento es el siguiente: Los ratones se anestesiaron profundamente con una combinación de isoflUrane (2% en carbógeno por minuto) y ketamina (100 mg / kg de peso corporal). A continuación abra el tórax, extraer la sangre con un palillo intracardiaca y la perfusión de los ratones por vía intracardiaca con PBS frío. A continuación, retire los ganglios linfáticos seguido de bazo y finalmente la médula espinal. Si no es necesario para perfundir los ratones por vía intracardiaca entonces la eutanasia a los ratones bajo anestesia profunda por luxación del cuello.

  1. Aislamiento de esplenocitos
    1. Anestesiar los ratones con una combinación de isoflurano (2% en carbógeno por minuto) y ketamina (100 mg / kg de peso corporal).
    2. área de la incisión mojado con isopropanol al 80% para evitar cualquier contaminación con pelos y abrir el tórax longitudinal, sin perforar los tejidos más profundos, con unas tijeras.
    3. Perfundir ratones intracardially de frío PBS pH 7,0 23.
      Nota: El bazo se encuentra en el cuadrante abdominal superior, izquierda debajo de la caja torácica. Si solamente se va a estudiar el bazo, este órgano puede ser removido antes de la perfusión con el fin de retain todos los tipos de células de interés.
    4. Extirpar el bazo y corte aproximadamente 1/8 y pesarlo. Conservar la muestra en PBS en hielo.
    5. Exprimir el tejido de bazo a través de un tamiz de malla de 70 micras (colocado sobre un tubo de 50 ml), utilizando el émbolo de una jeringa de 2 ml.
    6. Se lava la malla con 5 ml de PBS. Se centrifuga a 1.800 g durante 3 min. Resuspender el precipitado en 500 l solución de lisis.
      Nota: En esta etapa, puede ser necesario hacer un recuento celular diferencial si, después, un método de análisis FACS alternativa que se utiliza no emplea perlas (véase la sección 3).
    7. Incubar durante 10 min a temperatura ambiente (RT) y añadir 500 l de PBS. Centrifugar durante 6 min a 650 xg a temperatura ambiente (RT).
    8. Repetir la etapa de lavado con 500 l de PBS. Descartar el sobrenadante, resuspender el sedimento celular en 100 l 0,2% de albúmina de suero bovino (BSA) / PBS, añadir 2 l Fc receptor-1 (FcRI) tampón de bloqueo e incubar durante 15 min a TA en la oscuridad.
    9. Añadir 13 l unamezcla tibody, incubar 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad, añadir 500 l de PBS y centrifugar durante 6 minutos a 650 x g a temperatura ambiente. Descartar el sobrenadante.
      Nota: el procedimiento de tinción del fabricante recomienda un solo lavado, pero la reducción adicional de la tinción de fondo se puede lograr por repetir opcionalmente la etapa de lavado una o dos veces más.
    10. Resuspender el sedimento celular en 500 l de PBS (o tampón posiblemente funcionamiento para la separación de proteínas, para reducir potencialmente la formación de grumos de células) y la transfiere a la citometría de flujo del tubo. Mantener las células en hielo.
  2. Aislamiento de células de nódulos linfáticos
    1. Anestesiar los ratones con una combinación de isoflurano (2% en carbógeno por minuto) y ketamina (100 mg / kg de peso corporal).
    2. área de la incisión en húmedo con un 80% de isopropanol, y abrir el tórax longitudinalmente usando una tijera. Perfundir ratones intracardially de frío PBS pH 7,0 23.
    3. Para aislar el ganglio linfático inguinal, retire con cuidado la piel en la región de la hip y recoger el ganglio linfático con cuidado del tejido graso con unas pinzas. Pesar el ganglio linfático inguinal y almacenar la muestra en PBS en hielo.
      Nota: Se utilizaron los ganglios linfáticos inguinales en nuestros estudios porque O'Connor et al. encontraron que un alto número de monocitos activados, macrófagos, neutrófilos y células T estaban presentes en los ganglios linfáticos inguinales después de EAE inducción 24.
    4. Exprimir el ganglio linfático a través de un tamiz de malla de 70 micras (colocado sobre un tubo de 50 ml) usando el émbolo de una jeringa de 2 ml.
    5. Se lava la malla con 5 ml de PBS. Se centrifuga a 2.400 g durante 8 min. Resuspender el sedimento celular en 100 l 0,2% de BSA / PBS, añadir 2 l tampón de bloqueo FcRI y se incuba durante 15 min a TA en la oscuridad.
    6. Añadir 13 l mezcla de anticuerpos, incubar 15 min a TA en la oscuridad, añadir 500 l de PBS y centrifugar durante 6 min a 650 xg a TA.
    7. Descartar el sobrenadante, resuspender el sedimento celular en 300 l de PBS (o un tampón de desarrollo adecuado) y transferirloa un tubo de citometría de flujo.
  3. Aislamiento de células de la sangre
    1. Añadir 50 l de HEPES 20 mM a 50 l de sangre (estabilizado con EDTA) y añadir 500 l solución de lisis. Incubar durante 10 min a TA y añadir 500 l de PBS. Centrifugar durante 6 min a 650 xg a TA. Desechar el sobrenadante y repetir el paso de lavado.
    2. Resuspender el sedimento celular en 100 l 0,2% de BSA / PBS, añadir 2 l tampón de bloqueo FcRI y se incuba durante 15 min a TA en la oscuridad.
    3. Añadir 13 l mezcla de anticuerpos, incubar 15 min a TA en la oscuridad, añadir 500 l de PBS y centrifugar durante 6 min a 650 xg a TA. Descartar el sobrenadante, resuspender el sedimento celular en 300 l de PBS y transferirlo a la citometría de flujo del tubo.
  4. Aislamiento de células de la médula espinal
    1. Anestesiar los ratones con una combinación de isoflurano (2% en carbógeno por minuto) y ketamina (100 mg / kg de peso corporal).
    2. área de la incisión en húmedo con un 80% de isopropanol y abrir el tórax longitudinalmentecon unas tijeras. Perfundir ratones intracardially de frío PBS pH 7,0 23.
    3. Mojar el área de la incisión en la parte posterior y hacer de nuevo un corte longitudinal con un bisturí y quitar la piel.
    4. Cortar la parte lumbar de la columna vertebral (que inerva las patas traseras) y tirar de la cadena con una jeringa llena de PBS para extraer la médula espinal. Cortar aproximadamente 1/3 del cordón lumbar, pesar de esto y almacenar la muestra en PBS en hielo.
    5. Centrifugar a 250 xg durante 2 minutos a 4 ° C. Descartar el sobrenadante, añadir 500 l solución de desprendimiento de las células y HBSS (1: 1). Añadir 3 mg / ml de colagenasa A y 1 unidad / ml de DNasa I, decollate las células por repetido pipeteo arriba y abajo y se incuba durante 30 min con agitación a 37 ° C a 400 rpm.
      Nota: Si se prefiere, la suspensión de células se puede borrar de la contaminación de la mielina y los desechos celulares por centrifugación en gradiente de densidad que puede mejorar la sensibilidad de la citometría de flujo de medición, por lo tanto, la reducción de un fondo de autofluorescenciad el número de eventos que necesitan ser adquirida (ver sección 3.5).
    6. Centrifugar a 250 xg durante 2 min a TA. Descartar el sobrenadante, resuspender el precipitado en 1 ml 10% de suero de ternera fetal (FCS) / medio de Dulbecco mínimo esencial (DMEM) y decollate las células de nuevo por repetido hacia arriba y abajo de pipeteado.
    7. Centrifugar a 250 xg durante 2 min a TA. Repita el paso de lavado.
    8. Resuspender el sedimento celular en 1 ml de PBS y exprimir la médula espinal a través de un tamiz de malla de 70 micras (colocado sobre un tubo de 50 ml) usando el émbolo de una jeringa de 2 ml.
    9. Se lava la malla con 4 ml de PBS. Centrifugar a 1800 xg durante 3 min a TA. Descartar el sobrenadante, resuspender el sedimento celular en 100 l 0,2% de BSA / PBS, añadir 2 l FcRI reactivo de bloqueo e incubar durante 15 min a TA en la oscuridad.
    10. Añadir 13 l mezcla de anticuerpos, incubar 15 min a TA en la oscuridad, añadir 500 l de PBS y centrifugar durante 6 min a 650 xg a TA.
    11. Descartar el sobrenadante, resuspender el pelle celulart en 500 l de PBS (o un tampón de desarrollo adecuado) y transferirlo a la citometría de flujo del tubo.

3. Análisis de citometría de flujo

  1. Valorar todos los anticuerpos de antemano para determinar las concentraciones óptimas como se describe por Olesch et al. 25.
  2. Utilizar bolas de compensación de anticuerpos de captura de compensación de un solo color de crear matrices de compensación de varios colores según las instrucciones del fabricante.
  3. Controlar la calibración del instrumento todos los días usando cuentas específicas de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  4. Directamente antes de la citometría de flujo medida, añadir 30 l de citometría de flujo estándar recuento absoluto de las células (para el aislamiento véase la sección 2.1, 2.2, 2.3, 2.4) para determinar el recuento de células absolutos. En lugar de utilizar las células contar bolas se pueden contar.
  5. Toma de muestras (células de bazo, los ganglios linfáticos y sangre: 100.000 eventos, la médula espinal: 500.000 eventos) en un citómetro de flujo de unand analizar el uso de software específico de citometría de flujo.
    1. Abra el software de citometría de flujo y añadir FCS 3.0 archivos pulsando el botón "añadir muestras".
    2. Abra el archivo añadido haciendo doble clic. Ajustar los canales para las direcciones x y el eje y. Para seleccionar las poblaciones de células de interés crear una puerta (véase la figura 4).

4. Análisis Cuantitativo PCR

  1. Aislamiento del ARNm y la transcripción en ADNc
    1. Extraer el ARNm de médula espinal lumbar (1/3), el bazo (1/8) y los ganglios linfáticos inguinales con fenol-cloroformo y precipitar con etanol 26.
      1. Para esto, homogeneizar el tejido en 1 mezcla de tiocianato de guanidinio-fenol ml, se incuba durante 10 min. Añadir 200 l de cloroformo y se incuba de nuevo durante 10 min.
      2. Tras una etapa de centrifugación (18.000 xg durante 15 min a 4 ° C), se lava la fase acuosa superior es con isopropanol 500 l y se centrifuga (18.000 xg durante 4 min a 8DO).
      3. Lavar el precipitado con 500 l de etanol y después de una etapa de centrifugación (18.000 xg durante 5 min a 4ºC), secar el precipitado en el concentrador de vacío (5 minutos a 30 ° C). A partir de entonces, resuspender el precipitado en 30 l de agua.
    2. Para extraer el mRNA a partir de sangre, de centrifugación 500 l de sangre EDTA estabilizado (300 xg 10 min 4 ° C).
      1. Tomar la capa leucocitaria, que contiene células blancas de la sangre, y se diluye en 1 ml de solución (mM NaHCO 150 mM NH 4 Cl, 100 3, 0,1 mM Na-EDTA pH 7,4) lisar.
      2. Después de 10 min de incubación a RT, centrifugar las células a 650 xg durante 6 min y después se lava dos veces con PBS.
      3. Extraer el ARNm de las células blancas de la sangre (glóbulos blancos) utilizando un kit para la extracción de ARN de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    3. Realizar la síntesis de cDNA utilizando un kit para síntesis de ADNc incluyendo hexámeros aleatorios de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Utilice 200 ng de ARNm para el CDNUna síntesis.
  2. Quantitative PCR
    1. Para cuantificar la cantidad de un ARNm específico, utilice 1 cDNA l, 1 M de cebador de avance / retroceso y un ADN fluorescente colorante de unión de acuerdo con las instrucciones del fabricante 27. Ver Tabla 1 para las secuencias para los conjuntos de cebadores. Medir las CT-valores de IL-1β, IL-6, IL-23, IFN, TNF y PPIA (peptidil prolil isomerasa) usando un sistema de PCR cuantitativa.
    2. Para determinar la expresión relativa del mRNA utilizar el método comparativo CT (ciclo umbral) 27.
      1. Para esto, normalizar CT-valores de los genes diana a los niveles de expresión de PPIA restando la media CT-valor de PPIA del gen diana, como se describe en estudios previos (Barthelmes et al. 28, Schiffmann et al. 29, Schiffmann et al. 30). Posteriormente, el cálculo de los llamados ΔΔCT-valores, con el que, a normalizar los-valores Ctde los genes diana de ratones EAE al nivel de expresión de los genes diana de los ratones no tratados, de nuevo restando la media Ct-valor en los ratones sin tratar de la Ct-valor en los ratones EAE.
      2. Para obtener la expresión de ARNm relativa del gen diana, calcular la relación utilizando la siguiente fórmula: 2 - ΔΔct.
  3. Probar la especificidad de cada cebador. Determinar el tamaño de los fragmentos amplificados utilizando un gel de agarosa al 2% 31. El tamaño del fragmento se muestra en la Tabla 1.

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Representative Results

La figura 1 muestra una visión esquemática de los diferentes métodos que se describen en este artículo. 1) Los ratones reciben una inyección de antígeno MOG 35-55 y desarrollar síntomas clínicos iniciales después de 10.7 ± 0.3 los días 28. Un curso de la enfermedad representante de ratones EAE se muestra en la Figura 1. 2) Los varios tejidos (bazo, los ganglios linfáticos, la médula espinal lumbar) y la sangre se extrae de los ratones de control y EAE en diferentes puntos temporales durante la fase preclínica (día 2, día 4 , día 6), durante el inicio de la enfermedad (día 10) y durante la fase aguda de la enfermedad (día 12, día 14). 3) el perfil de expresión de ARNm de citoquinas, que regulan el desarrollo de EAE, se determina en los diferentes tejidos extraídos en diferentes puntos de tiempo durante el curso de la enfermedad, utilizando PCR cuantitativa. 4) las células individuales están aisladas de diversos tejidos extraídosen diferentes puntos de tiempo durante el curso de la enfermedad y la distribución de células inmunes determinó usando citometría de flujo.

En el bazo y los ganglios linfáticos, las células T y las células B se observan como el tipo de célula más prominente. En contraste a los ganglios linfáticos, en el bazo, adicionalmente, están presentes un gran número de monocitos y neutrófilos. Todas las células inmunes muestran un aumento transitorio en los ganglios linfáticos durante la fase aguda, mientras que sólo los macrófagos, células B, células T y neutrófilos aumento en el bazo. En la sangre, todas las células inmunes aumentan transitoriamente durante la fase preclínica. En la médula espinal lumbar, se observa un incremento de la enfermedad dependiente en todas las células inmunes, aparte de los monocitos, que presumiblemente diferencian a los macrófagos después de su entrada en la médula espinal (Figura 2). Las células CD4 + y T CD8 + muestran cambios comparables en el bazo, los ganglios linfáticos y sangre durante los diferentes cursos de la enfermedad. A.mcélulas ong que infiltran la médula espinal, el aumento en las células T CD4 + fue más pronunciada (Figura 3). En la Figura 4, se muestra el gating-estrategia para la determinación de las diferentes poblaciones de células. En detalle, las poblaciones de células descritas en este manuscrito se identifican como sigue: monocitos (CD45hi, CD3, Ly6G-, CD19-, CD11c-, CD11b +), macrófagos (CD45hi, CD3, Ly6G-, CD11c-, CD11b +, F4 / 80hi), neutrófilos (CD45hi, CD3, CD11b +, Ly6G +), células dendríticas (CD45hi, CD3, Ly6G-, CD19-, CD11c +), células B (CD45hi, CD3, CD19 +), células T (CD45hi, CD3 +) , las células T CD4 + (CD45hi, CD3 +, CD4 +) y células T CD8 + (CD45hi, CD3 +, CD8 +). El número de células están relacionados con la cantidad de tejido (peso del bazo, ganglios linfáticos, médula espinal lumbar) o el volumen de sangre, lo que refleja el número de células absoluta. Es, sin embargo, posible expresar los tipos de células como porcentajes de células totales medidos.

en lymlos nodos de pH, la expresión de IL-23 mRNA se incrementa transitoriamente en la fase preclínica, mientras que la expresión de IL-6 mRNA se incrementa de una manera enfermedad dependiente. En el bazo, IL-6 y IL-23 aumenta la expresión de ARNm transitoriamente en la fase preclínica, mientras que en el inicio de la enfermedad, se eleva la expresión de ARNm de IL-1β. En la sangre, la expresión de TNF mRNA se incrementa de una manera enfermedad dependiente. En la médula espinal lumbar, TNFa, IL-1β y aumento IFN durante la fase aguda, mientras que la IL-6 es upregulated durante la fase de inicio (Figura 5).

Figura 1

Figura 1: Esquema del flujo de trabajo para la inducción y evaluación inmunológica de la EAE. 1) EAE se induce en ratones que conducen al desarrollo de los síntomas clínicos. Los síntomas clínicos son clasificado por las puntuaciones clínicas, de la siguiente manera: 0) no hay signos, 0,5) parálisis distal de la cola, 1) parálisis completa de la cola, 1.5) cola flácida y debilidad leve de las patas traseras, 2) cola flácida y debilidad severa de las patas traseras , 2.5) de la cola floja y parálisis de una pata trasera, 3) la cola cojera y parálisis de ambas patas traseras. El número de ratones utilizados en la figura que se muestra era 7. La figura ha sido modificado a partir de Barthelmes et al. 28. 2) Los ratones se sacrificaron en diferentes puntos de tiempo durante el curso de la enfermedad, el bazo, los ganglios linfáticos inguinales, la sangre y la médula espinal lumbar células extraídas e individuales aislados de estos tejidos. 3) distribución de células inmunes en diversos tejidos, según lo determinado por citometría de flujo. 4) expresión de ARNm de diversas citocinas en los diferentes tejidos, según se determina mediante PCR cuantitativa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de este figura.

Figura 2
Figura 2:. Inmune Distribución celular, determinada por FACS (activada por fluorescencia celular) Análisis en el bazo, los ganglios linfáticos, muestras de sangre y de la médula espinal de EAE Los ratones en diferentes etapas de la enfermedad en el experimento que se muestra, el número de ratones por grupo fue de 2 - 10. la distribución de los neutrófilos / monocitos y neutrófilos en la sangre / macrófagos en la médula espinal están adaptados y modificados desde Barthelmes et al 28.. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3: CD4 + células T y CD8 Distribución de células T en muestras de EAE Los ratones en diferentes etapas de la enfermedad, determinado por análisis FACS. A) de los ganglios linfáticos, B) bazo, C) en la sangre y D) de la médula espinal. En el experimento que se muestra, el número de ratones por grupo fue de 2 - 10. Los resultados se presentan como media ± error estándar (SEM). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4: Estrategia de apertura de puerta para análisis citométrico de flujo de células T, células B, neutrófilos, monocitos, células dendríticas y macrófagos de la médula espinal de EAE Los ratones en el día 12. A) Una parcela de SSC / CD45 de todas las células. Puerta:. Células CD45 + B) Una parcela de FSC-H / W-FSC de células CD45 +s. Puerta: las células individuales C) Una gráfica de SSC-A / FSC-A partir de células individuales.. Puerta: células viables. D) Una parcela de FSC-H / CD3 de células viables. Puerta: CD3 + y CD3 - células E) Una parcela de CD4 / CD8 de las células CD3 +.. Gate: CD4 + CD8 - (células T CD4 +) y CD4 - CD8 + (células T CD8 +) F) Una parcela de CD19 y Ly6G / CD11b de CD3 - células.. Puerta: CD19 + CD11b - células (células B), Ly6G + CD11b + células (neutrófilos) y CD19 - Ly6G - células T) una parcela de células CD11c / CD11b de CD19 - Ly6G - Células:. Puerta de células CD11c + (células dendríticas ) y CD11c - células H) una parcela de SSC / F4 / 80 fr.om CD11c - células. Puerta: F4 / 80 - células (monocitos) y F4 / 80 + células (macrófagos). Se muestra un gráfico representativo de 9. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5:. Perfil de citoquinas (IL-1β, IL-6, IL-23, TNF, IFN) en muestras de EAE Los ratones en diferentes etapas de la enfermedad A) de los ganglios linfáticos, B) bazo, C) en la sangre y D) de la médula espinal. los niveles de expresión de ARNm se normalizaron para la peptidil isomerasa propilo a (PPIA) y se calcularon utilizando el nivel de ARNm de ratones no tratados de la misma edad. Las mediciones se realizaron por triplicado. El número de ratones por grupo fue de 2 - 3. Los resultados se presentan como medias sta ±ándar errores (SEM). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Gene adelante marcha atrás tamaño fragement (Bp)
IL-1β CTGGTGTGTGACGTTCCCATTA CCGACAGCACGAGGCTTT 76
IL-6 TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC 76
IL-23 GAGCAGCAACTCTGACTGAGCC GAACAGCACAAGTCCTAATGGGTTA 127
IFN? CACGGCACAGTCATTGAAAGC CACCATCCTTTTGCCAGTTCC 118
TNFa TGACAAGCCTGTAGCCCACG GCCTTGTCCCTTGAAGAGAACC 178
ppia GCTGGACCAAACACAAACGG GCCATTCCTGGACCCAAAAC 144

Tabla 1: Los pares de cebadores.

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Discussion

El modelo de EAE aquí descrito ha recibido la mayor atención como un modelo de MS y se usa rutinariamente en el ensayo de estrategias terapéuticas para MS 32. La enfermedad de ratón exhibe muchas características clínicas e histológicas de MS y es causado por la inducción de la autoinmunidad a los antígenos neuronales. La sensibilización a antígenos de mielina se asocia con disfunción hematoencefálica barrera y por lo tanto, infiltración de células inmunes en el SNC. Nuestros resultados muestran que células inmunes aumentan transitoriamente en los ganglios linfáticos en la fase aguda. células esplénicas T y células B disminución en la fase preclínica de la enfermedad. En la sangre en circulación, células T, células B, células dendríticas y monocitos aumentan transitoriamente en la fase preclínica, mientras que los neutrófilos aumentan la enfermedad dependiente de la. Por último, en la médula espinal, un aumento en las células inmunes es detectable (Figura 2). Estos datos indican que las células T y las células B migran del bazo, que actúaun depósito para estas células, a los ganglios linfáticos donde se activan y proliferan. Posteriormente, migran a través de la circulación en la médula espinal. Los neutrófilos, monocitos y células dendríticas, por otra parte, migran desde la médula ósea a través de la circulación en el SNC.

Nuestros datos revelan que en la médula espinal, IFN, TNF e IL-1β se regulan de una manera enfermedad dependiente, mientras que la IL-6 es upregulated transitoriamente en el inicio de la enfermedad. Estos datos apoyan la hipótesis de que la patología EAE es impulsado por las células Th1 y Th17. Las células Th1 liberan IFN, que a su vez activa los macrófagos para liberar TNF e IL-1β 33. Por otra parte, IL-6 es conocido para conducir la diferenciación de células Th1 y Th17 y de ese modo promover el desarrollo de EAE 34.

El día de la aparición de los síntomas clínicos y la gravedad de la enfermedad es variable en ratones EAE. Sobre la base de nuestra experiencia, hay varios rEasons de este. Los ratones expuestos a estrés durante la fase preclínica muestran una severidad reducida de la enfermedad y un retraso en el inicio de la enfermedad. La carcasa de los ratones también influye en la gravedad de la EAE y también el día de comienzo. Recientemente, se ha demostrado que la microbiota comensal de los ratones influye en el desarrollo de la EAE 35 y diferentes situaciones de vivienda puede influir en el microbioma y por lo tanto, la patología EAE. Además, es muy importante utilizar siempre la toxina pertussis recién preparado. La toxina pertussis daños de la barrera hematoencefálica, que es un requisito previo para el desarrollo de EAE. No utilice emulsionado 35-55 péptido MOG después de la fecha de caducidad. La edad de los ratones también influye en la patología de EAE. Por lo tanto, hay algunas reglas que deben cumplirse con el fin de generar un modelo de EAE reproducible. Utilice los ratones de edades comprendidas entre los 10 y 13 semanas y los ratones del mismo proveedor, si es posible. Si los ratones se ordenan de un proveedor externo, permitir que los ratones se aclimaten para dossemanas en la casa de los animales. Manejar con cuidado los ratones antes de la inducción de EAE para que se acostumbren a la manipulación. Evitar la manipulación innecesaria después de la inducción de EAE. Proporcionar a los ratones con comida y agua que se puede llegar fácilmente en cuanto se presentan síntomas clínicos. Si los ratones deben ser tratados con un fármaco, lo mejor es mezclarlo con la comida o el agua potable, para evitar confundir los efectos del estrés. Si sonda o una inyección es esencial para la administración de fármacos, es importante utilizar la misma ruta para el vehículo.

Además del modelo de EAE primaria progresiva se describe aquí, también existen modelos de EAE recaída-remisión. El curso de la enfermedad diferente es inducida por la administración de antígenos diferentes en diferentes cepas de ratón. Por lo tanto, la aplicación de MOG 35 - 55 en las cepas de ratón, tales como C57BL / 6, SV129, B10, NOD y ratones Biozzi, conduce a una forma de la enfermedad progresiva primaria. Curiosamente, el día de aparición difiere en las diferentes cepas de ratón. MientrasC57BL / 6, y los ratones SV129 B10 desarrollar los primeros síntomas clínicos de aproximadamente 11 a 12 días, los ratones muestran Biozzi primeros síntomas clínicos después de 21 días 36. En un estudio previo, se demostró que 129S4 / SvJae × C57BL / 6 híbridos de primera exhiben síntomas clínicos de aproximadamente 11 días 28. La inyección de proteínas proteolipıdica (PLP) 131-151 lleva en ratones SJL a la inducción de una recaída-remisión curso de la enfermedad 37. El mejor modelo de EAE a utilizar dependerá del foco de la investigación. Por lo tanto, si la fase de recaída es de interés, el modelo de recaída-remisión debe ser empleado mientras que si inicio de la enfermedad es el foco principal, el modelo progresivo debe ser utilizado. Si el papel de una proteína específica es que ser investigado en el modelo de EAE, usando ratones knock-out, es importante tener en cuenta que y no todas las cepas se pueden utilizar de inducir EAE y, posiblemente, el retrocruzamiento de la cepa knock-out en una cepa sensible es necesario.

Los tres t más utilizadoipos de modelos animales de EM son: (1) autoantígeno EAE inducida; (2) inducida viralmente enfermedad desmielinizante espontánea, crónica, y (3) la toxina inducida por la desmielinización 38. Modelos de EAE se caracterizan por la inducción de la inflamación y las respuestas autoinmunes mediante la aplicación de un péptido autoantigenic como la proteína de mielina de oligodendrocitos o proteína proteolipídica 38. Spontaneous EAE se desarrolla en ratones transgénicos que sobreexpresan un receptor de células T contra un péptido de la proteína de la mielina de los oligodendrocitos 39. Para inducir la inflamación crónica inducida por virus, una infección neurotrófico del sistema nervioso central puede ser inducida, por ejemplo, con el virus de la encefalomielitis murina Theiler`s. Las células infectadas con el virus son atacados por tanto las células T y una respuesta humoral y conducen de este modo a la desmielinización crónica 40,41. Inducida por toxina desmielinización puede ser inducida, por ejemplo, con el cobre quelante cuprizone 42. Este modelo conduce específicamente a demyelinación, porque cuprizone ataca a los oligodendrocitos y clientes potenciales, por lo tanto, a la activación de la microglía y astroglias, mientras que los procesos inflamatorios sólo desempeñan un papel menor. Tras eliminación de la toxina, nuevos oligodendrocitos se generan y se forma un nuevo vaina de mielina. El uso de estos tres modelos, de forma complementaria, permite la evaluación de efectos del fármaco sobre diferentes aspectos de la patogénesis de la EM, debido a que los modelos se diferencian con respecto a los procesos inflamatorios, e inmunes y desmielinizantes. En EAE y la inducida por el virus modelo, la inflamación y procesos autoinmunes conducir principalmente la enfermedad, mientras que en el modelo inducido por toxinas, desmielinizante y procesos remielinizantes son predominantes. Para los ensayos preclínicos de fármacos potenciales para el tratamiento de la EM, al menos tres modelos, un modelo inducido por toxinas, una EAE de recaída-remisión y una EAE progresiva primaria o un modelo inducida por virus debe ser utilizado para verificar la eficacia del fármaco.

El modelo de EAE la describióe puede utilizarse para adquirir más información sobre el mecanismo del desarrollo del proceso de la enfermedad similar a la EM, la identificación de los conductores celulares clave de la enfermedad, tales como las células B 43,44 Th1, Th17 y. Cuanto mejor sea la comprensión de los procesos inflamatorios e inmunológicos implicados en el desarrollo de la EM y de los procesos que promueven y resolver las lesiones, lo más probable es que las nuevas estrategias de tratamiento pueden ser desarrollados.

Sin embargo, el modelo de EAE se describe aquí solamente tiene algunas características en común con la EM, y cuenta con algunas diferencias claras de la enfermedad humana. La diferencia más prominente es que los pacientes con EM varían ampliamente en presentación de la enfermedad, que no se reproduce en el modelo de EAE. Esto puede ser debido a diferentes patrones de lesión en los pacientes con EM y ratones de EAE y al hecho de que los ratones que son cepas puras. En los ratones con EAE, lesiones homogéneos son más prominentes en la médula espinal, mientras que en los pacientes con EM, principalmente lesiones heterogéneos sonencontrado en el cerebro 45,46. Por otra parte, la EM y la EAE comparten la contribución esencial de las células Th1 y Th17 por su desarrollo, pero a diferencia de MS, linfocitos T CD8 + desempeñan un papel de menor importancia en la patología de EAE 33. En conclusión, el modelo de EAE se centra principalmente en los efectos combinados de la autoinmunidad, procesos inflamatorios, y la neurodegeneración mientras que los procesos desmielinizantes son menos susceptibles de evaluación selectiva. Por lo tanto, otros modelos animales tales como el modelo cuprizone se pueden utilizar para el estudio distinto de desmielinizante procesa 47. El modelo de EAE es imperfecta, pero, sin embargo, un modelo útil de la MS 33.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
ABI Prism 7500 Sequence Detection System  Applied Biosystems, Austin, USA quantitative PCR system
Accutase Sigma Aldrich Munich, Germany A6964 cell detachment solution
CD3-PE-CF594 BD, Heidelberg, Germany 562286
CD4-V500 BD, Heidelberg, Germany 560782
CD8-eFluor650 eBioscience, Frankfurt, Germany 95-0081-42
CD11b-eFluor605 eBioscience, Frankfurt, Germany 93-0112-42
CD11c-AlexaFluor700 BD, Heidelberg, Germany 560583
CD19-APC-H7  BD, Heidelberg, Germany 560143
CD45-Vioblue  Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany 130-092-910
CompBeads BD, Heidelberg, Germany 552843 compensation beads
Collagenase A Sigma Aldrich Munich, Germany C0130
Cytometric absolute count standard  Polyscience, Eppelheim, Germany BLI-580-10
Cytometer Setup and Tracking beads  BD, Heidelberg, Germany 642412
DNase I Sigma Aldrich Munich, Germany D5025
EAE Kit Hooke Laboratories, Lawrence, USA EK2110
F4/80-PE-Cy7  BioLegend, Fell, Germany 123114
First Strand cDNA-Synthesis kit  Thermo Scientific, Schwerte, Germany K1612
Fc receptor-1 blocking buffer  Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany 130-092-575
Flow cytometric absolute count standard Polyscience, Eppelheim, Germany 580
FlowJo software v10  Treestar, Ashland, USA flow cytometry software
LSRII/Fortessa  BD, Heidelberg, Germany flow cytometer
Ly6G-APC-Cy7  BD, Heidelberg, Germany 560600
Lysing solution  BD, Heidelberg, Germany 349202
Maxima SYBR Green  Thermo Scientific, Schwerte, Germany K0221 fluorescent DNA binding dye 
RNeasy Mini Kit  Qiagen, Hilden, Germany 74104 RNA extraction kit

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