Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

التصور الأوعية الدموية ومتني التجديد بعد استئصال الكبد الجزئي 70٪ في الفئران العادية

doi: 10.3791/53935 Published: September 13, 2016

Abstract

تم استخدام الإجراء حقن السيليكون تعديل لرؤية الشجرة الوعائية الكبدية. هذا الإجراء يتكون من حقن في الجسم الحي من مجمع سيليكون، عبر 26 G القسطرة، في المدخل أو الوريد الكبدي. بعد حقن السيليكون، وexplanted الأجهزة وأعد ل-CT الدقيقة (μCT) مسح السابقين فيفو. الإجراء حقن السيليكون يمثل تحديا تقنيا. تحقيق نتيجة ناجحة يتطلب خبرة المجهرية واسعة من الجراح. واحدة من التحديات التي تواجه هذا الإجراء ينطوي على تحديد سعر نضح الكافي لمركب السيليكون. معدل نضح لمركب السيليكون يحتاج إلى تعريف يستند إلى الدورة الدموية للنظام الأوعية الدموية في المصالح. معدل نضح غير لائق يمكن أن يؤدي إلى نضح غير مكتمل، تمدد الاصطناعي وتمزق الأشجار الأوعية الدموية.

واستند إعادة الإعمار 3D للنظام الأوعية الدموية في الأشعة المقطعية وتحقيقه باستخدامبرنامج ما قبل السريرية مثل HepaVision. نوعية الشجرة الوعائية التي أعيد بناؤها له علاقة مباشرة بنوعية نضح السيليكون. حسبت المعلمات الأوعية الدموية حسابها لاحقا إرشادية للنمو الأوعية الدموية، مثل إجمالي حجم الأوعية الدموية، استنادا إلى إعادة ترميم الأوعية الدموية. المتناقضة الشجرة الوعائية مع سيليكون يسمح لاحق النسيجي متابعة العمل من العينة بعد μCT المسح. العينة يمكن أن تخضع لباجتزاء المسلسل، والتحليل النسيجي وكله مسح الشرائح، وبعد ذلك لإعادة الإعمار 3D من الأشجار الأوعية الدموية على أساس الصور النسيجية. هذا هو الشرط الأساسي للكشف عن الأحداث الجزيئية وتوزيعها فيما يتعلق الشجرة الوعائية. ويمكن أيضا أن هذا الإجراء حقن السيليكون تعديل استخدامها لتصور وإعادة بناء أنظمة الأوعية الدموية من الأجهزة الأخرى. هذه التقنية لديها القدرة على أن تطبق على نطاق واسع في الدراسات المتعلقة تشريح الأوعية الدموية والنمو في مختلف حيوانالثاني نماذج المرض.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وغالبا ما يحدد الكبد تجديد عن طريق قياس زيادة الوزن الكبد والحجم، من خلال تقييم معدل انتشار الكبدية 16. ومع ذلك، وتجديد الكبد تحملها ليس فقط تجديد متني ولكن أيضا تجديد الأوعية الدموية 6. ولذلك، ينبغي مواصلة التحقيق في نمو الأوعية الدموية فيما يتعلق بدورها في تطور تجديد الكبد. تصور من الأوعية الدموية الكبدية أمر بالغ الأهمية لتعزيز فهمنا لتجديد الأوعية الدموية. وقد وضعت وسائل غير مباشرة عديدة لدراسة الآليات الجزيئية الكامنة وراء تجديد الأوعية الدموية الكبدية. تقليديا، والكشف عن السيتوكينات (عامل النمو البطاني الوعائي، VEGF) 14، كانت كيموكينات ومستقبلاتها (CXCR4 / CXCR7 / CXCL12) 4 الدعامة الأساسية لدراسة تجديد الأوعية الدموية. ومع ذلك، فإن نموذج 3D جنبا إلى جنب مع التحليل الكمي من الأوعية الدموية إضافة التشريحية الحرجةالمعلومات للحصول على فهم أفضل للعلاقة هامة بين متني كبدي وتجديد الأوعية الدموية.

لتصور الأوعية الدموية الكبدية، الأمر الذي يتطلب المتناقضة الأشجار الأوعية الدموية، تم حقن الفئران مع وكيل النقيض من مطاط السيليكون ظليل للأشعة مباشرة إلى البوابة أو الكبد شجرة الأوعية الدموية الوريدية. بعد البلمرة من السيليكون وexplantation من الجهاز، تعرض عينات الكبد لμCT المسح الضوئي باستخدام ماسح التصوير المقطعي. وأسفرت عمليات المسح في تمثيل صورة فوكسل من السيليكون حقن عينات 9.

لمراقبة الجودة، وتصور نظام الأوعية الدموية لأول مرة في 3D باستخدام برنامج ما قبل السريرية. تم تنفيذ التقسيم من خلال تحديد عتبة بين كثافة الأنسجة اللينة وكثافة السفينة. وقد تصور قناع سفينة الناتجة باستخدام جعل السطح. يسمح البرنامج أيضا لتحديد اليدوي للمعلمتين من vasculنمو AR: طول السفينة القصوى ونصف قطرها.

ثم استخدام برنامج ما قبل السريرية لإعادة الإعمار 3D من الأشجار الأوعية الدموية وحساب لاحق من توريد أو تجفيف الأراضي الوعائية 13. وبالإضافة إلى ذلك، وهذا البرنامج تحدد تلقائيا المعلمات معينة من نمو الأوعية الدموية، مثل الطول الإجمالي لجميع الهياكل الأوعية الدموية مرئية المعروف أيضا باسم مجموع طول حافة أو إجمالي حجم السفينة.

تم تنفيذ الإجراء سيليكون نضح في الفئران ساذجة وفي الفئران التي خضعت 70٪ استئصال الكبد الجزئي (PH). تم جمع كبد في مختلف نقاط وقت الملاحظة بعد الاستئصال الجزئي لتحليل الأوعية الدموية ومتني تجديد الكبد باستخدام التصور وتقدير التقنية المذكورة آنفا.

الأهداف الرئيسية لهذا الفيلم هي: (1) إظهار الحساسة حقن التقنية اللازمة لتحقيق المتناقضة الأمثل و(2) عرض محتمل الاب الفوائد الناتجة عن ذلكام تحليلا مفصلا للعينة الناتجة باستخدام μCT وأقسام مسلسل النسيجية. بعد مشاهدة هذا الفيلم، يجب أن يكون القارئ على فهم أفضل لكيفية حقن مركب السيليكون في نظام الأوعية الدموية محددة وللفائدة وتطبيق هذه التقنية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وقد تمت الموافقة على الإجراءات التي تجرى على الحيوانات التي كتبها THÜRINGER Landesamt FÜR Verbraucherschutz أبتيلونغ Tiergesundheit اوند Tierschutz، ألمانيا. لأنه تصور الجهاز الوريدي البابي بشكل منفصل عن الجهاز الوريدي الكبدي، هناك حاجة الحيوانات منفصلة للأشجار الأوعية الدموية المختلفة.

1. الكواشف إعداد

  1. حل الهيبارين المالحة
    1. إضافة 0.1 مل الهيبارين إلى 10 مل المالحة (5 وحدة دولية / مل).
  2. سيليكون خليط مركب
    1. إضافة 2 مل MV-120 في واحد أنبوب 5 مل. تمييع MV-120 وذلك بإضافة 3 مل MV مخفف مما أدى إلى حل 40٪.

2. البوابة ريدي نظام سيليكون حقن

  1. البطن
    1. ضع الماوس في غرفة تحريض التخدير وتخدير مع 2٪ الأيزوفلورين و 0.3 لتر / دقيقة الأكسجين.
    2. إصلاح الماوس مخدرة على طاولة العمليات باستخدام الشريط مع استنشاق المتواصل من 2٪ هيoflurane و 0.3 لتر / دقيقة الأكسجين. تحقق من أخمص القدمين قرصة الانسحاب المنعكس من الفأرة والبدء في عملية إذا كان رد الفعل غائب.
    3. جعل شق عرضي على البطن باستخدام مقص لطبقة الجلد ومخثار الكهربائية للطبقة العضلات. خروج الأمعاء إلى الجانب الأيسر باستخدام نصائح القطن، وتغطي الأمعاء بمحلول ملحي غارقة الشاش.
  2. القسطرة الإدراج
    1. تشريح الوريد البابي تحت المجهر باستخدام ملقط-الصغيرة. مكان واحد 6-0 خياطة الحرير تحت الوريد البابي خارج الكبد، في حوالي مسافة 1 ملم إلى التشعب وادراك التعادل فضفاضة لاستخدامها لاحقا.
    2. حقن استعداد حل الهيبارين المالحة عبر القضيب الوريد (الذكور) أو الوريد الأجوف السفلي (أنثى) لتنقص النظامية لمدة 5 دقائق.
    3. إدراج عيار 26 (26 G) القسطرة مع إبرة في الوريد البابي واصلاحها مع المشبك
  3. من الهيبارين المالحة حل ومجمع سيليكون نضح
    1. الحمل الهيبارين المالحة سولution في 5 مل حقنة وتشغيل جهاز نضح. ملء القسطرة تماما مع الحل الهيبارين المالحة لتجنب فقاعات الهواء.
    2. وربط أنبوب تمديد لالقسطرة ومعالجتها بإحكام. بدء نضح من الهيبارين المالحة مع معدل نضح من 0.4 مل / دقيقة.
    3. Ligate وضعت قبل خياطة 6-0 الحرير لتحديد ضعف القسطرة ومنع تدفق الدم من الوريد الطحال والوريد المساريقي. Euthanatize الماوس عن طريق استنزاف عن طريق نضح تحت التخدير.
    4. شطف الكبد باستخدام المياه المالحة أثناء إجراء نضح كله من أجل إبقائها رطبة.
    5. إضافة 0.1 مل كيل علاج في أنبوب MV-120. تغيير حقنة الهيبارين المالحة إلى حقنة سيليكون.
    6. بدء نضح سيليكون مع معدل نضح من 0.2 مل / دقيقة لحوالي 1 دقيقة لتعبئتها بشكل مسبق نظام القسطرة وملء النظام الوريد البابي. وقف نضح سيليكون عندما السفن على سطح بدوره الزرقاء.
  4. أخذ العينات
    1. حفاظ على الكبد في الموقع الاتحاد الوطني للعمالايل بلمرة سيليكون تماما بعد حوالي 15 إلى 30 دقيقة. تشريح الأربطة التي تربط الكبد والأعضاء المجاورة بعناية للحفاظ على الكبد سليمة. يزدرع الكبد ووضعها في الفورمالين لتثبيت.

3. الوريدي الكبدي نظام سيليكون حقن

  1. أداء البطن كما يؤديها في الخطوة 2.1 و فضح مجال المنطوق تماما.
  2. القسطرة الإدراج
    1. تشريح الوريد البابي تحت المجهر باستخدام ملقط-الصغيرة. مكان واحد 6-0 خياطة الحرير تحت الوريد البابي خارج الكبد، في حوالي مسافة 1 ملم إلى التشعب وادراك التعادل فضفاضة لاستخدامها لاحقا.
    2. حقن استعداد حل الهيبارين المالحة عبر القضيب الوريد (الذكور) أو الوريد الأجوف السفلي (أنثى) لتنقص النظامية لمدة 5 دقائق.
    3. إدراج واحد 26 G القسطرة (قسطرة 1) مع إبرة في الوريد البابي واصلاحها مع المشبك. إدراج G القسطرة آخر 26 (قسطرة 2) مع إبرة في الوريد الأجوف السفلي واصلاحها مع المشبك.
    4. Ligate فروع الأجوف السفلي الوريد (بما في ذلك الأوردة الكلوية اليمنى واليسرى) ونهايته البعيدة باستخدام 6-0 الاصطناعية، وحيدة، غير ممتص البولي بروبلين خياطة.
  3. من الهيبارين المالحة حل ومجمع سيليكون نضح
    1. تحميل حل الهيبارين المالحة في 5 مل حقنة وتشغيل جهاز نضح. ملء القسطرة 1 تماما مع حل الهيبارين المالحة لتجنب فقاعات الهواء. وربط أنبوب تمديد قسطرة 1 واصلاحها بإحكام. بدء نضح من الهيبارين المالحة بمعدل 0.4 مل / دقيقة.
    2. Ligate وضعت قبل خياطة 6-0 الحرير لتحديد ضعف القسطرة ومنع تدفق الدم من الوريد الطحال والوريد المساريقي. Euthanatize الماوس عن طريق استنزاف عن طريق نضح تحت التخدير.
    3. شطف الكبد باستخدام المياه المالحة أثناء إجراء نضح كله من أجل إبقائها رطبة. إضافة 0.1 مل كيل علاج في أنبوب MV-120. صرف الهيبارين مالحة المحاقن مع حقنة سيليكون.
    4. وضع المشبك على suprahepatجيم الوريد الأجوف لعرقلة تدفق الكبد.
    5. قم بتوصيل أنبوب تمديد لقثطار 2 والبدء نضح سيليكون مع معدل نضح من 0.2 مل / دقيقة لحوالي 2 دقيقة للوصول إلى حجم الأوعية الدموية الكبدية موضوعي كما ذكرت. وقف نضح سيليكون عندما السفن على سطح بدوره الزرقاء.
  4. أخذ العينات
    1. تشريح الأربطة الكبدية تجنب أي ضرر للكبد. يزدرع الكبد ووضعها في الفورمالين لتثبيت.

4. مايكرو-CT (μCT) الضوئي

لفحص عينة الكبد explanted باستخدام μCT، وهناك حاجة إلى خطوات التالية.

  1. أخذ عينة الكبد من الحل التثبيت. وضع الكبد على السرير μCT. وضع السرير μCT مع عينة الكبد في μCT.
  2. الحصول topogram قبل بدء عملية الفحص. استخدام subscan واحد للعينة الكبد الصغيرة واثنين subscans لعينات كبيرة.
  3. اختر81، بروتوكول CT مع دقة عالية (على سبيل المثال، HQD-6565-390-90). هذا البروتوكول يكتسب 720 التوقعات مع 1032 س 1012 بكسل أثناء دوران واحد كامل مع الوقت المسح من 90 ثانية في شبه المسح الضوئي. بدء المسح الضوئي μCT.

5. أقسام المسلسل النسيجية

  1. تضمين عينة الكبد في البارافين ككل بعد μCT المسح. قطع عينة البارافين كلها إلى أقسام 4μm، مما أدى إلى سلسلة من 2000 إلى 2500 أقسام.
  2. أقسام وصمة عار مع تقنية تلطيخ المناسبة لتصور الأحداث الجزيئية ذات الأهمية مثل كي-67 كعلامة انتشار وHMGB1 كعلامة من الضرر الدماغية. تحديد تسلسل تلطيخ فيما يتعلق مسألة علمية.
  3. استخدام الماسح الضوئي الشرائح كله إلى ترقيم المقاطع الملون.
  4. أداء 3D-إعادة بناء شجرة الأوعية الدموية (ق) (مجدية بالفعل) وتصور 3D-توزيع الأحداث الجزيئية فيما يتعلق الشجرة الوعائية (البحوث في التقدم).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

معايير الجودة

نوعية حقن السيليكون يمكن الحكم بالعين المجردة أثناء العملية. سفن صغيرة على سطح الكبد تملأ تدريجيا مع مجمع الأزرق. إذا لوحظ بنية الأوعية الدموية طبيعية على سطح الكبد، ونوعية حقن السيليكون والمطاط كانت جيدة. إذا كان حجم نضح كافية، والسفن الصغيرة على سطح الكبد لم تملأ تماما. في المقابل، عبر ملء تسبب تمزق الأوعية الدموية كما يتبين من بقع زرقاء غير النظامية على سطح الجهاز. كلاهما يسبب صعوبات عند 3D إعادة الإعمار جعل في نهاية المطاف إجراء فشل.

لتقييم أفضل للجودة حقن، تم إجراء مسح μCT تليها إعادة بناء الأوعية الدموية 3D باستخدام برنامج ما قبل السريرية. تم تحديد الحقن ليكون ملحق ناجحأون تجزئة أسفرت عن التصور من شجرة الأوعية الدموية كاملة سليمة من دون هياكل تمزق أشار تسرب مرئية. إذا ظهرت الشجرة الوعائية غير مكتملة (الشكل 1A)، وبلغ حجم نضح كافية. إذا ظهرت أكثر من شجرة الأوعية الدموية أو كان ينظر تسرب (الشكل 1B)، وبلغ حجم نضح أو ضغط غير كاف. كان هذا هو السبب الأكثر احتمالا للفشل. ضغط التروية يمكن أن تختلف من الناحية النظرية قليلا اعتمادا على اللزوجة من الحل. اللزوجة تعتمد على الوقت البلمرة المنقضي بين خلط المجمع والحقن في الأوعية الدموية. منذ مطلوب بعض التلاعب لخلط والحقن، ويمكن أن الفاصل الزمني تختلف قليلا بين 3 دقائق إلى 5 دقائق.

إذا كان هذا الحل هو من اللزوجة المنخفضة، والضغط نضح منخفض. في هذه الحالة يمكن للمجمع نقل إلى شجرة غير حقن الأوعية الدموية عن طريق نظام الجيبيةمما يؤدي إلى وحدة تخزين نضح أعلى قليلا. إذا كان هذا الحل هو بلمرة أخرى مما يؤدي إلى لزوجة أعلى، فإن ضغط التروية يرتفع، مما تسبب في تعطل السفن والتسرب.

تحديد الهدف حجم الإرواء

منذ عدم كفاية التروية أو hyperperfusion من شأنها أن تسبب فشل الحقن، وتوحيد اعتبر حجم نضح. كما ذكرت وتحتل 6٪ من حجم الكبد عن طريق الدم و 44٪ من الدم في الكبد موجود في الأوعية الكبيرة (على سبيل المثال، الشريان الكبدي، الوريد البابي). حجم الكبد في الفئران حوالي 1.3 مل 11. وبالتالي، فقد بلغ حجم الأوعية الدموية في الجهاز الوريدي البابي في الفئران العادية تتراوح بين 0.03 مل و 0.04 مل. تم تعيين معدل التدفق إلى 0.2 مل / دقيقة، ونضح إجمالي وقت كان من المقرر أن ما يقرب من 1 دقيقة مما أدى إلى ما مجموعه حقن حجمحوالي 0.2 مل.

هناك حاجة إلى هذا الحجم الكبير على ما يبدو، منذ يجب بريفيليد نظام القسطرة، والتي تستغرق حوالي 0،1 حتي 0،15 مل. هناك حاجة إلى حجم إضافي من 0.05 مل لملء الوريد البابي الداني بين نقير الكبد وربط القسطرة. معدل التدفق للحقن الوريد الكبدي كان من المقرر أيضا إلى 0.2 مل / دقيقة ولكن كان لفترات طويلة إجمالي وقت نضح إلى 2 دقيقة، مما أدى إلى الحجم الكلي أعلى من 0.4 مل. وكان من المفترض إجمالي حجم الأوعية الدموية داخل الكبد لتكون مشابهة إلى إجمالي حجم الأوعية الدموية الوريد البابي. ومع ذلك، يحتاج حجم لملء الوريد الأجوف داخل الكبد بين ربط infrahepatic وقدرت المشبك فوق الكبد مع 0.2 مل.

معدل النجاح

وتعرض ما مجموعه 49 حيوانات لحقن سيليكون: 22 الحيوانات في نظام PV و 27 الحيوانات في النظام HV ه. وكان لدينا نسبة نجاح الحقن 55٪ (12/22) في المجموعة PV و 89٪ (24/27) في مجموعة HV. مع الأخذ بعين الاعتبار أن تم استخدام مجموعة PV لتأسيس تقنية حقن السيليكون في بداية (ن = 4)، ينبغي أن تكون نسبة نجاح الحقن لنظام الكهروضوئية بشكل فعال أعلى من 55٪. ومع ذلك، كانت الصور μCT تم الحصول عليها من هذه الحقن مناسبة لإعادة الإعمار 3D والتحليل الكمي. بالإضافة إلى ذلك، يمكن بناؤها الأشجار الأوعية الدموية من أي PV أو HV من 36 الفئران مع البرنامج Imalytics ما قبل السريرية.

متني وتجديد الأوعية الدموية

زمن حل μCT سلسلة من عينات من كبد الفئران بعد تعرض استئصال الكبد إلى تحليل نوعي. متني تجديد يتألف من النمو 3D الكبد بقايا. وقد عرفت تجديد الأوعية الدموية في الانسجة التي يتم عرضها زيادة فيطول وقطر الساق الأوعية الدموية، مع الفروع الرئيسية وثمرة من فروع محطة إضافية في كل من الوريدي البابي وشجرة وريدية كبدية.

حاليا، العديد من المعلمات الكمية المناسبة لوصف نمو الأوعية الدموية والعلاقة بين تجديد متني كبدي وتجديد الأوعية الدموية هي قيد التحقيق. تشمل هذه المؤشرات تدل على نمو الأوعية الدموية، بما في ذلك طول الأوعية الدموية القصوى (الشكل 2)، دائرة نصف قطرها الأوعية الدموية والأوعية الدموية كثافة من حيث مجموع الأوعية الدموية طول / حجم الكبد أو الأوعية الدموية حجم حجم / الكبد.

تم حساب إجمالي حجم الكبد وحجم فصوص الكبد المحدد. في كبد طبيعية، تراوح إجمالي حجم الكبد من 1.2 مل إلى 1.6 مل (ن = 6، بما في ذلك مجموعة PV ومجموعة HV). وانخفضت إلى 0،6-0،7 مل بعد إجراء عملية استئصال الكبد بمد عن طريق إزالة اليسار اللاتاألطراف والفص المتوسط. ارتفع حجم الكبد بشكل مستمر أثناء نمو الكبد. بعد يوم بعد العملية 7 (POD 7)، زاد حجم الكبد إلى ما يقرب من 88٪ من حجمها الأصلي، أي بنسبة 2.6 أضعاف. زيادة حجم الكبد على ارتباط مع استعادة وزن الكبد.

تم احتساب إجمالي حجم الأوعية الدموية للنظام الكهروضوئية ونظام HV. وكان إجمالي حجم الأوعية الدموية للنظام HV أعلى مما كانت عليه في الأنظمة الكهروضوئية، لأنه أدرج جزء من داخل الكبد الوريد الأجوف السفلي. تراوح إجمالي حجم الأوعية الدموية من الأنظمة الكهروضوئية 0،05-0،08 مل في الفئران العادية. وانخفضت إلى 0،03-0،04 مل بعد استئصال الكبد الجزئي 70٪. بواسطة POD 7، ارتفع اجمالي حجم الأوعية الدموية في الكبد بقايا إلى 100٪ من حجم الأصلي. تراوح إجمالي حجم الأوعية الدموية HV 0،14-0،16 مل. وانخفض حجم الأوعية الدموية ل0،08-0،09 مل بعد استئصال. ضمن الاسبوع الاول بعد العملية الجراحية، زاد حجم الأوعية الدموية الكلي للكبد بقايا بذ 94٪ من القيمة الأصلية.

كما أن العلاقة بين النتائج، وزيادة في حجم الأوعية الدموية وحجم متني، تم حساب كثافة الأوعية الدموية على نحو أدق نسبة حجم الأوعية الدموية (حجم الأوعية الدموية مقسوما على حجم الكبد). وكشف هذا أن الأوعية الدموية حجم جزء ظلت مستقرة نسبيا طوال عملية التجدد.

التصور 3D من الأحداث الجزيئية

بعد مسح CT العينات المختارة تعرضوا لباجتزاء المسلسل، والرضوخ ليصل إلى 2000 الشرائح، التي كانت رقمنة بالكامل واستخدامها لإعادة بناء البوابة وكذلك شجرة الوريدية الكبدية 12. هذا هو الشرط الأساسي ل3D التصور المستقبلي للأحداث الجزيئية خلال تجديد فيما يتعلق الشجرة الوعائية المتزايدة.

الشكل 1. مراقبة الجودة من حقن السيليكون. وتصور A. الملء غير كاملة الصحيح الوريد البابي السفلي (السهم في اليسار) والوريد المذنبة البوابة (السهم في اليمين) في برنامج Imalytics ما قبل السريرية كما انقطاعات الشجرة الوعائية. وهذا يشير إلى ضغط التروية أو نضح حجم غير كافية أو وجود فقاعات الهواء. ب. وقد تصور التسرب من الصحيح الوريد البابي السفلي الذي أشار إلى تعطل سفينة بسبب الضغوط غير كافية أو hyperperfusion. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. قياس طول سفينة القصوى من الحقأدنى الوريد البابي. لتحديد طول السفينة القصوى، وضعت واحدة نقطة بداية ونقطة نهاية واحدة في جذور والنهاية البعيدة من الصحيح الوريد البابي السفلي (RIPV) من قناع الأوعية الدموية (الأزرق والأرجواني علامات الكرة) في برنامج ما قبل السريرية. تم الحصول على طول المسار الأوعية الدموية في RIPV (10.95 ملم) كجزء من تقييم "مسار تعرج". يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

المتناقضة الشجرة الوعائية عن طريق الحقن سيليكون وμCT المسح تم تقديمها في نماذج ورم ونماذج الأمراض العصبية في كثير من الأحيان لدراسة تطور عائية 5،7،8،10. تم إجراء تحسينات في منهجية حقن السيليكون في هذه الدراسة لتصور وقياس نمو الأوعية الدموية بعد استئصال الكبد الجزئي في الفئران.

وهناك عدد من الخطوات الحاسمة التي تحتاج الى اهتمام لتحقيق الجودة نضح جيدة. أولا وقبل كل شيء، تنقص النظامية ينصح بشدة قبل التنظيف الكبد مع الهيبارين أو المالحة لتجنب تجلط الدم داخل الكبد. القضاء على فقاعات الهواء من الأنابيب مهم أيضا لتحقيق نوعية جيدة من نضح السيليكون. تحديد معدل نضح والضغط يجب أولا أن يستند المعلمات الدورة الدموية الفسيولوجية 17. يعكس مرة نضح إجمالي كمية حقن ويتم تقدير تتخذ داخل الأوعية المتوقعحجم وحجم prefilling من نظام القسطرة في الاعتبار.

سيليكون هو مركب عالية اللزوجة الذي يختلف عن الدم أو المالحة. لذلك، هناك حاجة إلى العديد من التجارب لضبط معدل نضح والضغط. الحفاظ على معدل تدفق الحقن المستمر والضغط ضروري لمنع تمدد شديد أو حتى تمزق الأوعية الصغيرة. تم تعيين وقت التروية وفقا لحجم الحقن اللازمة المقدرة. ومع ذلك، يجب أن تتوقف على الفور نضح عندما يصبح مجمع الزرقاء واضحة في السفن على سطح الكبد. خلاف ذلك، يمكن للسيليكون تصب الجيوب وإلى الأوعية الدموية أخرى من شأنها أن تتداخل مع إعادة الإعمار وتحليلها لاحقا.

عادة، يتم perfused السيليكون بشكل منتظم عبر البطين الأيسر في معظم التقارير المنشورة 1،3،15. البطين الأيسر من السهل فضح لتمكين الوصول المجاني إلى موقع الحقن. ومع ذلك، فإن العيب هو أن هذا الطريق هو راذر غير مباشر لأن عامل تباين ديه للخضوع لتداول قبل الوصول إلى الموقع من الفائدة. لذلك، تم تعديل الإجراء الجراحي لتقنية حقن السيليكون في هذه الدراسة. وعلى النقيض من الطريق غير المباشر اختيار كثيرا من تطبيق يقوم بها آخرون، تم حقن السيليكون المركب مباشرة في الأوعية الدموية في المصالح، بدلا من المتناقضة الجسم كله. في هذا الطريق، وسرعة وحجم نضح يمكن التحكم بشكل أفضل. الجهاز الوريدي البابي وأنظمة الوريدية الكبدية يمكن perfused وأعيد بناؤها على حدة لتحليل الفردي في وقت لاحق، كما هو موضح في الفيديو.

الحد من هذا الإجراء المعدل هو صعوبة التقنية. ومن تحديا لإجراء حقن intraportal باستخدام مركبات عالية اللزوجة في الفئران بنجاح، لأن بنية الأوعية الدموية غير حساسة جدا. فمن السهل بدلا لتدمير السفن أثناء العملية. وهكذا، بوابة تشريح الوريد وINSE قسطرةrtion يجب أن يتم تنفيذ بلطف.

المتناقضة من الأشجار الأوعية الدموية والتصوير μCT لاحق من كبد explanted هو أداة مفيدة لتصور وقياس تجديد الأوعية الدموية بعد استئصال الكبد الجزئي. ويمكن استخدام المعلمات الأوعية الدموية الكمية لفهم أفضل للحركية النمو الوعائي في تطور تجديد الكبد. وعلاوة على ذلك، 3D إعادة بناء النظامين الأوعية الدموية الكبدية على أساس مسلسل أقسام ممكن من الناحية التقنية، وإن كان ذلك يمثل عبء العمل الهائل.

هذه التقنية يمكن تطبيقها في نماذج متعددة حيث التصور النوعي والكمي لنمو الأوعية الدموية هو المهم. وعلاوة على ذلك، 3D التصور من الأحداث الجزيئية فيما يتعلق الشجرة الوعائية الأساسية هي في متناول اليد. أمثلة من الأحداث الجزيئية من الفائدة يمكن أن يكون الكشف عن علامة انتشار مثل كي-67 أو علامات التلف الدماغية مثل HMGB1. تقييم إف الجزيئي حل مكانياالوالدان في المنطقة المجاورة للشجرة الأوعية الدموية وتجديد داخل لحمة الكبد تجديد هو شرط أساسي للمتقدم متعدد النطاقات النمذجة بيولوجيا الأنظمة. هذه التقنية حقن السيليكون هو خطوة تجريبية واحدة نحو تحقيق هذا الهدف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PERFUSOR® VI B.BRAUN 87 222/0
Pipetus®-akku Hirschmann 9907200
Pipets Greiner 606180
micro scissors Fine Science Tools (F·S·L) No. 14058-09
micro serrefine Fine Science Tools (F·S·L) No.18055-05
Micro clamps applicator Fine Science Tools (F·S·L) No. 18057-14
Straight micro forceps Fine Science Tools (F·S·L) No. 00632-11
Curved micro forceps Fine Science Tools (F·S·L) No. 00649-11
needle-holder Fine Science Tools (F·S·L) No. 12061-01
1 ml syringe B.Braun 9161406V
5 ml syringe B.Braun 4606051V
extension and connection lines B.Braun 4256000 30 cm, inner ø 1.2 mm
6-0 silk (Perma-Hand Seide) Ethicon 639H
6-0 prolene Ethicon 8711H
Microfil® MV diluent FLOW TECH, INC
Microfil® MV - 120 FLOW TECH, INC MV - 120 (blue)
MV curing agent FLOW TECH, INC
Heparin 2500 I.E./5 ml Rotexmedica ETI3L318-15
Saline Fresenius Kabi Deutschland GmbH E15117/D DE
Imalytics Preclinical software Experimental Molecular Imaging, RWTH Aachen University, Germany
HepaVision Fraunhofer MEVIS, Bremen, Germany
NanoZoomer 2.0-HT Digital slide scanner Hamamatsu Electronic Press, Japan  C9600
Tomoscope Duo CT  CT Imaging GmbH, Erlangen, Germany TomoScope® Synergy

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bearden, S. E., Segal, S. S. Neurovascular alignment in adult mouse skeletal muscles. Microcirculation. 12, (2), 161-167 (2005).
  2. Brown, R. P., Delp, M. D., Lindstedt, S. L., Rhomberg, L. R., Beliles, R. P. Physiological parameter values for physiologically based pharmacokinetic models. Toxicol.Ind.Health. 13, (4), 407-484 (1997).
  3. Dai, D., et al. Elastase-Induced Intracranial Dolichoectasia Model in Mice. Neurosurgery. (2015).
  4. Ding, B. S., et al. Inductive angiocrine signals from sinusoidal endothelium are required for liver regeneration. Nature. 468, (7321), 310-315 (2010).
  5. Downey, C. M., et al. Quantitative ex-vivo micro-computed tomographic imaging of blood vessels and necrotic regions within tumors. PLoS.One. 7, (7), 41685 (2012).
  6. Ehling, J., et al. CCL2-dependent infiltrating macrophages promote angiogenesis in progressive liver fibrosis. Gut. (2014).
  7. Ehling, J., et al. Micro-CT imaging of tumor angiogenesis: quantitative measures describing micromorphology and vascularization. Am.J.Pathol. 184, (2), 431-441 (2014).
  8. Ghanavati, S., Yu, L. X., Lerch, J. P., Sled, J. G. A perfusion procedure for imaging of the mouse cerebral vasculature by X-ray micro-CT. J.Neurosci.Methods. 221, 70-77 (2014).
  9. Gremse, F., et al. Hybrid microCT-FMT imaging and image analysis. J.Vis.Exp. (100), (2015).
  10. Jing, X. L., et al. Radiomorphometric quantitative analysis of vasculature utilizing micro-computed tomography and vessel perfusion in the murine mandible. Craniomaxillofac.Trauma Reconstr. 5, (4), 223-230 (2012).
  11. Melloul, E., et al. Small animal magnetic resonance imaging: an efficient tool to assess liver volume and intrahepatic vascular anatomy. J.Surg.Res. 187, (2), 458-465 (2014).
  12. Schwier, M., Bohler, T., Hahn, H. K., Dahmen, U., Dirsch, O. Registration of histological whole slide images guided by vessel structures. J.Pathol.Inform. 4, ((Suppl)), 10 (2013).
  13. Selle, D., Preim, B., Schenk, A., Peitgen, H. O. Analysis of vasculature for liver surgical planning. IEEE Trans.Med.Imaging. 21, (11), 1344-1357 (2002).
  14. Shergill, U., et al. Inhibition of of VEGF- and NO-dependent angiogenesis does not impair liver regeneration. Am.J.Physiol Regul.Integr.Comp Physiol. 298, (5), 1279-1287 (2010).
  15. Sueyoshi, R., Ralls, M. W., Teitelbaum, D. H. Glucagon-like peptide 2 increases efficacy of distraction enterogenesis. J.Surg.Res. 184, (1), 365-373 (2013).
  16. Wei, W., et al. Rodent models and imaging techniques to study liver regeneration. Eur.Surg.Res. 54, (3-4), 97-113 (2015).
  17. Xie, C., Wei, W., Zhang, T., Dirsch, O., Dahmen, U. Monitoring of systemic and hepatic hemodynamic parameters in mice. J.Vis.Exp. (92), e51955 (2014).
التصور الأوعية الدموية ومتني التجديد بعد استئصال الكبد الجزئي 70٪ في الفئران العادية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xie, C., Wei, W., Schenk, A., Schwen, L. O., Zafarnia, S., Schwier, M., Gremse, F., Jank, I., Dirsch, O., Dahmen, U. Visualization of Vascular and Parenchymal Regeneration after 70% Partial Hepatectomy in Normal Mice. J. Vis. Exp. (115), e53935, doi:10.3791/53935 (2016).More

Xie, C., Wei, W., Schenk, A., Schwen, L. O., Zafarnia, S., Schwier, M., Gremse, F., Jank, I., Dirsch, O., Dahmen, U. Visualization of Vascular and Parenchymal Regeneration after 70% Partial Hepatectomy in Normal Mice. J. Vis. Exp. (115), e53935, doi:10.3791/53935 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter