Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Visualisatie van vasculaire en Parenchymale Regeneratie na 70% Gedeeltelijke hepatectomy in normale muizen

doi: 10.3791/53935 Published: September 13, 2016

Abstract

Een gemodificeerde silicone injectieprocedure werd gebruikt voor visualisatie van de lever vaatstelsel. Deze bestond uit het in vivo injectie van de silicone verbinding, via een katheter 26 G, in het portaal of de vena hepatica. Na silicone injectie werden organen geëxplanteerd en voorbereid voor ex-vivo micro-CT (μCT) scannen. De siliconen injectie procedure is technisch uitdagend. Het bereiken van een succesvol resultaat vergt veel microchirurgische ervaring van de chirurg. Een van de uitdagingen van deze procedure houdt de bepaling van de adequate perfusiesnelheid de siliconenverbinding. De perfusiesnelheid van de silicone verbinding moet worden gedefinieerd op basis van de hemodynamische van het vaatstelsel van belang. Ongepast perfusie tarief kan leiden tot een onvolledige perfusie, kunstmatige dilatatie en scheuren van vasculaire bomen.

De 3D reconstructie van het vasculaire systeem is gebaseerd op CT-scans en werd bereikt met behulppreklinische software zoals HepaVision. De kwaliteit van de gereconstrueerde vasculaire boom is direct gerelateerd aan de kwaliteit van siliconen perfusie. Vervolgens berekende vasculaire parameters voor vasculaire groei, zoals vasculaire totale volume werd berekend op basis van de vasculaire reconstructies. Contrasterende de vasculaire boom met siliconen toegestaan ​​voor verdere histologische work-up van het monster na μCT scannen. Het monster kan worden onderworpen aan seriële snijden, histologische analyse en objectglaasje scannen en daarna 3D reconstructie van het vasculaire bomen op basis van histologische afbeeldingen. Dit is een voorwaarde voor de detectie van moleculaire gebeurtenissen en hun verdeling met betrekking tot het vaatstelsel. Deze gemodificeerde siliconen injectieprocedure kan ook worden gebruikt voor het visualiseren en reconstrueren de vasculaire systemen van andere organen. Deze techniek heeft het potentieel uitgebreid worden toegepast op studies over vasculaire anatomie en groei van diverse dierlijke eenziektemodellen nd.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Leverregeneratie wordt vaak bepaald door de toename van de lever gewicht en volume en door beoordeling van de hepatocyt proliferatiesnelheid 16. Echter, wordt de lever regeneratie niet alleen inducerende parenchymale regeneratie, maar ook vasculaire regeneratie 6. Daarom moet de groei van vasculaire nader worden onderzocht met betrekking tot zijn rol in de progressie van leverregeneratie. Visualisatie van de lever vasculaire systeem is cruciaal voor het bevorderen van ons begrip van vasculaire regeneratie. Talrijke indirecte methoden ontwikkeld om de onderliggende moleculaire mechanismen van hepatische regeneratie vasculaire onderzoeken. Traditioneel detectie van cytokinen (vasculaire endotheliale groeifactor, VEGF) 14, chemokinen en hun receptoren (CXCR4 / CXCR7 / CXCL12) 4 zijn de steunpilaar voor het bestuderen van vasculaire regeneratie geweest. Echter, een 3D-model, met kwantitatieve analyse van de vasculatuur kritische anatomische toevoegenaan een beter begrip van de belangrijke relatie tussen parenchymale en vasculaire regeneratie krijgen.

Om de lever vasculaire systeem, dat vereist contrasterende het vasculaire bomen te visualiseren, werden muizen geïnjecteerd met een radiopake siliconenrubber contrastmiddel direct in de portal of leverinsufficiëntie veneuze vasculaire boom. Na polymerisatie van de silicone en uitname van het orgaan, werden de lever monsters onderworpen aan μCT scannen met een CT-scanner. De scans resulteerde in voxel afbeelding representaties van de siliconen-injectie specimens 9.

Voor kwaliteitscontrole, werd het vasculaire systeem voor het eerst gevisualiseerd in 3D met behulp van preklinische software. Segmentatie werd uitgevoerd door een drempel tussen het zachte weefsel intensiteit en de intensiteit vat. Het verkregen masker vat werd zichtbaar gemaakt met oppervlak rendering. De software werd ook rekening handmatig bepalen van twee parameters van Vascular groei: maximale scheepslengte en radius.

Een preklinische software werd vervolgens gebruikt voor 3D-reconstructie van vasculaire bomen en nacalculatie van de toe- of afvoer van vasculaire gebieden 13. Daarnaast is deze software automatisch bepaald aantal parameters van vasculaire groei, zoals de totale lengte van alle zichtbare vasculaire structuren ook bekend als de totale ribbe of totale verblijf.

De siliconen perfusie procedure werd uitgevoerd bij naïeve muizen en in muizen die onderging 70% gedeeltelijke hepatectomie (PH). Levers werden verzameld op verschillende observatie tijdstippen na resectie voor het analyseren van vasculaire en parenchymale leverregeneratie met behulp van de eerder genoemde visualisatie en kwantificering techniek.

De hoofddoelen van deze film zijn: (1) tonen de delicate injectie-techniek vereist om optimale contrasterende en (2) tonen de mogelijke voordelen verkregen fr verwezenlijkenOM een gedetailleerde analyse van de resulterende monster met behulp van μCT en histologische seriecoupes. Na het bekijken van deze film wordt de lezer een beter begrip van hoe siliconeverbinding injecteren in een specifieke vaatstelsel en het nut en de toepasbaarheid van de techniek hebben.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Procedures waarbij proefdieren zijn goedgekeurd door Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz Abteilung Tiergesundheit und Tierschutz, Duitsland. Omdat het portaal veneuze systeem los van de lever veneuze systeem werd gevisualiseerd, werden afzonderlijke dieren die nodig zijn voor de verschillende vasculaire bomen.

1. Reagentia Voorbereiding

  1. Heparine-zoutoplossing
    1. Voeg 0,1 ml héparine in 10 ml zoutoplossing (5 IU / ml).
  2. Silicone compound mengsel
    1. Voeg 2 ml MV-120 in een 5 ml buis. Verdun MV-120 door toevoeging van 3 ml MV verdunningsmiddel resulteert in een 40% oplossing.

2. Portal veneuze systeem Silicone Injection

  1. laparotomie
    1. Plaats de muis in de anesthesie inductie kamer en verdoven met 2% isofluraan en 0,3 l / min zuurstof.
    2. Bevestig de verdoofde muis op de operatietafel met behulp van tape met continue inademing van 2%oflurane en 0,3 l / min zuurstof. Controleer de toe-snuifje reflex terugtrekking van de muis en start de werking als de reflex afwezig is.
    3. Voeg een dwarse incisie op de buik met een schaar van de huidlaag en een elektrische coagulator de spierlaag. Beweeg de darmen naar de linkerkant met behulp van katoen tips en hebben betrekking op de darmen met een zoutoplossing gedrenkt gaasje.
  2. katheterinsertieplaatsen
    1. Ontleden poortader onder de microscoop met micro-pincet. Plaats een 6-0 zijden hechtdraad onder de ader extrahepatische portal, in ongeveer 1 mm afstand tot de splitsing en bind het losjes voor later gebruik.
    2. Injecteren bereid heparine-zoutoplossing via een ader van de penis (mannelijk) of inferior vena cava (vrouwelijke) voor systemisch heparinisatie gedurende 5 minuten.
    3. Steek de 26-gauge (26 G) katheter met een naald in de poortader en zet het vast met een klem
  3. Heparine-zoutoplossing en siliconen verbinding perfusie
    1. Load heparine-zoutoplossing solution in 5 ml spuit en zet perfusie apparaat. Vul het catheter volledig met heparine-zoutoplossing om luchtbellen te voorkomen.
    2. Sluit de allonge aan de katheter en strak ze op te lossen. Start heparine-zoutoplossing perfusie met een perfusie snelheid van 0,4 ml / min.
    3. Ligeer pre-geplaatste 6-0 zijden hechtdraad voor dubbele vaststelling van de katheter en het blokkeren van de bloedstroom van de milt ader en mesenteriale ader. Euthanatize de muis door verbloeding via perfusie onder verdoving.
    4. Spoel de lever via zoutoplossing gedurende de gehele perfusie procedure om het vochtig te houden.
    5. Voeg 0,1 ml verharder in de MV-120 buis. Veranderen heparine-zoutoplossing spuit siliconen spuit.
    6. Begin silicone perfusie perfusie met een snelheid van 0,2 ml / min gedurende ongeveer 1 min tot het kathetersysteem Prefill en de poortader installatie te vullen. Stop met silicone perfusie wanneer de schepen op het oppervlak blauw worden.
  4. monsterneming
    1. Houd de lever in situ until het silicone volledig na ongeveer 15 tot 30 minuten gepolymeriseerd. Ontleden ligamenten aansluiten van de lever en de aangrenzende organen met zorg aan de lever intact te houden. Explanteer de lever en zet het in formaline voor fixatie.

3. Verminderde veneuze systeem Silicone Injection

  1. Voer laparotomie zoals uitgevoerd in stap 2.1 en bloot operatiegebied volledig.
  2. katheterinsertieplaatsen
    1. Ontleden poortader onder de microscoop met micro-pincet. Plaats een 6-0 zijden hechtdraad onder de ader extrahepatische portal, in ongeveer 1 mm afstand tot de splitsing en bind het losjes voor later gebruik.
    2. Injecteren bereid heparine-zoutoplossing via een ader van de penis (mannelijk) of inferior vena cava (vrouwelijke) voor systemisch heparinisatie gedurende 5 minuten.
    3. Steek een 26 G catheter (catheter 1) met een naald in de poortader en zet het vast met een klem. Plaats een andere 26 G catheter (catheter 2) met de naald in de vena cava inferior en zet het vast met een klem.
    4. Afbinden de takken van de vena cava inferior (met inbegrip van links en rechts renale aderen) en het distale einde met behulp van 6-0 synthetisch, monofilament, niet-absorbeerbare polypropyleen hechtdraad.
  3. Heparine-zoutoplossing en siliconen verbinding perfusie
    1. Laad heparine-zoutoplossing in 5 ml spuit en zet perfusie apparaat. Vul catheter 1 compleet met heparine-zoutoplossing om luchtbellen te voorkomen. Sluit uitbreiding buis catheter 1 en zet het stevig vast. Start heparine-zoutoplossing perfusie met een snelheid van 0,4 ml / min.
    2. Ligeer pre-geplaatste 6-0 zijden hechtdraad voor dubbele vaststelling van de katheter en het blokkeren van de bloedstroom van de milt ader en mesenteriale ader. Euthanatize de muis door verbloeding via perfusie onder verdoving.
    3. Spoel de lever via zoutoplossing gedurende de gehele perfusie procedure om het vochtig te houden. Voeg 0,1 ml verharder in de MV-120 buis. Exchange heparine-zoutoplossing spuit met siliconen spuit.
    4. Plaats een klem op de suprahepatic inferior vena cava om de uitstroom van de lever belemmeren.
    5. Sluit de allonge aan katheter 2 en begin silicone perfusie met een perfusie snelheid van 0,2 ml / min gedurende ongeveer 2 minuten om een ​​objectieve levervaten volume te bereiken zoals gerapporteerd. Stop met silicone perfusie wanneer de schepen op het oppervlak blauw worden.
  4. monsterneming
    1. Ontleden lever ligamenten berokkende schade te voorkomen aan de lever. Explanteer de lever en zet het in formaline voor fixatie.

4. Micro-CT (μCT) Scannen

Om de geëxplanteerde lever monster scannen met behulp van μCT, zijn de volgende stappen die nodig zijn.

  1. Neem de lever monster uit de fixatie-oplossing. Plaats de lever op de μCT bed. Doe de μCT bed met de lever monster in de μCT.
  2. Verwerven topogram voor aanvang van de scan. Gebruik een subscan voor de kleine lever monster en twee subscans voor grote steekproeven.
  3. Selecteer een81, CT-protocol met een hoge resolutie (bijv HQD-6565-390-90). Dit protocol verwerft 720 projecties met 1032 x 1012 pixels bij een volledige omwenteling met de scantijd van 90 sec per sub-scan. Start de μCT scan.

5. Histologische seriecoupes

  1. Insluiten de lever model in paraffine als geheel na μCT scannen. Snijd hele paraffine monster in 4 pm secties, waardoor een reeks van 2000 tot 2500 delen.
  2. Vlek secties met de juiste kleuring techniek te visualiseren moleculaire gebeurtenissen van belang, zoals Ki-67 als proliferatie marker en HMGB1 als een marker van ischemische schade. Bepaal de volgorde van de kleuring in ten opzichte van de wetenschappelijke vraag.
  3. Gebruik een hele dia scanner om de gekleurde coupes digitaliseren.
  4. Voer 3D-reconstructie van vasculaire boom (s) (al haalbaar) en visualiseren 3D-verdeling van de moleculaire gebeurtenissen met betrekking tot vasculaire boom (onderzoek in uitvoering).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

kwaliteitscriteria

De kwaliteit van siliconen injectie kan worden beoordeeld met het blote oog tijdens de procedure. De kleine bloedvaten op het oppervlak van de lever te vullen geleidelijk aan met de blauwe verbinding. Als de normale vasculaire structuur werd waargenomen op het oppervlak lever, de siliconen rubber injectie kwaliteit was goed. Wanneer de perfusie volume onvoldoende was, werden de kleine bloedvaten op de lever oppervlak niet volledig gevuld. Daarentegen overvullen veroorzaakte vasculaire scheuren zoals aangegeven door onregelmatige blauwe vlekken op het oppervlak van het orgaan. Beide veroorzaken problemen op 3D-reconstructie uiteindelijk het renderen van een procedure voor een mislukking.

Voor een betere evaluatie van de injectie kwaliteit, μCT scannen gevolgd door 3D vasculaire reconstructie met behulp van preklinische software werd uitgevoerd. Injectie was vastbesloten om succesvol te zijn when segmentatie resulteerde in de visualisatie van een intacte volledige vaatstelsel zonder gebroken structuren aangegeven toegankelijk extravasatie. Indien de vasculaire boom onvolledig verscheen (Fig. 1A), perfusie volume onvoldoende. Als meerdere endotheelcellen bleek of extravasatie waargenomen (fig. 1B), perfusie volume of druk ontoereikend. Dit was de meest waarschijnlijke reden voor het falen. Perfusiedruk theoretisch enigszins variëren afhankelijk van de viscositeit van de oplossing. Viscositeit is afhankelijk van de polymerisatie tijd tussen de verbinding te mengen en injectie in het vasculaire systeem. Aangezien sommige manipulatie vereist voor mengen en injectie kunnen tijdsinterval enigszins variëren tussen 3 min tot 5 min.

Indien de oplossing van lage viscositeit, lage perfusiedruk is. In dit geval kan de verbinding overbrengen naar de niet-geïnjecteerde vaatstelsel via het sinusoïdale systeemwat leidt tot een iets hogere perfusie volume. Indien de oplossing verder gepolymeriseerd waardoor een hogere viscositeit, zal de perfusiedruk stijgen, waardoor verstoring van de schepen en extravasatie.

Bepaling van Objective perfusie Volume

Sinds inadequate perfusie of hyperperfusie falen van de injectie zou veroorzaken, het standaardiseren van de perfusie volume werd beschouwd. Zoals gemeld 2, is 6% van het volume ingenomen door hepatische bloed en 44% van het bloed in de lever bevindt zich in de grote vaten (bv leverslagader, poortader). Levervolume in muizen ongeveer 1,3 ml 11. Hierdoor is het totale volume vasculaire bij portale veneuze systeem in normale muizen werd geschat op tussen 0,03 ml en 0,04 ml. Stroomsnelheid werd ingesteld op 0,2 ml / min en de totale tijd perfusie werd ingesteld op ongeveer 1 minuut resulterend in een totaal injectievolumevan ongeveer 0,2 ml.

Deze schijnbaar hoog volume nodig, aangezien het kathetersysteem worden voorgevuld, die ongeveer 0,1-0,15 ml draait. Een extra volume van 0,05 ml nodig om de ader proximale tussenportaal lever navel en de ligatie van de catheter te vullen. Stroomsnelheid voor leverader injectie werd ingesteld op 0,2 ml / min maar de totale perfusie werd verlengd tot 2 min, resulterend in een hogere totale volume van ongeveer 0,4 ml. Totaal intrahepatische vasculaire volume werd aangenomen gelijk aan de totale poortader vatenvolume zijn. De volume nodig intrahepatische vena cava tussen de infrahepatic ligatie en suprahepatic klem werd geschat met 0,2 ml vullen.

Slaagkans

Een totaal van 49 dieren werden onderworpen aan silicone injectie: 22 dieren in het PV-systeem en 27 dieren in the HV-systeem. Ons slagingspercentage van de injectie was 55% (12/22) in de PV-groep en 89% (24/27) in de HV-groep. Aangezien de PV-groep werd gebruikt om de siliconen injectietechniek aanvankelijk vastgesteld (n = 4), het slagingspercentage van injectie voor het PV systeem moet effectief groter dan 55% bedragen. Echter, μCT beelden verkregen uit deze injecties waren geschikt voor 3D reconstructie en kwantitatieve analyse. Bovendien kan de vasculaire bomen van ofwel PV of HV van 36 muizen worden gereconstrueerd met Imalytics Preklinische software.

Parenchymale en Vasculaire Regeneration

Een tijdsopgeloste μCT reeks murine lever monsters na hepatectomie werd onderworpen aan een kwalitatieve analyse. Parenchymale regeneratie bestond uit 3D-groei van het overblijfsel lever. Vasculaire regeneratie werd gedefinieerd als weefsel dat een toename weergegeven in delengte en diameter van de vasculaire stam, met hoofdtakken en uitgroei van aanvullende eindtakken, zowel in de portale veneuze en hepatische veneuze boom.

Tegenwoordig worden meerdere kwantitatieve parameters geschikt zijn om bijvoorbeeld vasculaire groei en de relatie tussen parenchymale regeneratie en vasculaire regeneratie onderzocht. Deze omvatten de parameters van vasculaire groei, inclusief maximale vasculaire lengte (fig. 2), vasculaire straal en vasculaire dichtheid in termen van totale vasculaire / volume lever lengte of vasculaire volume volume / lever.

Totale lever en het volume van geselecteerde leverlobben berekend. In normale lever, lever totale varieerde van 1,2 ml tot 1,6 ml (n = 6, dat zowel de PV-groep en HV groep). Daalde tot 0,6-0,7 ml na het uitvoeren van een uitgebreide leverresectie door verwijdering van de linker latrale en de mediaan kwab. Het volume lever voortdurend gestegen tijdens de groei lever. Door postoperatieve dag 7 (POD 7), het volume lever verhoogd tot ongeveer 88% van het oorspronkelijke volume, dat wil zeggen, door 2,6-voudig. De toename van het volume lever gecorreleerd met lever gewicht herstel.

Totaal vasculaire volumes van de PV-installatie en de HV-systeem werden berekend. Vasculaire totale volume van de HS systeem was hoger dan in PV systeem, omdat een deel van de intrahepatische inferior vena cava werd opgenomen. Totaal vatenvolume PV systeem varieerde 0,05-0,08 ml in normale muizen. Het daalde tot 0,03-0,04 ml na 70% gedeeltelijke hepatectomie. Door POD 7, totaal vasculaire volume van het overblijfsel lever verhoogd tot 100% van het oorspronkelijke volume. Totaal vatenvolume HV varieerde 0,14-0,16 ml. Vasculaire daalde tot 0,08-0,09 ml na resectie. Binnen de eerste week na de operatie, de totale vasculaire volume van het overblijfsel lever toegenomen by 94% van de oorspronkelijke waarde.

Als de verhouding tussen de resultaten, verhoogde vasculaire parenchymale volume en het volume, werd een vaatdichtheid berekend, meer bepaald de vasculaire volumefractie (vasculaire volume gedeeld door de lever). Hieruit bleek dat vasculaire volume fractie relatief stabiel bleef gedurende het regeneratieproces.

3D Visualisatie van moleculaire gebeurtenissen

Na CT-scannen van de geselecteerde monsters werden onderworpen aan seriële snijden, waarbij op maximaal 2000 slides, dat volledig gedigitaliseerd en gebruikt om het portaal te reconstrueren en de hepatische veneuze boom 12 waren. Dit is de voorwaarde voor toekomstige 3D-visualisatie van moleculaire gebeurtenissen tijdens de regeneratie ten opzichte van het groeiende vaatstelsel.

"Figuur Figuur 1. Het toezicht op de kwaliteit van siliconen injectie. A. Onvolledige vulling van rechts inferieure poortader (pijl in de linker) en ader caudate portal (pijl in de rechter) werden gevisualiseerd in Imalytics preklinisch software discontinuïteiten van de vasculaire boom. Dit wees op een inadequate perfusiedruk of perfusie volume of het bestaan ​​van luchtbellen. B. Extravasatie van rechts inferieure poortader werd gevisualiseerd die verstoring van een vaartuig aangegeven als gevolg van onvoldoende druk of hyperperfusie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. Meting van lengte maximale vaartuig van het rechtinferieure vena portae. De maximale scheepslengte, een beginpunt en een eindpunt werden aan de basis en het distale uiteinde van de rechter inferieure vena portae (RIPV) van de vasculaire masker (blauw en magenta bal markers) in preklinische software zijn geplaatst. De vasculaire pad lengte van de RIPV (10,95 mm) werd verkregen in het kader van de evaluatie van de "Path Kronkeligheid". Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Contrasterende de vasculaire boom door siliconen injectie en μCT scanning is geïntroduceerd in tumor modellen en neurologische ziekte modellen vaak naar de angiogene progressie 5,7,8,10 bestuderen. Verbeteringen in de methodologie van siliconen injectie werden gemaakt in de huidige studie voor het visualiseren en kwantificeren van vasculaire groei na gedeeltelijke hepatectomie bij muizen.

Er zijn een aantal kritische stappen aandacht nodig om goede perfusie kwaliteit. Allereerst wordt systemische heparinisatie sterk aanbevolen voor het spoelen van de lever met heparine of zoutoplossing om bloedstolling in de lever te voorkomen. Verwijdering van luchtbellen uit de slang is ook belangrijk om een ​​goede kwaliteit van siliconen perfusie bereiken. De bepaling van perfusie snelheid en de druk moet eerst worden gebaseerd op de fysiologische hemodynamische parameters 17. Perfusie tijd weerspiegelt het totale geïnjecteerde volume en wordt geschat met de verwachte intravasculairevolume en prefilling volume van het kathetersysteem wordt gehouden.

Silicone is een zeer viskeuze verbinding die afwijkt van bloed of zoutoplossing. Daarom zijn verschillende proeven nodig voor het aanpassen perfusiesnelheid en druk. Het voortdurende injectie stroomsnelheid en druk nodig ernstige dilatatie of zelfs breuk van kleine vaartuigen voorkomen. Perfusie tijd is ingesteld op basis van de geschatte benodigde injectie volume. Toch moet perfusie onmiddellijk gestopt als de blauwe verbinding zichtbaar in vaten op het oppervlak van de lever. Anders kan de siliconen afwateren in sinusoïden en in een andere vasculaire systeem dat zal interfereren met latere reconstructie en analyse.

Typisch wordt silicone systematisch geperfuseerd via de linker ventrikel in de meeste gepubliceerde rapporten 1,3,15. De linker ventrikel gemakkelijk bloot vrije toegang tot de injectieplaats mogelijk. Het nadeel is dat deze route rather indirect omdat het contrastmiddel moet de circulatie te ondergaan alvorens de plaats van belang. Daarom heeft de chirurgische procedure van siliconen injectietechniek gewijzigd in deze studie. In tegenstelling tot de vaak geselecteerde indirecte toedieningsweg uitgevoerd door anderen, werd siliconenverbinding direct geïnjecteerd in het vasculaire systeem plaats, in plaats van contrasterende het gehele lichaam. Op deze wijze kan de snelheid en het volume van perfusie beter beheerst. Het portale veneuze systeem en hepatische veneuze systemen kunnen worden geperfuseerd en afzonderlijk gereconstrueerd later individuele analyse, zoals in de video.

De beperking van deze aangepaste procedure is het technische probleem. Het is een uitdaging om een ​​intraportale injectie met behulp van zeer viskeuze compound in muizen met succes uit te voeren, omdat de vasculaire structuur is zo delicaat. Het is vrij eenvoudig om de schepen te vernietigen tijdens de procedure. Aldus poortader dissectie en katheter insertion moet voorzichtig worden uitgevoerd.

Contrasterende van de vasculaire bomen en de daaropvolgende μCT beeldvorming van de geëxplanteerde lever is een nuttig hulpmiddel voor het visualiseren en kwantificeren van vasculaire regeneratie na gedeeltelijke hepatectomie. Kwantitatieve vasculaire parameters kunnen worden gebruikt voor een beter begrip van de kinetische van vasculaire groei in de progressie van leverregeneratie. Bovendien, 3D-reconstructie van zowel de lever vasculaire systemen op basis van seriële secties is technisch haalbaar, zij het wat neerkomt op een enorme werklast.

Deze techniek kan worden toegepast in verschillende modellen waarin visualisatie en kwantificatie van vasculaire groei belangrijk. Bovendien 3D visualisatie van moleculaire gebeurtenissen met betrekking tot de onderliggende vasculaire boom is voorzien. Voorbeelden van moleculaire gebeurtenissen van belang kan de detectie van proliferatie marker zoals Ki-67 of markers van ischemische schade, zoals HMGB1. Het beoordelen van de ruimtelijk opgeloste moleculaire events in de nabijheid van de regenererende vaatstelsel in de regenererende lever parenchym is een voorwaarde voor geavanceerde multi-schaal systeembiologie modelleren. Deze siliconen injectietechniek is een experimentele stap op weg naar het bereiken van dit doel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PERFUSOR® VI B.BRAUN 87 222/0
Pipetus®-akku Hirschmann 9907200
Pipets Greiner 606180
micro scissors Fine Science Tools (F·S·L) No. 14058-09
micro serrefine Fine Science Tools (F·S·L) No.18055-05
Micro clamps applicator Fine Science Tools (F·S·L) No. 18057-14
Straight micro forceps Fine Science Tools (F·S·L) No. 00632-11
Curved micro forceps Fine Science Tools (F·S·L) No. 00649-11
needle-holder Fine Science Tools (F·S·L) No. 12061-01
1 ml syringe B.Braun 9161406V
5 ml syringe B.Braun 4606051V
extension and connection lines B.Braun 4256000 30 cm, inner ø 1.2 mm
6-0 silk (Perma-Hand Seide) Ethicon 639H
6-0 prolene Ethicon 8711H
Microfil® MV diluent FLOW TECH, INC
Microfil® MV - 120 FLOW TECH, INC MV - 120 (blue)
MV curing agent FLOW TECH, INC
Heparin 2500 I.E./5 ml Rotexmedica ETI3L318-15
Saline Fresenius Kabi Deutschland GmbH E15117/D DE
Imalytics Preclinical software Experimental Molecular Imaging, RWTH Aachen University, Germany
HepaVision Fraunhofer MEVIS, Bremen, Germany
NanoZoomer 2.0-HT Digital slide scanner Hamamatsu Electronic Press, Japan  C9600
Tomoscope Duo CT  CT Imaging GmbH, Erlangen, Germany TomoScope® Synergy

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bearden, S. E., Segal, S. S. Neurovascular alignment in adult mouse skeletal muscles. Microcirculation. 12, (2), 161-167 (2005).
  2. Brown, R. P., Delp, M. D., Lindstedt, S. L., Rhomberg, L. R., Beliles, R. P. Physiological parameter values for physiologically based pharmacokinetic models. Toxicol.Ind.Health. 13, (4), 407-484 (1997).
  3. Dai, D., et al. Elastase-Induced Intracranial Dolichoectasia Model in Mice. Neurosurgery. (2015).
  4. Ding, B. S., et al. Inductive angiocrine signals from sinusoidal endothelium are required for liver regeneration. Nature. 468, (7321), 310-315 (2010).
  5. Downey, C. M., et al. Quantitative ex-vivo micro-computed tomographic imaging of blood vessels and necrotic regions within tumors. PLoS.One. 7, (7), 41685 (2012).
  6. Ehling, J., et al. CCL2-dependent infiltrating macrophages promote angiogenesis in progressive liver fibrosis. Gut. (2014).
  7. Ehling, J., et al. Micro-CT imaging of tumor angiogenesis: quantitative measures describing micromorphology and vascularization. Am.J.Pathol. 184, (2), 431-441 (2014).
  8. Ghanavati, S., Yu, L. X., Lerch, J. P., Sled, J. G. A perfusion procedure for imaging of the mouse cerebral vasculature by X-ray micro-CT. J.Neurosci.Methods. 221, 70-77 (2014).
  9. Gremse, F., et al. Hybrid microCT-FMT imaging and image analysis. J.Vis.Exp. (100), (2015).
  10. Jing, X. L., et al. Radiomorphometric quantitative analysis of vasculature utilizing micro-computed tomography and vessel perfusion in the murine mandible. Craniomaxillofac.Trauma Reconstr. 5, (4), 223-230 (2012).
  11. Melloul, E., et al. Small animal magnetic resonance imaging: an efficient tool to assess liver volume and intrahepatic vascular anatomy. J.Surg.Res. 187, (2), 458-465 (2014).
  12. Schwier, M., Bohler, T., Hahn, H. K., Dahmen, U., Dirsch, O. Registration of histological whole slide images guided by vessel structures. J.Pathol.Inform. 4, ((Suppl)), 10 (2013).
  13. Selle, D., Preim, B., Schenk, A., Peitgen, H. O. Analysis of vasculature for liver surgical planning. IEEE Trans.Med.Imaging. 21, (11), 1344-1357 (2002).
  14. Shergill, U., et al. Inhibition of of VEGF- and NO-dependent angiogenesis does not impair liver regeneration. Am.J.Physiol Regul.Integr.Comp Physiol. 298, (5), 1279-1287 (2010).
  15. Sueyoshi, R., Ralls, M. W., Teitelbaum, D. H. Glucagon-like peptide 2 increases efficacy of distraction enterogenesis. J.Surg.Res. 184, (1), 365-373 (2013).
  16. Wei, W., et al. Rodent models and imaging techniques to study liver regeneration. Eur.Surg.Res. 54, (3-4), 97-113 (2015).
  17. Xie, C., Wei, W., Zhang, T., Dirsch, O., Dahmen, U. Monitoring of systemic and hepatic hemodynamic parameters in mice. J.Vis.Exp. (92), e51955 (2014).
Visualisatie van vasculaire en Parenchymale Regeneratie na 70% Gedeeltelijke hepatectomy in normale muizen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xie, C., Wei, W., Schenk, A., Schwen, L. O., Zafarnia, S., Schwier, M., Gremse, F., Jank, I., Dirsch, O., Dahmen, U. Visualization of Vascular and Parenchymal Regeneration after 70% Partial Hepatectomy in Normal Mice. J. Vis. Exp. (115), e53935, doi:10.3791/53935 (2016).More

Xie, C., Wei, W., Schenk, A., Schwen, L. O., Zafarnia, S., Schwier, M., Gremse, F., Jank, I., Dirsch, O., Dahmen, U. Visualization of Vascular and Parenchymal Regeneration after 70% Partial Hepatectomy in Normal Mice. J. Vis. Exp. (115), e53935, doi:10.3791/53935 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter