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Medicine

Visualisierung von Gefäß- und Parenchymregeneration nach 70% Teilhepatektomie in normalen Mäusen

doi: 10.3791/53935 Published: September 13, 2016

Abstract

Eine modifizierte Silikoninjektionsverfahren wurde zur Sichtbarmachung des Leber-Gefäßbaum verwendet. Dieses Verfahren bestand aus in-vivo - Injektion der Siliconverbindung, über eine 26 G - Katheter, in das Portal oder Lebervene. Nach Silikon Injektion wurden Organe explantiert und für die Ex-vivo - Mikro-CT (μCT) Scannen vorbereitet. Die Silikon-Injektionsverfahren ist technisch anspruchsvoll. ein erfolgreiches Ergebnis zu erreichen, erfordert umfangreiche mikro Erfahrung des Chirurgen. Eine der Herausforderungen dieses Verfahren beinhaltet die Bestimmung der angemessenen Perfusionsgeschwindigkeit für die Siliconverbindung. Die Perfusionsgeschwindigkeit für die Silicon-Verbindung muss auf der Basis der hämodynamischen des Gefäßsystems von Interesse definiert werden. Unangemessen Perfusionsrate kann zu einer unvollständigen Perfusion, künstliche Dilatation und Ruptur von Gefäßbäumen führen.

Die 3D-Rekonstruktion des Gefäßsystems wurde auf CT-Scans basieren und wurde erreicht unter Verwendung vonpräklinische Software wie HepaVision. Die Qualität des rekonstruierten Gefäßbaum wurde direkt auf die Qualität des Silicon-Perfusions verwandt. Anschließend berechnet Gefäßparameter indikativ für Gefäßwachstum, wie Gesamtgefäßvolumen, wurden basierend auf den vaskulären Rekonstruktion berechnet. Kontras den Gefäßbaum mit Silikon für die anschließende histologische Aufarbeitung der Probe nach μCT Scannen erlaubt. Die Probe kann auf Serienschnitt, histologische Analyse und ganze Dia Scan unterzogen werden, und danach auf 3D-Rekonstruktion der Gefäßbäume basierend auf histologischen Bildern. Dies ist die Voraussetzung für die Erkennung von molekularen Ereignissen und deren Verteilung in Bezug auf den Gefäßbaum. Dieses modifizierte Silikoninjektionsverfahren können auch die Gefäßsysteme anderer Organe zu visualisieren und zu rekonstruieren, verwendet werden. Diese Technik hat das Potenzial, umfassend Studien angewendet werden Gefäßanatomie über und Wachstum in verschiedenen Tier and Krankheitsmodelle.

Introduction

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Leberregeneration wird durch Messen der Zunahme des Lebergewichts und Volumens und durch die Bewertung der Hepatozyten Proliferationsrate 16 häufig bestimmt. Allerdings ist die Regeneration der Leber nicht nur Parenchymregeneration induziert , sondern auch Gefäßregeneration 6. Daher sollte Gefäßwachstum weiter in Bezug auf ihre Rolle bei der Progression der Leberregeneration untersucht werden. Visualisierung des Lebergefäßsystems ist von entscheidender Bedeutung für unser Verständnis der vaskulären Regeneration voranzutreiben. Zahlreiche indirekte Methoden wurden die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen der Lebergefäßregeneration zu studieren entwickelt. Traditionell Nachweis von Zytokinen (vascular endothelial growth factor, VEGF) 14, Chemokine und deren Rezeptoren (CXCR4 / CXCR7 / CXCL12) 4 haben die tragende Säule gewesen vaskuläre Regeneration für das Studium. Jedoch zusammen ein 3D-Modell mit quantitativen Analyse des Gefäßsystems würde hinzufügen kritischen anatomischenInformationen ein besseres Verständnis für die wichtige Beziehung zwischen Leberparenchyms und Gefäßregeneration zu gewinnen.

Um die hepatische Gefäßsystem sichtbar zu machen, die die vaskuläre Bäume erfordert kontras wurden Mäuse mit einem strahlenundurchlässigen Silikonkautschuk Kontrastmittel direkt in das Portal oder hepatische venöse Gefäßbaum injiziert. Nach der Polymerisation des Silikon und Explantation des Organs, wurden die Leberproben zu μCT Abtastung unterworfen, um ein CT-Scanner. Die Scans ergaben in Voxel-Bilddarstellungen des silikonInjektionsProben 9.

Für die Qualitätskontrolle wurde das Gefäßsystem zunächst in 3D mit präklinischen Software visualisiert. Die Segmentierung erfolgt durch Setzen einer Schwelle zwischen dem weichen Gewebe Intensität und der Gefäß Intensität durchgeführt. Die sich ergebende Gefäß Maske wurde unter Verwendung von Oberflächendarstellung visualisiert. Die Software auch für die manuelle Bestimmung von zwei Parametern von vascul erlaubtar Wachstum: maximale Schiffslänge und Radius.

Eine präklinische Software wurde dann zur 3D - Rekonstruktion von Gefäßbäumen und die anschließende Berechnung der Lieferung oder Trockenlegung Gefäßterritorien 13 verwendet. Darüber hinaus bestimmt dieses Software automatisch bestimmte Parameter der Gefäßwachstum, wie beispielsweise die Gesamtlänge aller sichtbaren Gefäßstrukturen auch als die Gesamtkantenlänge oder Gesamtbehältervolumen bekannt.

Die Silikon-Perfusions-Verfahren wurde in naiven Mäusen und in Mäusen durchgeführt, die 70% partielle Hepatektomie (PH) unterzog. Die Lebern wurden zur Analyse von Gefäß- und parenchymalen Leberregeneration bei unterschiedlichen Beobachtungszeitpunkten nach der Resektion gesammelt, um die oben genannten Visualisierung und Quantifizierung Technik.

Die Hauptziele dieses Films sind: (1) erforderlich, um die empfindlichen Spritztechnik zeigen eine optimale Kontrastierung zu erreichen, und (2) zeigen den möglichen Nutzen daraus resultierende from eine detaillierte Analyse der erhaltenen Probe μCT und histologischen Schnittserien mit. Nachdem sie diesen Film sehen, sollte der Leser ein besseres Verständnis dafür, wie Silicon-Verbindung in einem bestimmten Gefäßsystem und von der Nützlichkeit und Anwendbarkeit der Technik zu injizieren.

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Protocol

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Verfahren unter Verwendung tierischer Probanden wurden von Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz Abteilung Tiergesundheit und Tierschutz, Bundesrepublik Deutschland. Da die Pfortader-System wurde getrennt von der Leber-venösen System sichtbar gemacht, getrennte Tiere wurden für die verschiedenen Gefäßbäumen benötigt.

1. Reagenzien Vorbereitung

  1. Heparin-Kochsalzlösung
    1. 0,1 ml Heparin in 10 ml Kochsalzlösung (5 IU / ml).
  2. Silikon-Verbindungsmischung
    1. 2 ml MV-120 in ein 5-ml-Tube. Verdünnte MV-120 durch Zugabe von 3 ml MV Verdünnungsmittel, was zu einer 40% igen Lösung.

2. Pfortader-System-Silikon-Einspritzung

  1. Laparotomie
    1. Platzieren Sie die Maus in der Anästhesie Induktionskammer und betäuben sie mit 2% Isofluran und 0,3 l / min Sauerstoff.
    2. Befestigen Sie den narkotisierten Maus auf dem Operationstisch mit kontinuierlicher Inhalation mit Klebeband von 2%oflurane und 0,3 l / min Sauerstoff. Überprüfen Sie die Zehen Prise Rückzug Reflex der Maus und starten Sie den Betrieb, wenn der Reflex fehlt.
    3. Machen Sie einen Quereinschnitt auf den Bauch einer Schere für die Hautschicht und einer elektrischen Koagulator für die Muskelschicht verwendet wird. Bewegen Sie heraus den Darm auf die linke Seite mit Baumwollspitzen und decken den Darm mit Kochsalzlösung getränkten Gaze.
  2. Einführkatheter
    1. Präparieren Pfortader unter dem Mikroskop mit Mikro-Pinzette. Legen Sie eine 6-0 Seidennaht unterhalb der extrahepatischen Pfortader, in etwa 1 mm Abstand zu seiner Gabelung und binden Sie es locker für die spätere Verwendung.
    2. Spritzen Sie bereit Heparin-Kochsalzlösung über Penis-Vene (männlich) oder untere Hohlvene (weiblich) für die systemische Heparinisierung für 5 min.
    3. Legen Sie die 26-Gauge (26 G) Katheter mit Nadel in Pfortader und fixieren Sie es mit einer Klammer
  3. Heparin-Kochsalzlösung und Silikon-Verbindung Perfusion
    1. Laden Heparin-Kochsalzlösung Solution in 5-ml-Spritze und schalten Sie die Perfusion Gerät. Füllen Sie den Katheter vollständig mit Heparin-Kochsalzlösung Luftblasen zu vermeiden.
    2. Schließen Sie das Verlängerungsrohr mit dem Katheter und befestigen Sie sie fest. Starten Sie Heparin-Kochsalzlösung Perfusion mit einer Durchblutungsrate von 0,4 ml / min.
    3. Ligat vorplatzierte 6-0 Seidennaht für die doppelte Katheter Fixierung und den Blutfluss aus Milzvene und mesenterica blockieren. Euthanatize die Maus durch Ausbluten über die Perfusion unter Narkose.
    4. Spülen Sie die Leber während der gesamten Perfusion, um es feucht zu halten mit Kochsalzlösung.
    5. 0,1 ml Mittel in die MV-120 Rohr aushärtet. Ändern Sie Heparin-Kochsalzspritze Silikonspritze.
    6. Starten Sie Silikon-Perfusion mit einer Durchblutungsrate von 0,2 ml / min für ca. 1 min das Kathetersystem zu prefill und die Pfortader-System zu füllen. Stoppen Sie Silikon-Perfusion, wenn die Gefäße auf der Oberfläche blau.
  4. Sampling
    1. Halten Sie die Leber in situ until das Silikon wird nach ca. 15 bis 30 min vollständig polymerisiert. Präparieren Bänder Leber und benachbarte Organe sorgfältig Verbindungs ​​Leber intakt zu halten. Explantat die Leber und steckte es in Formalin-Fixierung.

3. Lebervenensystem Silikon-Einspritzung

  1. Führen Sie Laparotomie als vollständig in Schritt 2.1 und setzen Operationsfeld durchgeführt.
  2. Einführkatheter
    1. Präparieren Pfortader unter dem Mikroskop mit Mikro-Pinzette. Legen Sie eine 6-0 Seidennaht unterhalb der extrahepatischen Pfortader, in etwa 1 mm Abstand zu seiner Gabelung und binden Sie es locker für die spätere Verwendung.
    2. Spritzen Sie bereit Heparin-Kochsalzlösung über Penis-Vene (männlich) oder untere Hohlvene (weiblich) für die systemische Heparinisierung für 5 min.
    3. Legen Sie eine 26 G-Katheter (Katheter 1) mit Nadel in Pfortader und befestigen Sie ihn mit einer Klemme. Legen Sie eine andere 26 G-Katheter (Katheter 2) mit der Nadel in der unteren Hohlvene und fixieren Sie es mit einer Klammer.
    4. Ligieren die Zweige der unteren Hohlvene (einschließlich linke und rechte Nierenvenen) und seinem distalen Ende mit 6-0 synthetischen, Monofilament, nicht-resorbierbaren Polypropylen Naht.
  3. Heparin-Kochsalzlösung und Silikon-Verbindung Perfusion
    1. Laden Heparin-Kochsalzlösung in 5-ml-Spritze und schalten Sie die Perfusion Gerät. Füllen Katheter 1 vollständig mit Heparin-Kochsalzlösung, um Luftblasen zu vermeiden. Schließen Sie das Verlängerungsrohr zu Katheter 1 und befestigen Sie es fest. Beginnen Heparin-Kochsalzlösung Perfusion mit einer Rate von 0,4 ml / min.
    2. Ligat vorplatzierte 6-0 Seidennaht für die doppelte Katheter Fixierung und den Blutfluss aus Milzvene und mesenterica blockieren. Euthanatize die Maus durch Ausbluten über die Perfusion unter Narkose.
    3. Spülen Sie die Leber während der gesamten Perfusion, um es feucht zu halten mit Kochsalzlösung. 0,1 ml Mittel in die MV-120 Rohr aushärtet. Exchange-Heparin-Kochsalzlösung Spritze mit Silikonspritze.
    4. Legen Sie eine Klemme an der suprahepatic inferior vena cava den Abfluss von der Leber zu behindern.
    5. Schließen Sie das Verlängerungsrohr 2 mit dem Katheter und Silikon-Perfusion mit einer Durchblutungsrate von 0,2 ml / min für ca. 2 min eine objektive Lebergefäßvolumen zu erreichen, wie berichtet, beginnen. Stoppen Sie Silikon-Perfusion, wenn die Gefäße auf der Oberfläche blau.
  4. Sampling
    1. Präparieren Leber Bänder eine Schädigung der Leber zu vermeiden. Explantat die Leber und steckte es in Formalin-Fixierung.

4. Micro-CT (μCT) Scan

Zum Scannen werden die explantiert Leberprobe mit μCT, die folgenden Schritte erforderlich.

  1. Nehmen Sie die Leberprobe aus der Fixierungslösung. Legen Sie die Leber auf die μCT Bett. Setzen Sie die μCT Bett mit der Leberprobe in die μCT.
  2. Erwerben Sie Topogramm vor dem Scan zu starten. Verwenden Sie eine Nebenabtastrichtung für die kleine Leberprobe und zwei Teilscan für große Proben.
  3. Wählen Sie ein81; CT - Protokoll mit einer hohen Auflösung (zB HQD-6565-390-90). Dieses Protokoll erwirbt 720 Projektionen mit 1.032 x 1.012 Pixeln bei einer vollen Umdrehung mit der Scanzeit von 90 Sekunden pro Unterabtastung. Starten Sie den μCT-Scan.

5. Histologische Serienschnitte

  1. Einbetten der Leberprobe in Paraffin als Ganzes nach μCT Scannen. Schneiden gesamte Paraffinprobe in 4 um Abschnitte, was zu einer Reihe von 2000 bis 2500 Abschnitten.
  2. Stain Abschnitte mit entsprechenden Färbetechnik molekularen Ereignisse von Interesse zu visualisieren, wie Ki-67 als Proliferationsmarker und HMGB1 als Marker für ischämische Schädigung. Bestimmen Sie Reihenfolge der Färbung in Bezug auf wissenschaftliche Frage.
  3. Verwenden Sie eine ganze Dia-Scanner die gefärbten Schnitten zu digitalisieren.
  4. Führen Sie 3D-Rekonstruktion des Gefäßbaumes (n) (bereits machbar) und visualisieren 3D-Verteilung der molekularen Ereignisse in Bezug auf Gefäßbaum (Forschung im Gange).

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Representative Results

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Qualitätskriterien

Die Qualität der Silikoninjektion kann mit dem bloßen Auge während des Verfahrens beurteilt werden. Die kleinen Schiffe, die auf Leberoberfläche füllen nach und nach mit der blauen Verbindung. Wenn der normale vaskuläre Struktur auf der Leberoberfläche beobachtet wurde, wurde die Siliconkautschukinjektionsqualität gut. Wenn der Perfusionsvolumen unzureichend war, wurden die kleinen Gefäße auf der Leberoberfläche nicht vollständig gefüllt. Im Gegensatz dazu über Füllung verursacht Gefäßruptur wie durch irreguläre blauen Flecken auf der Oberfläche des Organs gekennzeichnet. Beide verursachen Schwierigkeiten bei der 3D-Rekonstruktion schließlich ein Verfahren ein Fehler gemacht wird.

Zur besseren Beurteilung der Injektion Qualität, μCT Scannen gefolgt von 3D-Gefäßrekonstruktion präklinischen Software durchgeführt wurde. Injection wurde festgestellt, erfolgreich zu sein when Segmentierungs führte zur Visualisierung eines intakten vollständigen vaskulären Baum ohne zerrissen Strukturen sichtbar Extravasation angezeigt. Wenn der Gefäßbaum unvollständig erschienen (Abb. 1A), war Perfusionsvolumen unzureichend. Wenn mehr als ein Gefßbaum erschienen oder Extravasation wurde gesehen (Fig. 1B), Perfusionsvolumen oder Druck war unzureichend. Dies war der wahrscheinlichste Grund für einen Ausfall. Perfusionsdruck kann theoretisch leicht variieren in Abhängigkeit von der Viskosität der Lösung. Viskosität ist abhängig von der Polymerisationszeit verstrichen zwischen Mischen der Verbindung und die Injektion in das Gefäßsystem. Da einige Manipulationen zum Mischen und Einspritzung erforderlich ist, kann Zeitintervall variieren zwischen 3 min bis 5 min.

Wenn die Lösung mit niedriger Viskosität ist, ist Perfusionsdruck gering. In diesem Fall kann die Verbindung übertragen in die nicht injizierten Gefäßbaum über das Sinussystemwas zu einem etwas höheren Perfusionsvolumen. Wenn die Lösung weiter polymerisiert wird, zu einer höheren Viskosität führt, wird der Perfusionsdruck steigt, was zu Störungen der Gefäße und Extravasation.

Die Bestimmung des Ziels Perfusionsvolumen

Da unzureichende Perfusion oder Hyperperfusion würde Versagen der Injektion verursachen, die Standardisierung der Perfusionsvolumen betrachtet wurde. Wie in 2 angegeben, 6% des Lebervolumens von Blut besetzt und 44% des Blutes in der Leber liegt in den großen Gefäßen (zB Leberarterie, Pfortader). Lebervolumen in Mäusen , etwa 1,3 ml 11. Daher wurde die gesamte Gefäßvolumen in Pfortader-System in normalen Mäusen schätzungsweise zwischen 0,03 ml und 0,04 ml bis reichen. Fließgeschwindigkeit wurde auf 0,2 ml / min und insgesamt Perfusionszeit wurde auf ca. 1 Minute, was zu einem Gesamtinjektionsvolumenvon etwa 0,2 ml.

Diese scheinbar hohe Volumen benötigt wird, da das Kathetersystem vorbelegt werden müssen, die etwa 0,1 bis 0,15 ml nimmt. Ein zusätzliches Volumen von 0,05 ml erforderlich, um die proximal Pfortader zwischen Leber Hilus und die Ligation des Katheters zu füllen. Durchflussrate für die Injektion Lebervene wurde ebenfalls auf 0,2 ml / min, aber insgesamt Perfusionszeit wurde auf 2 Minuten verlängert, was zu einer höheren Gesamtvolumen von etwa 0,4 ml. Gesamt intrahepatischen wurde vaskulären Volumens zum Gesamt Pfortader Gefäßvolumen als ähnlich angenommen. Allerdings benötigt das Volumen der intrahepatischen Hohlvene zwischen der infrahepatische Ligatur und die suprahepatischen Klemme zu füllen wurde mit 0,2 ml geschätzt.

Erfolgsrate

Insgesamt 49 Tiere wurden Silikon-Injektion unterzogen: 22 Tiere in die PV-Anlage und 27 Tiere in the HV-System. Unsere Erfolgsquote der Injektion betrug 55% (12/22) in der PV-Gruppe und 89% (24/27) in der HV-Gruppe. Unter Berücksichtigung, dass die PV-Gruppe aufzubauen, wurde verwendet, um die Silikon-Injektionstechnik am Anfang (n = 4), die Erfolgsrate der Einspritzung für die PV-Anlage sollte effektiv höher als 55%. μCT Bilder von diesen Injektionen erhalten wurden, waren jedoch geeignet für die 3D-Rekonstruktion und quantitative Analyse. Zusätzlich könnten die Gefäß Bäume aus entweder PV oder HV von 36 Mäusen mit dem Imalytics Preclinical Software rekonstruiert werden.

Parenchymale und Gefäßregeneration

Eine Zeit μCT Reihe von murinen Leberproben aufgelöst nach Hepatektomie zu einer qualitativen Analyse unterzogen wurde. Parenchymregeneration bestand aus 3D-Wachstum der Rest Leber. Vascular Regeneration wurde als Gewebe definiert, die eine Erhöhung der angezeigtenLänge und Durchmesser des Gefäßschaft mit seinen Hauptniederlassungen und Auswuchs zusätzlicher Endästen, sowohl in der Pfortader und Lebervenen Baum.

Derzeit mehrere quantitative Parameter für Gefäßwachstum und die Beziehung zwischen Leber Parenchymregeneration und Gefäßregeneration beschreiben, sind untersucht. Dazu gehören Parameter, die das Gefäßwachstum, einschließlich der maximalen Gefäßlänge (Abb. 2), Gefäßradius und Gefäßdichte in Bezug auf die Gesamtgefäß Länge / Lebervolumen oder Gefäßvolumen / Lebervolumen.

Gesamtlebervolumen und das Volumen der ausgewählten Leberlappen wurden berechnet. Im normalen Lebern lag Gesamtlebervolumen von 1,2 ml bis 1,6 ml (n = 6, einschließlich der PV-Gruppe und HV-Gruppe). Es verringerte sich auf 0,6 bis 0,7 ml nach einer ausgedehnten Leberresektion durchführen, indem Sie die linke Entfernen latrere und Mittellappen. Die Lebervolumen erhöht kontinuierlich während der Leberwachstum. Von postoperativen Tag 7 (POD 7) erhöhte die Lebervolumen auf etwa 88% seines ursprünglichen Volumens, das heißt um 2,6-fach. Der Anstieg der Lebervolumens mit Lebergewicht Erholung korreliert.

Insgesamt Gefäßvolumen des PV-Systems und HV-System berechnet wurden. Insgesamt Gefäßvolumen des HV-System war höher als in PV-Anlage, weil ein Teil der intrahepatische untere Hohlvene enthalten war. Insgesamt Gefäßvolumen PV-Anlage lag im Bereich von 0,05 bis 0,08 ml in normalen Mäusen. Es verringerte sich auf 0,03 bis 0,04 ml nach 70% Teilhepatektomie. Mit dem POD 7, erhöhte sich das gesamte Gefäßvolumen der Rest der Leber zu 100% des ursprünglichen Volumens. Gesamtgefäßvolumen HV reichten von 0,14 bis 0,16 ml. Gefäßvolumen verringerte sich auf 0,08 bis 0,09 ml nach der Resektion. Innerhalb der ersten postoperativen Woche, wobei die Gesamtgefäßvolumen der Rest der Leber erhöht by 94% des ursprünglichen Wertes.

Da die Beziehung zwischen den Ergebnissen, die Erhöhung der vaskulären Volumens und parenchymale Volumen wurde eine vaskuläre Dichte berechnet, genauer gesagt die Gefäßvolumenanteil (vascular Volumen von Lebervolumen unterteilt). Dies zeigte, dass vaskuläre Volumenanteil relativ stabil blieb während des Regenerationsprozesses.

3D - Visualisierung von molekularen Ereignisse

Nach CT-Abtastung der ausgewählten Proben wurden serielle Schnitte unterzogen, wodurch man zu bis zu 2000 Folien, die vollständig digitalisiert wurden und 12 verwendet das Portal sowie die hepatische venöse Baum zu rekonstruieren. Dies ist die Voraussetzung für die Zukunft 3D-Visualisierung von molekularen Ereignisse während der Regeneration in Bezug auf den wachsenden Gefßbaum.

"1" Abbildung 1. die Qualität der Silikoneinspritzung Überwachung. A. Eine unvollständige Füllung der rechten unteren Pfortader (Pfeil in der linken Seite) und Nucleus caudatus Pfortader (Pfeil in der rechten Seite ) wurden in Imalytics Präklinische Software als Diskontinuitäten des Gefäßbaumes sichtbar gemacht . Dies zeigte eine unzureichende Perfusionsdruck oder Perfusionsvolumen oder das Vorhandensein von Luftblasen. B. Extravasation von rechten unteren Pfortader wurde sichtbar gemacht, die Unterbrechung eines Schiffes angegeben aufgrund unzureichender Druck oder Hyperperfusion. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Messung der maximalen Gefäßlänge von rechtsminderwertig Pfortader. Um die maximale Schiffslänge, ein Startpunkt und ein Endpunkt bestimmen , an der Wurzel und distalen Ende des rechten unteren Pfortader (RIPV) der Gefäß Maske (blau und magenta Ballmarker) in der präklinischen Software gelegt wurden. Die Gefäßpfadlänge des RIPV (10.95 mm) wurde im Rahmen der Evaluierung des "Path Tortuosität" erhalten. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

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Kontras den Gefäßbaum durch Silikon - Injektion und μCT - Scanning wurde 5,7,8,10 die angiogene Progression häufig zu studieren in Tumormodellen und neurologische Krankheitsmodelle eingeführt. Verbesserungen in der Methodik der Silikoninjektion wurden in der vorliegenden Studie zur Visualisierung und Quantifizierung von vaskulären Wachstums nach partieller Hepatektomie in Mäusen hergestellt.

Es gibt eine Reihe von kritischen Schritte Aufmerksamkeit benötigen gute Perfusion Qualität zu erreichen. Zuallererst wird eine systemische Heparinisierung stark vor dem Spülen der Leber mit Heparin oder Kochsalzlösung empfohlen Blutgerinnung in der Leber zu vermeiden. Beseitigung von Luftblasen aus dem Schlauch ist auch wichtig, eine gute Qualität der Silikon Perfusion zu erreichen. Die Bestimmung der Perfusion und Druck sollten zunächst 17 ​​auf physiologische hämodynamische Parameter basieren. Perfusionszeit spiegelt das injizierte Volumen insgesamt und wird die erwartete intravaskulären geschätzte EinnahmeVolumen und die Vorfüllung Volumen des Kathetersystems berücksichtigt.

Silikon ist eine hochviskose Verbindung, die aus dem Blut oder Kochsalzlösung unterscheidet. Daher werden zur Einstellung der Perfusion und Druck mehrere Versuche benötigt. konstante Injektionsflussrate und Druck beizubehalten ist notwendig schwere Dilatation oder sogar Bruch der kleinen Gefäße zu verhindern. Perfusionszeit wird entsprechend der geschätzten benötigten Injektionsvolumen eingestellt. Allerdings sollte Perfusion sofort gestoppt werden, wenn die blaue Verbindung in Gefäßen auf der Oberfläche der Leber sichtbar wird. Andernfalls kann das Silikon in Sinusoiden abtropfen lassen und in eine andere Gefäßsystem, das mit späteren Rekonstruktion und Analyse stören.

Typischerweise wird Silikon in den meisten veröffentlichten Berichten 1,3,15 systematisch über den linken Ventrikel perfundiert. Der linke Ventrikel ist leicht zu belichten freien Zugang zu der Injektionsstelle zu ermöglichen. Jedoch ist der Nachteil, dass diese Route rather indirekt, da das Kontrastmittel hat Zirkulation zu unterziehen, bevor die Stelle von Interesse zu erreichen. Daher ist das chirurgische Verfahren der Silikoninjektionstechnik wurde in dieser Studie modifiziert. Im Gegensatz zu der häufig ausgewählten indirekten Weg der Anwendung von anderen durchgeführt wurde Siliconverbindung direkt in das Gefäßsystem von Interesse eingespritzt wird, anstatt den ganzen Körper kontras. Auf diese Weise kann die Geschwindigkeit und das Volumen der Perfusion gesteuert werden besser. Die Pfortader-System und Lebervenensysteme können für eine spätere individuelle Analyse durchbluteten und rekonstruiert getrennt werden, wie in dem Video zu sehen.

Die Begrenzung dieses modifizierten Verfahrens ist die technische Schwierigkeit. Es ist eine Herausforderung, um erfolgreich eine intraportale Injektion durchzuführen unter Verwendung von hochviskosen Verbindung in Mäusen, weil die Gefäßstruktur ist so zart. Es ist ziemlich einfach, die Schiffe während des Verfahrens zu zerstören. So Pfortader Dissektion und Katheter insertion sollte vorsichtig durchgeführt werden.

Kontras der Gefäßbäumen und anschließender μCT Bildgebung der explantierten Lebern ist ein nützliches Werkzeug für die Visualisierung und vaskuläre Regeneration nach einer partiellen Hepatektomie zu quantifizieren. Quantitative vaskulären Parameter können für ein besseres Verständnis der Kinetik der vaskulären Wachstums in der Progression der Leberregeneration verwendet werden. Darüber hinaus 3D-Rekonstruktion beider Lebergefäßsysteme auf Serienschnitten basiert technisch machbar ist, wenn auch eine enorme Arbeitsbelastung darstellt.

Diese Technik kann in mehrere Modelle angewendet werden, wo die Visualisierung und Quantifizierung von Gefäßwachstum wichtig ist. Darüber hinaus 3D-Visualisierung molekularer Ereignisse in Bezug auf die zugrunde liegenden Gefäßbaum ist in Reichweite. Beispiele für molekulare Ereignisse von Interesse könnte der Nachweis von Proliferationsmarker wie Ki-67 oder Marker ischämischer Schäden wie HMGB1 sein. Die Beurteilung der ortsaufgelösten molekularen evGefäßbaum in der regenerierenden Leberparenchym ist die Voraussetzung für die erweiterte Multiskalensystembiologie Modellierung ents in der Nähe des zu regenerieren. Diese Silikon-Injektionstechnik ist ein experimenteller Schritt, um dieses Ziel zu erreichen.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
PERFUSOR® VI B.BRAUN 87 222/0
Pipetus®-akku Hirschmann 9907200
Pipets Greiner 606180
micro scissors Fine Science Tools (F·S·L) No. 14058-09
micro serrefine Fine Science Tools (F·S·L) No.18055-05
Micro clamps applicator Fine Science Tools (F·S·L) No. 18057-14
Straight micro forceps Fine Science Tools (F·S·L) No. 00632-11
Curved micro forceps Fine Science Tools (F·S·L) No. 00649-11
needle-holder Fine Science Tools (F·S·L) No. 12061-01
1 ml syringe B.Braun 9161406V
5 ml syringe B.Braun 4606051V
extension and connection lines B.Braun 4256000 30 cm, inner ø 1.2 mm
6-0 silk (Perma-Hand Seide) Ethicon 639H
6-0 prolene Ethicon 8711H
Microfil® MV diluent FLOW TECH, INC
Microfil® MV - 120 FLOW TECH, INC MV - 120 (blue)
MV curing agent FLOW TECH, INC
Heparin 2500 I.E./5 ml Rotexmedica ETI3L318-15
Saline Fresenius Kabi Deutschland GmbH E15117/D DE
Imalytics Preclinical software Experimental Molecular Imaging, RWTH Aachen University, Germany
HepaVision Fraunhofer MEVIS, Bremen, Germany
NanoZoomer 2.0-HT Digital slide scanner Hamamatsu Electronic Press, Japan  C9600
Tomoscope Duo CT  CT Imaging GmbH, Erlangen, Germany TomoScope® Synergy

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References

  1. Bearden, S. E., Segal, S. S. Neurovascular alignment in adult mouse skeletal muscles. Microcirculation. 12, (2), 161-167 (2005).
  2. Brown, R. P., Delp, M. D., Lindstedt, S. L., Rhomberg, L. R., Beliles, R. P. Physiological parameter values for physiologically based pharmacokinetic models. Toxicol.Ind.Health. 13, (4), 407-484 (1997).
  3. Dai, D., et al. Elastase-Induced Intracranial Dolichoectasia Model in Mice. Neurosurgery. (2015).
  4. Ding, B. S., et al. Inductive angiocrine signals from sinusoidal endothelium are required for liver regeneration. Nature. 468, (7321), 310-315 (2010).
  5. Downey, C. M., et al. Quantitative ex-vivo micro-computed tomographic imaging of blood vessels and necrotic regions within tumors. PLoS.One. 7, (7), 41685 (2012).
  6. Ehling, J., et al. CCL2-dependent infiltrating macrophages promote angiogenesis in progressive liver fibrosis. Gut. (2014).
  7. Ehling, J., et al. Micro-CT imaging of tumor angiogenesis: quantitative measures describing micromorphology and vascularization. Am.J.Pathol. 184, (2), 431-441 (2014).
  8. Ghanavati, S., Yu, L. X., Lerch, J. P., Sled, J. G. A perfusion procedure for imaging of the mouse cerebral vasculature by X-ray micro-CT. J.Neurosci.Methods. 221, 70-77 (2014).
  9. Gremse, F., et al. Hybrid microCT-FMT imaging and image analysis. J.Vis.Exp. (100), (2015).
  10. Jing, X. L., et al. Radiomorphometric quantitative analysis of vasculature utilizing micro-computed tomography and vessel perfusion in the murine mandible. Craniomaxillofac.Trauma Reconstr. 5, (4), 223-230 (2012).
  11. Melloul, E., et al. Small animal magnetic resonance imaging: an efficient tool to assess liver volume and intrahepatic vascular anatomy. J.Surg.Res. 187, (2), 458-465 (2014).
  12. Schwier, M., Bohler, T., Hahn, H. K., Dahmen, U., Dirsch, O. Registration of histological whole slide images guided by vessel structures. J.Pathol.Inform. 4, ((Suppl)), 10 (2013).
  13. Selle, D., Preim, B., Schenk, A., Peitgen, H. O. Analysis of vasculature for liver surgical planning. IEEE Trans.Med.Imaging. 21, (11), 1344-1357 (2002).
  14. Shergill, U., et al. Inhibition of of VEGF- and NO-dependent angiogenesis does not impair liver regeneration. Am.J.Physiol Regul.Integr.Comp Physiol. 298, (5), 1279-1287 (2010).
  15. Sueyoshi, R., Ralls, M. W., Teitelbaum, D. H. Glucagon-like peptide 2 increases efficacy of distraction enterogenesis. J.Surg.Res. 184, (1), 365-373 (2013).
  16. Wei, W., et al. Rodent models and imaging techniques to study liver regeneration. Eur.Surg.Res. 54, (3-4), 97-113 (2015).
  17. Xie, C., Wei, W., Zhang, T., Dirsch, O., Dahmen, U. Monitoring of systemic and hepatic hemodynamic parameters in mice. J.Vis.Exp. (92), e51955 (2014).
Visualisierung von Gefäß- und Parenchymregeneration nach 70% Teilhepatektomie in normalen Mäusen
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Xie, C., Wei, W., Schenk, A., Schwen, L. O., Zafarnia, S., Schwier, M., Gremse, F., Jank, I., Dirsch, O., Dahmen, U. Visualization of Vascular and Parenchymal Regeneration after 70% Partial Hepatectomy in Normal Mice. J. Vis. Exp. (115), e53935, doi:10.3791/53935 (2016).More

Xie, C., Wei, W., Schenk, A., Schwen, L. O., Zafarnia, S., Schwier, M., Gremse, F., Jank, I., Dirsch, O., Dahmen, U. Visualization of Vascular and Parenchymal Regeneration after 70% Partial Hepatectomy in Normal Mice. J. Vis. Exp. (115), e53935, doi:10.3791/53935 (2016).

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