Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

ויזואליזציה של התחדשות כלי דם Parenchymal לאחר 70% חלקיות כריתה בעכברים נורמליים

doi: 10.3791/53935 Published: September 13, 2016

Abstract

הליך הזרקת סיליקון שונה שמש להדמיה של עץ כלי הדם בכבד. הליך זה כלל הזרקה ב- vivo של מתחם סיליקון, באמצעות קטטר 26 G, לתוך הפורטל או הווריד כבד. לאחר הזרקת סיליקון, האיברים היו explanted והכינו לסריקה לשעבר vivo מיקרו-CT (μCT). ההליך הזרקת סיליקון הוא מאתגר מבחינה טכנית. השיג תוצאה מוצלחת דורש ניסיון microsurgical נרחב של המנתח. אחד האתגרים של הליך זה כרוך בקביעת שיעור זלוף ההולם במתחם סיליקון. שיעור זלוף עבור מתחם סיליקון צריך להיות מוגדר על בסיס המודינמי של מערכת כלי הדם של עניין. שיעור זלוף לא ראוי יכול להוביל זלוף שלם, התרחבות מלאכותית פקיעת עצים וסקולרית.

שחזור 3D של מערכת כלי הדם התבסס על בדיקות CT ו הושג באמצעותתוכנת פרה-קלינית כגון HepaVision. איכות עץ כלי הדם המשוחזר הייתה קשורה ישירות לאיכות זלוף סיליקון. בהמשך מחושבים פרמטרים וסקולרית מעידים על צמיחה של כלי דם, כגון נפח כלי דם הכולל, חושבו על בסיס השחזורים וסקולרית. הניגודיות את העץ וסקולרית עם סיליקון מותר לעבודה-אפ היסטולוגית עוקב של הדגימה לאחר סריקת μCT. הדגימה יכולה להיות נתונה חתך סדרתי, ניתוח היסטולוגית וסריקה השקופית כולה, ולאחר מכן כדי שחזור 3D של העצים וסקולרית המבוססת על תמונות היסטולוגית. זהו התנאים ההכרחיים לצורך זיהוי של אירועים מולקולריים והפצתי ביחס עץ כלי הדם. הליך להזרקת סיליקון שונה זה יכול לשמש גם כדי לחזות לשחזר את מערכות כלי הדם של איברים אחרים. טכניקה זו יש פוטנציאל להיות מיושם באופן נרחב כדי מחקרים לגבי האנטומיה של כלי הדם וצמיחה בתוך בעלי חיים שוניםמודלים המחלה nd.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

התחדשות כבדה לעתים קרובות נקבעת על ידי מדידת העלייה במשקל כבד נפח על ידי בחינה של קצב התפשטות hepatocyte 16. עם זאת, התחדשות כבדה אינה רק גרימת התחדשות parenchymal אבל גם 6 התחדשות כלי דם. לכן, צמיחה של כלי דם צריכה להיחקר נוסף באשר לתפקידה בהתקדמות של התחדשות כבדה. ויזואליזציה של מערכת כלי דם בכבד היא קריטית לקידום הבנתנו התחדשות כלי דם. רבים בשיטות עקיפות פותחו כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים שבבסיס של התחדשות כלי הדם בכבד. באופן מסורתי, זיהוי של ציטוקינים (פקטור הגדילה של אנדותל כלי הדם, VEGF) 14, כמוקינים ואת הקולטנים שלהם (CXCR4 / CXCR7 / CXCL12) 4 היו עמוד התווך ללימוד התחדשות כלי הדם. עם זאת, מודל 3D יחד עם ניתוח כמותי של כלי הדם יוסיף אנטומיים קריטימידע כדי להשיג הבנה טובה יותר של מערכת היחסים החשובים בין parenchymal הכבד והתחדשות כלי דם.

כדי להמחיש את מערכת כלי דם בכבד, מחייב מנוגדי העצים וסקולרית, עכברים הזריקו חומר ניגוד גומי סיליקון radiopaque ישירות לתוך הפורטל או עץ כלי דם מוריד בכבד. לאחר פילמור של סיליקון explantation של האיבר, הדגימות הכבדות היו נתוני סריקת μCT באמצעות סורק CT. הסריקות הביאו ייצוגי תמונת voxel של הזרקת סיליקון דגימות 9.

עבור בקרת איכות, מערכת כלי הדם הייתה מדמיין הראשון 3D באמצעות תוכנת פרה-קלינית. פילוח בוצע על ידי קביעת סף בין עוצמת רקמות הרכה לבין עוצמת הכלי. מסכת הכלי וכתוצאה מכך הייתה דמיינה באמצעות טיוח משטח. התוכנה אפשרה גם זיהוי ידני של שני פרמטרים של vasculצמיחת ar: Vessel אורך מקסימאלי ורדיוס.

תוכנת פרה-מכן שמשה שחזור 3D של עצים וסקולרית והחישוב הבא של השטחים וסקולרית באספקה ​​או ניקוז 13. בנוסף, תוכנה זו באופן אוטומטי נקבעה פרמטרים מסוימים של צמיחה של כלי דם, כגון האורך הכולל של כל המבנים וסקולרית הגלויים הידוע גם בשם אורך הקצה המוחלט או נפח כלי כולל.

הליך סיליקון זלוף בוצע בעכברים נאיביים בעכברים שעברו 70% כריתה חלקית (PH). כבד נאספו בנקודות שונות מדידה לאחר כריתה לניתוח ההתחדשות כבדה של כלי דם ואת parenchymal בטכניקה להדמיה וכימות הנ"ל.

המטרות העיקריות של הסרט הזה הן: (1) להדגים את טכניקת ההזרקה העדינה נדרשה להשיג מנוגדים אופטימליים (2) הצגת תרומה האפשרית כתוצאת frאום ניתוח מפורט של הדגימה וכתוצאה מכך באמצעות μCT וחתכים סדרתי היסטולוגית. לאחר הצפייה בסרט זה, הקורא צריך להיות בעל הבנה טובה יותר של כיצד להזריק תרכובת סיליקון לתוך מערכת כלי דם ספציפית של תועלת תחולתה של הטכניקה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הנהלים הקשורים בנושאים בעלי חיים אושרו על ידי Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz ה"אבטיילונג" Tiergesundheit und Tierschutz, גרמניה. מכיוון וריד השער היה דמיין בנפרד ממערכת ורידי הכבד, חיות נפרדות דרושי העצים וסקולרית השונים.

1. ריאגנטים כן

  1. פתרון הפרין-מלוחה
    1. להוסיף 0.1 מ"ל הפרין לתוך מלוחים 10 מ"ל (5 IU / ml).
  2. תערובת תרכובת סיליקון
    1. הוסף 2 מ"ל MV-120 בצינור אחד 5 מ"ל. לדלל MV-120 על ידי הוספת diluent 3 מ"ל MV וכתוצאה מכך פתרון 40%.

2. הזרקת סיליקון מערכת פורטל הוורידים

  1. פיום
    1. מניחים את העכבר בתא אינדוקציה הרדמה לטשטש את זה עם 2% isoflurane ו 0.3 L / min חמצן.
    2. תקן את העכבר מורדם על שולחן הניתוחים באמצעות קלטת עם שאיפה מתמדת של 2% הםoflurane וחמצן 0.3 ליטר / דקה. בדוק את רפלקס נסיגה הבוהן קמצוץ של העכבר ולהתחיל במבצע אם רפלקס נעדר.
    3. ביצוע חתך רוחבי על הבטן באמצעות מספריים עבור שכבת העור וכן coagulator חשמלי עבור שכבת השריר. הזז את המעיים אל הצד השמאלי באמצעות טיפי כותנה ולכסות את המעיים עם גזה מלוחה ספוג.
  2. החדרת צנתר
    1. לנתח וריד השער תחת מיקרוסקופ באמצעות מיקרו-מלקחיים. מניחים תפר משי אחד 6-0 מתחת וריד שער extrahepatic, מרחק כ 1 מ"מ עד הסתעפות שלה ולקשור אותו באופן רופף לשימוש מאוחר יותר.
    2. להזריק פתרון הפרין-מלוח מוכן באמצעות וריד פין (זכר) או וריד נבוב נח (נקבה) עבור heparinization המערכתית במשך 5 דקות.
    3. הכנס את מד 26 (26 G) קטטר עם מחט לווריד פורטל ולתקן אותה עם מלחציים
  3. הפרין-מלוח פתרון זלוף סיליקון תרכובת
    1. סול הפרין-מלוח טעןution ב מזרק 5 מ"ל ולהדליק המכשיר זלוף. מלאו את הקטטר מלא עם פתרון הפרין-מלח כדי למנוע בועות אוויר.
    2. חבר צינור רחבת הקטטר ולתקן אותם בחוזקה. התחל זלוף מלוחים הפרין עם שיעור זלוף של 0.4 מ"ל / דקה.
    3. תפר משי מראש להציב ולקשור 6-0 בכפול לתקן את הקטטר וחסימת זרימת הדם מן הווריד הטחול וריד mesenteric. Euthanatize את העכבר על ידי exsanguination דרך זלוף בהרדמה.
    4. יש לשטוף את הכבד באמצעות מי מלח במהלך ההליך זלוף כולו כדי לשמור אותו לח.
    5. להוסיף 0.1 מ"ל סוכן ריפוי לתוך הצינור MV-120. שנת מזרק מלוח הפרין כדי מזרק סיליקון.
    6. התחל זלוף סיליקון עם שיעור זלוף של 0.2 מ"ל / דקה במשך כ 1 דקות כדי ולמלא מראש את מערכת קטטר וכדי למלא את מערכת וריד השער. עצור זלוף סיליקון כאשר הכלי על המשטח להכחיל.
  4. דְגִימָה
    1. שמור את הכבד in-situ until הסיליקון הוא polymerized מלא לאחר כ 15 עד 30 דקות. לנתח רצועות חיבור כבד ואיברים סמוכים בזהירות כדי לשמור כבד פגע. Explant הכבד והכניס אותו לתוך פורמלין עבור קיבעון.

3. הזרקת סיליקון מערכת הוורידים כבדיה

  1. בצע laparotomy כפי שבוצעה בשלב 2.1 ולחשוף שדה הניתוח באופן מלא.
  2. החדרת צנתר
    1. לנתח וריד השער תחת מיקרוסקופ באמצעות מיקרו-מלקחיים. מניחים תפר משי אחד 6-0 מתחת וריד שער extrahepatic, מרחק כ 1 מ"מ עד הסתעפות שלה ולקשור אותו באופן רופף לשימוש מאוחר יותר.
    2. להזריק פתרון הפרין-מלוח מוכן באמצעות וריד פין (זכר) או וריד נבוב נח (נקבה) עבור heparinization המערכתית במשך 5 דקות.
    3. הכנס אחד 26 G קטטר (צנתר 1) עם מחט לווריד פורטל ולתקן אותה עם מהדק. הכנס 26 אחר קטטר G (קטטר 2) עם מחט לתוך וריד נבוב נח ולתקן אותה עם מלחציים.
    4. ולקשור את ענפי וריד נבוב נח (כוללים ורידי כליות שמאל וימין) ואת הקצה הדיסטלי שלה באמצעות 6-0 סינטטי, monofilament, תפר פוליפרופילן nonabsorbable.
  3. הפרין-מלוח פתרון זלוף סיליקון תרכובת
    1. טען תמיסת מלח-הפרין מזרק 5 מ"ל ולהדליק המכשיר זלוף. מלאו קטטר 1 לחלוטין עם פתרון הפרין-מלח כדי למנוע בועות אוויר. חבר צינור רחב קטטר 1 ולתקן אותה בחוזקה. התחל זלוף מלוחים הפרין בשיעור של 0.4 מ"ל / דקה.
    2. תפר משי מראש להציב ולקשור 6-0 בכפול לתקן את הקטטר וחסימת זרימת הדם מן הווריד הטחול וריד mesenteric. Euthanatize את העכבר על ידי exsanguination דרך זלוף בהרדמה.
    3. יש לשטוף את הכבד באמצעות מי מלח במהלך ההליך זלוף כולו כדי לשמור אותו לח. להוסיף 0.1 מ"ל סוכן ריפוי לתוך הצינור MV-120. שער הפרין מלוח מזרק עם מזרק סיליקון.
    4. מניחים מהדק על suprahepatic נחות וריד נבוב להכשיל את היצוא של הכבד.
    5. חבור את הצינור הרחב קטטר 2 ולהתחיל זלוף סיליקון עם שיעור זלוף של 0.2 מיליליטר / דקה במשך כ 2 דקות כדי להגיע נפח כלי דם בכבד אובייקטיבי כפי שדווח. עצור זלוף סיליקון כאשר הכלי על המשטח להכחיל.
  4. דְגִימָה
    1. לנתח רצועות כבדות להימנע מכל פגיעה בכבד. Explant הכבד והכניס אותו לתוך פורמלין עבור קיבעון.

סריקה 4. Micro-CT (μCT)

כדי לסרוק המדגם הכבד explanted באמצעות μCT, השלבים הבאים נדרשים.

  1. קח המדגם הכבד מתוך פתרון הקיבעון. מניחים את הכבד על המיטה μCT. שים את המיטה μCT עם המדגם הכבד לתוך μCT.
  2. רוכשת topogram לפני תחילת הסריקה. השתמש subscan אחד למדגם הכבד הקטן והשני subscans עבור מדגמים גדולים.
  3. בחר81; פרוטוקול CT עם רזולוציה גבוהה (למשל, HQD-6565-390-90). פרוטוקול זה רוכש 720 תחזיות עם 1,032 x 1,012 פיקסלים במהלך סיבוב מלא אחד עם זמן הסריקה של 90 שניות לכל סריקת משנה. התחל את הסריקה μCT.

5. סעיפים סידורי היסטולוגית

  1. הטמע את הדגימה הכבדה פרפין בכללותו לאחר סריקת μCT. חותכים מדגם פרפין כולו למקטעים 4μm, והתוצאה היא סדרה של 2,000 עד 2,500 חלקים.
  2. סעיפי כתם עם טכניקה מכתימה מתאימה לדמיין אירועים מולקולריים של עניין כגון Ki-67 כסמן התפשטות HMGB1 כסמן של ניזק איסכמי. לקבוע רצף של מכתים בגין לשאלה מדעית.
  3. השתמש בסורק שקופיות שלם digitalize בסעיפים המוכתמים.
  4. בצע עץ 3D-מחדש של כלי דם (ים) (כבר ריאלי) ולדמיין-הפצת 3D של אירועים מולקולריים בגין לעץ וסקולרית (מחקר בתהליך).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

קריטריוני איכות

איכות הזרקת סיליקון אפשר לשפוט בעין בלתי מזוינת במהלך ההליך. הכלי הקטן על פני שטח כבדים למלא בהדרגה עם התרכובת הכחולה. אם מבנה כלי הדם הנורמלי נצפה על פני השטח הכבדים, איכות הזרקת גומי סיליקון הייתה טובה. אם נפח זלוף היה די בכל אלה, הספינות הקטנות על פני השטח הכבדים לא מולאו במלואן. לעומת זאת, במהלך המילוי שנגרם קרע של כלי דם כפי שצוין על ידי כתמי כחולים סדירים על פני השטח של האיבר. שני גורמות קשיים על 3D-שחזור בסופו של דבר טיוח הליך כישלון.

להערכה טובה יותר של איכות ההזרקה, סריקת μCT ואחריו שחזור כלי דם 3D באמצעות תוכנת פרה-קלינית בוצעה. הזרקת היה נחוש בדעתו להיות ש"ש מוצלחen פילוח הביא הדמיה של עץ כלי הדם ללא פגע שלם בלי מבנים מקרע שמציינים extravasation גלוי. אם עץ כלי הדם הופיע שלם (האיור. 1A), נפח זלוף לא היה מספיק. אם יותר מ עץ וסקולרית אחד הופיע או extravasation נתפסה (איור. 1B), נפח זלוף או הלחץ היה לקוי. זו היתה הסיבה הסבירה ביותר עבור כישלון. לחץ זלוף יכול תיאורטית להשתנות מעט בהתאם הצמיגות של הפתרון. צמיגות תלוי זמן פילמור שחלף בין ערבוב המתחם זריקה לתוך מערכת כלי הדם. מכיוון שחלק מניפולציה נדרשת לערבוב ואת הזריקה, מרווח הזמן יכול להשתנות מעט בין 3 דקות ל -5 דקות.

אם הפתרון הוא של צמיגות נמוכה, לחץ זלוף הוא נמוך. במקרה זה המתחם יכול להעביר לתוך עץ כלי הדם מוזרק הלא באמצעות מערכת סינוסימוביל נפח זלוף מעט גבוה. אם הפתרון הוא polymerized נוסף שמוביל צמיגות גבוהה יותר, לחץ זלוף יעלה, גרימת הפרעה של כלי השיט extravasation.

קביעת נפח זלוף Objective

מאז זלוף או hyperperfusion לקוי יגרום לכישלון של ההזרקה, סטנדרטיזציה נפח זלוף נחשב. כפי שדווח 2, 6% מנפח הכבד היא נכבשה על ידי הדם ו -44% מהדם בכבד מתגורר כלי גדול (למשל, עורק הכבד, וריד השער). נפח כבד בעכברים הוא כ -1.3 מ"ל 11. לכן, נפח כלי הדם סך וריד שער בעכברים נורמליים נאמד בטווח שבין 0.03 מ"ל ו 0.04 מ"ל. קצב הזרימה נקבע ל -0.2 מ"ל / דק 'ו זלוף הכולל הזמן נקבע כ 1 דקה וכתוצאה מכך בהיקף כולל מוזרקשל כ 0.2 מ"ל.

נפח גבוה לכאורה זה נחוץ, שכן מערכת קטטר חייב להיות מלא מראש, אשר לוקח בערך 0.1-0.15 מ"ל. כרך נוסף של 0.05 מיליליטר נדרש כדי למלא את וריד השער הפרוקסימלי בין hilum הכבד ואת הקשירה של הקטטר. ספיקה עבור הזרקה לווריד הכבד גם נקבע ל -0.2 מ"ל / דקה אבל הפעם זלוף הכולל הוארך עד 2 דקות, וכתוצאה מכך בהיקף כולל גבוה יותר של כ -0.4 מ"ל. הנפח הכולל intrahepatic וסקולרית הונח להיות דומה בהיקף וסקולרית וריד שער הכולל. עם זאת, נפח הדרושים כדי למלא את הווריד הנבוב intrahepatic בין קשירת infrahepatic ואת מהדק suprahepatic נאמדה עם 0.2 מ"ל.

שיעור הצלחה

סך של 49 חיות היו נתונים הזרקת סיליקון: 22 חיות למערכת PV ו -27 חיות לתוך המערכת דואר HV. שיעור הזרקת ההצלחה שלנו היה 55% (12/22) בקבוצת PV ו -89% (24/27) בקבוצת HV. אם תיקח בחשבון כי קבוצת PV שמשה להקים את טכניקת הזרקת סיליקון בהתחלה (n = 4), שיעור ההצלחה של הזרקה עבור מערכת PV צריך להיות גבוה יותר יעיל מ -55%. עם זאת, תמונות μCT המתקבל זריקות אלה היו מתאימים לשיקום 3D ו ניתוח כמותי. בנוסף, העצים וסקולרית משני PV או HV של 36 עכברים ניתן לשחזר עם תוכנת פרת Imalytics.

Parenchymal והתחדשות דם

זמן נפתר סדרת μCT של דגימות כבדות בעכברים לאחר הכריתה הייתה נתון ניתוח איכותני. התחדשות Parenchymal כללה צמיחת 3D של כבד השריד. התחדשות כלי דם הוגדרה רקמות שהציגו עלייהאורך וקוטר של הגזע וסקולרית, עם הענפים העיקריים שלה תולדה של סניפי מסוף נוספים, הוא ורידי הפורטל ועץ ורידי כבד.

נכון לעכשיו, מספר פרמטרים כמותיים מתאים לתיאור צמיחה של כלי הדם ומערכת היחסים בין התחדשות parenchymal הכבד והתחדשות כלי הדם נמצאים תחת חקירה. אלה כוללים פרמטרים המצביעים צמיחה של כלי דם, כולל אורך כלי דם מקסימאלי (איור. 2), רדיוס וסקולרית וצפיפות כלי דם במונחים של נפח אורך הכולל של כלי דם / כבד או נפח נפח / כבד וסקולרית.

נפח נפח כבד סך אונות כבדה שנבחרה חושבו. בשנת כבדי נורמלי, נפח הכבד הכולל נע בין 1.2 מ"ל ל -1.6 מ"ל (n = 6, כולל הן את הקבוצה PV וקבוצת HV). זה ירד ל -0.6 עד 0.7 מיליליטר לאחר ביצוע כריתה כבדה הוארכה הסרת שמאל lateral ואת האונה חציון. היקף הכבד גדל ללא הרף במהלך הגידול בכבד. על ידי שלאחר ניתוח יום 7 (POD 7), הנפח הכבד עלה לכ -88% מנפחו המקורי, כלומר, ב -2.6 פי. הגידול של נפח כבד בקורלציה עם התאוששות משקל כבד.

כרכים וסקולרית סה"כ של מערכת PV ומערכת HV חושבו. נפח כלי דם הכולל של מערכת HV היה גבוה יותר מאשר מערכת PV, כי חלק מן הווריד הנבוב הנח intrahepatic נכלל. נפח כלי הדם סה"כ של מערכת PV נע בין 0.05 כדי 0.08 מ"ל בעכברים נורמליים. זה ירד ל- 0.03 עד 0.04 מ"ל לאחר כריתה חלקית 70%. על ידי POD 7, נפח כלי הדם הכולל של הכבד שריד עלה ל 100% של נפח המקורי. נפח וסקולרית סך HV נע בין 0.14 כדי 0.16 מ"ל. נפח דם ירד 0.08 ל 0.09 מ"ל לאחר כריתה. בתוך שבוע לאחר הניתוח הראשון, היקף כלי הדם הכולל של הכבד שריד גדל בy 94% מהערך המקורי.

כמו היחס בין התוצאות, הגידול בהיקף וסקולרית ונפח parenchymal, צפיפות כלי הדם חושבה, ליתר דיוק את השבר נפח וסקולרית (נפח וסקולרית מחולק בנפח הכבד). זה גילה כי שבר נפח כלי דם נותר יציב יחסית לאורך כל תהליך ההתחדשות.

הדמיית 3D של אירועים מולקולריים

לאחר CT-סריקת דגימות שנבחרו היו נתונים חתך סדרתי, כניעה עד 2000 שקופיות, שהיו דיגיטלית לחלוטין ומשמש לשחזר את הפורטל וכן העץ ורידי הכבד 12. זהו תנאי הכרחי הדמיית 3D בעתיד של אירועים מולקולריים במהלך רגנרציה בגין לעץ כלי הדם גדל.

איור 1. ניטור איכות הזרקת סיליקון. א. מילוי Incomplete של וריד שער נח ימינה (חץ שמאלה) וריד פורטל caudate (חץ בפינה הימנית) היו דמיינו בתוכנת Imalytics פרה כמו שיבושים של עץ כלי הדם. עובדה זו מצביעה על נפח הלחץ זלוף לקוי או זלוף או קיומן של בועות אוויר. ב. Extravasation של וריד שער נח התקין היה דמיין אשר הצביע הפרעה של כלי עקב לחץ או hyperperfusion לקויים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
מדידת איור 2. של Vessel אורך המקסימאלי של זכותוריד שער נח. כדי לקבוע את אורך הכלי המקסימאלי, נקודת התחלה אחד ונקודת קצה אחד הונחו בשורש הקצה הדיסטלי של וריד השער הנח התקין (RIPV) של המסכה וסקולרית (סמני כדור כחולים מגנטו) בתוכנה פרה-קלינית. אורכו של שביל כלי הדם של RIPV (10.95 מ"מ) הושג כחלק מהערכת "נתיב tortuosity". אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הניגודיות את עץ כלי הדם על ידי הזרקת סיליקון וסריקה μCT כבר הציג מודלים הגידול ומודלים מחלה נוירולוגית לעתים קרובות כדי ללמוד את התקדמות angiogenic 5,7,8,10. שיפורים במתודולוגיה של הזרקת סיליקון נעשו במחקר הנוכחי המאפשרים הדמיה לכימות צמיחה של כלי דם לאחר כריתה חלקית בעכברים.

ישנם מספר שלבים קריטיים הדורשים תשומת לב כדי להשיג איכות זלוף טוב. heparinization קודם כל, המערכתי מומלץ מאוד לפני השטיפה כבדה עם הפרין או תמיסת מלח כדי למנוע קרישת דם בתוך הכבד. ביעור בועות אוויר בצינור חשוב גם כדי להשיג איכות טובה של זלוף סיליקון. קביעת שיעור זלוף לחץ צריך להיות ראשון המבוססת על פרמטרים פיסיולוגיים המודינמי 17. זמן זלוף משקף את הנפח הכולל מוזרק והוא נאמד נטילת intravascular הצפוינפח נפח prefilling של מערכת קטטר בחשבון.

סיליקון הוא תרכובת צמיגה מאוד שונה דם או תמיסת מלח. לכן, כמה ניסויים נדרשים להתאמת שיעור זלוף ולחץ. שמירת קצב ולחץ זרימת הזרקה מתמיד נחוצה כדי למנוע התרחבות חמורה או אפילו קרע של כלי דם קטנים. זמן זלוף נקבע על פי נפח הזרקת צורך המוערך. עם זאת, זלוף צריך להיפסק מיד כאשר המתחם הכחול הופך לגלוי כלי על פני השטח של הכבד. אחרת, סיליקון יכול להתנקז לתוך sinusoids ולתוך אחר מערכת כלי דם אשר תפריע שחזור מאוחר וניתוח.

בדרך כלל, סיליקון הוא perfused שיטתי דרך החדר השמאלי בדוחות שפורסמו ביותר 1,3,15. החדר השמאלי הוא קל לחשוף לאפשר גישה חופשית על הזריקה. עם זאת, החיסרון הוא כי תוואי זה הוא raיס עקיף כי חומר ניגוד יש לעבור במחזור לפני שהגיע לאתר של עניין. לפיכך, ההליך כירורגי של טכניקת הזרקת סיליקון שונה במחקר זה. בניגוד בדרך עוקפת שנבחרו לעתים קרובות היישום מבוצע על ידי אחרים, מתחם סיליקון הוזרק ישירות לתוך מערכת כלי הדם של עניין, במקום נוגד את כל הגוף. בדרך זו, על המהירות ועל נפח של זלוף ניתן לשלוט טוב יותר. מערכת ורידי הפורטל ומערכות ורידי כבד ניתן perfused ושחזרו בנפרד לניתוח בודד לאחר מכן, כפי שניתן לראות בסרטון.

המגבלה של הליך זה שונה היא הקושי הטכני. זה מאתגר לבצע בהצלחת זריקה intraportal באמצעות תרכובת צמיגה מאוד בעכברים, כי המבנה של כלי הדם הוא כל כך עדין. זה די קל להרוס את הכלי במהלך ההליך. לפיכך, דיסקציה וריד שער ו קטטר insertion צריך להתבצע בעדינות.

הניגודיות של עצי כלי דם הדמית μCT הבאה של כבדי explanted היא כלי שימושי המאפשר הדמיה לכימות התחדשות כלי דם לאחר כריתה חלקית. פרמטרים וסקולרית כמוני יכולים להיות מנוצלים עבור הבנה טובה יותר של הקינטית של צמיחת כלי דם בהתקדמות של התחדשות כבדה. יתר על כן, שחזור 3D של שני מערכות וסקולרית כבדות על בסיס סעיפי סדרתי קיימת היתכנות טכנית, אם כי מייצג עומס עבודה עצום.

טכניקה זו ניתן ליישם מודלים רבים שבהם להדמיה וכימות של צמיחה של כלי הדם חשוב. יתר על כן, הדמיית 3D של אירועים מולקולריים בגין לעץ כלי הדם הבסיסי הוא בהישג. דוגמאות של אירועים מולקולריים של עניין יכול להיות זיהוי של סמן התפשטות כגון Ki-67 או סמנים של נזק איסכמי כגון HMGB1. הערכת ev המולקולרי נפתר מרחביתהמציג בקרבת העץ וסקולרית ההתחדשות בתוך parenchyma כבד ההתחדשות הוא התנאי ההכרחי עבור מודלי ביולוגיה מערכתיות רב היקף מתקדמים. טכניקת הזרקת סיליקון זהו צעד ניסיוני אחד לעבר השגת מטרה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PERFUSOR® VI B.BRAUN 87 222/0
Pipetus®-akku Hirschmann 9907200
Pipets Greiner 606180
micro scissors Fine Science Tools (F·S·L) No. 14058-09
micro serrefine Fine Science Tools (F·S·L) No.18055-05
Micro clamps applicator Fine Science Tools (F·S·L) No. 18057-14
Straight micro forceps Fine Science Tools (F·S·L) No. 00632-11
Curved micro forceps Fine Science Tools (F·S·L) No. 00649-11
needle-holder Fine Science Tools (F·S·L) No. 12061-01
1 ml syringe B.Braun 9161406V
5 ml syringe B.Braun 4606051V
extension and connection lines B.Braun 4256000 30 cm, inner ø 1.2 mm
6-0 silk (Perma-Hand Seide) Ethicon 639H
6-0 prolene Ethicon 8711H
Microfil® MV diluent FLOW TECH, INC
Microfil® MV - 120 FLOW TECH, INC MV - 120 (blue)
MV curing agent FLOW TECH, INC
Heparin 2500 I.E./5 ml Rotexmedica ETI3L318-15
Saline Fresenius Kabi Deutschland GmbH E15117/D DE
Imalytics Preclinical software Experimental Molecular Imaging, RWTH Aachen University, Germany
HepaVision Fraunhofer MEVIS, Bremen, Germany
NanoZoomer 2.0-HT Digital slide scanner Hamamatsu Electronic Press, Japan  C9600
Tomoscope Duo CT  CT Imaging GmbH, Erlangen, Germany TomoScope® Synergy

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bearden, S. E., Segal, S. S. Neurovascular alignment in adult mouse skeletal muscles. Microcirculation. 12, (2), 161-167 (2005).
  2. Brown, R. P., Delp, M. D., Lindstedt, S. L., Rhomberg, L. R., Beliles, R. P. Physiological parameter values for physiologically based pharmacokinetic models. Toxicol.Ind.Health. 13, (4), 407-484 (1997).
  3. Dai, D., et al. Elastase-Induced Intracranial Dolichoectasia Model in Mice. Neurosurgery. (2015).
  4. Ding, B. S., et al. Inductive angiocrine signals from sinusoidal endothelium are required for liver regeneration. Nature. 468, (7321), 310-315 (2010).
  5. Downey, C. M., et al. Quantitative ex-vivo micro-computed tomographic imaging of blood vessels and necrotic regions within tumors. PLoS.One. 7, (7), 41685 (2012).
  6. Ehling, J., et al. CCL2-dependent infiltrating macrophages promote angiogenesis in progressive liver fibrosis. Gut. (2014).
  7. Ehling, J., et al. Micro-CT imaging of tumor angiogenesis: quantitative measures describing micromorphology and vascularization. Am.J.Pathol. 184, (2), 431-441 (2014).
  8. Ghanavati, S., Yu, L. X., Lerch, J. P., Sled, J. G. A perfusion procedure for imaging of the mouse cerebral vasculature by X-ray micro-CT. J.Neurosci.Methods. 221, 70-77 (2014).
  9. Gremse, F., et al. Hybrid microCT-FMT imaging and image analysis. J.Vis.Exp. (100), (2015).
  10. Jing, X. L., et al. Radiomorphometric quantitative analysis of vasculature utilizing micro-computed tomography and vessel perfusion in the murine mandible. Craniomaxillofac.Trauma Reconstr. 5, (4), 223-230 (2012).
  11. Melloul, E., et al. Small animal magnetic resonance imaging: an efficient tool to assess liver volume and intrahepatic vascular anatomy. J.Surg.Res. 187, (2), 458-465 (2014).
  12. Schwier, M., Bohler, T., Hahn, H. K., Dahmen, U., Dirsch, O. Registration of histological whole slide images guided by vessel structures. J.Pathol.Inform. 4, ((Suppl)), 10 (2013).
  13. Selle, D., Preim, B., Schenk, A., Peitgen, H. O. Analysis of vasculature for liver surgical planning. IEEE Trans.Med.Imaging. 21, (11), 1344-1357 (2002).
  14. Shergill, U., et al. Inhibition of of VEGF- and NO-dependent angiogenesis does not impair liver regeneration. Am.J.Physiol Regul.Integr.Comp Physiol. 298, (5), 1279-1287 (2010).
  15. Sueyoshi, R., Ralls, M. W., Teitelbaum, D. H. Glucagon-like peptide 2 increases efficacy of distraction enterogenesis. J.Surg.Res. 184, (1), 365-373 (2013).
  16. Wei, W., et al. Rodent models and imaging techniques to study liver regeneration. Eur.Surg.Res. 54, (3-4), 97-113 (2015).
  17. Xie, C., Wei, W., Zhang, T., Dirsch, O., Dahmen, U. Monitoring of systemic and hepatic hemodynamic parameters in mice. J.Vis.Exp. (92), e51955 (2014).
ויזואליזציה של התחדשות כלי דם Parenchymal לאחר 70% חלקיות כריתה בעכברים נורמליים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xie, C., Wei, W., Schenk, A., Schwen, L. O., Zafarnia, S., Schwier, M., Gremse, F., Jank, I., Dirsch, O., Dahmen, U. Visualization of Vascular and Parenchymal Regeneration after 70% Partial Hepatectomy in Normal Mice. J. Vis. Exp. (115), e53935, doi:10.3791/53935 (2016).More

Xie, C., Wei, W., Schenk, A., Schwen, L. O., Zafarnia, S., Schwier, M., Gremse, F., Jank, I., Dirsch, O., Dahmen, U. Visualization of Vascular and Parenchymal Regeneration after 70% Partial Hepatectomy in Normal Mice. J. Vis. Exp. (115), e53935, doi:10.3791/53935 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter