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Medicine

सामान्य चूहों में 70% आंशिक hepatectomy के बाद संवहनी और Parenchymal उत्थान के दृश्य

doi: 10.3791/53935 Published: September 13, 2016

Abstract

एक संशोधित सिलिकॉन इंजेक्शन प्रक्रिया यकृत संवहनी पेड़ के दृश्य के लिए इस्तेमाल किया गया था। यह प्रक्रिया, सिलिकॉन परिसर के इन विवो इंजेक्शन के शामिल है, एक 26 जी कैथेटर के माध्यम से पोर्टल या यकृत नस में। सिलिकॉन इंजेक्शन के बाद, अंगों explanted और पूर्व विवो सूक्ष्म सीटी (μCT) स्कैनिंग के लिए तैयार थे। सिलिकॉन इंजेक्शन प्रक्रिया तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है। एक सफल परिणाम हासिल करने सर्जन से व्यापक microsurgical अनुभव की आवश्यकता है। इस प्रक्रिया की चुनौतियों में से एक सिलिकॉन परिसर के लिए पर्याप्त मात्रा में छिड़काव दर का निर्धारण शामिल है। सिलिकॉन परिसर के लिए छिड़काव दर ब्याज की नाड़ी तंत्र की रक्तसंचारप्रकरण के आधार पर परिभाषित किया जाना चाहिए। अनुचित छिड़काव दर एक अधूरी छिड़काव, कृत्रिम फैलाव और नाड़ी पेड़ों की rupturing के लिए नेतृत्व कर सकते हैं।

नाड़ी तंत्र के 3D पुनर्निर्माण सीटी स्कैन के आधार पर किया गया था और का उपयोग कर हासिल की थीऐसे HepaVision के रूप में preclinical सॉफ्टवेयर। खंगाला संवहनी पेड़ की गुणवत्ता को सीधे सिलिकॉन छिड़काव की गुणवत्ता से संबंधित था। इसके बाद से गणना की नाड़ी इस तरह कुल संवहनी मात्रा के रूप में संवहनी वृद्धि का संकेत मापदंडों, नाड़ी पुनर्निर्माण के आधार पर गणना की गई। सिलिकॉन के साथ संवहनी पेड़ बाद ऊतकीय μCT स्कैनिंग के बाद नमूना के काम-अप के लिए अनुमति दी विषम। नमूना उसके बाद ऊतकीय छवियों पर आधारित संवहनी पेड़ों की 3 डी पुनर्निर्माण करने के लिए धारावाहिक सेक्शनिंग, ऊतकीय विश्लेषण और पूरे स्लाइड स्कैनिंग के लिए किए जा सकते हैं, और। यह आणविक घटनाओं का पता लगाने और नाड़ी पेड़ के संबंध में उनके वितरण के लिए शर्त है। इस संशोधित सिलिकॉन इंजेक्शन प्रक्रिया भी कल्पना और अन्य अंगों की नाड़ी सिस्टम को फिर से संगठित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस तकनीक को संभावित बड़े पैमाने पर नाड़ी शरीर रचना विज्ञान और विभिन्न पशु एक में विकास के विषय में अध्ययन के लिए लागू किया जाना हैएन डी रोग मॉडल।

Introduction

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लिवर उत्थान अक्सर जिगर वजन और मात्रा की वृद्धि को मापने के द्वारा और hepatocyte प्रसार दर 16 का आकलन करने से चुना गया है। हालांकि, जिगर उत्थान न केवल parenchymal उत्थान लेकिन यह भी संवहनी उत्थान 6 उत्प्रेरण है। इसलिए, संवहनी विकास आगे जिगर उत्थान की प्रगति में अपनी भूमिका के संबंध में जांच की जानी चाहिए। यकृत संवहनी प्रणाली के दृश्य संवहनी उत्थान के बारे में हमारी समझ को आगे बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण है। कई अप्रत्यक्ष तरीकों यकृत संवहनी उत्थान के अंतर्निहित आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है। परंपरागत रूप से, साइटोकिन्स का पता लगाने (संवहनी endothelial वृद्धि कारक, वीईजीएफ़) 14, chemokines और उनके रिसेप्टर्स (CXCR4 / CXCR7 / CXCL12) 4 संवहनी उत्थान के अध्ययन के लिए मुख्य आधार किया गया है। हालांकि, एक 3 डी मॉडल वाहिका के मात्रात्मक विश्लेषण के साथ मिलकर महत्वपूर्ण शारीरिक जोड़ना होगाजानकारी यकृत parenchymal और नाड़ी उत्थान के बीच महत्वपूर्ण संबंध का एक बेहतर समझ हासिल करने के लिए।

यकृत नाड़ी तंत्र है, जो संवहनी पेड़ विषम आवश्यकता कल्पना, चूहों सीधे पोर्टल या यकृत शिरापरक संवहनी पेड़ में एक radiopaque सिलिकॉन रबर विपरीत एजेंट के साथ इंजेक्शन थे। सिलिकॉन और अंग की explantation के polymerization के बाद, जिगर नमूने एक सीटी स्कैनर का उपयोग कर μCT स्कैनिंग के अधीन थे। स्कैन voxel की छवि अभ्यावेदन में हुई सिलिकॉन इंजेक्शन के 9 नमूनों।

गुणवत्ता नियंत्रण के लिए, नाड़ी तंत्र पहले preclinical सॉफ्टवेयर का उपयोग कर 3 डी में कल्पना की गई थी। विभाजन नरम ऊतक तीव्रता और पोत तीव्रता के बीच एक सीमा की स्थापना द्वारा प्रदर्शन किया गया था। जिसके परिणामस्वरूप पोत मुखौटा सतह प्रतिपादन का उपयोग कर कल्पना की गई थी। इस सॉफ्टवेयर को भी Vascul के दो मापदंडों के मैनुअल निर्धारण के लिए अनुमति दीएआर विकास: अधिक से अधिक पोत की लंबाई और त्रिज्या।

एक preclinical सॉफ्टवेयर तो संवहनी पेड़ों की 3 डी पुनर्निर्माण और आपूर्ति या draining संवहनी प्रदेशों 13 के बाद के गणना के लिए इस्तेमाल किया गया था। इसके अलावा, इस सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से इस तरह के सभी दृश्य संवहनी संरचनाओं भी कुल बढ़त लंबाई या कुल पोत मात्रा के रूप में जाना जाता है की कुल लंबाई के रूप में संवहनी विकास के कुछ मानकों को निर्धारित किया।

सिलिकॉन छिड़काव प्रक्रिया भोले चूहों में और चूहों कि 70% कराना पड़ा आंशिक hepatectomy (पीएच) में प्रदर्शन किया गया था। यकृत संवहनी और parenchymal जिगर उत्थान का विश्लेषण ऊपर उल्लिखित दृश्य और मात्रा का ठहराव तकनीक का उपयोग कर के लिए लकीर के बाद अलग अवलोकन समय बिंदुओं पर एकत्र किए गए थे।

(1) नाजुक इंजेक्शन तकनीक इष्टतम विषम और (2) संभावित लाभ जिसके परिणामस्वरूप बुधवार दिखाने प्राप्त करने की आवश्यकता का प्रदर्शन: इस फिल्म के मुख्य लक्ष्यों के लिए कर रहेओम μCT और histological धारावाहिक वर्गों का उपयोग कर परिणामस्वरूप नमूना का एक विस्तृत विश्लेषण। इस फिल्म को देखने के बाद, पाठक कैसे एक विशेष नाड़ी तंत्र में और उपयोगिता और तकनीक की प्रयोज्यता की सिलिकॉन यौगिक इंजेक्षन करने का एक बेहतर समझ होनी चाहिए।

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Protocol

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पशु विषयों को शामिल प्रक्रियाओं Thüringer Landesamt फर Verbraucherschutz Abteilung Tiergesundheit und Tierschutz, जर्मनी द्वारा अनुमोदित किया गया है। क्योंकि पोर्टल शिरापरक प्रणाली यकृत शिरापरक प्रणाली से अलग से कल्पना की गई थी, अलग अलग जानवरों संवहनी पेड़ों के लिए की जरूरत थी।

1. अभिकर्मकों तैयारी

  1. हेपरिन खारा समाधान
    1. 10 मिलीलीटर खारा (5 आइयू / एमएल) में 0.1 मिलीलीटर हेपरिन जोड़ें।
  2. सिलिकॉन यौगिक मिश्रण
    1. एक 5 मिलीलीटर ट्यूब में 2 मिलीलीटर एमवी 120 जोड़े। 3 मिलीग्राम एमवी एक 40% समाधान में जिसके परिणामस्वरूप मंदक जोड़कर एमवी 120 पतला।

2. पोर्टल शिरापरक प्रणाली सिलिकॉन इंजेक्शन

  1. laparotomy
    1. संज्ञाहरण प्रेरण कक्ष में माउस प्लेस और 2% isoflurane और 0.3 एल / मिनट ऑक्सीजन के साथ यह चतनाशून्य।
    2. निरंतर साँस लेना के साथ टेप का उपयोग ऑपरेटिंग मेज पर anaesthetized माउस को ठीक से 2% हैoflurane और 0.3 एल / मिनट ऑक्सीजन। माउस के पैर के अंगूठे चुटकी वापसी पलटा चेक करें और ऑपरेशन शुरू अगर पलटा अनुपस्थित है।
    3. त्वचा की परत और मांसपेशियों परत के लिए एक बिजली के coagulator के लिए कैंची का उपयोग पेट पर एक अनुप्रस्थ चीरा। कपास युक्तियों का उपयोग करने के लिए बाईं ओर आंतों से बाहर ले जाएँ और खारा लथपथ धुंध के साथ आंतों को कवर किया।
  2. कैथेटर प्रविष्टि
    1. माइक्रोस्कोप सूक्ष्म संदंश का उपयोग तहत पोर्टल नस काटना। नीचे extrahepatic पोर्टल शिरा एक 6-0 रेशम सीवन की जगह, लगभग 1 मिमी अपने विभाजन के लिए दूरी में और बाद में उपयोग के लिए शिथिल टाई।
    2. 5 मिनट के लिए प्रणालीगत heparinization के लिए के माध्यम से शिश्न नस (पुरुष) तैयार हेपरिन-नमकीन घोल या अवर रग Cava (महिला) इंजेक्षन।
    3. पोर्टल नस में 26 गेज (26 जी) सुई के साथ कैथेटर डालने और एक क्लैंप के साथ इसे ठीक
  3. हेपरिन खारा समाधान और सिलिकॉन यौगिक छिड़काव
    1. लोड हेपरिन खारा प5 मिलीलीटर सिरिंज में संविधान और छिड़काव उपकरण चालू करें। हेपरिन खारा समाधान के साथ पूरी तरह से कैथेटर भरें हवा के बुलबुले से बचने के लिए।
    2. कैथेटर को विस्तार ट्यूब कनेक्ट और कसकर उन्हें ठीक। 0.4 मिलीग्राम / मिनट की एक छिड़काव दर के साथ हेपरिन खारा छिड़काव शुरू करो।
    3. डबल कैथेटर फिक्सिंग और प्लीहा नस और mesenteric नस से रक्त के प्रवाह को रोकने के लिए Ligate पूर्व रखा 6-0 रेशम सीवन। संज्ञाहरण के तहत छिड़काव के माध्यम से exsanguination द्वारा माउस Euthanatize।
    4. आदेश में यह नम रखने के लिए जिगर पूरे छिड़काव की प्रक्रिया के दौरान खारा का उपयोग कर कुल्ला।
    5. एमवी 120 ट्यूब में इलाज के एजेंट 0.1 मिलीलीटर जोड़ें। सिलिकॉन सिरिंज के लिए हेपरिन खारा सिरिंज बदलें।
    6. लगभग 1 मिनट के लिए 0.2 मिलीग्राम / मिनट की दर से छिड़काव कैथेटर प्रणाली prefill के लिए और पोर्टल शिरा प्रणाली को भरने के लिए के साथ सिलिकॉन छिड़काव शुरू करो। सिलिकॉन छिड़काव बंद करो जब सतह पर जहाजों नीले रंग की बारी है।
  4. सैम्पलिंग
    1. में सीटू UNT जिगर रखेंआईएल सिलिकॉन पूरी तरह से करने के बाद लगभग 15 से 30 मिनट के लिए polymerized है। देखभाल के साथ जिगर और आसन्न अंगों को जोड़ने जिगर बरकरार रखने के लिए स्नायुबंधन काटना। जिगर explant और formalin में यह निर्धारण के लिए डाल दिया।

3. यकृत शिरापरक प्रणाली सिलिकॉन इंजेक्शन

  1. के रूप में 2.1 चरण में प्रदर्शन laparotomy प्रदर्शन और पूरी तरह से सहकारी क्षेत्र को बेनकाब।
  2. कैथेटर प्रविष्टि
    1. माइक्रोस्कोप सूक्ष्म संदंश का उपयोग तहत पोर्टल नस काटना। नीचे extrahepatic पोर्टल शिरा एक 6-0 रेशम सीवन की जगह, लगभग 1 मिमी अपने विभाजन के लिए दूरी में और बाद में उपयोग के लिए शिथिल टाई।
    2. 5 मिनट के लिए प्रणालीगत heparinization के लिए के माध्यम से शिश्न नस (पुरुष) तैयार हेपरिन-नमकीन घोल या अवर रग Cava (महिला) इंजेक्षन।
    3. पोर्टल नस में सुई के साथ एक 26 जी कैथेटर (कैथेटर 1) डालें और एक क्लैंप के साथ यह तय कर लो। अवर रग Cava में सुई के साथ एक और 26 जी कैथेटर (कैथेटर 2) डालें और एक क्लैंप के साथ इसे ठीक।
    4. अवर रग Cava (बाएं और दाएं गुर्दे की नसों सहित) और उसके बाहर का अंत की शाखाओं 6-0 सिंथेटिक, monofilament, nonabsorbable polypropylene सीवन का उपयोग ligate।
  3. हेपरिन खारा समाधान और सिलिकॉन यौगिक छिड़काव
    1. 5 मिलीलीटर सिरिंज में हेपरिन-नमकीन घोल लोड और छिड़काव उपकरण चालू करें। हेपरिन खारा समाधान के साथ पूरी तरह से कैथेटर 1 भरें हवा के बुलबुले से बचने के लिए। कैथेटर 1 करने के लिए विस्तार ट्यूब कनेक्ट और कसकर यह तय कर लो। 0.4 मिलीग्राम / मिनट की दर से हेपरिन खारा छिड़काव शुरू करो।
    2. डबल कैथेटर फिक्सिंग और प्लीहा नस और mesenteric नस से रक्त के प्रवाह को रोकने के लिए Ligate पूर्व रखा 6-0 रेशम सीवन। संज्ञाहरण के तहत छिड़काव के माध्यम से exsanguination द्वारा माउस Euthanatize।
    3. आदेश में यह नम रखने के लिए जिगर पूरे छिड़काव की प्रक्रिया के दौरान खारा का उपयोग कर कुल्ला। एमवी 120 ट्यूब में इलाज के एजेंट 0.1 मिलीलीटर जोड़ें। एक्सचेंज हेपरिन खारा सिलिकॉन सिरिंज के साथ सिरिंज।
    4. suprahepat पर एक क्लैंप रखेंआईसी अवर रग Cava जिगर का बहिर्वाह में बाधा डालती।
    5. 2 कैथेटर और लगभग 2 मिनट के लिए 0.2 मिलीग्राम / मिनट की दर से छिड़काव के साथ सिलिकॉन छिड़काव शुरू एक उद्देश्य यकृत संवहनी मात्रा तक पहुँचने के रूप में सूचित करने के लिए विस्तार ट्यूब कनेक्ट करें। सिलिकॉन छिड़काव बंद करो जब सतह पर जहाजों नीले रंग की बारी है।
  4. सैम्पलिंग
    1. जिगर के लिए किसी भी चोट से परहेज यकृत स्नायुबंधन काटना। जिगर explant और formalin में यह निर्धारण के लिए डाल दिया।

4. सूक्ष्म सीटी (μCT) स्कैनिंग

μCT का उपयोग कर explanted जिगर नमूना स्कैन करने के लिए, निम्न चरणों के लिए आवश्यक हैं।

  1. नियतन समाधान से बाहर जिगर नमूना ले लो। μCT बिस्तर पर जिगर रखें। μCT में जिगर नमूने के साथ μCT बिस्तर डाल।
  2. स्कैन शुरू करने से पहले topogram मोल। छोटे जिगर नमूना के लिए एक subscan और बड़े नमूने के लिए दो subscans का प्रयोग करें।
  3. एक चुने81, एक उच्च संकल्प के साथ सीटी प्रोटोकॉल (जैसे, HQD-6565-390-90)। इस प्रोटोकॉल के अनुसार उप-स्कैन 90 सेकंड की स्कैनिंग के समय के साथ एक पूर्ण रोटेशन के दौरान 1,032 x 1,012 पिक्सल के साथ 720 अनुमानों प्राप्त कर लेता है। μCT स्कैन शुरू करो।

5. ऊतकीय धारावाहिक वर्गों

  1. μCT स्कैनिंग के बाद एक पूरे के रूप में पैराफिन में जिगर नमूना शामिल करें। 4μm वर्गों में पूरे आयल नमूना कट, 2,000 से 2,500 वर्गों की एक श्रृंखला में जिसके परिणामस्वरूप।
  2. उचित धुंधला तकनीक के साथ दाग वर्गों में इस तरह के प्रसार मार्कर और इस्कीमिक क्षति के एक मार्कर के रूप में HMGB1 के रूप में की-67 के रूप में ब्याज की आणविक घटनाओं कल्पना करने के लिए। वैज्ञानिक सवाल के संबंध में धुंधला के अनुक्रम का निर्धारण करें।
  3. दाग वर्गों डिजिटलीकरण के लिए एक पूरी स्लाइड स्कैनर का प्रयोग करें।
  4. संवहनी पेड़ (एस) (पहले से ही संभव) की 3 डी पुनर्निर्माण प्रदर्शन और नाड़ी पेड़ (प्रगति में अनुसंधान) के संबंध में आणविक घटनाओं के 3 डी-वितरण कल्पना।

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Representative Results

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गुणवत्ता के मानदंड

सिलिकॉन इंजेक्शन की गुणवत्ता की प्रक्रिया के दौरान नग्न आंखों के साथ न्याय किया जा सकता है। जिगर की सतह पर छोटे जहाजों नीले परिसर के साथ धीरे-धीरे भरने के लिए। सामान्य संवहनी संरचना जिगर सतह पर मनाया गया, तो सिलिकॉन रबर इंजेक्शन गुणवत्ता अच्छी थी। अगर छिड़काव की मात्रा अपर्याप्त था, जिगर की सतह पर छोटे जहाजों पूरी तरह से भरे नहीं थे। इसके विपरीत, भरने पर संवहनी टूटना कारण के रूप में अंग की सतह पर अनियमित नीले धब्बे द्वारा संकेत दिया। दोनों पर 3 डी पुनर्निर्माण अंततः एक प्रक्रिया एक विफलता प्रतिपादन कठिनाइयों पैदा कर रहे हैं।

इंजेक्शन गुणवत्ता के बेहतर मूल्यांकन के लिए, μCT स्कैनिंग 3 डी संवहनी पुनर्निर्माण preclinical सॉफ्टवेयर का उपयोग कर के द्वारा पीछा किया गया था। इंजेक्शन सफल क होने के लिए निर्धारित किया गया थाएन विभाजन दिखाई परिस्त्राव ने संकेत दिया उठी संरचनाओं के बिना एक अक्षुण्ण पूरा संवहनी पेड़ के दृश्य में हुई। अगर संवहनी पेड़ अधूरा दिखाई दिया (छवि। 1 ए), छिड़काव की मात्रा अपर्याप्त था। एक से अधिक संवहनी पेड़ दिखाई दिया या परिस्त्राव में देखा गया था, तो (छवि। 1 बी), छिड़काव की मात्रा या दबाव अपर्याप्त थी। यह एक विफलता के लिए सबसे अधिक संभावना कारण था। छिड़काव दबाव सैद्धांतिक रूप से समाधान की चिपचिपाहट के आधार पर थोड़ा भिन्न हो सकते हैं। चिपचिपापन polymerization समय नाड़ी तंत्र में यौगिक और इंजेक्शन मिश्रण के बीच गुजरे पर निर्भर है। चूंकि कुछ हेरफेर मिश्रण और इंजेक्शन के लिए आवश्यक है, समय अंतराल थोड़ा 5 मिनट के लिए 3 मिनट के बीच भिन्न हो सकते हैं।

समाधान कम चिपचिपापन का है, छिड़काव दबाव कम है। इस मामले में यौगिक sinusoidal प्रणाली के माध्यम से गैर इंजेक्शन संवहनी पेड़ में हस्तांतरण कर सकते हैंएक से थोड़ा अधिक मात्रा छिड़काव के लिए अग्रणी। समाधान के लिए आगे एक उच्च चिपचिपाहट के लिए अग्रणी polymerized है, तो छिड़काव दबाव बढ़ जाएगा, जहाजों और परिस्त्राव के विघटन के कारण।

उद्देश्य छिड़काव मात्रा के निर्धारण

अपर्याप्त छिड़काव या hyperperfusion के बाद इंजेक्शन की विफलता के कारण होता है, मानकीकरण छिड़काव मात्रा माना जाता था। के रूप में 2 की सूचना दी, यकृत की मात्रा का 6% रक्त के कब्जे में है और जिगर में रक्त का 44% बड़े जहाजों (जैसे, यकृत धमनी, पोर्टल नस) में रहता है। चूहों में लिवर मात्रा के बारे में 1.3 मिलीलीटर 11 है। इसलिए, सामान्य चूहों में पोर्टल शिरापरक प्रणाली में कुल संवहनी मात्रा 0.03 मिलीग्राम और 0.04 मिलीग्राम के बीच सीमा का अनुमान था। प्रवाह की दर 0.2 मिलीग्राम / मिनट और कुल छिड़काव समय के लिए स्थापित किया गया था लगभग 1 मिनट कुल इंजेक्शन की मात्रा में जिसके परिणामस्वरूप के लिए स्थापित किया गया थाके आसपास 0.2 मिलीलीटर।

यह प्रतीत होता है उच्च मात्रा की जरूरत है, के बाद से कैथेटर प्रणाली प्रीफिल्ड किया जाना चाहिए, जो 0.1-0.15 के बारे में मिलीलीटर लेता है। 0.05 मिलीग्राम की एक अतिरिक्त मात्रा जिगर नाभिका और कैथेटर की बंधाव के बीच समीपस्थ पोर्टल शिरा को भरने की जरूरत है। यकृत नस इंजेक्शन के लिए प्रवाह की दर भी 0.2 मिलीग्राम / मिनट लेकिन कुल छिड़काव समय के बारे में 0.4 मिलीलीटर की एक उच्च कुल मात्रा में जिसके परिणामस्वरूप 2 मिनट के लिए लंबे समय तक किया गया था, के लिए स्थापित किया गया था। कुल intrahepatic संवहनी मात्रा कुल पोर्टल शिरा संवहनी मात्रा के समान माना जाता था। हालांकि, मात्रा infrahepatic बंधाव और suprahepatic दबाना 0.2 मिलीलीटर के साथ अनुमान लगाया गया था के बीच intrahepatic रग कावा को भरने की जरूरत है।

सफलता दर

वें में पीवी प्रणाली में 22 जानवरों और 27 जानवरों: 49 जानवरों की कुल सिलिकॉन इंजेक्शन के अधीन थेई एचवी प्रणाली। हमारे इंजेक्शन की सफलता की दर पीवी समूह में 55% (12/22) और एचवी समूह में 89% (24/27) था। ध्यान में रखते हुए कि पीवी समूह शुरुआत में सिलिकॉन इंजेक्शन तकनीक स्थापित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था (एन = 4), पीवी प्रणाली के लिए इंजेक्शन की सफलता की दर को प्रभावी ढंग से 55% से अधिक होना चाहिए। हालांकि, इन इंजेक्शनों से प्राप्त μCT छवियों 3 डी पुनर्निर्माण और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए उपयुक्त थे। इसके अतिरिक्त, या तो पीवी या 36 चूहों के एचवी से संवहनी पेड़ Imalytics Preclinical सॉफ्टवेयर के साथ खंगाला जा सकता है।

Parenchymal और संवहनी पुनर्जनन

एक समय संकल्प लिया murine जिगर के नमूनों की μCT श्रृंखला के बाद hepatectomy एक गुणात्मक विश्लेषण के अधीन था। Parenchymal उत्थान बचे हुए जिगर के 3 डी विकास शामिल थे। संवहनी उत्थान ऊतक कि में वृद्धि दिखाया गया के रूप में परिभाषित किया गया थालंबाई और नाड़ी स्टेम के व्यास, इसका मुख्य शाखाओं और अतिरिक्त टर्मिनल शाखाओं के परिणाम, दोनों में पोर्टल शिरापरक और यकृत शिरापरक पेड़ के साथ।

वर्तमान में, संवहनी विकास और यकृत parenchymal उत्थान और नाड़ी उत्थान के बीच संबंधों का वर्णन करने के लिए उपयुक्त कई मात्रात्मक मानकों को जांच के अधीन हैं। ये संवहनी वृद्धि का संकेत पैरामीटर, अधिक से अधिक संवहनी लंबाई सहित (छवि। 2), नाड़ी त्रिज्या और कुल लंबाई संवहनी / जिगर मात्रा या नाड़ी मात्रा / जिगर की मात्रा के संदर्भ में संवहनी घनत्व।

कुल जिगर मात्रा और चयनित जिगर पालियों की मात्रा की गणना की गई। सामान्य यकृत में कुल जिगर मात्रा 1.2 मिलीग्राम से 1.6 मिलीलीटर (एन = 6, पीवी समूह और एचवी समूह दोनों सहित) तक बताया गया। यह बाईं Lat को हटाने के द्वारा एक विस्तारित जिगर लकीर प्रदर्शन के बाद 0.7 मिलीलीटर 0.6 की कमी हुईआम और मंझला पालि। जिगर मात्रा जिगर विकास के दौरान लगातार वृद्धि हुई है। पोस्ट ऑपरेटिव दिन 7 (पॉड 7) के द्वारा, जिगर की मात्रा, अपने मूल मात्रा, यानी की लगभग 88% की वृद्धि हुई 2.6 गुना। जिगर की मात्रा में वृद्धि जिगर वजन वसूली के साथ सहसंबद्ध।

पीवी प्रणाली और एचवी प्रणाली की कुल संवहनी खंडों में गणना कर रहे थे। एचवी प्रणाली की कुल संवहनी मात्रा PV प्रणाली की तुलना में अधिक था क्योंकि intrahepatic अवर रग कावा का हिस्सा शामिल किया गया था। पीवी प्रणाली की कुल संवहनी मात्रा सामान्य चूहों में 0.05 0.08 मिलीलीटर से लेकर। यह 70% आंशिक hepatectomy के बाद 0.04 मिलीलीटर के लिए 0.03 की कमी हुई। द्वारा पॉड 7, बचे हुए जिगर की कुल संवहनी मात्रा मूल मात्रा के 100% की वृद्धि हुई। एचवी की कुल संवहनी मात्रा 0.14 से 0.16 मिलीलीटर तक बताया गया। संवहनी मात्रा लकीर के बाद 0.08 0.09 मिलीलीटर की कमी हुई। पहले पश्चात सप्ताह के भीतर, बचे हुए जिगर की कुल संवहनी मात्रा में वृद्धि हुई खY मूल मूल्य का 94%।

परिणाम, नाड़ी की मात्रा और parenchymal मात्रा में वृद्धि के बीच संबंध के रूप में, एक संवहनी घनत्व की गणना की गई, और अधिक ठीक संवहनी मात्रा अंश (नाड़ी मात्रा जिगर मात्रा से विभाजित)। यह पता चला है कि नाड़ी मात्रा अंश उत्थान प्रक्रिया के दौरान अपेक्षाकृत स्थिर बने रहे।

आणविक घटनाओं की 3 डी दृश्य

बाद सीटी-स्कैन कर रहा चुने गए नमूनों, धारावाहिक सेक्शनिंग के अधीन थे करने के लिए 2000 स्लाइड, जो पूरी तरह से digitalized और पोर्टल को फिर से संगठित करने के लिए यकृत शिरापरक पेड़ 12 के रूप में के रूप में अच्छी तरह से इस्तेमाल कर रहे थे करने के लिए उपज। यह भविष्य 3 डी बढ़ रही संवहनी पेड़ के संबंध में उत्थान के दौरान आणविक घटनाओं के दृश्य के लिए शर्त है।

चित्रा 1. सिलिकॉन इंजेक्शन की गुणवत्ता की निगरानी करना। सही अवर पोर्टल शिरा का। अंडरग्रेजुएट भरने (बाएँ में तीर) और पूंछवाला पोर्टल शिरा (सही में तीर) संवहनी पेड़ के रूप में discontinuities Imalytics Preclinical सॉफ्टवेयर में कल्पना थे। यह एक अपर्याप्त छिड़काव दबाव या छिड़काव मात्रा या हवा के बुलबुले का अस्तित्व। बी संकेत दिया। सही अवर पोर्टल शिरा के परिस्त्राव कल्पना की गई थी, जो अपर्याप्त दबाव या hyperperfusion के कारण एक पोत के विघटन का संकेत दिया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. अधिकार का अधिक से अधिक पोत लंबाई की मापअवर पोर्टल शिरा। अधिक से अधिक पोत की लंबाई, एक शुरू बिंदु और एक अंत बिंदु जड़ और preclinical सॉफ्टवेयर में संवहनी मुखौटा (नीले और मजेंटा गेंद मार्कर) की सही अवर पोर्टल शिरा (RIPV) के बाहर अंत में रखा गया था निर्धारित करने के लिए। RIPV (10.95 मिमी) की नाड़ी पथ की लंबाई "पथ टेढ़ा-मेढ़ापन" के मूल्यांकन के भाग के रूप में। प्राप्त हुई थी यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

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सिलिकॉन इंजेक्शन और μCT स्कैनिंग द्वारा संवहनी पेड़ विषम अक्सर ट्यूमर मॉडल और तंत्रिका संबंधी रोग मॉडल में पेश किया गया एन्जियोजेनिक प्रगति 5,7,8,10 अध्ययन करने के लिए। सिलिकॉन इंजेक्शन की कार्यप्रणाली में सुधार visualizing और चूहों में आंशिक hepatectomy के बाद संवहनी वृद्धि बढ़ाता के लिए वर्तमान अध्ययन में किए गए थे।

ध्यान देने की जरूरत अच्छा छिड़काव की गुणवत्ता को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण कदमों में से एक नंबर रहे हैं। सबसे पहले, प्रणालीगत heparinization अत्यधिक हेपरिन या नमक के साथ जिगर निस्तब्धता जिगर के अंदर रक्त के थक्के से बचने के लिए पहले की सिफारिश की है। ट्यूबिंग से हवा के बुलबुले के उन्मूलन सिलिकॉन छिड़काव की अच्छी गुणवत्ता प्राप्त करने के लिए भी महत्वपूर्ण है। छिड़काव दर और दबाव के निर्धारण के पहले शारीरिक मापदंडों के रक्तसंचारप्रकरण 17 के आधार पर किया जाना चाहिए। छिड़काव समय कुल इंजेक्शन की मात्रा को दर्शाता है और उम्मीद intravascular लेने से अनुमान लगाया गया हैमात्रा और खाते में कैथेटर प्रणाली के prefilling मात्रा।

सिलिकॉन एक अत्यधिक चिपचिपा परिसर में रक्त या खारा से अलग है। इसलिए, कई परीक्षणों छिड़काव दर और दबाव को एडजस्ट करने के लिए आवश्यक हैं। लगातार इंजेक्शन प्रवाह दर और दबाव बनाए रखने गंभीर फैलाव या छोटे जहाजों का भी टूटना को रोकने के लिए आवश्यक है। छिड़काव समय का अनुमान जरूरत इंजेक्शन की मात्रा के हिसाब से सेट किया गया है। हालांकि, छिड़काव तुरंत रोका जाना चाहिए जब नीले यौगिक जिगर की सतह पर जहाजों में दिखाई हो जाता है। अन्यथा, सिलिकॉन sinusoids में और एक अन्य नाड़ी तंत्र है जो बाद में पुनर्निर्माण और विश्लेषण के साथ हस्तक्षेप करेगा में पलायन कर सकते हैं।

आमतौर पर, सिलिकॉन सबसे प्रकाशित रिपोर्ट 1,3,15 में बाएं वेंट्रिकल के माध्यम से योजनाबद्ध तरीके से भरकर रखा जाता है। बाएं वेंट्रिकल इंजेक्शन साइट के लिए स्वतंत्र पहुँच सक्षम करने के लिए बेनकाब करने के लिए आसान है। हालांकि, नुकसान यह है कि इस मार्ग रा हैवहाँ अप्रत्यक्ष विपरीत एजेंट ब्याज की साइट तक पहुँचने से पहले प्रचलन से गुजरना पड़ता है क्योंकि। इसलिए, सिलिकॉन इंजेक्शन तकनीक की शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया इस अध्ययन में संशोधित किया गया है। दूसरों के द्वारा प्रदर्शन आवेदन की अक्सर चुने अप्रत्यक्ष मार्ग के विपरीत, सिलिकॉन यौगिक सीधे, ब्याज की नाड़ी तंत्र में इंजेक्ट किया गया था बजाय पूरे शरीर विषम की। इस रास्ते में, वेग और छिड़काव की मात्रा बेहतर नियंत्रित किया जा सकता है। पोर्टल शिरापरक प्रणाली और यकृत शिरापरक सिस्टम भरकर रखा जाता है और के रूप में वीडियो में दिखाया गया है, बाद में अलग-अलग विश्लेषण के लिए अलग से खंगाला जा सकता है।

इस संशोधित प्रक्रिया की सीमा तकनीकी कठिनाई है। यह सफलतापूर्वक चूहों में अत्यधिक चिपचिपा यौगिक का उपयोग कर एक intraportal इंजेक्शन प्रदर्शन करने के लिए चुनौतीपूर्ण है क्योंकि संवहनी संरचना इतनी नाजुक है। बल्कि यह प्रक्रिया के दौरान जहाजों को नष्ट करने के लिए आसान है। इस प्रकार, पोर्टल शिरा विच्छेदन और कैथेटर INSErtion धीरे किया जाना चाहिए।

संवहनी पेड़ और explanted यकृत के बाद μCT इमेजिंग की विषम visualizing और आंशिक hepatectomy के बाद संवहनी उत्थान बढ़ाता के लिए एक उपयोगी उपकरण है। मात्रात्मक संवहनी मापदंडों के जिगर उत्थान की प्रगति में संवहनी विकास की गतिज की बेहतर समझ के लिए उपयोग किया जा सकता है। इसके अलावा, धारावाहिक वर्गों के आधार पर दोनों यकृत संवहनी प्रणाली की 3 डी पुनर्निर्माण तकनीकी रूप से संभव है, एक बहुत बड़ा काम के बोझ का प्रतिनिधित्व यद्यपि।

इस तकनीक को कई मॉडल में लागू किया जा सकता है, जहां दृश्य और संवहनी वृद्धि की मात्रा का ठहराव के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, अंतर्निहित संवहनी पेड़ के संबंध में आणविक घटनाओं के 3 डी दृश्य पहुंच में है। ब्याज की आणविक घटनाओं के उदाहरण इस तरह के की-67 या इस तरह के रूप में HMGB1 इस्कीमिक क्षति के मार्कर के रूप में प्रसार मार्कर का पता लगाने के हो सकता है। स्थानिक संकल्प लिया आणविक ईवी का आकलनदस्तावेजों regenerating यकृत पैरेन्काइमा भीतर regenerating संवहनी पेड़ के आसपास के क्षेत्र में उन्नत बहु पैमाने पर सिस्टम जीव विज्ञान मॉडलिंग के लिए शर्त है। यह सिलिकॉन इंजेक्शन तकनीक इस लक्ष्य तक पहुंचने की दिशा में एक प्रयोगात्मक कदम है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
PERFUSOR® VI B.BRAUN 87 222/0
Pipetus®-akku Hirschmann 9907200
Pipets Greiner 606180
micro scissors Fine Science Tools (F·S·L) No. 14058-09
micro serrefine Fine Science Tools (F·S·L) No.18055-05
Micro clamps applicator Fine Science Tools (F·S·L) No. 18057-14
Straight micro forceps Fine Science Tools (F·S·L) No. 00632-11
Curved micro forceps Fine Science Tools (F·S·L) No. 00649-11
needle-holder Fine Science Tools (F·S·L) No. 12061-01
1 ml syringe B.Braun 9161406V
5 ml syringe B.Braun 4606051V
extension and connection lines B.Braun 4256000 30 cm, inner ø 1.2 mm
6-0 silk (Perma-Hand Seide) Ethicon 639H
6-0 prolene Ethicon 8711H
Microfil® MV diluent FLOW TECH, INC
Microfil® MV - 120 FLOW TECH, INC MV - 120 (blue)
MV curing agent FLOW TECH, INC
Heparin 2500 I.E./5 ml Rotexmedica ETI3L318-15
Saline Fresenius Kabi Deutschland GmbH E15117/D DE
Imalytics Preclinical software Experimental Molecular Imaging, RWTH Aachen University, Germany
HepaVision Fraunhofer MEVIS, Bremen, Germany
NanoZoomer 2.0-HT Digital slide scanner Hamamatsu Electronic Press, Japan  C9600
Tomoscope Duo CT  CT Imaging GmbH, Erlangen, Germany TomoScope® Synergy

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References

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सामान्य चूहों में 70% आंशिक hepatectomy के बाद संवहनी और Parenchymal उत्थान के दृश्य
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Xie, C., Wei, W., Schenk, A., Schwen, L. O., Zafarnia, S., Schwier, M., Gremse, F., Jank, I., Dirsch, O., Dahmen, U. Visualization of Vascular and Parenchymal Regeneration after 70% Partial Hepatectomy in Normal Mice. J. Vis. Exp. (115), e53935, doi:10.3791/53935 (2016).More

Xie, C., Wei, W., Schenk, A., Schwen, L. O., Zafarnia, S., Schwier, M., Gremse, F., Jank, I., Dirsch, O., Dahmen, U. Visualization of Vascular and Parenchymal Regeneration after 70% Partial Hepatectomy in Normal Mice. J. Vis. Exp. (115), e53935, doi:10.3791/53935 (2016).

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