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Medicine

正常マウスで70%肝切除後の血管と実質再生の可視化

doi: 10.3791/53935 Published: September 13, 2016

Abstract

変性シリコーンの注入手順は、肝臓の血管樹の視覚化のために使用しました。この手順は、ポータルまたは肝静脈に、26 Gカテーテルを介して、シリコーン化合物の生体内注射からなりました。シリコーン注入後、臓器を外植し、ex vivoでのマイクロCT(μCT)スキャンのために準備します。シリコーン注入手順は、技術的に困難です。成功した結果を達成することは、外科医からの豊富な顕微経験が必要です。この手順の課題の一つは、シリコーン化合物のための適切な灌流速度を決定することを含みます。シリコーン化合物のための灌流速度は、対象の血管系の血行動態に基づいて定義される必要があります。不適切な灌流速度は、血管木の不完全灌流、人工拡張および破裂につながることができます。

血管系の3D再構成は、CTスキャンに基づいていたと使用して達成されましたこのようなHepaVisionとして前臨床ソフトウェア。再構築された血管樹の品質が直接シリコーン灌流の品質に関連していました。このような総血管容積のような血管の成長の指標と続い計算血管パラメータは、血管の再構成に基づいて計算しました。 μCTスキャン後の試験片のその後の組織学的後処理のために許可されたシリコーンと血管樹を対比。試料を連続切片、組織学的分析及び全スライドスキャンを、その後、組織の画像に基づいて血管樹の3D再構成を行うことができます。これは、分子事象および血管樹に関するそれらの分布を検出するための前提条件です。この変性シリコーン注入手順は、他の器官の血管系を可視化し、再構成するために使用することができます。この技術は、広く様々な動物aで血管の解剖学的構造と成長についての研究に適用する可能性を有しています目の疾患モデル。

Introduction

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肝再生は、多くの場合、肝臓重量および体積の増加を測定することによって、および肝細胞増殖速度16を評価することによって決定されます。しかし、肝臓の再生だけでなく、実質の再生だけでなく、血管再生6を誘導されます。したがって、血管の成長はさらに、肝臓再生の進行におけるその役割に関して調査する必要があります。肝臓の血管系の可視化は、血管再生の我々の理解を進めるために重要です。多数の間接的な方法は、肝臓の血管再生の根底にある分子メカニズムを研究するために開発されてきました。伝統的に、サイトカインの検出(血管内皮増殖因子、VEGF)14は ケモカインおよびその受容体(CXCR4 / CXCR7 / CXCL12)4は、血管再生を研究するための主力でした。しかし、血管系の定量分析と一緒に3Dモデルが重要な解剖学的を追加します肝実質と血管の再生の間の重要な関係のより良い理解を得るための情報。

血管ツリーを対比必要肝臓の血管系を可視化するために、マウスを直接門脈又は肝静脈血管樹に放射線不透過性のシリコーンゴムの造影剤を注入しました。シリコーン及び器官の外植の重合後に、肝臓試料を、CTスキャナーを使用してμCTスキャンを行いました。スキャンは、ボクセルの画像表現をもたらし シリコーン注入標本9。

品質管理のために、血管系は、最初の臨床前のソフトウェアを使用して3Dで可視化しました。セグメント化は、軟組織の強度と血管強度の閾値を設定することによって行いました。得られた容器マスクは表面レンダリングを用いて可視化しました。ソフトウェアはまた、vasculの二つのパラメータを手動で決意に許可しますarの成長:最大血管長と半径。

前臨床ソフトウェアは、次いで、血管樹および供給または排出する血管領域13のその後の計算の3次元再構成のために使用しました。また、このソフトウェアは自動的にそのようなも総エッジ長や総容器容積として知られている全ての可視血管構造の全体の長さなどの血管の成長の特定のパラメータを、決定しました。

シリコーン灌流手順はナイーブマウスにおいて、70%部分肝切除(PH)を受けたマウスで行いました。肝臓は、前述の可視化および定量化技術を使用して、血管と実質肝再生を分析するための切除後の異なる観測時点で採取しました。

この映画の主な目的は、次のとおりです。(1)最適な対照的なを達成するために必要な繊細な注入技術を実証し、(2)FRを結果として潜在的な利益を示しますμCTおよび組織学的連続切片を用いて得られた試​​料のオム詳細な分析。この映画を見た後、読者が特定の血管系にシリコーン化合物を注入する方法のと技術の有用性と適用性をよりよく理解している必要があります。

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Protocol

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動物を対象とする手順は、テューリンゲンのLandesamtエリーゼVerbraucherschutz Abteilung TiergesundheitウントTierschutz、ドイツによって承認されています。門脈系が肝静脈系とは別に可視化したので、別々の動物は異なる血管木のために必要でした。

1.試薬の調製

  1. ヘパリン - 生理食塩水
    1. 10ミリリットルの生理食塩水(5 IU / mL)に0.1ミリリットルのヘパリンを追加します。
  2. シリコーン化合物の混合物
    1. 1 5ミリリットルチューブに2ミリリットルMV-120を追加します。 40%溶液をあるために3 mlのMVの希釈剤を添加することによって、MV-120を希釈します。

2.ポータル静脈系シリコーンインジェクション

  1. 開腹
    1. 麻酔導入チャンバー内にマウスを置き、2%イソフルランおよび0.3リットル/分の酸素とそれをanaesthetize。
    2. 2%の連続吸入でテープを使用して、オペレーティングテーブルの上に麻酔したマウスをされている修正プログラムofluraneおよび0.3リットル/分の酸素。マウスの足指ピンチ引っ込め反射をチェックして、反射が存在しない場合は、操作を開始します。
    3. スキン層と筋肉層のための電気凝固のためのはさみを使用して腹部に横切開を行います。綿のヒントを使用して、左側に腸を移動し、生理食塩水に浸したガーゼで腸にカバーしています。
  2. カテーテルの挿入
    1. マイクロピンセットを用いて、顕微鏡下で門脈を解剖。その分岐部に1mm程度の距離で、肝外門脈の下に1 6-0絹縫合糸を置き、後で使用するために緩くそれを結びます。
    2. 5分間の全身ヘパリン化のための陰茎静脈(オス)または下大静脈(メス)を介して調製ヘパリン生理食塩水を注入します。
    3. 門脈に26ゲージ針を用いて(26 G)カテーテルを挿入し、クランプで固定します
  3. ヘパリン生理食塩液とシリコーン化合物灌流
    1. 負荷ヘパリン生理食塩水ゾル5ミリリットルの注射器でutionと灌流装置の電源をオンにします。気泡を避けるために、ヘパリン生理食塩水で十分にカテーテルを埋めます。
    2. カテーテルに延長チューブを接続し、しっかりとそれらを修正。 0.4ミリリットル/分の灌流速度でヘパリン生理食塩水灌流を開始します。
    3. 事前配置された二重カテーテルを固定し、脾静脈および腸間膜静脈からの血流を遮断するための6-0絹縫合糸を結紮。麻酔下での灌流を介して放血によりマウスをEuthanatize。
    4. しっとりそれを維持するために、全体の灌流処置中に生理食塩水を使用して肝臓をすすぎます。
    5. MV-120チューブに硬化剤を0.1ミリリットルを追加します。シリコーン注射器にヘパリン生理食塩水の注射器を変更します。
    6. カテーテルシステムを事前入力し、門脈系を充填するために、約1分間0.2 ml /分の灌流速度でシリコーン灌流を開始します。表面の血管が青色の電源を入れたときにシリコーン灌流を停止します。
  4. サンプリング
    1. UNT in-situで肝臓を保ちますILは、シリコーンは、完全に、約15〜30分後に重合されます。無傷の肝臓を維持するために注意して肝臓や隣接臓器を結ぶ靭帯を解剖。肝臓を外植し、固定のためにホルマリンに入れて。

3.肝静脈系シリコーンインジェクション

  1. ステップ2.1で実行されるように開腹術を行い、完全に術野を公開します。
  2. カテーテルの挿入
    1. マイクロピンセットを用いて、顕微鏡下で門脈を解剖。その分岐部に1mm程度の距離で、肝外門脈の下に1 6-0絹縫合糸を置き、後で使用するために緩くそれを結びます。
    2. 5分間の全身ヘパリン化のための陰茎静脈(オス)または下大静脈(メス)を介して調製ヘパリン生理食塩水を注入します。
    3. 門脈に針で1 26 Gカテーテル(カテーテル1)を挿入し、クランプで固定します。下大静脈に針を持つ別の26のGカテーテル(カテーテル2)を挿入し、クランプで固定します。
    4. 6-0の合成、モノフィラメント、非吸収性ポリプロピレン縫合糸を用いて、(左と右腎静脈を含む)下大静脈とその先端の枝を結紮。
  3. ヘパリン生理食塩液とシリコーン化合物灌流
    1. 5ミリリットルの注射器にヘパリン生理食塩水ソリューションをロードし、灌流装置の電源をオンにします。気泡を避けるために、ヘパリン - 生理食塩液で完全にカテーテル1を入力します。カテーテル1に延長チューブを接続し、しっかりと固定します。 0.4ミリリットル/分の速度でヘパリン生理食塩水灌流を開始します。
    2. 事前配置された二重カテーテルを固定し、脾静脈および腸間膜静脈からの血流を遮断するための6-0絹縫合糸を結紮。麻酔下での灌流を介して放血によりマウスをEuthanatize。
    3. しっとりそれを維持するために、全体の灌流処置中に生理食塩水を使用して肝臓をすすぎます。 MV-120チューブに硬化剤を0.1ミリリットルを追加します。シリコーン注射器を使用してExchangeヘパリン生理食塩水の注射器。
    4. suprahepatにクランプを置きIC下大静脈は、肝臓の流出を妨害します。
    5. カテーテル2に延長チューブを接続し、報告されているように客観的肝血管容積に到達するまでの約2分間0.2ミリリットル/分の灌流速度でシリコーン灌流を開始します。表面の血管が青色の電源を入れたときにシリコーン灌流を停止します。
  4. サンプリング
    1. 肝臓への損傷を避ける肝靭帯を解剖。肝臓を外植し、固定のためにホルマリンに入れて。

4.マイクロCT(μCT)スキャン

μCTを用いた外植肝臓試料をスキャンするには、以下のステップが必要とされています。

  1. 固定液のうち、肝臓試料を取ります。 μCT床上に肝臓を置きます。 μCTに肝臓サンプルとμCTのベッドを置きます。
  2. スキャンを開始する前に、トポグラムを取得します。小さな肝臓試料のための1つの副走査と大きなサンプル用の2つのsubscansを使用してください。
  3. 選択します81;高解像度のCTプロトコル( 例えば 、HQD-6565-390-90)。このプロトコルは、副走査あたり90秒のスキャン時間で1全回転の間に1032のx 1012ピクセルと720の突起を取得します。 μCTスキャンを開始します。

5.組織学的連続切片

  1. μCTスキャン後に全体としてパラフィン中の肝臓片を埋め込みます。 2,000〜2,500一連のセクションで、その結果、4μmのセクションに全体のパラフィンサンプルをカットします。
  2. 虚血性損傷のマーカーとして増殖マーカーおよびHMGB1などのKi-67などの対象の分子事象を可視化するための適切な染色技術で染色切片。科学的疑問に対するで染色の配列を決定します。
  3. 染色した切片をデジタル化全体スライドスキャナを使用してください。
  4. 血管樹(複数可)(既に実行可能)の3次元再構成を行い、血管樹(進行中の研究)に対するにおける分子事象の3次元分布を可視化します。

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Representative Results

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品質基準

シリコーン注射の質は、処置中の肉眼で判断することができます。肝臓の表面上の小血管が青色化合物と徐々に埋めます。正常な血管構造が肝臓表面上に観察された場合には、シリコーンゴムの射出品質が良好でした。灌流量が不十分であった場合、肝臓表面の微小血管が完全には満たされませんでした。これとは対照的に、充填にわたり臓器の表面に不規則な青い斑点で示されるように、血管の破裂を引き起こしました。両方とも、3D再構成が最終的に手順の失敗をレンダリングする際に困難を引き起こしています。

注入品質のより良い評価のために、前臨床ソフトウェアを使用して3D血管再建続いμCTスキャンを行いました。注射は成功のwhであると決定されましたセグメンテーションエン目に見える血管外漏出によって示さ破裂した構造をなし、無傷の完全な血管ツリーの可視化をもたらしました。血管樹は、不完全な( 図1A)が出現した場合、潅流量が不十分でした。複数の血管樹(図1B)を登場または溢出が見られた場合は、潅流量または圧力が不十分でした。これは、失敗の可能性が最も高い理由でした。灌流圧は、理論的には、溶液の粘度によって多少異なる場合があります。粘度は、血管系に化合物および注入を混合間の経過重合時間に依存しています。いくつかの操作は、混合および注入のために必要とされるので、時間間隔は、わずか5分の3分の間で変化することができます。

溶液が低粘度である場合に、灌流圧は低いです。この場合、化合物は、正弦波システムを介して非注射血管ツリーに転送することができますわずかに高い灌流量につながります。解決策は、より高い粘度につながるさらに重合の場合は、灌流圧は、容器および溢出の破壊を引き起こして、上昇します。

目的灌流ボリュームの決意

不十分な灌流または過灌流は、灌流量が考慮された標準化、注入の故障の原因となるので。 2報告されているように、肝容積の6%は、血液によって占有され、肝臓の血液の44%は、大血管( 例えば 、肝動脈、門脈)に格納されています。マウスにおける肝容積は約1.3ミリリットル11です。したがって、正常マウスでポータル静脈系の総血管容積は0.03ミリリットルと0.04ミリリットルの間の範囲と推定されました。流速0.2 ml /分および合計灌流時間に設定し、約1分間、合計注入量をもたらすに設定しました約0.2ミリリットル。

カテーテルシステムは、約0.1〜0.15ミリリットルをとる、あらかじめ充填されなければならないので、この一見高いボリュームは、必要とされています。 0.05ミリリットルの余分な容量は、肝門部とカテーテルの結紮間の近位の門脈を埋めるために必要とされます。肝静脈注射のための流量はまた、0.2 ml /分が、合計灌流時間は約0.4 mlに高い総容量を生じる、2分に延長したとしました。総肝血管の容積は、全門脈血管容積と同様であると仮定しました。しかし、肝臓下の結紮と肝上クランプとの間に肝臓内大静脈を満たすのに必要な容量は0.2ミリリットルで推定しました。

成功率

49匹の動物の合計は、シリコーン注入に供した:PVシステムへの22の動物と27匹の動物を目に電子のHVシステム。注射の当社の成功率はPV群では55%(12/22)とHV群では89%(24/27)でした。 PVグループが最初にシリコーン注入技術を確立するために使用されたことを考慮した(n = 4)、PVシステムの注入の成功率を効果的に55%よりも高くあるべきです。しかし、これらの注入から得られたμCT画像が​​3次元再構成および定量分析に適していました。さらに、36匹のマウスのPVやHVのいずれかからの血管の木はImalytics前臨床ソフトウェアを使用して再構築することができました。

実質と血管の再生

肝切除は、定性分析に供した後の時間は、マウスの肝臓サンプルのμCTシリーズを解決しました。実質再生はレムナント肝臓の3次元成長から成っていました。血管再生は増加を示した組織と定義しましたその主な枝やポータル静脈および肝静脈ツリーの両方で、追加の端末枝の伸長と血管幹の長さと直径、。

現在、血管の成長と肝実質の再生及び血管再生との関係を説明するのに適したいくつかの定量的なパラメータは調査中です。これらは、最大血管長を含む血管増殖を示すパラメータが含まれる( 図2)、総血管長/肝体積または血管ボリューム/肝体積の点で血管半径と血管密度。

選択された肝葉の総肝臓体積及び容積を計算しました。正常な肝臓では、総肝体積は1.2ミリリットルから(PVグループとHV基の両方を含むN = 6、)1.6ミリリットルの範囲でした。これは、左の緯度を除去することによって、拡張肝切除を行った後、0.6〜0.7 mlに減少しましたERALおよび中葉。肝臓の体積は、肝臓の成長中に連続的に増加しました。術後7日目(POD 7)により、肝体積は2.6倍、 すなわち 、元の体積の約88%に増加しました。肝臓体積の増加は、肝臓重量の回復と相関しました。

太陽光発電システムとHV系の全血管容積を計算しました。肝下大静脈の一部が含まれていたため、HVシステムの総血管容積は、PVシステムの場合よりも高かったです。 PVシステム全体の血管の容積は、正常なマウスにおいて0.05​​〜0.08 mlの範囲でした。これは、70%部分肝切除後に0.04ミリリットルに0.03に低下しました。 POD 7により、レムナント肝臓の総血管容積は元の体積の100%に増加しました。 HVの総血管容積は0.14〜0.16ミリリットルの範囲でした。血管容積は、切除後0.08〜0.09 mlに減少しました。術後1週間以内に、レムナント肝臓の総血管容積は、Bを増加しましたyの元の値の94%。

その結果、血管の容積と実質量の増加との関係のように、血管密度は、より正確に血管の体積分率(肝臓の体積で割った血管の量)を算出しました。これは、血管の体積分率は、再生プロセスを通じて比較的安定なままであることを明らかにしました。

分子事象の3次元可視化

CTは、スキャンした後、選択標本は完全にデジタル化したポータルだけでなく、肝静脈ツリー12を再構築するために使用される最大2000スライドに降伏、連続切片に供しました。これは、成長している血管樹に関してで再生中の分子事象の将来の3D視覚化するための前提条件です。

シリコーン注入の品質を監視する 1。 。不完全右下門脈の充填(左の矢印)と尾状門脈は(右の矢印)は、血管ツリーの不連続としてImalytics前臨床ソフトウェアで可視化しました。これは、不十分な灌流圧、または灌流量または気泡の存在を示した。B。右下門脈の溢出が不十分な圧力または過灌流に容器の破壊を示している可視化した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
右の最大血管長の 図2. 測定劣っ門脈。最大血管長を決定するための1つの開始点と一つのエンドポイントは、ルート及び前臨床ソフトウェア血管マスク(青とマゼンタのボールマーカー)の右下門脈(RIPV)の遠位端に配置しました。 RIPV(10.95ミリメートル)の血管路長が。「パス蛇行を「評価の一環として得られた。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

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シリコーン注入とμCTスキャンすることにより、血管ツリーを対比すると、血管新生の進行5,7,8,10を研究するために頻繁に腫瘍モデルおよび神経学的疾患モデルで導入されました。シリコーン注入の方法論の改善は、マウスにおける部分肝切除後の血管の成長を可視化し、定量化するために本研究で作製しました。

良好な潅流品質を達成するために注意が必要重要なステップの数があります。まず第一に、全身ヘパリン化は非常に肝臓内部の血液凝固を避けるために、ヘパリンまたは生理食塩水で肝臓をフラッシュする前にお勧めします。チューブからの気泡の除去は、シリコーン灌流の良好な品質を達成することも重要です。灌流速度と圧力の決意は最初の生理学的血行動態パラメータ17に基づくべきです。灌流時間は、総注入量を反映していると予想される血管内を取って推定されていますボリュームとアカウントへのカテーテルシステムの事前入力ボリューム。

シリコーンは、血液または生理食塩水とは異なる粘性の高い化合物です。したがって、いくつかの試験は、灌流速度及び圧力を調整するために必要とされます。一定の注入流量および圧力を維持することは厳しい膨張または小血管の偶数破裂を防止する必要があります。潅流時間は、推定に必要な注入量に応じて設定されます。しかし、灌流は、青色化合物が肝臓の表面上の容器内で表示されたときにすぐに停止する必要があります。そうでなければ、シリコーンは正弦波に、後に再建し、分析を妨害する他の血管系に排出することができます。

一般的に、シリコーンはほとんど公表された報告1,3,15で左心室を経由して体系的に灌流されます。左心室は、注射部位への無料アクセスを可能にするために公開するのは簡単です。しかし、欠点は、このルートがRAであるということですTHER造影剤は、目的の部位に到達する前に循環を受ける間接有するからです。したがって、シリコーン注入技術の外科的処置は、この研究で修飾されています。他者によって行われるアプリケーションの頻繁に選択された間接的な経路とは対照的に、シリコーン化合物は、代わりに、直接全身コントラストの、関心の血管系に注入しました。この方法では、灌流の速度及び体積がより良好に制御することができます。ビデオに示すように、門脈静脈系および肝静脈系は、後で個々の分析のために別々に灌流し、再構成することができます。

この修​​正された手順の限界は、技術的な難しさです。血管構造は非常にデリケートですので、成功したマウスでは高粘性化合物を用いた門脈内注入を実行するために困難です。処置中に血管を破壊することはむしろ容易です。したがって、門脈解剖とカテーテルinsertionを緩やかに実行する必要があります。

血管の木と外植肝臓のその後のμCTイメージングの対比は、部分肝切除後の血管再生を可視化し、定量化するための便利なツールです。定量的な血管のパラメータは、肝再生の進行中の血管増殖の動態をより良く理解するために利用することができます。また、連続切片に基づいて、両方の肝臓の血管系の三次元再構成は、膨大な作業負荷を表すにもかかわらず、技術的に可能です。

この技術は、血管増殖の可視化および定量化が重要な複数のモデルに適用することができます。また、基礎となる血管樹に対する内分子事象の3次元可視化は、リーチです。関心の分子事象の例としては、このようなのKi-67またはそのようなHMGB1などの虚血性損傷のマーカーとして増殖マーカーの検出である可能性があります。空間分解分子EVを評価しますエント再生肝実質内の再生血管樹の近くに高度なマルチスケールシステム生物学モデリングのための前提条件です。このシリコーン注入技術がこの目標に到達するに向かって1つの実験段階です。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
PERFUSOR® VI B.BRAUN 87 222/0
Pipetus®-akku Hirschmann 9907200
Pipets Greiner 606180
micro scissors Fine Science Tools (F·S·L) No. 14058-09
micro serrefine Fine Science Tools (F·S·L) No.18055-05
Micro clamps applicator Fine Science Tools (F·S·L) No. 18057-14
Straight micro forceps Fine Science Tools (F·S·L) No. 00632-11
Curved micro forceps Fine Science Tools (F·S·L) No. 00649-11
needle-holder Fine Science Tools (F·S·L) No. 12061-01
1 ml syringe B.Braun 9161406V
5 ml syringe B.Braun 4606051V
extension and connection lines B.Braun 4256000 30 cm, inner ø 1.2 mm
6-0 silk (Perma-Hand Seide) Ethicon 639H
6-0 prolene Ethicon 8711H
Microfil® MV diluent FLOW TECH, INC
Microfil® MV - 120 FLOW TECH, INC MV - 120 (blue)
MV curing agent FLOW TECH, INC
Heparin 2500 I.E./5 ml Rotexmedica ETI3L318-15
Saline Fresenius Kabi Deutschland GmbH E15117/D DE
Imalytics Preclinical software Experimental Molecular Imaging, RWTH Aachen University, Germany
HepaVision Fraunhofer MEVIS, Bremen, Germany
NanoZoomer 2.0-HT Digital slide scanner Hamamatsu Electronic Press, Japan  C9600
Tomoscope Duo CT  CT Imaging GmbH, Erlangen, Germany TomoScope® Synergy

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正常マウスで70%肝切除後の血管と実質再生の可視化
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Xie, C., Wei, W., Schenk, A., Schwen, L. O., Zafarnia, S., Schwier, M., Gremse, F., Jank, I., Dirsch, O., Dahmen, U. Visualization of Vascular and Parenchymal Regeneration after 70% Partial Hepatectomy in Normal Mice. J. Vis. Exp. (115), e53935, doi:10.3791/53935 (2016).More

Xie, C., Wei, W., Schenk, A., Schwen, L. O., Zafarnia, S., Schwier, M., Gremse, F., Jank, I., Dirsch, O., Dahmen, U. Visualization of Vascular and Parenchymal Regeneration after 70% Partial Hepatectomy in Normal Mice. J. Vis. Exp. (115), e53935, doi:10.3791/53935 (2016).

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