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Immunology and Infection

鼠后肢长骨解剖和骨髓隔离

doi: 10.3791/53936 Published: April 14, 2016

Protocol

所有的动物工作按照指南中概述了美国国立卫生研究院的实验动物的护理和使用的建议被批准的机构动物护理和使用委员会。

1.后肢长骨解剖

  1. 安乐死按照机构准则鼠标。
  2. 鼠标在仰卧位置定位并通过踝关节下方的小鼠爪垫钉扎所有四条腿贴上。
  3. 喷鼠标用70%乙醇,充分浇熄腿部。
  4. 做一个小切口,中线右侧下腹部,只是臀部上方。
  5. 向下延伸的腿和过去的踝关节的切口。
  6. 拉回皮肤和切割锚固到股骨近端股四头肌以暴露股骨的前侧并从腿部引脚输出,将所述销从所述板成45度角。
  7. 随着BLAD对股骨的后侧的剪刀电子,切腿筋从膝关节程。
  8. 拉回皮肤和锚定在股骨的近端,以暴露该股骨的后侧并从腿销从腿筋肌肉,将销从所述板成45度角。
  9. 与镊子,保持股骨的远端,在膝盖关节的上方。引导朝向所述髋关节的股骨干的任一侧上的剪刀刀片,小心不要切入股骨本身。
  10. 到达股骨头,用剪刀轻轻打开后表示,拧剪刀用剪刀直接在股骨头移动的顶部叶片打乱股骨,小心不要捕捉股骨头下方的骨头。
  11. 把握股骨干与镊子的顶端,切割软组织从股骨头远离从髋臼松开。
  12. 拉动整个腿骨,包括股骨,膝,和胫骨,并远离身体,小心地切去结缔组织和肌肉的腿连接到皮肤上。
  13. 透支踝关节和再次使用剪刀扭转运动脱臼胫骨。
  14. 抓胫骨的远端,小心不要切断筋,并从主体和销板远离拉胫骨。
  15. 切断的任何剩余结缔组织在膝盖附接长骨的鼠标。
  16. 删除的任何其他肌肉或附到股骨和胫骨的结缔组织。
  17. 对于需要骨的任何应用程序保持不动(组织学,组织形态计量学,生物力学测试, ),继续进行标准的内部协议(如在4-7)。为了分离骨髓,进行第2节。

2.长骨准备骨​​髓隔离

  1. 使用镊子,把握股骨髌骨背向一第二近端(股骨头)下来。
  2. 透支膝关节,并使用剪刀扭转运动打乱了胫骨和股骨。
  3. 切的任何结缔组织保持股骨和胫骨在一起。
  4. 使用镊子,把握股骨与前侧背向和近端(股骨头端)向下。
  5. 股骨轴引导剪刀到髁。
  6. 轻轻转动剪刀来回除去髁,髌骨和骨骺揭露干骺端。
  7. 删除的任何其他肌肉或使用镊子,剪刀和的Kimwipes附着于股骨结缔组织。
  8. 使用镊子,把握胫骨与前侧背向和远端(脚踝端)向下。
  9. 如果骨骺胫骨完好,引导剪了胫骨的髁。
  10. 轻轻转动剪刀来回去除髁骨骺揭露metaphysis。
  11. 删除的任何其他肌肉或使用镊子,剪刀和的Kimwipes附着在胫骨的结缔组织。

3.骨髓隔离

  1. 通过0.5 ml离心管的底部推18G的针。
  2. 将长骨(最多2股骨和胫骨2)入管,膝降到底端,然后合上盖子。
  3. 窝在一个1.5 ml离心管0.5 ml离心管。
  4. 离心机≥10,000XG嵌套管在15秒的离心。
  5. 验证骨髓已通过目测纺出的骨头。骨头应该出现白色应该有较大的管大视觉沉淀。
  6. 丢弃的骨头0.5 ml离心管。
  7. 暂停在适当溶液骨髓( 例如 ,PBS,培养基,FACS缓冲液),并继续进行与实验协议(DNA,RNA或蛋白质分离,FACS分析,或原代细胞培养物)。

Representative Results

这里所描述的协议为鼠标股骨和胫骨以最小到骨组织损伤的快速解剖优化。该技术是适合于许多下游的分析,包括生物力学研究中,组织形态计量学( 图1A - B)和组织学( 1C)4,7。代表histomophometric micoCT三维重建( 图1A - B)中表明,两者的松质骨和皮质壳被维持,允许骨组织形态计量学,包括骨小梁数,厚度和间距的标准化结构参数的准确定量;骨量;和皮质厚度等措施8之一。该代表组织切片显示了H&E染色福尔马林固定和脱钙胫骨( 图1C)。图像展示两个钙化b的完整性之一,细胞的骨髓进行组织学分析。

骨髓分离过程保留骨髓空间的无菌性,具有低的处理,以减少污染,并且不需要长骨的切割,从而减少骨髓产量的损失。这骨髓是适合于许多下游应用,包括流式细胞仪5和PCR分析。此外,此过程可用于分离骨髓细胞,包括破骨细胞和成骨细胞( 图2A - B)的原代培养骨髓4,6。

图1
显示(A)外皮质外壳和鼠标胫骨图1.组织形态学和鼠标的长骨的组织学分析。三维显微重建(B 仲>)骨小梁(比例尺= 0.5毫米)。一个脱钙和切片胫骨(4倍),(三)组织学H&E染色。图片凯瑟琳Weilbaecher,医学院,美国华盛顿大学医学院提供。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
图2.原发性骨髓细胞培养的破骨细胞和成骨细胞分化的影响。(A)TRAP染色后7天破骨媒体(4倍)多核破骨细胞。 (B)碱性磷酸酶(紫色),成骨细胞和茜素红(红色)染色后对成骨媒体21天矿化。凯瑟琳Weilbaecher图像礼貌,医药,美国华盛顿大学医学院。尔斯/ ftp_upload / 53936 / 53936fig2large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pinboard
Pins
70% Ethanol
Dissection scissors 
Dissection forceps
Kimwipes Kimberly-Clark 34120
16 G needle
1.5 ml Microcentrifuge tube
0.5 ml Microcentrifuge tube
Microcentrifuge

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References

  1. McHayleh, W. M., Ellerman, J., Roodman, G. D. Ch. 80. Primer on the Metabolic Bone Diseases and Disorders of Mineral Metabolism. American Socieyt for Bone and Mineral Research. 379-381 (2008).
  2. Weilbaecher, K. N., Guise, T. A., McCauley, L. K. Cancer to bone: a fatal attraction. Nat Rev Cancer. 11, (6), 411-425 (2011).
  3. Pedersen, E. A., Shiozawa, Y., Pienta, K. J., Taichman, R. S. The prostate cancer bone marrow niche: more than just 'fertile soil. Asian J Androl. 14, (3), 423-427 (2012).
  4. Amend, S. R., et al. Thrombospondin-1 regulates bone homeostasis through effects on bone matrix integrity and nitric oxide signaling in osteoclasts. J Bone Miner Res. 30, (1), 106-115 (2015).
  5. Hurchla, M. A., et al. The epoxyketone-based proteasome inhibitors carfilzomib and orally bioavailable oprozomib have anti-resorptive and bone-anabolic activity in addition to anti-myeloma effects. Leukemia. 27, (2), 430-440 (2013).
  6. Rauch, D. A., et al. The ARF tumor suppressor regulates bone remodeling and osteosarcoma development in mice. PLoS One. 5, (12), e15755 (2010).
  7. Su, X., et al. The ADP receptor P2RY12 regulates osteoclast function and pathologic bone remodeling. J Clin Invest. 122, (10), 3579-3592 (2012).
  8. Dempster, D. W., et al. Standardized nomenclature, symbols, and units for bone histomorphometry: a 2012 update of the report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee. J Bone Miner Res. 28, (1), 2-17 (2013).
  9. Begley, C. G., Ellis, L. M. Drug development: Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483, (7391), 531-533 (2012).
  10. Festing, M. F., Altman, D. G. Guidelines for the design and statistical analysis of experiments using laboratory animals. ILAR J. 43, (4), 244-258 (2002).
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Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation. J. Vis. Exp. (110), e53936, doi:10.3791/53936 (2016).More

Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation. J. Vis. Exp. (110), e53936, doi:10.3791/53936 (2016).

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